KR101894486B1 - 신경능선줄기세포의 다층세포시트 및 이의 제조방법 - Google Patents

신경능선줄기세포의 다층세포시트 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신경능선줄기세포의 다층세포시트 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 생분해성 천연고분자 하이드로젤을 3차원 지지체로 이용하여, 말초신경 유래 신경능선줄기세포를 하이드로젤 내로 함입시켜 3차원 단일 배양과정을 통하여 다층세포시트를 제조하는 방법을 제공하고자 한다. 본 발명의 다층 세포 시트는 제조하는데 특수한 기구가 필요하지 않으며, 물리적 특성이 좋아 다루기도 쉬우며, 세포 사이에 각종 성장 및 보호 인자 와 세포외 기질이 충분히 축적되어 이식 후 세포의 생존율을 높이며, 세포에 의해 유발된 수축에 의해 두께 또한 얇아 영양분 이동 또한 용이하다. 따라서, 상기 신경능선줄기세포의 다층세포시트는 척수 손상 질환 또는 뇌 손상 질환 치료제로 유용하게 활용될 수 있을 것으로 예상된다.

Description

신경능선줄기세포의 다층세포시트 및 이의 제조방법{Multilayer cell sheet of neural crest stem cells and method for preparing the same}
본 발명은 성인 말초신경 유래 신경능선줄기세포(neural crest stem cells, NCSCs)의 다층세포시트 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 성인 말초신경 유래 신경능선줄기세포를 하이드로젤 내 함입시켜 다층으로 3차원 배양하여 제조된 다층세포시트는 척수 손상 질환 또는 뇌 손상 질환 치료제로 적용 가능하다.
척수 손상(Spinal cord injury; SCI)은 척수에 가해진 외상으로 인하여 정상적인 운동, 감각 및 자율 신경 기능에 이상이 생긴 상태를 말한다. 안타깝게도, 척수 손상 후 신경 기능의 회복은 제한적이며, 대부분의 SCI 환자들은 평생 동안 영구적인 신경 기능 장애에 직면하게 된다. SCI에 대한 치료 방법으로 약물치료, 감압 수술 등이 제시되고 있으나, 세포 사멸을 감소시키고, 2차 손상을 줄이며, 축색(axon) 및 수초(myelin) 생성을 촉진할 수 있는 신경 보호 및 재생 기술의 필요성이 대두되면서, 세포치료제 혹은 줄기세포치료제 및 줄기세포치료기술-조직 공학적 제품을 포함한 치료방법이 부각되고 있다.
SCI 치료에 있어, 척수 보호 및 재생을 위한 줄기세포 치료에는 조혈모세포(hematopoietic stem cells, HSCs), 골수, 제대혈, 지방 조직 유래 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cells, MSCs), 슈반세포(Schwann cells; SCs), 후각초성세포(Olfactory ensheathing cells; OECs), 신경줄기세포(neural stem cells; NSCs), 신경능선줄기세포(neural crest stem cells, NCSCs) 등이 적용될 수 있다고 보고되고 있다.
현재 척수 손상을 대상으로 한 임상 및 전임상 시험에서, 줄기세포의 주입은 (1) 척수 내 직접 주사, (2) 뇌척수액에 주입, (3) 정맥 주사를 통해 대부분 이루어 지고 있다. 그 중 투여된 세포의 손상부위 내 전달율이 높다는 이유로 척수 내로 줄기세포를 직접 주사하는 방식이 가장 많이 시행되고 있다. 하지만, 이러한 직접 주사 방식은 척수에 직접 바늘을 삽입해야 하므로 주사 바늘에 의한 추가적인 손상이 생길 뿐만 아니라 주사된 세포나 약물의 용적에 비례하여 추가적인 손상이 생긴다. 또한 투여된 세포는 손상된 신경조직 내 과도한 염증반응 및 자유라디컬에 의하여 손상을 받게 된다. 따라서 투여한 세포의 손상부위로 전달율과 생존율을 동시에 높일 수 있는 세포 이식 방법이 요구되고 있다.
경막외공간은 19세기 후반부터 다양한 약물의 투여 경로로 사용되었으며, 현재에도 무통 분만을 비롯한 마취제 및 진통제의 투여 경로로 널리 사용되고 있다. 경막외공간에 투여된 약물은 주변 척수 및 척수 신경을 비롯한 주위 조직으로 확산하거나 전신 순환에 흡수되어 작용을 나타내며 정맥 투여와 비교하여 약 1/10의 용량으로도 동일한 중추신경계 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 따라서 경막외투여는 척수 신경과 직접적인 접촉 및 손상 없이 척수신경계에 선택적으로 고농도의 약물을 투여할 수 있는 방법이다. 현재까지 척수 손상에서의 줄기세포 치료는 직접적인 세포 대체 효과 보다는 줄기세포에서 분비하는 물질에 의한 신경 보호 및 재생효과가 더 주된 작용 기전으로 알려져 있으므로, 경막외 세포 투여는 직접적인 척수 신경과의 접촉 및 손상없이 높은 농도의 세포 분비물을 전달할 수 있는 효과적인 방법일 수 있다.
종래에는 줄기세포치료제의 척수로의 국소전달을 위한 운반체로서 지지체가 가장 널리 사용하고 있다. 지지체는 세포의 생존과 기능유지에 필수적인 세포외기질을 제공할 수 있어 세포치료제 전달 시 생존율을 높일 수 있다. 지지체는 생체 내에서 분해되는 생분해 특성을 지닌 천연고분자 혹은 합성고분자를 하이드로젤 유형과 다공성 스펀지 유형으로 제조되어 사용되고 있다. 하이드로젤은 다공성 스펀지 유형의 지지체와 비교하여 원하는 모양과 크기로의 제조가 용이하며, 고밀도로 세포를 탑재하여 전달할 수 있는 장점이 있다. 반면 물리적 강도가 취약하여 척수로의 고정하기 어려워, 줄기세포치료제와 혼합한 후 척수 내로 주입 시 가장 널리 사용되는 지지체이다. 반면 다공성 스폰지 유형의 지지체는 다양한 크기와 모양으로 가공이 어려우나 물리적 강도 조절이 용이하여 줄기세포치료제를 척수로의 이식 시 운반체로 적용되고 있다. 그러나 다공성 스펀지 유형의 지지체는 고밀도의 세포를 전달하기 어렵고, 물리적 특성 강화를 위하여 가교반응에 따른 이물반응과 염증반응을 유발하는 단점이 제시되었다.
지지체를 통한 줄기세포치료제의 전달이 갖는 문제점을 극복하기 위하여 줄기세포치료제를 세포시트 형태로 제조하여 생체 내로 국소 전달하는 기술이 보고되고 있다. 종래, 다층세포시트를 제작하기 위해서는, 먼저 단층세포시트를 제작한 후 피펫, 지지막, 특수조작기 등을 이용하여 회수한 단층세포시트를 여러 겹으로 쌓아 다층세포시트를 제조하는 방법이 제시되었다. 단층세포시트를 층을 쌓는 방법은 5층 이상 제작 시 세포시트 내부로 산소 및 영양분 공급이 제한되어 세포손상이 발생하는 문제점이 대두되었으며, 그 결과 5층 미만의 다층세포시트만 생물학적 유효성을 지니는 것으로 밝혀졌다. 단층세포시트의 중첩과정은 3층의 세포시트를 4번 5일 간격으로 층을 쌓는 방법으로 부착하여 만들 수 있지만, 총 제작시간은 20일 이상 소요되며, 세포시트 내 구성 세포의 생물학적 특성이 변화될 가능성도 있을 수 있고, 생체 내로 이식한 3층의 세포시트 내 혈관생성을 유도 후 반복적인 이식을 통해야만 다층세포시트의 치료효과를 얻을 수 있다. 즉, 현재까지 알려진 기술로 두꺼운 세포시트를 제작할 경우 많은 시간과 특수 배양용기 및 조작기가 필요하며, 각 과정 동안 섬세하게 조작하지 않을 경우 세포시트에 손상이 있을 수 있으며, 세포시트의 탈부착 및 이동 과정에서 오염기회 가능성이 단일 배양 과정 보다 많아서 안전성 문제가 제기될 수 있다.
미국공개특허 2016-0045641(2016.02.18 공개)
본 발명은 생분해성 천연고분자 하이드로젤을 3차원 지지체로 이용하여, 말초신경 유래 신경능선줄기세포를 하이드로젤 내로 함입시켜 3차원 단일 배양과정을 통하여 다층세포시트를 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명은 신경능선줄기세포가 함입된 하이드로젤, 상기 신경능선줄기세포에서 분비되어 축적된 세포외기질, 혈관성장인자, 항염증인자, 신경보호/성장인자 및 신경활성인자를 포함하는 신경능선줄기세포의 다층세포시트를 제공하는데 있다.
