KR102644326B1 - 피브리노젠 기반 세포 시트 및 이의 제조방법 - Google Patents

피브리노젠 기반 세포 시트 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 피브리노젠을 무혈청배지에 녹여 피브리노젠 저장 용액을 제조하는 단계, 상기 피브리노젠 저장 용액을 세포 배양 배지에 분주시키는 단계, 상기 피브리노젠 분주된 세포를 배양시켜 피브린층을 형성시켜 세포 시트화시키는 단계, 및 상기 시트화된 세포 시트를 배양 배지로부터 박리시키는 단계를 포함하는 제조방법으로부터 제조된 피브리노젠을 기반으로 하되, 상기 피브리노젠으로부터 형성된 피브린층과 세포를 포함하는 세포 시트와 상기 세포 시트를 다수 개 적층시킨 것으로 이루어진 다층 구조의 세포 시트; 방향성을 가지는 세포 배양 배지를 지지체로 사용하여, 여기에 피브리노젠을 분주시켜 제조된 방향성을 가지는 세포 시트; 헤파린이 결합된 피브리노젠을 이용해 만들어지는 세포 시트에 약물이 탑재된 약물 전달체와 응용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 배양 접시에서 배양된 상태, 모양을 그대로 유지할 수 있으며, 배양된 세포는 시트화시켜 탈착되어지며 세포가 가지는 ECM을 유지하기 때문에 이식 후 세포 생존율 유지에 이점을 가지며, 생체 내 이식 시, 이식 부위로의 세포 전달에 대한 손실을 감소시켜 치료 효율의 상승을 기대할 수 있다.

Description

피브리노젠 기반 세포 시트 및 이의 제조방법{Fibrinogen-based cell sheet, and method for preparing thereof}
본 발명은 피브리노젠을 기반으로 한 세포 시트 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 상세하게는 세포 배양액에 피브리노젠을 첨가하여 간단한 방법으로 세포 시트를 얻을 수 있는 피브리노젠을 기반으로 한 세포 시트 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
종래 세포를 이식하기 위해서는 화학적 혹은 물리적 방법을 이용하여 세포 배양 용기로부터 세포를 분리, 회수하여 이식하였다. 그 중, 화학적 방법은 트립신(trypsin-EDTA)과 같은 효소를 이용해 세포의 부착 단백질을 분해 (enzymatic proteolysis) 시켜 세포를 회수하는 방법으로, ECMs, 세포-세포 간 결합(cell-cell junction), 막 단백질(membrane protein) 등이 분해된다는 단점이 있으며, 물리적 방법은 세포 결합, ECM의 손상, 및 세포 활성이 낮아지는 문제가 있다.
이러한 한계점을 해결하기 위해 Okano 교수팀이 세포 시트 공학(cell sheet engineering)을 제안했다. 상기 세포 시트 공학은 온도 감응성 고분자인 Poly(N-sopropylacrylamide)(PNIPAAm)으로 코팅한 배양 접시에 세포를 (confluent) 배양시킨 후, 온도를 낮추어 온도 감응성 고분자의 소수성(hydrophobic) 상태를 친수성(hydrophilic) 상태로 변화시키는, 표면매질의 상태를 변화시키는 과정으로 인해 제조되는데, PNIPAAm과 세포 표면 사이의 결합이 감소되어 배양 접시로부터 분리되고 ECM, cell junction, membrane protein이 보존된 세포시트를 얻는 기술이다.
그러나, 이러한 온도감응성 고분자를 배양 접시에 코팅하기 위해서는 전자 빔(electron beam), 기상 중합(vapor phase polymerization)을 위한 기기 등 고가의 특수 장비를 사용하기 때문에, 이를 이용해 상업용으로 시판된 배양 접시 또한 고가라는 문제가 있다. 또한, 여러 종류의 폴리머를 사용하는 과정 등 복잡한 화학적 과정도 추가되어야 하고, 온도 감응성 재료가 코팅되어 시판되는 배양 접시는 크기와 모양에 획일화되어 있어, 이식 부위를 고려한 다양한 형태를 가지는 세포 시트를 제작하는 데는 한계가 있다.
뿐만 아니라, 온도 감응성 고분자를 이용한 세포 시트 제작은 필연적으로 온도를 20℃로 낮추는 과정에서의 세포 생존능(cell viability) 및 기능 활성에 부정적인 영향을 미칠 수 있으며, 만들어진 세포 시트의 기계적 물성이 낮아 3차원 세포 시트로 제조 시, 별도의 도구, 조작(manipulator)이 필요한 문제가 있다.
이러한 세포 시트 제조에 따른 종래기술로는, 한국등록특허 10-1922346에서는 (A) 온도감응성 수화젤의 제조 단계; (B) 단일세포 형태의 줄기세포를 3D culture dish에서 배양하여 줄기세포 스페로이드를 제조하는 단계; (C) 상기 줄기세포 스페로이드를 상기 수화젤에 분주하여 배양하는 단계; 및 (D) 상기 수화젤 표면을 냉각하여 상기 수화젤 표면에서 배양한 줄기세포 스페로이드를 시트의 형태로 분리하는 단계;를 포함하는 줄기세포 스페로이드-시트 복합체의 제조방법을 제시하였다.
상기 특허에서는 저임계 용액 온도 (lower critical solution temperature; LCST)를 보이는 온도감응성 고분자로 구성된 ‘온도감응성 수화젤’을 사용한 것으로, LCST보다 높은 온도에서 수축하고, 그보다 낮은 온도에서 팽창하는 특성을 가지고 있다. 따라서, 상기와 같은 온도감응성 수화젤의 특성을 이용하면서, 세포접착 단백질로서 세포와 세포, 세포와 matrix, 세포와 기타 물질의 결합을 용이하게 하는 것으로써, 예를 들어, 카드헤린(Cadherin), 피브리노젠(fibrinogen), 피브로넥틴(fibronectin), 비트로넥틴(vitroectin), 라미닌(laminin), 콜라젠(collagen), 셀렉틴(selectin) 등을 포함한다.