또한, 본 발명은 상기 신경능선줄기세포의 다층세포시트 및 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 척수 손상 치료용 조성물, 뇌 손상 치료용 조성물 또는 말초신경 손상 치료용 조성물을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 (1) 신경능선줄기세포(neural crest stem cells, NCSCs)를 분리하여 배양하는 단계; (2) 상기 배양된 신경능선줄기세포를 하이드로젤 내로 함입시키는 단계; (3) 상기 신경능선줄기세포가 함입된 하이드로젤을 물리적 지지가 유지되는 부착배양조건에서 배양하는 단계; 및 (4) 상기 (3) 단계에서 배양된 하이드로젤을 물리적 지지가 배제된 부유배양조건에서 배양하는 단계를 포함하는 신경능선줄기세포의 다층세포시트 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 신경능선줄기세포가 함입된 하이드로젤, 상기 신경능선줄기세포에서 분비되어 축적된 세포외기질, 혈관성장인자, 항염증인자, 신경보호/성장인자 및 신경활성인자를 포함하는 신경능선줄기세포의 다층세포시트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 신경능선줄기세포의 다층세포시트 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 척수 손상 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 신경능선줄기세포의 다층세포시트 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 뇌 손상 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 신경능선줄기세포의 다층세포시트 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 말초신경 손상 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 신경능선줄기세포의 다층세포시트 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 생분해성 천연고분자 하이드로젤을 3차원 지지체로 이용하여, 말초신경 유래 신경능선줄기세포를 하이드로젤 내로 함입시켜 3차원 단일 배양과정을 통하여 다층세포시트를 제조하는 방법을 제공하고자 한다. 종래의 다층세포시트 제조 시 물리적 취약성으로 인하여 시트가 손상되는 문제 및 오염 위험성을 방지하며, 다단계 배양공정을 단일 배양공정으로 제조하는 방법을 통하여 제작시간을 단축할 수 있는 신경능성줄기세포 다층세포시트를 제조할 수 있는 새로운 방법을 제공하고자 한다. 더불어 신경능선줄기세포 다층세포시트는 세포-세포 간 접합과 세포-하이드로젤 고분자 간의 결합을 통한 물리적 특성을 강화할 수 있으며, 세포배양 과정 중 신경능선줄기세포에서 생성, 분비 된 생리활성인자 및 세포외기질을 다층세포시트 내 축적시켜 다층세포시트의 생물학적 기능을 강화할 수 있다. 본 발명의 다층 세포 시트는 제조하는데 특수한 기구가 필요하지 않으며, 물리적 특성이 좋아 다루기도 쉬우며, 세포 사이에 각종 성장 및 보호 인자 와 세포외 기질이 충분히 축적되어 이식 후 세포의 생존율을 높이며, 세포에 의해 유발된 수축에 의해 두께 또한 얇아 영양분 이동 또한 용이하다. 이는 기존의 세포 시트가 가지고 있던 단점을 대부분 보완한 것으로 사료된다.
도 1은 콜라겐 하이드로젤을 이용하여 말초신경에서 PN-NCSCs를 분리하는 과정을 나타낸다.
도 2는 콜라겐 하이드로젤에 함입된 말초신경에서 시간의 경과에 따른 PN-NCSCs의 성장 및 이동을 나타낸다.
도 3은 콜라겐 하이드로젤을 선택적으로 분해하여 얻은 PN-NCSCs의 군집형성능을 BMSC 와 비교 염색한 결과이다.
도 4는 PN-NCSCs와 BMSC의 군집형성 정도를 나타낸 그래프이다.
도 5는 PN-NCSCs의 증식배가시간과 누적그래프를 나타낸다.
도 6은 PN-NCSCs의 신경능선세포 특이적 면역표현 특성을 PC12 및 BMSC와 비교한 결과이다.
도 7은 PN-NCSCs의 분화된 신경 및 신경아교세포 특이적 면역표현 특성이 없음을 PC12 및 BMSC와 비교한 결과이다.
도 8은 PN-NCSCs의 기질세포 특이적 면역표현 특성을 PC12 및 BMSC와 비교한 결과이다.
도 9는 PN-NCSCs의 혈관내피 내지 조혈계세포 특이적 면역표현 특성이 없음을 PC12 및 BMSC와 비교한 결과이다.
도 10은 PN-NCSCs의 배아 신경능선세포 특이적 mRNA 발현을 PC12 및 BMSC와 비교한 결과이다.
도 11은 PN-NCSCs의 체외 신경계 세포로의 분화능력을 확인하기 위해 세포구를 형성하여 분화유도 후 신경 및 신경아교세포의 면역표현 특성이 있음을 BMSC와 비교한 결과이다.
도 12는 PN-NCSCs의 체외 다분화 능력을 확인하기 위해 골 및 지방으로 분화유도 후 세포질 내 지방질이 축적되고 세포외부에 미네랄 침착을 보여 지방세포 및 조골세폴의 분화를 나타낸 결과이다.
도 13은 PN-NCSCs의 3차원 분포 및 배양을 위한 하이드로젤 조성을 비교한 결과이다.
도 14는 PN-NCSCs의 섬유소용해를 매개하는 uPA, tPA의 mRNA 발현율을 나타낸다.
도 15는 PN-NCSCs의 3차원 배양을 위한 하이드로젤 조성을 비교한 결과이다.
도 16은 PN-NCSCs를 함입하는 하이드로젤 조성에 따른 세포의 3차원적 분포를 비교한 결과이다.
도 17은 PN-NCSCs의 3차원 배양환경에 따른 세포의 자멸사를 비교한 결과이다.
도 18은 부착환경에서 콜라겐/피브린 하이드로젤 내 PN-NCSCs의 세포 밀도에 따른 세포간 결합을 비교한 결과이다.
도 19는 하이드로젤 내 함입되는 PN-NCSCs의 세포 수에 따라 다층세포시트 내 중첩되는 세포층을 나타낸다.
도 20은 부유배양 시간에 따른 PN-NCSCs의 다층세포시트 내 섬유소의 응축과 수분 방출을 나타내는 결과이다.
도 21은 PN-NCSCs 다층세포시트 내 세포외기질의 축적(fibronectin, laminin, collagen type IV)을 나타낸다.
도 22는 PN-NCSCs 다층세포시트 내 혈관생성인자 축적을 mRNA 발현을 통해 나타낸다.
도 23은 PN-NCSCs 다층세포시트 내 항염증인자 축적을 mRNA 발현을 통해 나타낸다.
도 24는 PN-NCSCs 다층세포시트 내 신경세포성장/보호인자 축적을 mRNA 발현을 통해 나타낸다.
도 25는 PN-NCSCs 다층세포시트 내 신경활성인자 축적을 mRNA 발현을 통해 나타낸다.
도 26은 PN-NCSCs 다층세포시트 내 신경활성인자 축적을 mRNA 발현을 통해 나타낸다.
도 27은 PN-NCSCs 다층세포시트 내 세포간 결합(beta catenin)과 세포와 세포외기질 결합(CD29)을 나타낸다.
도 28은 PN-NCSCs의 세포보호효과를 확인하기 위해 과산화수소를 처리한 SH-SY5Y 세포에 PN-NCSCs의 배양액을 농도별 처리 후 세포의 생존율을 BMSC와 비교한 결과이다.
도 29는 PN-NCSCs의 세포사멸 억제효과를 확인하기 위해 과산화수소를 처리한 SH-SY5Y 세포에 PN-NCSCs의 배양액을 농도별 처리 후 세포의 자멸사 인자인 caspase 3 및 caspase 7 억제능력을 BMSC와 비교한 결과이다.
도 30은 PN-NCSCs의 신경세포 증식 효과를 확인하기 위해 PN-NCSCs 배양액을 농도별 처리하여 SH-SY5Y 세포의 증식 정도를 DNA 농도로 나타낸 결과이다.
도 31은 PN-NCSCs의 배양액을 사용하여 분열한 SH-SY5Y 세포를 확인하기 위해 BrdU 항체를 이용한 면역염색 결과를 BMSC 와 비교하여 나타낸 결과이다.
도 32는 도 21의 결과를 그래프로 나타낸 결과이다.
도 33은 PN-NCSCs의 신경돌기 및 시냅스 형성을 촉진함을 확인하기 위해 배양액을 농도별로 처리한 SH-SY5Y 세포의 신경돌기 증가를 NGF 또는 BMSC와 비교하여 나타낸 결과이다.
도 34는 PN-NCSCs의 배양액을 처리한 SH-SY5Y 세포의 신경돌기 길이를 NGF 또는 BMSC와 비교하여 나타낸 결과이다.
도 35는 PN-NCSCs의 배양액을 처리한 SH-SY5Y 세포의 신경돌기 연결 정도를 NGF 또는 BMSC와 비교하여 나타낸 결과이다.
도 36은 PN-NCSCs의 염증억제효과를 확인하기 위해서 대식세포를 활성화한 후 PN-NCSCs 배양액을 농도별 처리하여 TNF-α의 발현이 감소됨을 BMSC와 비교한 결과이다.
도 37은 PN-NCSCs의 염증억제효과를 확인하기 위해서 대식세포를 활성화한 후 PN-NCSCs 배양액을 농도별 처리하여 IL-1β의 발현이 감소됨을 BMSC와 비교한 결과이다.
도 38은 척수손상 백서로 이식한 PN-NCSCs 다층세포시트의 이식 3일재 척수 내 잔존율을 나타낸 분자영상사진이며, PN-NCSCs 세포 수와 비례하여 척수 내 잔존하는 세포 수가 증가되는 결과를 나타낸다.
도 39는 척수손상 백서로 이식한 PN-NCSCs 다층세포시트가 척수와 부착하고 척수 내 혈관이 다층세포시트 내로 성장하여 생착되는 결과를 나타낸 결과이다.
도 40은 척수손상 백서의 척수로 이식한 PN-NCSCs 다층세포시트의 3일, 7일, 14일, 28일까지 생존하는 결과를 나타낸 결과이다.
도 41은 손상척수 경막 위에 이식한 PN-NCSCs 다층세포시트의 섬유아세포 및 혈관내피세포로의 분화특성을 나타낸다.
도 42는 PN-NCSCs 다층세포시트를 이식한 척수손상 백서의 운동기능 회복을 나타낸다.
도 43은 PN-NCSCs 다층세포시트를 이식한 척수손상 백서의 감각기능 회복을 나타낸다.
도 44는 PN-NCSCs 다층세포시트를 이식한 척수손상 백서의 전기생리 기능 회복을 나타낸다.
도 45는 척수손상 백서의 척수 외막으로 이식한 PN-NCSCs 다층세포시트의 이식 2주째 손상된 척수를 재생하는 능력을 나타낸다.
도 46은 척수손상 백서의 척수 외막으로 이식한 PN-NCSCs 다층세포시트의 4주째 손상된 척수를 재생하는 능력을 나타내는 결과이다.
도 47은 척수손상 백서의 척수 외막으로 이식한 PN-NCSCs 다층세포시트의 이식 2주째 Bodian's silver 염색을 통한 형태계측 방법을 통하여 축삭 재생 작용을 나타내는 결과이다.
도 48은 척수손상 백서의 척수 외막으로 이식한 PN-NCSCs 다층세포시트의 이식 4주째 손상된 척수 내의 신경추적(anterograde neural tracing)을 통하여 신경회로 복구 정도를 나타낸다.
도 49는 척수손상 백서의 척수 외막으로 이식한 PN-NCSCs 다층세포시트의 이식 4주째 이식한 손상된 척수 내의 신경추적(anterograde neural tracing)을 통하여 손상부위에서 축삭이 차지하는 밀도를 백분율로 나타낸다.
도 50은 척수손상 백서의 척수 외막으로 이식한 PN-NCSCs 다층세포시트의 TNF-α 및 IL-1β의 발현양 감소를 통하여 척수 내 염증 억제효과를 나타낸다.
도 51은 척수손상 백서의 척수 외막으로 이식한 PN-NCSCs 다층세포시트의 손상 받기 전 척수와 비교하여 손상 후 척수 내 신경활성 mRNA 발현이 증가되는 것을 나타낸다.
이에, 본 발명자들은 현재까지 알려진 방법으로 두꺼운 다층세포시트 제작 시 요구되는 시간과 복잡한 과정을 개선하고, 오염 등 여러 위험성을 방지하고자 하였다. 생분해성 천연고분자 하이드로젤을 3차원 지지체로 이용하여, 말초신경 유래 신경능선줄기세포를 하이드로젤 내로 함입시켜 3차원 단일 배양과정을 통하여 다층세포시트를 제조하는 방법을 제공하고자 한다. 종래의 다층세포시트 제조 시 물리적 취약성으로 인하여 시트가 손상되는 문제 및 오염 위험성을 방지하며, 다단계 배양공정을 단일 배양공정으로 제조하는 방법을 통하여 제작시간을 단축할 수 있는 신경능성줄기세포 다층세포시트를 제조할 수 있는 새로운 방법을 제공하고자 한다. 더불어 신경능선줄기세포 다층세포시트는 세포-세포 간 접합과 세포-하이드로젤 고분자 간의 결합을 통한 물리적 특성을 강화할 수 있으며, 세포배양 과정 중 신경능선줄기세포에서 생성, 분비된 생리활성인자 및 세포외기질을 다층세포시트 내 축적시켜 다층세포시트의 생물학적 기능을 강화할 수 있다. 척수 경막외로의 전달을 통하여 줄기세포치료제의 전달율, 잔존율, 그리고 생착율 증대를 통하여 척수재생 및 척수보호를 증진시킬 수 있는 방법을 제공함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 (1) 신경능선줄기세포(neural crest stem cells, NCSCs)를 분리하여 배양하는 단계; (2) 상기 배양된 신경능선줄기세포를 하이드로젤 내로 함입시키는 단계; (3) 상기 신경능선줄기세포가 함입된 하이드로젤을 물리적 지지가 유지되는 부착배양조건에서 배양하는 단계; 및 (4) 상기 (3) 단계에서 배양된 하이드로젤을 물리적 지지가 배제된 부유배양조건에서 배양하는 단계를 포함하는 신경능선줄기세포의 다층세포시트 제조방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 신경능선줄기세포는 말초신경(peripheral nerve, PN)으로부터 분리된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 (2) 단계는 배양된 신경능선줄기세포를 용액 상태의 하이드로젤에 혼합한 후, 젤 상태로 전환시켜 신경능선줄기세포를 하이드로젤 내에 3차원적으로 균일하게 분포시킬 수 있다. 바람직하게는 30초에서 10분 내로 용액 상태에서 젤 상태로 하이드로젤의 상전환을 조절할 수 있다.
바람직하게는, 상기 하이드로젤은 천연 혹은 합성 고분자로 제조할 수 있으며, fibrin, collagen, gelatin, chitosan, PLLA, PEG, peptide 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 3차원 하이드로젤 내 고분자 함량은 0.1% ~ 5%로 구성되나, 바람직하게는 0.5% 미만의 고분자로 구성될 수 있다.
보다 바람직하게는, 상기 하이드로젤은 콜라겐 및 피브리노겐 혼합 하이드로젤일 수 있으며, 상기 콜라겐 및 피브리노겐 혼합 하이드로젤은 최종 농도 0.1% 내지 1%의 콜라겐 및 최종 농도 0.1% 내지 1%의 피브리노겐을 함유할 수 있다.
한편, 본 발명에 있어서 상기 하이드로젤은 탄성계수(elastic modulus)가 낮은 콜라겐(collagen)과 탄성계수가 높은 피브린(fibrin)을 혼합한 하이드로젤을 사용하여 부착환경 배양 시 세포-매개 수축현상에 의하여 하이드로젤이 배양용기(mold)로부터 탈락되는 현상을 방지하였다.
바람직하게는, 상기 (2) 단계의 배양된 신경능선줄기세포는 트롬빈 및 콜라겐 혼합용액에 첨가된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 (2) 단계의 배양된 신경능선줄기세포는 1 × 106/ml 내지 1 × 108/ml의 밀도일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
보다 바람직하게는, 본 발명에 따른 신경능선줄기세포의 다층세포시트 내 세포 세포층을 조절하기 위하여 용액 상의 하이드로젤 내 1 × 106/ml 내지 1 × 108/ml 밀도의 세포를 혼합하여 특정한 모양의 틀(mold/몰드)에 100 μl/mm2 내지 500 μl/mm2 용량을 전달한 후 37℃에서 2시간 동안 중합/가교과정을 거쳐 젤(gel)로 상전이 시켜 3차원적으로 균일하게 세포가 분포하도록 하며, 바람직하게는 2.5 × 106/ml 내지 1 × 107/ml 세포 밀도로 150 μl/mm2 내지 250 μl/mm2 용량을 전달하여 신경능선줄기세포의 다층세포시트를 제조할 수 있다. 세포밀도 및 용량의 조절을 통하여 10층 내지 50층으로 구성된 다층세포시트를 제조할 수 있다.
바람직하게는, 상기 (3) 단계의 물리적 지지가 유지되는 부착배양조건은 신경능선줄기세포가 함입된 하이드로젤을 원형, 직사각형, 혹은 정사각형 형태의 몰드 내로 캐스팅(casting)하여 물리적으로 지지되는 조건에서 배양할 수 있다.
바람직하게는, 상기 (3) 단계의 부착배양조건은 세포-세포 간 접합과 세포-하이드로젤 고분자 간 접합을 유도할 수 있다. 상기 부착배양조건에서 1일 내지 5일간 배양을 통하여 하이드로젤 내 함입된 세포가 하이드로젤 섬유상 체인(fibrillary chain)에 부착하고, 세포질의 확장, 이동 및 세포간 접합을 유도하여 물리적 특성을 강화하는 방법이다.
바람직하게는, 상기 (3) 단계의 부착배양조건에서의 배양은 신경능선줄기세포에서 생성되어 분비되는 세포외기질 (extracellular matrix, ECM), 혈관성장인자, 항염증인자, 신경보호/성장인자 및 신경활성인자를 하이드로젤 내로 축적할 수 있다.
보다 바람직하게는, 상기 세포외기질은 피브로넥틴(fibronectin), 라미닌(laminin) 및 콜라겐 타입 IV(collagen type IV)로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
보다 바람직하게는, 상기 혈관성장인자는 안지오포이에틴(angiopoietin; ANGPT)-1, 안지오포이에틴-2, 안지오포이에틴-3 및 안지오포이에틴-4로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 안지오포이에틴 계열, 혈관내피세포 성장인자(vascular endothelial growth factor; VEGF) 또는 혈소판-유래 성장인자(platelet-derived growth factor; PDGF)로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
보다 바람직하게는, 상기 항염증인자는 인터루킨(interleukin; IL)-6, IL-10 또는 형질전환 성장인자(transforming growth factor-β; TGF-β)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
보다 바람직하게는, 상기 신경활성인자는 신경 성장 인자(nerve growth factor; NGF), 뇌-유래 성장인자(brain-derived growth factor; BDNF), 뉴트로핀-3(neurotrophin-3; NT-3) 및 NT-4/5로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 뉴트로핀 계열; 신경교세포주-유래 신경영양인자(glial cell line-derived neurotrophic factor; GDNF) 또는 아테민(artemin; ARTN)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 GDNF 계열; 에프린(ephrin; EFN) A1, 에프린 A2, 에프린 A4, 에프린 A5, 에프린 B1, 에프린 B2 및 에프린 B3로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 에프린 계열; 섬모 신경 영양 인자(ciliary neurotrophic factor; CNTF), 백혈병 억제 인자(leukemia inhibitory factor; LIF) 및 IL-6으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 CNTF 계열; 아교세포 성숙인자(glial maturation factor; GMF); 뉴레귤린(neuregulin; NRG) 또는 인슐린-유사 성장인자(insulin-like growth factor; IGF)-1일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
보다 바람직하게는, 상기 신경보호/성장인자는 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor; FGF)-7, FGF-9, FGF-16, FGF-19, FGF-12, FGF-5, FGF-6 및 FGF-14로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 FGF 계열일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 (4) 단계의 부유배양조건은 세포-매개 하이드로젤 수축을 유도하여, 하이드로젤 내 수분을 방출시킬 수 있다.