그러나, 상기 특허의 경우 온도감응성 고분자를 사용함에 따른 문제를 해결할 수 없을 뿐만 아니라, 수화젤 표면에서 배양한 줄기세포 스페로이드를 시트의 형태로 분리하기 위해서는 수화젤 표면을 0℃ 내지 10℃까지 냉각시키는 별도의 과정이 필요한 등 공정이 매우 복잡하고 까다로운 문제가 있다.
또한, 한국등록특허 10-1894486에서는 (1) 신경능선줄기세포(neural crest stem cells, NCSCs)를 분리하여 배양하는 단계; (2) 상기 배양된 신경능선줄기세포를 최종 농도 0.1% 내지 1%의 콜라겐 및 최종 농도 0.1% 내지 1%의 피브리노겐을 함유하는 콜라겐 및 피브리노겐 혼합 하이드로젤 내로 함입시키는 단계; (3) 상기 신경능선줄기세포가 함입된 콜라겐 및 피브리노겐 혼합 하이드로젤을 물리적 지지가 유지되는 부착배양조건에서 배양하는 단계; 및 (4) 상기 (3) 단계에서 배양된 콜라겐 및 피브리노겐 혼합 하이드로젤을 물리적 지지가 배제된 부유배양조건에서 배양하는 단계를 포함하는 신경능선줄기세포의 다층세포시트 제조방법을 제시하였다.
한국 공개특허 2020-0014247 한국등록특허 10-1894486
본 발명은 별도의 온도 조절이나 시약의 사용 없이, 배양된 세포에 특정 농도의 피브리노젠을 첨가함으로써 촉발되는 피브린으로 응집(aggregation)되는 기전을 이용하여 세포 종류, 배양 접시의 형태에 상관없이 효과적으로 세포의 탈착을 유도할 수 있고 기계적 물성이 우수한 세포 시트를 제공하는 데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명에서는 이러한 특징을 가지는 세포 시트의 제조방법을 제공하는 데도 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 상기 세포 시트를 이용하여 다수 개 적층시킨 구조의 세포 시트; 상기 세포시트에 약물을 탑재시킨 세포 시트를 이용한 약물 전달체; 및 배양된 세포가 방향성을 가지는 세포 시트 등으로 다양한 기능성을 가지는 세포 시트를 제공하는 데도 그 목적이 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 세포 시트는 피브리노젠을 기반으로 하되, 상기 피브리노젠으로부터 형성된 피브린층과 세포를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 세포 시트는 피브리노젠을 배양중인 세포에 분주시켜 상기 피브리노젠이 피브린층으로 응집(aggregation) 반응을 통하여 세포를 포함하는 시트 형태로 형성되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 세포 시트 내에서 피브리노젠은 200~1000㎍/㎖의 농도로 포함되는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 세포 시트에 포함되는 세포는 인간 섬유아세포(Fibroblast Sheet), 인간 평활근세포(SMC Sheet), 인간 혈관세포(HUVEC Sheet), 쥐(mouse) 근육세포(C2C12 Sheet), 쥐(rat) 신경세포(PC12 Sheet), 쥐(rat) 골세포(Rat osteoblast Sheet)), 인간 지방유래 줄기세포 (Human ADSC Sheet), 쥐(rat) 골수 유래 줄기세포(Rat bmMSC Sheet) 중에서 선택되는 1종 이상이 바람직하게 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 세포 시트는 2차원 구조를 가지는 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 세포 시트에 포함되는 세포는 1종 또는 2종 이상의 세포를 같은 배양 접시에 공 배양시켜 사용할 수 있는 특징을 가진다.
이러한 본 발명의 세포 시트의 제조방법은 피브리노젠을 무혈청배지에 녹여 피브리노젠 저장 용액을 제조하는 단계, 상기 피브리노젠 저장 용액을 세포 배양 배지에 분주시키는 단계, 상기 피브리노젠 분주된 세포를 배양시켜 피브린층을 형성시켜 세포 시트화시키는 단계, 및 상기 시트화된 세포 시트를 배양 배지로부터 박리시키는 단계를 포함하여 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 세포 배양 배지는 크기 제한없이 사용 가능한 데 특징이 있다.
상기 세포 배양 배지에 분주되는 최종 피브리노젠 저장 용액의 농도는 200~1000 μg/mL인 것이 바람직하다.
또한, 상기 시트화된 세포 시트를 배양 배지로부터의 박리는 별도의 온도조절, 화학적 및 물리적 박리 기작을 거치지 않고도 가능한 특징을 가진다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 세포 시트를 다수 개 적층시킨 것으로 이루어진 다층 구조의 세포 시트를 제공할 수 있다.
상기 다층 구조의 세포 시트는 이식할 세포의 양을 증대시킬 수 있으며, 서로 다른 세포를 포함하는 세포 시트를 적층시켜 이루어질 수 있다.
본 발명의 추가의 다른 실시예에 따르면, 피브리노젠을 기반으로 하되, 방향성을 가지는 세포 배양 배지를 지지체로 사용하여 여기에 피브리노젠을 분주시켜 상기 피브리노젠으로부터 형성된 피브린층과 세포를 포함하는 방향성을 가지는 세포 시트를 제공한다.
상기 세포 배양 배지에 포함된 세포는 지지체에 형성된 방향성과 동일한 형태의 방향성을 따라 배열되는 특징을 가진다.
또한, 상기 세포 시트 내에 포함된 세포는 지지체에 형성된 방향성과 동일한 형태의 방향성을 따라 배열되는 특징을 가진다.
상기 방향성은 패턴의 형태에 따라 결정될 수 있으며, 상기 패턴은 구조체의 크기 조절 (Multiscale)이 가능한 것으로 그루브-릿지(Groove-Ridge), 기둥(Pillar), 점(Dot), 방사형(Radial) 중에서 선택되는 1종 이상이 바람직하다.