바람직하게는, 상기 신경능선줄기세포의 다층세포시트는 10층 내지 50층으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 신경능선줄기세포가 함입된 하이드로젤, 상기 신경능선줄기세포에서 분비되어 축적된 세포외기질, 혈관성장인자, 항염증인자, 신경보호/성장인자 및 신경활성인자를 포함하는 신경능선줄기세포의 다층세포시트를 제공한다.
바람직하게는, 상기 하이드로젤은 콜라겐 및 피브리노겐 혼합 하이드로젤일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 상기 신경능선줄기세포의 다층세포시트 내 하이드로젤은 생체 내 염증반응 및 이물반응을 유발하지 않으며, 생체 내 3일 내지 3주 이내에 완전히 분해되는 생분해 특성을 지닌다.
바람직하게는, 상기 신경능선줄기세포는 1 × 106/ml 내지 1 × 108/ml의 밀도일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 신경능선줄기세포의 다층세포시트는 10층 내지 50층으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 신경능선줄기세포의 다층세포시트는 세포막이 온전히 유지된 상태이며, 하이드로젤 고분자 및 세포외기질 지지를 통하여 안정적 구조적 특성을 지녀, 손상 부위의 과도한 산화 자유 라디칼 매개 손상과 염증반응 매개체로부터 이식한 신경능선줄기세포의 생존율을 증가시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 신경능선줄기세포의 다층세포시트 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 척수 손상 치료용 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 조성물은 손상된 신경 내 축색(axon) 및 수초(myelin) 생성을 증진시킬 수 있고, 손상된 신경 내 염증반응을 억제시키며, 손상된 신경 내 혈관생성을 증진시킬 수 있다.
특히, 본 발명의 신경능선줄기세포의 다층세포시트는 신경능선줄기세포에서 분비되는 염증억제인자, 신경활성/재생인자, 신생혈관유도인자를 통하여 척수조직재생을 유도하는 작용기전을 통하여 손상된 척수재생과 기능을 회복시키는 세포치료법을 제공한다.
한편, 본 발명의 신경능선줄기세포의 다층세포시트는 전신적으로 투여하는 경로가 아니라 손상 척수부위로 직접 국소 이식하여 척수 내 전달효율을 증진시킬 수 있으며, 척수 내로 주입 시 주입과정에서 동반되는 이차적 척수손상을 방지하기 위하여, 손상된 척수를 싸고 있는 경질(dura 혹은 dura matter) 내 혹은 외로 국소 전달하여 이식 시 이차적 척수손상을 방지할 수 있다.
또한, 본 발명의 신경능선줄기세포의 다층세포시트를 척수로 국소 전달 시 세포의 이식 부위 정체률(retention ate)과 생착률(engraftment rate)을 높일 수 있으며, 국소 전달된 신경능선줄기세포의 다층세포시트는 척수 주변조직 및 혈관과 융합하여 4주 이상 생존하여 지속적으로 항염증인자, 신경재생/활성인자, 신생혈관인자를 분비하여 손상된 척수재생과 기능회복을 증진할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 신경능선줄기세포의 다층세포시트 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 뇌 손상 치료용 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 조성물은 신경세포 손상을 억제하고, 신경세포 성장 및 분화를 촉진할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 신경능선줄기세포의 다층세포시트 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 말초신경 손상 치료용 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
< 실시예 1> 성인 말초신경으로부터 PN - NCSCs 분리 및 배양
인제대학교 의과대학 윤리위원회 승인 후 성인 말초신경(peripheral nerve, PN)로부터 신경능선줄기세포(Peripheral Nerve-derived Neural Crest Stem Cell, NCSCs)를 분리하고자 하였다. PN-NCSCs 분리는 KR 10-1389851에 제시된 방법을 이용하였다. 뇌사자로부터 공여받은 말초신경은 주변 연부조직과 신경외막을 제거한 후 1 mm3 크기의 절편으로 절단한 후 Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 용액으로 5번 세척하였다. 말초신경은 콜라겐 용액(0.5 % porcine skin derived collagen, Matrixen™-PSC, 바이오랜드, 대전, 대한민국)을 reconstitution buffer (50 mM NaHCO3, 40 mM HEPES, 0.01 N NaOH in DW)와 혼합하여 0.2% 콜라겐 용액을 제조하였다. 0.2% 콜라겐 용액과 말초신경 절편을 혼합한 후 혼합액 10 mL을 100-mm 배양용기로 옮긴 후 겔이 형성되도록 37℃ 인큐베이터에서 2시간 동안 반응하였다. 콜라겐 하이드로젤이 형성된 후 10 ml 세포배양액을 첨가하였다. 세포배양액은 90% DMEM (웰진, 경산시, 대한민국), 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS; Gibco, 서울, 대한민국), 10 ng/ml epidermal growth factor (EGF, Peprotech, 서울, 대한민국), 2 ng/ml basic fibroblast growth factor (bFGF, Peprotech, 서울, 대한민국), 10 ng/ml insulin-like growth factor (IGF, Peprotech, 서울, 대한민국), 10 μg/ml 젠타마이신(gentamicin, Invitrogen) 조성으로 제조하였다. 이후 배양접시는 오비탈 쉐이커(orbital shaker) 위에서 30 rpm 속도로 교반 하면서 2주간 배양하였다. 신선한 세포배양액은 2일마다 교체하였다. 말초신경 절편에서 콜라겐 하이드로젤 내로 이동 성장한 PN-NCSCs는 collagenase type I (Worthington Biochemical, Lakewood, 미국)을 사용하여 콜라겐 하이드로젤을 분해한 후 유리되는 세포를 회수하였다. 회수된 PN-NCSCs는 통상적인 단층배양법으로 증폭 배양하였다. 세포가 80% 이상의 밀집도 상태에서 0.05% 트립신/EDTA (시그마알드리치, 서울, 대한민국)를 사용하여 세포를 배양용기로부터 떼어낸 후 계대 배양하였다.
도 1과 같이, 콜라겐은 pH를 중성으로 만든 후 37℃에서 2시간 반응 후 고형성 콜라겐 하이드로젤이 형성되었고, 그 결과 말초신경 조직을 하이드로젤 내에 3차원적으로 함입시켰다.
도 2에 나타난 바와 같이, 콜라겐 하이드로젤 지지 3차원 장기 배양법을 통하여 말초신경으로부터 세포의 이동, 성장을 유도할 수 있으며 3차원적으로 함입한 이후 24시간 이내에 세포의 이동을 관찰하였다. 배양 1주 후, 하이드로젤 내로 말초신경조직으로부터 이동, 성장한 세포가 증가하였고, 배양기간이 증가됨에 따라 말초신경으로부터 이동, 성장하는 세포 수가 비례하여 증가하였다. 말초신경으로부터 이동 성장한 세포가 함유된 콜라겐 하이드로젤은 DMEM:F12 배지 내에 용해된 0.01% collagenase type I (Worthington Biochemical, Lakewood, 미국)을 사용하여 콜라겐 하이드로젤을 분해한 후 유리되는 세포를 회수하였다. 회수된 PN-NCSCs는 통상적인 단층배양환경에서 증폭 배양하였다. 세포가 80% 이상의 밀집도 상태에서 0.05% 트립신/EDTA (시그마알드리치, 서울, 대한민국)를 사용하여 세포를 배양용기로부터 때어낸 후 배양하였다. 2주간 장기 배양 후 하이드로젤 내로 이동, 성장한 세포는 콜라겐 분해 효소인 0.01% collagenase를 사용하여 하이드로젤로부터 회수하였고, 하이드로젤로부터 해리된 세포 95% 이상 생존을 나타내었다. 단층배양환경에서 PN-NCSCs은 전형적인 방추상 모양으로 성장하였다.
< 실시예 2> 성인 말초신경 유래 PN - NCSCs의 성장특성, 면역표현형, mRNA 발현특성
PN-NCSCs의 체외 성장능력은 colony 형성도(colony forming unit-fibroblasts, CFU-Fs)와 세포배가시간(population doubling time, PDTs)로 평가하였다. 분리한 PN-NCSCs의 면역표현적 특성은 면역형광염색을 시행한 후 공초점 레이저스캔현미경으로 분석하였다. 면역표현특성을 평가하기 위하여 사용한 항체는 신경능선세포 표지자인 p75NTR, nestin, sox-10, myelin protein 0 (P0), 신경세포 표지자인 neuronal class III β-Tubulin (Tuj1), 신경교세포 표지자인 glial fibrillary acidic protein (GFAP), 핍지세포 표지자인 A2B5, oligodendrocyte transcription factor (Olig2), myelin basic protein (MBP), 중간엽줄기세포 표지자인 CD105 및 CD29, 조혈모세포 표지자인 CD45, 혈관내피세포자인 CD34를 이용하여 면역표현 특성을 평가하였다.