또한, 본 발명의 추가의 다른 실시예에 따르면, 상기 세포 시트에 약물을 탑재시킨 세포 시트를 이용한 약물 전달체를 제공한다.
상기 약물 전달체는 헤파린이 결합된 피브리노젠, 및 자유 피브리노젠의 혼합 피브리노젠에 약물을 혼합하여 배양된 세포에 첨가하여 상기 혼합 피브리노젠으로부터 형성된 피브린층에 상기 약물이 탑재됨과 동시에 세포 시트를 형성하여 이루어지는 것이 바람직하다.
또한, 상기 탑재되는 약물은 헤파린과 결합가능한 약물로써, 골형성 단백질 (Bone morphogenetic protein; BMP), 혈관 내피 성장 인자 (Vascular endothelial growth factor; VEGF), 변형 성장 인자 (Transforming growth factor-β; TGF-β), 혈소판 유도 성장인자 (Platelet derived growth factor; PDGF) 및 섬유아세포 성장인자 (Fibroblast growth factor; FGF)로부터 선택되는 1종 이상의 성장인자가 바람직하게 사용될 수 있다.
본 발명은 화학적 혹은 물리적 방법을 이용하지 않고 혈장 단백질인 피브리노젠을 이용하여 배양중인 세포를 간단하게 피브린층으로 응집 반응을 통해 세포를 시트화시킬 수 있다. 또한, 본 발명은 피브리노젠의 농도에 의한 기계적 물성을 조절할 수 있으며, 세포를 배양하는 지지체(배양 접시, substrate)의 다양성을 이용하여 세포의 종류, 형태, 적층 등 조직 특이성을 반영한 세포 시트를 종래기술 대비 저렴한 비용으로 제작할 수 있다는 장점이 있다.
또한, 본 발명에 따른 이러한 세포 시트는 별도의 박리 과정을 거치지 않고도 피브리노젠이 피브린층으로 응집되면서 별도의 온도조절 등의 공정없이도 자연스럽게 세포를 포함하는 시트 상으로 박리가 되는 특징을 가진다.
또한, 소정의 목적에 맞도록 피브리노젠의 농도를 조절하여 최종 제조되는 세포 시트의 두께 조절이 가능할뿐만 아니라, 목표로 하는 크기에 따라 다양한 사이즈로 조절하여 제조할 수 있다.
또한, 본 발명에 따르면, 배양 접시에서 배양된 상태, 모양을 그대로 유지할 수 있으며, 배양된 세포는 시트화시켜 탈착되어지며 세포가 가지는 ECM을 유지하기 때문에 이식 후 세포 생존율 유지에 이점을 가지며, 생체 내 이식 시, 이식 부위로의 세포 전달에 대한 손실을 감소시켜 치료 효율의 상승을 기대할 수 있다.
본 발명은 상기 세포 시트를 이용하여 다수개 적층시킨 구조의 세포 시트; 세포 시트에 약물을 포함하는 세포 시트; 및 방향성을 가지는 배양 배지를 이용한 방향성을 가지는 세포 시트 등으로 다양한 기능성을 가지는 세포 시트로의 응용이 가능하다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 시트의 제조 과정을 나타낸 것이고,
도 2는 실시예 1~3에 따라 제조된 각 세포 시트의 형태학적 구조 확인 결과이고,
도 3은 실시예 4에 따라 제조된 각 세포 시트들의 형태학적 구조를 전자현미경 결과이고,
도 4는 실시예 4의 인간 평활근세포(SMC)를 이용하여 다양한 크기의 세포 시트의 제조가 가능한지 확인한 결과이고,
도 5~7은 각각 실시예 5의 CS 그룹, TCPS 그룹(대조군 1), 및 CS-1 그룹의 세포 독성 실험 결과이고,
도 8은 실시예 6에 따라 제조된 적층 구조를 가지는 기능성 세포 시트의 전자현미경 결과이고,
도 9는 실시예 7에 따라 제조된 방향성을 가지는 세포 시트의 각 단계별 전자현미경 결과이다.
이하에서 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.
본 명세서에서 사용된 용어는 특정 실시예를 설명하기 위하여 사용되며, 본 발명을 제한하기 위한 것이 아니다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥상 다른 경우를 분명히 지적하는 것이 아니라면, 복수의 형태를 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 경우 "포함한다(comprise)" 및/또는 "포함하는 (comprising)"은 언급한 형상들, 숫자, 단계, 동작, 부재, 요소 및/또는 이들 그룹의 존재를 특정하는 것이며, 하나 이상의 다른 형상, 숫자, 동작, 부재, 요소 및/또는 그룹들의 존재 또는 부가를 배제하는 것이 아니다.
본 발명은 피브리노젠을 기반으로 하는 세포 시트, 이의 제조방법, 및 이를 다양한 형태로 이용하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 사용된 ‘세포 시트(cell sheet)’는 단일 세포(single cell)를 이용하여 형성된 2차원 구조, 예를 들어 판상(sheet)으로 이루어진 것을 포함하는 의미이다. 상세하게는 세포 배양 접시에서 세포끼리 붙어있는 상태로도 시트화시킬 수 있고, 단일 세포를 포함하는 것을 시트화시켜 회수하는 것을 포함하는 의미이다.
통상 혈액을 원심분리 할 경우 밀도 차에 의해서 혈구와 혈장으로 나뉘어지며, 혈구에는 백혈구, 적혈구, 혈소판을 포함한다. 적혈구를 포함하고 있기 때문에 붉은색을 띄는 것이 특징이다. 혈장에는 섬유소원인 피브리노젠(fibrinogen)을 포함하고 있으며 이 섬유소원을 제거한 것이 혈청이다.
한편, 출혈이 발생하게 되면, 혈소판이 파괴되어 혈소판이 가지고 있는 트롬보키나아제가 방출된다. 혈장에 존재하는 프로트롬빈이 트롬보키나아제에 의해 트롬빈이라는 효소로 전환되며, 전환된 트롬빈은 혈장단백질인 피브리노젠과 반응하여 피브린이라는 섬유소 단백질로 전환되어 적혈구, 백혈구를 서로 엉켜 응고시킨다.
본 발명에서는 이러한 기전을 이용한 것으로, 피브리노젠을 혈청(혈청에 혈액응고단백질인 피브리노젠, 프로트롬빈이 포함되어있지 않다고 알려져 있음)이 포함된 배지에 첨가하여 일정시간 반응시켰을 때, 반응물이 형성되는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명에 따른 세포 시트는 피브리노젠을 기반으로 하되, 상기 피브리노젠으로부터 형성된 피브린층과 세포를 포함하는 구조를 가진다.
즉, 본 발명에서는 혈장 단백질인 피브리노겐을 배양중인 세포에 처리하여 배지에 포함된 혈청과 피브리노젠의 응집(aggregation) 반응을 유도하여 상기 피브리노젠이 피브린층을 형성하면서 다른 물리적 혹은 화학적인 방법을 이용하지 않고 세포외 기질 (ECM, extracellular matrix)을 포함하는 세포 시트 (Cell sheet)를 제조할 수 있다. 즉, 세포 배양 시 별다른 효소의 사용없이 피브리노젠을 일반 세포 배양액에 넣게 되면, 세포와 피브리노젠/트롬빈 등이 결합된 구조의 세포시트를 제조할 수 있고, 이를 간단히 회수하여 원하는 용도에 이식하여 사용할 수 있다.
이를 위해 본 발명에서는 피브리노젠을 먼저 무혈청 배지에 용해시켜 피브리노젠 저장 용액 (stock solution)을 제조한 다음, 이를 혈청이 포함되어 있는 세포 배양 배지에 유효한 농도로 첨가 및 반응시킴으로써 제조할 수 있다. 이때, 상기 피브리노젠은 혈청에 포함된 혈액응고 전구물질들과 유도되는 응집(aggregation) 반응을 통하여 세포를 포함하는 시트 형태를 형성하는 것으로 유추된다. 상기 응집되는 과정에서 형성된 피브린층이 세포를 감싸는 구조가 될 수도 있고, 세포 위에서 응집될 수도 있다.
상기 세포 시트 내에서 피브리노젠은 200~1000㎍/㎖의 농도로 포함되는 것이 바람직하며, 상기 피브리노젠의 농도에 따라 최종 제조되는 세포 시트의 두께가 결정된다고 할 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 세포 시트는 피브리노젠으로부터 형성된 피브린층과 세포로 구성되어 있기 때문에 상기 피브리노젠의 농도가 높을수록 최종 제조되는 세포 시트의 두께도 두꺼워진다.
그러나 본 발명에 따른 세포 시트가 조직에 이식되어 사용되기 위해서는 그 두께는 얇을수록 좋지만 너무 얇은 경우에는 물성이 약한 문제가 있기 때문에 물성을 유지하면서도 적절한 두께를 유지하는 것이 필요하다. 따라서, 상기 피브리노젠의 농도가 200㎍/㎖ 미만에서는 두께가 얇아서 좋지만 물성이 약할 수 있어 바람직하지 못하고, 1000㎍/㎖의 농도를 초과하는 경우에는 물성은 확보될 수 있으나, 제조되는 세포 시트의 두께가 너무 두꺼워 지기 때문에, 이식 공간 확보에 어려움이 있을 수 있어 피브리노젠의 농도를 정확하게 조절할 필요가 있다.
이러한 본 발명에 따른 세포 시트의 제조방법은 피브리노젠을 무혈청배지에 녹여 피브리노젠 저장 용액을 제조하는 단계, 상기 피브리노젠 저장 용액을 세포 배양 배지에 분주시키는 단계, 상기 피브리노젠 분주된 세포를 배양시켜 피브린층을 형성시켜 세포 시트화시키는 단계, 및 상기 시트화된 세포 시트를 배양 배지로부터 박리시키는 단계를 포함하는 과정을 거쳐 제조될 수 있다.
먼저 첫 번째 단계는 피브리노젠을 혈청이 포함되어 있지 않은 무혈청 배지에 녹여 피브리노젠 저장 용액(stock solution)을 제조한다.
그 다음에는 상기 피브리노젠 저장 용액을 세포 배양 배지에 분주시키는 단계로서, 본 발명의 세포 시트에 사용될 수 있는 세포는 인간 섬유아세포(Fibroblast Sheet), 인간 평활근세포(SMC Sheet), 인간 혈관세포(HUVEC Sheet), 쥐(mouse) 근육세포(C2C12 Sheet), 쥐(rat) 신경세포(PC12 Sheet), 쥐(rat) 골세포(Rat osteoblast Sheet), 인간 지방유래 줄기세포 (Human ADSC Sheet), 쥐(rat) 골수 유래 줄기세포(Rat bmMSC Sheet) 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 세포 외에도 세포 배양 접시와 같은 배양 배지에서 배양할 수 있는 ‘부착 세포’또는 부유 배양이 가능한 것이면 어떠한 세포도 가능하다. 또한 명시되어진 세포 중 2종 이상의 세포를 같은 배양 접시에 공 배양 후, 피브리노젠 첨가에 의해 2종 이상의 세포가 포함된 세포 시트를 제조할 수도 있다.
또한, 지금까지의 세포 시트는 정해진 규격의 배양 접시에만 한정되어 다양한 크기의 세포 시트의 제조가 불가능하였고, 본 기술은 종래 기술들과 달리 온도감응성 고분자를 이용한 것이 아니기 때문에 배양 접시의 크기, 형태에 영향을 받지 않는다. 따라서, 본 발명에서는 목표로 하는 크기에 따라 종래의 세포와 배양 배지를 포함한 다양한 크기, 모양을 가지는 세포 배양 접시 또는 배양용 지지체를 사용할 수 있어 최종 제조되는 세포 시트의 크기에 제한이 없는 특징을 가진다.