1) PN - NCSCs의 자기복제(self-renewal) 능력
PN-NCSCs의 자기복제 능력은 콜로니 형성 유닛-섬유아세포(colony forming unit-fibroblasts, CFU-Fs)와 군집배가시간(population doubling time, PDTs)으로 평가하였다. PN-NCSCs의 CFU-F의 형성능력을 평가하고자 단층배양법에 의해 증폭된 세포를 5 cells/cm2 밀도의 100-mm 배양 접시에 파종한 후 성장배양액을 첨가하였다. 배양 7일째, 2% 포르말린으로 10분간 세포를 고정한 후 0.1% crystal violet (LabChem Inc., Pittsburgh, PA)으로 염색하여 관찰하였다. 형성된 CFU-F 형성능력은 영상분석 프로그램(Image J, NIH, Bethesda, MD)을 이용하여 2 mm 크기 이상의 콜로니 수를 측정하였으며, 파종세포 수 당 콜로니 수를 산정하여 백분율(%)로 표기하였다. 골수 유래 중간엽줄기세포(bone marrow-derived mesenchymal stem cells; BMSCs)를 대조군으로 사용하였다.
도 3에 나타난 바와 같이, PN-NCSCs는 단층배양환경에서 다수의 콜로니를 형성하였고, 콜로니는 방추상 모양의 세포가 고밀도로 군집되어 구성하였다. 이는 PN-NCSCs이 자기복제능력을 보유하는 것을 확인할 수 있었다. 반면 대조군인 BMSC의 경우 콜로니 형성이 낮았으며, 또한 콜로니를 구성하는 방추상 모양의 세포는 저밀도로 군집하여 있었다. 도 4에 나타난 바와 같이, 대조군으로 사용한 BMSC에서 파종한 세포의 5% 미만에서 콜로니를 형성하였으나, PN-NCSCs의 경우 파종한 세포의 30% 이상에서 콜로니를 형성하였고, 계대배양 33회 이상에서도 콜로니 형성능력이 유지되는 것은 체외에서 높은 성장능력을 지닌 것임을 확인할 수 있었다.
2) PN - NCSCs의 체외성장 능력
단층배양환경에서 세포배가시간(population doubling time, PDT)를 산정하여 PN-NCSCs의 체외성장 능력을 평가하였다. 1000개의 세포들을 48-멀티웰(multi-well) 배양용기에 파종하여 3일간 배양하였다. CelLyticTM MT lysis reagent (Sigma-Aldrich, Seoul, Korea)을 이용하여 세포를 용해하였고, 용해된 DNA 함량을 Quant-iT™ PicoGreen reagent (Molecular probes, Eugene, OR)을 이용하여 측정하였다. 형광 마이크로 플레이트 리더기(fluorescent microplate reader, SynergyTM HT; Bio-Tek Instruments, Neufahrn, Germany)를 사용하여 발광(emission) 485 nm, 여기(excitation) 540 nm 파장에서 형광강도를 측정하였다. 측정된 형광강도를 세포수로 전환하기 위해 말초신경조직으로부터 분리한 세포를 이용하여 표준곡선을 구하였고, 이 표준곡선을 이용하여 샘플 내 형광강도를 세포수로 변환하였다. PDT는 다음 공식에 따라 산정하였다. PDT=[(days in exponential phase)/((logN2-logN1)/log2)] 이때, N1은 지수성장기의 초기의 세포 수이며, N2는 지수성장기의 말기에서의 세포 수이다.
도 5에 나타난 바와 같이, 단층배양환경에서 PN-NCSCs는 43회 이상 계대배양이 가능하였다. 계대배양 43회까지 PN-NCSCs의 PDT는 평균 13.5~15.8 시간 이내로 뛰어난 체외 세포성장 능력을 보였다. 또한 계대배양이 길어짐에 따라서 PDT는 다소 증가하였지만, 계대배양 43번째까지 세포의 노화는 나타내지 않았다. 이는 말초신경조직으로부터 분리한 세포는 자기복제능력과 성장능력이 뛰어남을 확인하였다.
3) PN - NCSCs의 면역표현 특성
PN-NCSCs의 면역표현형 특성을 분석하기 위하여 면역형광염색을 시행하였다. 단층배양환경에서 증폭 배양한 3×104 세포를 4-멀티웰 챔버 슬라이드(Lab-Tek™ II Chamber Slide™ System, Thermo Fisher Scientific, Seoul, Korea)에 파종하여 1일간 배양하였다. 이후, acetone/methanol 1:1 혼합액으로 세로를 고정하였다. 비특이적인 반응을 억제하기 위하여 5% 우혈청알부민(bovine serum albumin, BSA; Fraction V, IgG-free, Thermo Fisher Scientific)을 이용하여 상온에서 30분간 반응하였다. 면역표현 특성을 평가하기 위하여 사용한 일차항체는 신경능선세포 표지자로 p75NTR, nestin, sox-10, 신경세포 표지자인 neuronal class III β-tubulin (Tuj1), 성상세포 표지자로 glial fibrillary acidic protein (GFAP), 핍지세포 표지자로 A2B5, oligodendrocyte transcription factor (Olig2), myelin basic protein (MBP), 슈반세포 (Schwann cell) 표지자로 myelin protein 0 (P0), 간질세포(stromal cell) 표지자로 CD105 및 CD29, 조혈모세포 표지자로 CD45, 혈관내피세포 표지자로 CD34를 항체를 이용하였다. 이후 해당 일차항체 isotype-matched Alexa Fluor 488-conjugated IgG를 상온에서 45분간 반응하여 시그널을 검출하였다. 10 μg/ml DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole, Invitrogen) 용액으로 핵을 염색한 후 공초점 현미경으로 분석하였다. BMSC 및 신경능선 유래 종양세포주인 PC12를 대조군으로 사용하였다.
도 6에 나타난 바와 같이, 단층배양법에 의해 체외에서 증폭시킨 PN-NCSCs는 신경능선세포 표지자인 p75NTR (95.6% ± 2.67%), Sox-10 (88.2% ± 3.6%), nestin (95.7% ± 2.7%)의 발현율을 나타내었다. 신경능선 유래 종양세포주인 PC12는 p75NTR (90.3% ± 5.2%), Sox-10 (81.2% ± 5.5%), nestin (92.6% ± 1.1%)의 발현율을 나타내었다. 반면 BMSCs의 경우 p75NTR는 41.7% ± 3.0% 발현되었지만, Sox-10에서 2.2% ± 1.4%, nestin은 1.1% ± 1.1%으로 낮은 발현율을 나타내었다. 이상의 결과는 3차원 장기배양법을 통하여 말초신경조직으로부터 분리한 세포가 신경능선 기원 세포와 동일한 면역표현 특성을 지닌 것을 확인할 수 있다.
도 7에 나타난 바와 같이, 말초신경 유래 PN-NCSCs의 신경세포 및 신경교세포 표지자의 발현율을 분석하였다. 신경능선 유래 종양세포인 PC12는 신경세포 표지자인 Tuj1는 2.9% ± 0.9%, 성상세포 표지자인 GFAP는 32.5% ± 3.2%, 핍지세포 표지자인 A2B5는 69.9% ± 6.7%, MBP는 23.1% ± 1.1%로 발현율은 비록 낮지만 배양 과정 중 신경세포 및 신경교세포로 분화한 세포가 혼재되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 반면 PN-NCSCs 및 BMSC의 경우 신경세포, 성상세포, 핍지세포, 슈반세포 표지자 모두 1% 미만으로 검출되어, 신경세포 및 신경교세포 면역표현형을 지닌 세포는 검출되지 않았다. 이상의 결과는 말초신경 유래 PN-NCSCs은 성숙한 신경능선 세포가 아니라 미분화 상태의 신경능선 유래 줄기세포와 동일한 면역표현 특성을 지닌 것을 확인할 수 있었다.
도 8에 나타난 바와 같이, 기질세포의 표지자로 알려진 CD29와 CD105는 PC12, PN-NCSCs, BMSCs 모두에서 95% 이상 발현되었다. BMSCs와 동일하게 PC12와 PN-NCSCs은 기질-의존(substrate-dependent) 특성을 지닌 세포임을 확인할 수 있었다.
도 9에 나타난 바와 같이, 혈관내피세포 표지자인 CD34, 조혈계세포 표지자인 CD45를 이용하여 말초신경 유래 PN-NCSCs 분리 배양과정 중 조혈계 세포 및 혈관세포로부터 유래한 세포의 오염 여부를 확인하고자 하였다. PC12, NCSCs, BMSCs 모두 CD34 및 CD45의 발현율은 1% 미만으로 발현되어, 조혈계 세포 및 혈관계 세포로부터의 오염이 없다는 것을 확인할 수 있었다. 이상의 결과는 3차원 장기배양방법을 통하여 말초신경조직으로부터 이동, 성장한 세포는 혈관내피세포 및 조혈계 세포로의 오염이 없는 순도가 높은 PN-NCSCs임을 반영하는 결과이다.
4) 신경 유래 PN - NCSCs의 mRNA 발현특성
실시예 1과 같이, 말초신경으로부터 세포를 분리한 후, 2차원 단층배양법에 의해 세포를 증폭 배양하였다. 신경세포 특이 mRNA 발현 여부를 확인하기 위하여, TRI-reagent® (Thermo Scientific)을 이용하여 RNA를 분리하였다. 신경능선 특이 유전자인 Sox-2, Sox-10, Fgf5 mRNA 발현을 평가하기 위하여 reverse-transcriptase quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) 후 전기영동 분석을 통하여 판정하였다. PC12와 BMSCs를 대조군으로 사용하였다.
도 10에 나타난 바와 같이, 3차원 장기배양법을 통하여 말초신경조직으로부터 이동, 성장해 온 PN-NCSCs는 PC12와 함께 신경능선세포와 관련된 mRNA인 Sox-2, Sox-10, Dlx2, Tcfap2a, Erbb3, Fgf5 mRNA가 발현되었다. 반면에 대조군으로 사용한 BMSCs에서는 신경능선세포 표지자 및 외배엽세포 표지자는 음성으로 발현이 되지 않았다. 이는 말초신경조직을 이용한 3차원 장기배양방법을 통하여 이동, 성장 해온 세포는 신경능선 유래 세포임을 확인할 수 있었다.