즉, 본 발명에 따른 세포 배양접시는 세포 배양이 가능한 것이면 그 크기와 형태의 제한없이 사용 가능하며, 세포 시트화 시키는데 바람직하기로는 약 30mm2 내지 15000mm2 까지 사용될 수 있다.
세 번째 과정은 상기 피브리노젠이 분주된 세포를 배양시켜 피브린층을 형성시켜 세포 시트화시키는 단계로서, 이 단계에서는 통상적인 세포 배양 조건으로 알려진 37℃의 온도에서, CO2 농도 5%에서 수행되는 것이 바람직하다. 특별히 세포 활성은 온도 변화에 많은 영향을 받을 수 있기 때문에 37℃에서 세포를 배양시키는 것이 중요하다.
다만, 피브리노젠의 농도만 소정의 범위로 조절하여 넣어주면 세포-배양접시 간의 점착력보다 세포-피브리노젠의 점착력이 커서 배양접시로 부터 쉽게 회수 가능하고 피브린이 형성된 세포 시트를 형성하게 된다.
마지막으로 상기 시트화된 세포 시트를 배양 접시로부터 박리시키는 단계를 거쳐 최종 세포 시트를 얻을 수 있다.
종래에는 제조된 세포 시트를 세포 배양 접시로부터 박리시키기 위하여 온도를 조절하거나 박리하기 위한 도구를 사용하는 등이 필요하였으나, 본 발명에서는 피브리노젠이 피브린층으로 응집되면서 별도의 온도조절, 화학적 및 물리적 박리 기작없이 간단한 tapping(배양접시를 살짝 쳐서 떨어뜨리는 방법)으로 배양 배지로부터 자연스럽게 세포를 포함하는 시트 상으로 박리되어 용이하게 회수할 수 있다.
또한, 본 발명에서는 상기 탈착된 세포 시트를 별도의 도구 사용 및 조작(manipulator) 과정을 거치지 않고 다양한 형태로 조작이 가능하다. 기존 세포 시트 기술에서는 세포 시트를 조작 및 이식하기 위하여 젤라틴이 코팅된 plunge stamp 등을 사용하였지만 본 발명에서 새롭게 개발한 세포 시트는 피브린층을 포함하고 있어 포셉(tweezer)을 이용하여 단순히 조작 및 이식이 가능한 장점을 가진다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명에서는 상기 특징을 가지는 세포 시트를 다수 개 적층시킨 것으로 이루어진 다층 구조의 세포 시트를 제공할 수 있다. 즉, 2차원 구조로 제조된 세포 시트를 회수하여 이를 적층시킴으로써 3차원 구조의 세포 시트를 제조할 수 있게 되는 것이다.
상기 다층 구조의 세포 시트 제조를 위한 세포 시트의 적층은 상기 세포 시트를 순차적으로 위치시키는 간단한 방법으로 이루어질 수 있다.
따라서 본 발명과 같이 세포 시트를 다수 개 적층시키는 경우, 이식할 세포의 양을 증대시킬 수 있으며, 서로 다른 세포를 포함하는 세포 시트를 적층시킴으로써 조직 결손 부위에 이식하여 재생 효과를 극대화시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 방향성을 가지는 고분자 지지체 위에서 세포를 배양하여 세포에 방향성을 부여한 후, 여기에 피브리노젠 용액을 분주시켜 방향성을 가지는 세포 시트를 제조할 수 있다.
즉, 세포 배양 지지체로써 구조체의 크기 조절 (Multiscale) 이 가능한 그루브-릿지(Groove-Ridge), 기둥(Pillar), 점(Dot), 방사형(Radial) 중에서 선택되는 1종 이상의 패턴을 고분자 지지체 표면에 식각하고, 형성된 패턴 지지체 위에 세포를 배양하여 세포의 형태 조절, 및 방향성을 부여한 후, 피브리노젠을 분주시켜 형성된 모양에 따라 최종 세포 시트를 얻도록 하는 방법이다. 상기 방향성은 패턴의 형태에 따라 결정된다고 할 수 있다.
따라서, 이때 상기 세포 배양 지지체에 포함된 세포는 지지체에 형성된 방향성과 동일한 형태와 방향성을 따라 배열되는 특징을 가지며, 상기 세포 시트 내에 포함된 세포는 지지체에 형성된 방향성과 동일한 형태와 방향성을 따라 배열되는 특징을 가진다. 이러한 결과 본 발명에 따른 세포 시트는 사용되는 배양 배지의 표면 성질에 따라 여러 방향성을 가지도록 조절할 수 있어 소정의 용도에 적합하도록 조직 특이적인 형태로 변경 및 이식이 가능한 특징을 가진다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기와 같이 제조된 세포 시트에 포함된 피브린층에 약물이 결합되어 세포 시트를 이용한 약물 전달체로도 이용 가능한 특징을 가진다.
상기 세포 시트를 이용한 약물 전달체는 활성화시킨 헤파린을 피브리노젠과 결합하여 헤파린이 결합된 피브리노젠을 이용하며, 여기에 자유 피브리노젠을 적절한 비율로 혼합하여 혼합 피브리노젠을 준비한다. 상기 혼합 피브리노젠과 약물(성장인자)를 세포가 배양되어져 있는 배양접시에 배지와 함께 분주시키면 상기 혼합 피브리노젠으로부터 형성된 피브린층에 상기 약물이 결합됨과 동시에 세포 시트를 형성하게 된다.
이때 사용 가능한 약물은 골형성 단백질 (Bone morphogenetic protein; BMP), 혈관 내피 성장 인자 (Vascular endothelial growth factor; VEGF), 변형 성장 인자 (Transforming growth factor-β; TGF-β), 혈소판 유도 성장인자 (Platelet derived growth factor; PDGF) 및 섬유아세포 성장인자 (Fibroblast growth factor; FGF) 등과 같은 성장인자가 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 복수의 성장인자가 사용될 수도 있다.
또한, 상기 약물 전달체는 성장 인자 단백질의 전달이 용이하여 세포 시트와 더불어 뼈, 피부, 혈관, 연골 등의 결손 부위의 조직 재생에 탁월한 효과를 나타내는 치료제로 사용될 수 있다.
이하에서 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 이하의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 또한, 이하의 실시예에서는 특정 화합물을 이용하여 예시하였으나, 이들의 균등물을 사용한 경우에 있어서도 동등 유사한 정도의 효과를 발휘할 수 있음은 당업자에게 자명하다.
실시예 1~3 : 피브리노젠 기반 세포 시트의 제조
피브리노젠을 Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 에 25 mg/mL의 농도로 37 ℃에서 녹여 저장 용액(stock solution)을 제조하였다. 상기 제조된 피브리노젠 저장 용액을 배양중인 세포의 성장 배지(Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM+10% Fetal Bovine Serum (FBS)+1% Penicillin Streptomycin (PS))에 첨가하여 피브리노젠의 최종 농도를 500, 750, 1000 μg/mL로 변화시키면서 분주시켰다.
그 다음, 피브리노젠 처리된 세포를 5% CO2, 37℃의 환경의 인큐베이터에서 약 4시간 정도 배양시키면 세포를 포함하는 겔화(gelation)된 세포 시트가 배양접시에 형성되며, 배양접시를 간단히 tapping을 가해 세포 시트를 획득하였다. 전체적인 세포시트의 과정은 다음 도 1에 나타내었다.
실험예 1 : 피브리노젠 농도에 따른 세포 시트의 형태학적 구조 확인
상기 실시예 1~3에 따라 제조된 각 세포 시트의 피브리노젠 용액의 농도에 따른 세포 시트의 형성을 현미경 사진과, hematoxylin & eosin 염색을 통해 확인하였으며, 그 결과를 다음 도 2에 나타내었다.
다음 도 2를 참조하면, 피브리노젠 농도의 증가에 따라 피브린층(fibrin layer)의 두께가 증가하는 것을 확인할 수 있다. 세포 시트를 떼어내기 전(Before detachment)의 현미경 사진에서는 농도가 서로 다른 3그룹의 눈에 띄는 형태학적 차이는 확인할 수 없었다. 그러나, 세포 시트를 떼어낸 후(After detachment)에는 피브리노젠 농도가 증가함에 따라 세포 시트의 형태가 더 잘 유지되고 두께가 증가하는 것을 확인할 수 있다.
또한, Hematoxylin & Eosin (H&E) 염색을 통해 세포(짙은 보라색)가 피브린층(옅은 보라색) 밑에 존재하며 피브리노젠 농도의 증가에 따라 피브린층의 두께가 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
이러한 결과를 통해, 세포 배양 배지에 첨가하는 피브리노젠의 농도 조절을 통해 최종 제조되는 세포 시트에서 피브린층(fibrin layer)의 두께를 조절할 수 있음을 확인하였고, 피브린층의 두께가 증가함에 따라 그 형태는 더 잘 유지되는 것을 확인할 수 있었다. (* 표시는 시트의 아랫면 (세포 부분) 표시한 것임)
피브리노젠의 농도를 500, 750, 1000 μg/mL로 변화시킴에 따라 최종 제조된 세포 시트에서 피브린층의 두께는 각각 약 40~70㎛, 80~140㎛, 150~250㎛ 두께를 가지는 것을 알 수 있다.
그러나 세포 시트에서 피브린층의 두께가 너무 두꺼우면 두께 때문에 타겟 조직에 이식하기 어렵고 너무 얇으면 핸들링하기 어렵기 때문에 이하의 실시예에서는 중간 정도의 두께를 가지는 피브리노젠의 농도인 750 μg/mL를 선택하여 실험하였다.
실시예 4 : 다양한 세포들을 이용한 세포 시트 제작
피브리노젠의 농도를 750 μg/mL로 하고, 세포의 종류를 다음과 같이 6가지로 변경하면서 세포 변경에 따른 배양 배지의 조건을 수정하는 것(섬유아세포(Fibroblast), 근육세포(C2C12), 신경세포(PC12), 골세포(osteoblast); DMEM+10% FBS+1% PS, 평활근세포 (SMC); Smooth muscle cell basal medium+5% FBS+0.2% HFGF+0.1% Insulin+0.1% GA-1000+0.1% HEGF, SmGM™-2 SingleQuots™ supplements, CC-4149, Lonza), 혈관세포(HUVEC); Endothelilal cell basal medium+2% FBS+1% VEGF+1% R3-IGF+1% Ascorbic acid+1% EGF+1% GA-1000+1% Heparin+0.4% hFGF-β+0.04% Hydrocortisone, EGM™-2 SingleQuots™ supplements, CC-4176, Lonza) 을 제외하고는, 상기 실시예 1~3의 조건과 동일하게 여러 종류의 세포를 이용하여 세포 시트의 제작이 가능한지 확인하였다.
피브리노젠 기반의 세포 시트가 세포 특이적인 현상인지 확인하기 위해 다양한 유래와 종류를 가지는 이하의 6가지 세포들(인간 섬유아세포(Fibroblast), 인간 평활근세포(SMC), 인간 혈관세포(HUVEC), 쥐(mouse) 근육세포(C2C12), 쥐(rat) 신경세포(PC12 ), 쥐 골세포(Rat osteoblast))을 제작하였다.
실험예 2 : 다양한 세포들을 이용한 세포 시트 형태학적 구조 확인
상기 실시예 4에 따라 제조된 각 세포 시트들의 형태학적 구조를 전자현미경으로 관찰하였으며, 그 결과를 다음 도 3에 나타내었다.
다음 도 3을 참조하면, 6가지 다양한 세포들로부터 각각의 세포 시트들(인간 섬유아세포(Fibroblast Sheet), 인간 평활근세포(SMC Sheet), 인간 혈관세포(HUVEC Sheet), 쥐(mouse) 근육세포(C2C12 Sheet), 쥐(rat) 신경세포(PC12 Sheet), 쥐(rat) 골세포(Rat osteoblast Sheet))의 제조가 효과적으로 이루어짐을 확인하였다.