< 실시예 3> 성인 말초신경 유래 PN - NCSCs의 신경능선 계열 세포로의 다분화능력
1) 신경세포 및 신경교세포로의 분화능력
20만개의 PN-NCSCs를 세포부착을 억제하는 24-멀티웰 세포배양용기(Ultra-Low attachment plates, Sigma-Aldrich)에 파종하여 부유배양(suspension culture) 환경에서 배양하였다. 부유배양 환경에서 PN-NCSCs는 배양용기와의 부착이 방지되었고, 반면 세포-세포 간 접합이 유도되어 미세구(microsphere) 형성을 유도하였다. 신경세포 및 신경교세포로 분화를 유도하기 위하여 99% Dulbecco's Minimum Essential Medium (DMEM), 1% 송아지 혈청(calf serum; Gibco), 0.1 μM 덱사메타손(Sigma-Aldrich), 50 μg/ml 아스코르브산(Sigma-Aldrich), 0.1% dimethyl sulfoxide (DMSO; Sigma-Aldrich) 조성의 분화배지를 첨가한 후 5일간 배양하였다. 부유배양환경에서 5일간 배양 후 미세구를 회수하여 4% 중성 포르말린으로 고정한 후 파라핀 블록을 제조하였다. 파라핀 블록은 5 μm 두께로 파라핀 절편을 취득한 후 면역형광염색을 실시하였다. 세포특이 표지자 발현 여부로 미세구 내 PN-NCSCs의 신경세포 및 신경교세포 분화여부를 평가하였다. 세포-특이 표지자 발현 여부를 평가하기 위하여 사용한 항체는 신경세포 표지자인 neuronal class III β-Tubulin (Tuj1), neurofilament-200 (NF200), 성상세포 표지자인 glial fibrillary acidic protein (GFAP), 핍지세포 표지자인 A2B5, oligodendrocyte transcription factor (Olig2), myelin basic protein (MBP), Schwann 세포 표지자인 P0를 사용하였다.
도 11에 나타난 바와 같이, 말초신경으로부터 분리한 PN-NCSCs 세포의 신경세포 및 신경교세포로의 분화능력을 확인하고자 하였다. 부유배양환경에서 형성된 미세구 내 PN-NCSCs는 신경세포 표지자인 Tuj1, NF200, 성상세포 표지자인 GFAP, 핍지세포 표지자인 A2B5, Olig2, MBP, Schwann 세포 표지자인 P0, 섬유아세포 표지자인 SMA는 모두 양성으로 발현되어 신경능선 유래 줄기세포와 같이 신경세포 및 신경교세포로의 분화능력을 가진 것으로 확인하였다. 반면 대조군으로 사용한 BMSC에서는 해당 표지자가 모두 음성으로 신경능선 세포로의 분화능력을 확인할 수 없었다.
2) PN - NCSCs의 지방세포 및 조골세포로의 분화능력
PN-NCSCs의 지방으로의 분화능력을 평가하기 위해서 20만개의 세포를 24-멀티웰 세포배양용기에 파종한 뒤 90% DMEM에 10% 송아지혈청, 0.5 mM 3-이소부틸-1-메틸잔틴 (Sigma-Aldrich), 1 μM 덱사메타손, 0.2 unit/ml 인슐린(Sigma-Aldrich), 200 μM 인도메타신(Sigma-Aldrich)으로 구성된 분화배지를 첨가한 후 2주간 배양하였다. 지방세포로의 분화는 세포질 내 지방축적 여부로 평가하였으며, 이를 위하여 0.5% Oil Red O (Sigma-Aldrich) 염색을 이용하여 분석하였다. PN-NCSCs의 조골세포로의 분화능력을 평가하기 위해서 20만개의 세포를 24-멀티웰 세포배양용기에 파종한 후 90% alpha-minimum essential medium (α-MEM; Welgene)에 10% 송아지혈청, 0.1 μM 덱사메타손, 10 mM β-글리세롤 인산(Sigma-Aldrich), 50 μM 아스코르브산 조성의 분화배지를 첨가한 후 2주간 배양하였다. 조골세포로의 분화는 미네랄의 침착여부로 평가하였으며, 이를 위하여 alizarin red S (Sigma-Aldrich)염색을 시행하였다.
도 12에 나타난 바와 같이, 말초신경조직으로부터 분리한 PN-NCSCs의 중간엽계 세포로의 분화능력을 평가하고자 지방세포 및 조골세포로의 분화를 유도하였다. 배양 2주 후, 지방세포로 분화를 유도한 PN-NCSCs에서 세포질 내로 지방질의 축적을 관찰할 수 있으며, oil red O 염색을 통하여 확인할 수 있었다. 또한 조골세포로 분화가 유도된 PN-NCSCs에서는 세포의 형태가 입방상피 모양을 나타내었으며, 알리자린 레드(alizarin red S) 염색을 통하여 무기질 침착을 확인할 수 있었다. 이는 말초신경조직을 이용한 3차원 장기배양법을 통하여 이동, 성장한 세포는 신경능선 계열과 중간엽 계열 세포로의 다분화 능력을 보유한 것으로 확인할 수 있었다.
< 실시예 4> PN - NCSCs 3차원 분포 및 배양을 위한 하이드로젤 조성
1) PN - NCSCs의 3차원 배양을 위한 피브린 하이드로젤 조성
인간혈장 유래 피브리노겐(녹십자, 서울, 대한민국)은 10 mM CaCl2가 포함된 DMEM 배지에 녹여 최종 0.5%의 농도에 피브리노겐 용액을 제조하였다. 트롬빈(Sigma, St.Louis, MI)은 DMEM에 녹여 최종 0.25 unit/ml 농도의 트롬빈 용액을 제조하였다. 십만 개 혹은 백만 개 PN-NCSCs을 1 ml에 트롬빈 용액과 혼합하여 PN-NCSCs가 분산된 트롬빈 용액을 제조하였다. 이후 피브리노겐 용액과 PN-NCSCs가 포함된 트롬빈 용액을 1:1 비율로 혼합하여 100 μl를 24-멀티웰 플레이트에 옮긴 후 37℃ 인큐베이터에 넣어서 2시간 동안의 가교반응을 거쳤다. 이후 DMEM에 1% 혹은 10% 송아지 혈청(calf serum, CS)과 10 μg/ml 젠타마이신이 첨가된 배양액을 첨가하였다. 배양접시는 15 rpm 속도의 오비탈 쉐이커(orbital shaker)에서 1일간 배양하였다. PN-NCSCs의 섬유소 용해 활성도와 이를 억제하는 PAI 역할을 평가하기 위하여 항섬유소용해제(plasminogen activator inhibitor, PAI)인 100 μg/ml 트란제믹산(tranexamic acid)을 사용하였다. 섬유소용해제 억제제인 PAI를 넣지 않은 피브린 하이드로젤은 대조군으로 사용하였다.
도 13에 나타난 바와 같이, PAI가 포함되지 않은 피브린 하이드로젤은 PN-NCSCs의 섬유소용해 작용에 의하여 배양 1일째부터 하이드로젤이 완전히 용해되어 PN-NCSCs가 부착하고 성장할 수 있는 3차원적 기질을 제공하지 못하였다. 피브린 하이드로젤 용해는 하이드로젤 내 함입된 세포 수와 혈청농도와 비례하였다. 십만 개의 PN-NCSCs가 함유된 피브린 하이드로젤의 경우 혈청농도와 무관하게 배양 1일째는 용해되지 않고 3차원 기질을 제공하였으나, 배양 2일째부터 하이드로젤은 용해되기 시작하였으며, 배양액 내 10% 혈청을 함유한 경우 90% 이상의 하이드로젤이 용해되었으며, 배양액 내 1% 혈청을 함유한 경우에도 60% 이상의 하이드로젤이 용해되어 PN-NCSCs은 배양용기 바닥에 부착하여 2차원적으로 성장하였다. 반면 백만 개의 PN-NCSCs가 함유된 피브린 하이드로젤의 경우는 혈청농도와 무관하게 배양 1일째 하이드로젤이 용해되어 세포는 배양용기 바닥에 부착하여 2차원적으로 성장하였다. 반면 100 μg/ml 트란제믹산(tranexamic acid)을 배양액 및 하이드로젤 내로 첨가하여 PN-NCSCs의 섬유소용해 활성을 억제하였을 때 십만 개 세포가 함입된 피브린 하이드로젤은 혈청농도와 상관없이 세포-매개 섬유소용해 작용을 억제할 수 있었으며, 그 결과 피브린 하이드로젤의 3차원 기질로서의 기능은 유지될 수 있었다. 반면 백만 개의 PN-NCSCs이 함유된 피브린 하이드로젤은 혈청농도와 상관없이 트란제믹산(tranexamic acid)을 통한 세포-매개 섬유소용해 작용을 억제할 수 없었다.
도 14에 제시한 바와 같이, PN-NCSCs는 BMSC 및 섬유아세포와 비교하여 섬유소용해를 매개하는 urokinase type plasminogen activator (uPA) 및 tissue plasminogen activator (tPA) mRNA의 발현이 유의하게 높았으며, PN-NCSCs에서 생성되어 분비되는 uPA 및 tPA에 의하여 피브린 하이드로젤이 용해되는 것을 반영한다. 이상의 결과는 피브린 하이드로젤은 저밀도 PN-NCSCs의 3차원 배양은 가능하나, 고밀도 3차원 배양을 위한 하이드로젤로서는 적합하지 않다는 것을 확인할 수 있었다.