실시예 5 : 인간 평활근세포(SMC)를 이용한 다양한 크기의 세포 시트 제작
상기 실시예 4의 인간 평활근세포(SMC)를 이용하여 다양한 크기의 세포 시트의 제조가 가능한지 확인하였다. 본 실시예에서는 상기 세포를 이용하여 7mm, 12mm, 100mm 크기를 가지는 배양 배지를 이용하여 크기 변화에 따른 세포 시트의 제조를 수행하였으며, 각각 제조된 세포 시트는 다음 도 4에 나타내었다.
다음 도 4에서와 같이 SMC 세포를 이용하여 다양한 크기로 세포 시트의 제조가 가능함을 확인하였다. 지금까지의 세포 시트들은 온도 감응성 고분자로 코팅된 배양접시를 사용했기 때문에 세포 시트의 제작이 배양 접시 크기에 한정적인 반면 본 발명의 세포 시트는 배양 접시 크기에 제한 없이 원하는 크기의 세포 시트를 제작할 수 있어 향후 다양한 크기의 조직에 적용이 가능한 효과를 가진다.
실험예 3 : 세포 독성 실험
Live & Dead와 CCK-8 assay를 통해 제작한 세포 시트가 세포 독성을 유발할 수 있는지 확인하기 위하여 상기 실시예 4의 rat osteoblast(골 아세포) 세포 시트 그룹 (이하, CS라 함), 상기 rat osteoblast(골 아세포) 세포 시트를 배지 교환 없이 배양한 그룹(no medium exchange, (이하 CS-1이라 함) 과 함께 종래와 같이 세포 배양 접시에서 제조된 그룹(대조군 1, 이하 TCPS라 함)과 함께 비교 검증하였으며, 그 결과를 다음 도 5~7에 나타내었다.
다음 도 5~7의 결과를 참조하면, Live & dead assay를 통해 정성 정량적으로 CS 그룹이 TCPS 그룹과 비교했을 때 7일차 14일차 모두 유의적인 차이가 나지 않는 것을 확인하였고, 특히 CS-1 그룹은 배지 교환 없는 조건에서도 14일차에 다른 그룹과 비교하여 유의적인 차이가 보이지 않은 것을 확인하였다. (도 6 참조) 이를 통해 이식 시, 초기에 영양분과 산소를 충분히 공급받지 않는 상태에서도 세포 생존율(cell viability)가 떨어지지 않을 것으로 예상된다. 통상 배양시에는 새로운 영양공급을 위해 배지 교환을 해줘야만 세포 배양이 가능하지만, CS-1 그룹에서 확인할 수 있는 바와 같이, 배지 교환이 없이도 세포 시트에 있는 피브린층이 보다 안정적인 환경을 제공하여 세포 활성을 유지할 수 있는 것으로 판단된다.
CCK-8 결과인 도 7에서도 역시 CS 그룹의 세포 증식률이 TCPS 그룹과 유사한 세포 증식량이 이뤄짐을 확인하였다.
위 결과 값들을 바탕으로 CS 그룹, 및 CS-1 그룹의 세포 생존율 및 증식률이 TCPS 그룹과 유의적인 차이가 없는 것을 통해 새롭게 첨가한 피브리노젠에 의해서 세포의 생존과 증식에 영향을 주는 독성은 의 세포 독성을 유발하지 않는 것을 확인하였다.
실시예 6 : 적층 구조를 가지는 기능성 세포 시트의 제조
본 발명에 따라 제조된 세포 시트를 여러 형태로의 응용 가능성을 확인하였다.
먼저, DiO와 DiI로 labeling된 인간 섬유아세포(fibroblast)를 세포 시트로 제작한 후(피브리노젠 농도 750 μg/mL으로 한 실시예 1~3의 조건과 동일하게 제조함)에 특별한 장비 없이 간편하게 포셉을 이용하여 세포 시트를 mono, bi, tri, tetra layer로 적층시켜 제조하였다.
상기 적층된 구조의 각 세포 시트를 전자현미경으로 확인한 다음 도 8을 참조하면, 다양한 층을 가지는 세포 시트를 효과적으로 제조할 수 있음을 확인하였다. 이러한 결과로부터 본 발명에서 새로 개발한 피브리노젠을 기반으로 한 세포 시트는 manipulator의 조작 없이 다층으로 적층이 가능하며, 조작 및 이식이 용이하여 기존 대비 비용을 절약할 수 있는 효과를 가진다.
실시예 7 : 방향성을 가지는 세포 시트의 제조
본 실시예에서는 PLGA를 이용하여 800 nm 스케일의 Groove-Ridge 형태의 나노 패턴을 식각하여 방향성을 가지는 지지체(PLGA 800 nm pattern patch) 위에서 인간 섬유아세포(fibroblast)를 배양시켰다. 그 다음 피브리노젠(농도 750 μg/mL으로 한 실시예 1~3의 조건과 동일하게 제조함)을 첨가해 세포 시트를 제조하였으며, 각 단계에서의 구조를 현미경으로 관찰하였으며 그 결과를 다음 도 9에 나타내었다.
다음 도 9를 참조하면, 나노 패턴 구조를 가지는 지지체에 인간 섬유아세포(fibroblast)를 배양해 방향성을 부여한 후, 피브리노젠을 첨가하면 피브린층이 형성되면서 세포 시트화에 기여 한다.
상기 제조된 세포시트의 현미경 사진을 나타낸 다음 도 9를 참조하면, 나노 패턴이 식각된 지지체에 세포를 분주하면 (a)에서와 같이 지지체에 형성된 나노 패턴의 방향성에 따라 상기 분주된 섬유아세포도 방향성을 따라 배열되어 있음을 알 수 있다. 또한, 여기에 피브리노젠 용액을 첨가하여 배양시키게 되면 세포 시트화가 되면서 시트 내 세포 역시 지지체에 형성된 나노 패턴의 방향성을 따라 배열되어 있는 것을 확인할 수 있다. (b, c)
이러한 결과로부터 표면의 성질에 따라 여러 방향성 혹은 다른 형태의 세포를 제작하여 시트화가 용이하여 조직 특이적인 형태의 이식이 가능함을 알 수 있다.