2) PN - NCSCs의 3차원 배양을 위한 콜라겐-피브린 하이드로젤 조성
PN-NCSCs의 3차원 배양을 위하여 0.2% 콜라겐(porcine skin derived collagen, Matrixen™-PSC, SK바이로랜드, 천안, 대한민국) 혹은 0.25% 피브리노겐(Greencross, 수원. 대한민국)와 0.2% 콜라겐이 혼합된 하이드로젤을 사용하였다. 0.5% 콜라겐 용액은 reconstitution buffer (50 mM NaHCO3, 40 mM HEPES, 0.01 N NaOH in DW)와 혼합하여 최종 0.2% 콜라겐 용액을 제조하였다. 인간혈장 유래 피브리노겐(녹십자, 서울, 대한민국)은 0.2% 콜라겐 용액에 피브리노겐(0.5%)-콜라겐(0.2%) 혼합 용액을 제조하였고, 트롬빈(Sigma, St.Louis, MI)은 0.2% 콜라겐 용액에 녹여 최종 0.25 unit/ml 농도의 트롬빈 용액을 제조하였다. 이후 2 x 106 PN-NCSCs 세포를 50 μl 트롬빈/콜라겐 용액과 혼합하여 분산시킨 후 동량의 피브리노겐/콜라겐 용액과 혼합한 후 배양용기에 부착된 10-mm 직경의 O-ring 내로 전달한 후 sol에서 gel이 형성되도록 37℃ 에서 한 시간 동안 반응시켰다. 이후 DMEM에 1% 송아지 혈청(calf serum, CS)과 10 μg/ml 젠타마이신이 첨가된 배양액을 첨가하였고, 배양접시는 15 rpm 속도의 오비탈 쉐이커(orbital shaker)에서 3일간 배양하였다. 이후 PN-NCSCs가 함입된 피브린/콜라겐 하이드로젤은 1% 중성 포르말린에 고정하고, 파라핀 블록을 제조하였다. 파라핀 절편을 취득한 후 hematoxylin eosin 염색을 통하여 세포질의 확장 및 세포의 3차원 분포를 평가하였다.
도 15에서 제시하였듯이, 콜라겐 혹은 콜라겐/피브린 하이드로젤 내로 PN-NCSCs을 함입시킬 수 있었으며, 피브린 하이드로젤과 달리 3일 동안의 배양기간 중 하이드로젤은 PN-NCSCs의 3차원 기질로서 그 기능과 구조가 유지되었다. PN-NCSCs이 함입된 콜라겐 하이드로젤은 배양 1일째 하이드로젤이 수축되어 O-ring과 배양용기로부터 탈락되었으며, 배양기간이 길어질수록 하이드로젤 수축이 증가되었다. 반면 콜라겐/피브린 혼합 하이드로젤은 배양 3일 동안 O-ring 및 배양용기에 안정적으로 부착되었고 수축되어 하이드로젤이 탈락되는 현상은 발생하지 않았다.
도 16에서 제시하였듯이, 콜라겐 하이드로젤은 sol에서 gel이 형성되는 상전이 시간은 평균 48분 소요되었으나, 콜라겐/피브린 혼합 하이드로젤은 sol에서 gel로의 상전이 시간은 평균 5분 이내로 이루어졌다. 하이드로젤 내로 함입된 PN-NCSCs의 3차원적 분포는 형태학적으로 평가하였으며, 콜라겐 하이드로젤 내 PN-NCSCs은 하이드로젤 하층에 밀집하여 분포하고 있었으나, 반면 콜라겐/피브린 혼합 하이드로젤 내 PN-NCSCs은 층에 따른 세포분포는 차이가 없이 균일하게 3차원적으로 분포하고 있었다.
이상의 결과는 콜라겐 하이드로젤은 PN-NCSCs의 3차원 배양을 위한 지지체로서의 기능을 제공할 수 있으나, 상전이 시간이 늦는 특성으로 인하여 PN-NCSCs의 균일한 3차원 분포를 제공할 수 없었으며, 또한 취약한 물리적 특성을 지녀 세포-매개 수축에 대한 저항성이 없어 O-ring과 배양용기로부터 탈락되어 수축되는 문제점을 확인할 수 있었다. 반면 콜라겐/피브린 혼합 하이드로젤은 상전이 시간이 빨라 균일한 3차원적 세포분포를 이룰 수가 있었으며, 세포-매개 하이드로젤 수축에 대한 저항성을 띄는 물리적 특성을 지닌 것을 확인할 수 있었다.
< 실시예 5> PN - NCSCs 다층세포시트의 제조
1) PN - NCSCs 다층세포시트 제조를 위한 배양환경
PN-NCSCs 다층세포시트 제조를 위한 배양환경과 배양기간을 설정하고자 하였다. 실시예 4에 기술한 방법에 따라 0.5% 콜라겐 용액은 reconstitution buffer (50 mM NaHCO3, 40 mM HEPES, 0.01 N NaOH in DW)와 혼합하여 최종 0.2% 콜라겐 용액을 제조하였다. 인간혈장 유래 피브리노겐(녹십자, 서울, 대한민국)은 0.2% 콜라겐 용액에 피브리노겐(0.5%)-콜라겐(0.2%) 혼합 용액을 제조하였고, 트롬빈(Sigma, St.Louis, MI)은 0.2% 콜라겐 용액에 녹여 최종 0.25 unit/ml 농도의 트롬빈 용액을 제조하였다. 2 × 106 PN-NCSCs 세포를 50 μl 트롬빈/콜라겐 용액과 혼합하여 분산시킨 후 동량의 콜라겐/피브리노젠 용액과 혼합한 후 배양용기에 부착된 10-mm 직경의 O-ring 내로 전달한 후 sol에서 gel이 형성되도록 37℃ 에서 2시간 동안 반응시켰다. 하이드로젤이 형성된 후 PN-NCSCs가 함입된 콜라겐/피브린 혼합 하이드로젤을 O-ring에서 떼어낸 후 물리적 지지가 배제된 환경(부유배양환경, floating culture condition, non-stressed culture conditions)에서 배양한 군과 O-ring 내로 casting한 후 물리적 지지가 유지된 환경(부착배양환경, attached culture condition, stressed culture condition)에서 3일간 배양하였다. DMEM에 1% 송아지 혈청(calf serum, CS), 100 μg/ml 트란제믹산(tranexamic acid), 10 μg/ml 젠타마이신을 함유한 배양액을 첨가하였고, 배양접시는 15 rpm 속도의 오비탈 쉐이커(orbital shaker)에서 3일간 배양하였다. 배양환경에 따른 하이드로젤 내 PN-NCSCs의 특성을 평가하기 위하여 배양 1일, 2일, 3일째 하이드로젤을 수거한 후 1% 중성포르말린에 고정하였고, 파라핀 블록과 절편을 제조하였다. Hematoxylin eosin 염색을 시행한 후 하이드로젤 내 PN-NCSCs의 생존율을 평가하였다.
도 17에 나타난 바와 같이, 세포질의 응고 및 핵의 분절이 관찰되는 세포 자멸사(apoptosis) 빈도는 부유배양환경에서 배양한 하이드로젤 내 PN-NCSCs에서 부착배양환경에서 배양한 하이드로젤 내 PN-NCSCs 보다 유의하게 증가되었다. 부유배양환경에서 배양한 하이드로젤의 PN-NCSCs 세포 자멸사 빈도는 배양 1일째 4.5% ± 0.8%, 배양 2일째 8.5% ± 2.4%, 배양 3일째 12.7% ± 2.6%였다. 세포자멸사 빈도는 부유배양환경에서의 배양기간과 비례하여 증가하였다. 반면 부착배양환경에서 배양한 하이드로젤 내 PN-NCSCs 세포자멸사 빈도는 배양 1일째 0.3% ± 0.1%, 배양 2일째 0.6% ± 0.3%, 배양 3일째 0.7% ± 0.2%로 1% 미만의 세포자멸사 빈도를 보였다. 부유배양환경에서 배양기간이 길어질수록 세포-매개 하이드로젤 수축이 증가 되고, 그 결과 하이드로젤 내부로의 영양분 및 산소공급이 차단되어 세포손상 및 세포죽음이 발생한다는 것을 확인할 수 있었다. 이상의 결과는 다층세포시트 내 세포손상을 방지하기 위해서는 물리적 지지를 통하여 하이드로젤 수축을 억제하며, 동시에 하이드로젤 내부로 산소, 영양분, 대사산물 교환을 지속적으로 제공할 수 있는 부착배양환경이 요구되는 것을 확인할 수 있었다. 이상의 결과는 하이드로젤 내로 PN-NCSCs의 3차원 분포 및 배양을 위하여 하이드로젤, 배양액 조성 및 배양환경에 따라 상이한 편차가 발생하는 것을 확인할 수 있다.