Claims (19)

  1. 배양 중인 세포가 포함되어 있고, 트롬빈이 포함되어 있지 않고 혈청이 포함된 세포의 성장 배지에 무혈청배지에 녹인 피브리노젠 저장 용액을 500~1000㎍/㎖의 농도로 분주하여 피브리노젠 처리된 세포를 배양시켜
    피브리노젠이 혈청에 포함된 혈액응고 전구물질들과 응집(aggregation) 반응을 통하여 피브린층이 형성되면서 상기 피브리노젠이 분주된 세포의 성장 배지에서 세포외 기질 (ECM, extracellular matrix)을 포함하는 배양된 세포가 시트 형태로 형성되는 것이며,
    상기 세포 시트는 응집되는 과정에서 형성된 피브린층이 세포를 감싸는 구조이거나, 세포 위에서 피브린층이 형성되는 것이며,
    세포의 배양과 피브리노젠 처리된 세포로부터 세포 시트의 형성은 세포의 이동없이 동일한 세포 성장 배지에서 이루어지도록 하며,
    상기 시트화된 세포 시트를 배양 배지로부터의 박리는 별도의 온도조절이 필요치 않은 것을 특징으로 하는 피브리노젠을 기반으로 하는 세포 시트.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 세포 시트에 포함되는 세포는 인간 섬유아세포(Fibroblast Sheet), 인간 평활근세포(SMC Sheet), 인간 혈관세포(HUVEC Sheet), 쥐(mouse) 근육세포(C2C12 Sheet), 쥐(rat) 신경세포(PC12 Sheet), 쥐 골세포(Rat osteoblast Sheet)), 인간 지방유래 줄기세포 (Human ADSC Sheet), 쥐 골수 유래 줄기세포(Rat bmMSC Sheet) 중에서 선택되는 1종 이상인 것인 세포 시트.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 세포 시트는 2차원 구조를 가지는 것인 세포 시트.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 세포 시트에 포함되는 세포는 1종 또는 2종 이상의 세포를 같은 배양 접시에 공 배양시킬 수 있는 것인 세포 시트.
  7. 피브리노젠을 무혈청배지에 녹여 피브리노젠 저장 용액을 제조하는 단계,
    상기 무혈청배지에 녹인 피브리노젠 저장 용액을 트롬빈은 포함되어 있지 않고, 혈청이 포함된 세포 배양 배지에 500~1000㎍/㎖의 농도로 분주시키는 단계,
    상기 피브리노젠 저장 용액이 상기 혈청에 포함된 혈액응고 전구물질들과 응집(aggregation) 반응을 통하여 형성된 피브린층과 상기 피브리노젠이 분주된 세포 배양 배지에서 배양된 세포를 포함하는 시트 형태의 세포 시트로 시트화시키는 단계, 및
    상기 시트화된 세포 시트를 별도의 온도조절 없이 세포 배양 배지로부터 박리시키는 단계를 포함하는 제 1 항에 따른 피브리노젠을 기반으로 하는 세포 시트의 제조방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 세포 배양 배지는 크기 제한없이 사용 가능한 것인 세포 시트의 제조방법.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 제 1 항에 따른 세포 시트를 다수 개 적층시킨 것으로 이루어진 다층 구조의 세포 시트.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 다층 구조의 세포 시트는 이식할 세포의 양을 증대시킬 수 있으며, 서로 다른 세포를 포함하는 세포 시트를 적층시킬 수 있는 것인 다층 구조의 세포 시트.
  13. 피브리노젠을 기반으로 하되, 방향성을 가지는 세포 배양 배지를 지지체로 사용하여 여기에 피브리노젠을 분주시켜 상기 피브리노젠으로부터 형성된 피브린층과 세포를 포함하는 방향성을 가지는 세포 시트.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 세포 배양 배지에 포함된 세포는 지지체에 형성된 방향성과 동일한 형태의 방향성을 따라 배열되는 것인 방향성을 가지는 세포 시트.
  15. 제 13 항에 있어서,
    상기 세포 시트 내에 포함된 세포는 지지체에 형성된 방향성과 동일한 형태의 방향성을 따라 배열되는 것인 방향성을 가지는 세포 시트.
  16. 제 13 항에 있어서,
    상기 방향성은 패턴의 형태에 따라 결정될 수 있으며, 상기 패턴은 구조체의 크기 조절 (Multiscale)이 가능한 것으로 그루브-릿지(Groove-Ridge), 기둥(Pillar), 점(Dot), 방사형(Radial) 중에서 선택되는 1종 이상인 것인 방향성을 가지는 세포 시트.
  17. 제 1 항에 따른 세포 시트에 약물을 탑재시킨 세포 시트를 이용한 약물 전달체.
  18. 제 17 항에 있어서,
    상기 약물 전달체는 헤파린이 결합된 피브리노젠과 자유 피브리노젠이 혼합된 혼합 피브리노젠에 약물을 주입하여 배양된 세포에 첨가하여 상기 혼합 피브리노젠으로부터 형성된 피브린층에 상기 약물이 탑재됨과 동시에 세포 시트를 형성하는 것인 세포 시트를 이용한 약물 전달체.
  19. 제 18 항에 있어서,
    상기 약물은 헤파린과 결합가능한 약물로써, 골형성 단백질 (Bone morphogenetic protein; BMP), 혈관 내피 성장 인자 (Vascular endothelial growth factor; VEGF), 변형 성장 인자 (Transforming growth factor-β; TGF-β), 혈소판 유도 성장인자 (Platelet derived growth factor; PDGF) 및 섬유아세포 성장인자 (Fibroblast growth factor; FGF)로부터 선택되는 1종 이상의 성장인자인 세포 시트를 이용한 약물 전달체.
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