2) PN - NCSCs 다층세포시트 내 세포층 조절
실시예 5에 기술한 방법에 따라 0.5% 콜라겐 용액은 reconstitution buffer (50 mM NaHCO3, 40 mM HEPES, 0.01 N NaOH in DW)와 혼합하여 최종 0.2% 콜라겐 용액을 제조하였다. 인간혈장 유래 피브리노겐(녹십자, 서울, 대한민국)은 0.2% 콜라겐 용액에 피브리노겐(0.5%)-콜라겐(0.2%) 혼합 용액을 제조하였고, 트롬빈(Sigma, St.Louis, MI)은 0.2% 콜라겐 용액에 녹여 최종 0.25 unit/ml 농도의 트롬빈 용액을 제조하였다. 5 × 105, 1 × 106, 2 × 106, 4 × 106 PN-NCSCs 세포를 50 μl 트롬빈/콜라겐 용액과 혼합하여 분산시킨 후 동량의 피브리노겐/콜라겐 용액과 혼합한 후 배양용기에 부착된 10-mm 직경의 O-ring 내로 전달한 후 sol에서 gel이 형성되도록 37℃ 에서 한 시간 동안 반응시켰다. 이후 DMEM에 1% 송아지 혈청(calf serum, CS), 100 μg/ml 트란제믹산(tranexamic acid), 10 μg/ml 젠타마이신을 함유한 배양액을 첨가하였고, 배양접시는 15 rpm 속도의 오비탈 쉐이커(orbital shaker)에서 1일간 배양하였다. 배양 1일 후 PN-NCSCs이 함유된 하이드로젤은 O-ring으로부터 떼어내 후 부유환경에서 2시간 배양하였다. 이후 제조된 PN-NCSCs다층세포시트는 1% 중성 포르말린에 고정하고, 파라핀 블록을 제조하였다. 파라핀 절편을 취득한 후 hematoxylin eosin 염색을 통하여 세포층을 평가하였다.
도 18에 제시하였듯이, 부착배양 환경에서 위상차 현미경 관찰 상 콜라겐/피브린 하이드로젤 내 함입된 PN-NCSCs는 배양 6시간 후 세포질의 확장을 관찰할 수 있으며, 이는 하이드로젤 내 고분자 체인과 세포가 부착하여 세포질 확장이 이루어 지는 것을 확인할 수 있다. 또한 세포-세포 간 접합이 시간이 경과할수록 증가되었으며, 함입된 세포밀도에 따라 세포간 접합이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
도 19에 제시하였듯이, 콜라겐/피브린 하이드로젤 내 함입된 PN-NCSCs 밀도에 따라 하이드로젤 내 세포층은 비례하여 증가되었다. PN-NCSCs 다층세포시트는 5 × 105 밀도의 경우 15.3 ± 3.2, 1 × 106 밀도의 다층세포시트는 21.7 세포층 ± 4.2 세포층, 4 × 106 밀도의 다층세포시트는 31.8 세포층 ± 3.7 세포층, 4 × 106 밀도의 다층세포시트는 43.9 세포층 ± 5.1 세포층으로 구성되었다. 즉, 하이드로젤 내 세포밀도 조절을 통하여 다층세포시트 내 세포층을 용이하게 조절할 수 있는 것을 확인할 수 있었다.
3) 세포-매개 하이드로젤 수축을 통한 PN - NCSCs 다층세포시트의 물리적 특성 강화
하이드로젤의 취약한 물리적 특성에 따라 조작하기 어려운 단점이 제시되었다. 본 기술은 세포-매개 하이드로젤 수축을 통하여 하이드로젤 내 콜라겐 섬유를 응축시켜, 하이드로젤 내부에 함유된 수분을 방출시켜 물리적 특성을 강화하는 방법을 제시하고자 한다. 실시예 5에서 기술한 방법으로 2 × 106 PN-NCSCs 세포를 50 μl 트롬빈/콜라겐 용액과 혼합하여 분산시킨 후 동량의 콜라겐/피브리노젠 용액과 혼합한 후 배양용기에 부착된 10-mm 직경의 O-ring내로 전달한 후 sol에서 gel이 형성되도록 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. PN-NCSCs가 함입된 콜라겐/피브린 혼합 하이드로젤은 O-ring과 배양용기에 부착한 상태로 1일간 배양하였다. DMEM에 1% 송아지 혈청(calf serum, CS), 100 μg/ml 트란제믹산(tranexamic acid), 10 μg/ml 젠타마이신을 함유한 배양액을 첨가한 후 하이드로젤 내로 함입된 PN-NCSCs은 15 rpm 속도의 오비탈 쉐이커(orbital shaker)에서 배양하였다. 배양 3일 후 하이드로젤을 O-ring으로부터 떼어낸 후 부유배양환경에 2시간 동안 배양하였다. 이후 하이드로젤을 수거한 후 1% 중성포르말린에 고정하였고, 파라핀 블록과 절편을 제조하였다. Masson trichrome 염색을 통하여 세포의 분포와 콜라겐 섬유질의 변화를 평가하였다.
도 20에서 나타난 바와 같이, 세포-세포 및 세포-콜라겐 섬유와의 결합을 유도할 수 있도록 부착배양환경에서 1일간의 배양한 후 부유배양환경에서 세포-매개 하이드로젤 수축을 유도하였다. 세포-매개 하이드로젤 수축은 하이드로젤 내 수분을 다층세포시트로 방출하고, 하이드로젤 구성 고분자 사슬의 응축을 유도할 수 있었다. 부유배양 전의 PN-NCSCs 다층세포시트 내의 하이드로젤은 유리양 모양으로 수분을 함유하고 있으나, 부유배양환경에서 배양 30분 후 수분의 함량이 감소하고, 하이드로젤 구성 고분자 사슬이 섬유양 모양으로 응축되고, 그 결과 세포 간 간격이 치밀해 치는 것을 확인할 수 있다. 부유배양환경에서 배양 2시간 후 고분자 사슬이 응축되어 섬유양 모양의 고분자 사슬이 두드러지며, 세포간 간격의 감소하고 치밀해 지는 것을 확인할 수 있다. 이상의 결과는 부착배양환경에서 세포간 접합과 세포-하이드로젤 고분자 사슬과의 결합을 유도한 후 부유배양환경에서 배양을 통하여 세포-매개 하이드로젤 수축을 유도하여 PN-NCSCs 다층세포시트의 물리적 특성을 강화할 수 있는 방법을 제시한다.
4) PN - NCSCs 다층세포시트 내 세포외기질 , 신경세포보호/성장인자, 혈관생성 인자, 항염증인자 및 신경활성인자의 축적
본 실시예는 PN-NCSCs 다층세포시트의 생물학적 기능을 강화하기 위하여 다층세포시트 내 PN-NCSCs가 생성하여 분비하는 세포외기질과 신경활성인자의 축적을 이룰 수 있는 기술을 제공한다. 실시예 5에서 기술한 방법에 따라 0.5% 콜라겐 용액은 reconstitution buffer (50 mM NaHCO3, 40 mM HEPES, 0.01 N NaOH in DW)와 혼합하여 최종 0.2% 콜라겐 용액을 제조하였다. 인간혈장 유래 피브리노겐(녹십자, 서울, 대한민국)은 0.2% 콜라겐 용액에 피브리노겐(0.5%)-콜라겐(0.2%) 혼합 용액을 제조하였고, 트롬빈(Sigma, St.Louis, MI)은 0.2% 콜라겐 용액에 녹여 최종 0.25 unit/ml 농도의 트롬빈 용액을 제조하였다. 2 × 106 PN-NCSCs 세포를 50 μl 트롬빈/콜라겐 용액과 혼합하여 분산시킨 후 동량의 콜라겐/피브리노젠 용액과 혼합한 후 배양용기에 부착된 10-mm 직경의 O-ring 내로 전달한 후 sol에서 gel이 형성되도록 37℃ 에서 2시간 동안 반응시켰다. 하이드로젤이 형성된 후 PN-NCSCs가 함입된 콜라겐/피브린 혼합 하이드로젤을 O-ring에서 떼어낸 후 물리적 지지가 배제된 환경(부유배양환경, floating culture condition, non-stressed culture conditions)에서 배양한 군과 O-ring 내로 casting한 후 물리적 지지가 유지된 환경(부착배양환경, attached culture condition, stressed culture condition)에서 3일간 배양하였다. DMEM에 1% 송아지 혈청(calf serum, CS), 100 μg/ml 트란제믹산(tranexamic acid), 10 μg/ml 젠타마이신을 함유한 배양액을 첨가하였고, 배양접시는 15 rpm 속도의 오비탈 쉐이커(orbital shaker)에서 3일간 배양하였다. 배양환경에 따른 하이드로젤 내 PN-NCSCs의 특성을 평가하기 위하여 배양 1일, 2일, 3일째 하이드로젤을 수거한 후 1% 중성포르말린에 고정하였고, 파라핀 블록과 절편을 제조하였다. 다층세포시트 내 세포외기질의 축적을 평가하기 위하여 anti-fibronectin, anti-laminin, ant-collagen type IV, anti-fibriongen 항체를 이용하여 면역형광염색을 시행하였으며, 공초점현미경으로 관찰하였다. Hematoxylin eosin 염색을 시행한 후 하이드로젤 내 PN-NCSCs의 생존율을 평가하였다.
PN-NCSCs 다층세포시트 내 신경성장, 신경보호, 혈관생성, 항염증, 신경활성 관련 mRNA 발현을 평가하고자, PN-NCSCs 다층세포시트에서 RNA를 추출한 후 real time-quantitative PCR을 시행하였다. 대조군으로 단층배양 증폭된 PN-NCSCs, BMSC, spinal cord에서부터 분리한 RNA를 사용하였다. 신경성장/보호 mRNA는 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor; FGF) 계열 mRNA인 FGF-1, FGF-2, FGF-4, FGF-5, FGF-6, FGF-7, FGF-8, FGF-9, FGF-10, FGF-11, FGF-12, FGF-13, FGF-14, FGF-16, FGF-20, FGF-23 발현을 평가하였다. 혈관생성 mRNA는 안지오포이에틴(angiopoietin; ANGPT)-1, -2, -4, 혈소판-유래 성장인자(platelet-derived growth factor; PDGF)-C, -D 및 혈관내피세포 성장인자(vascular endothelial growth factor; VEGF)-A, -B, -C 발현을 평가하였다. 항염증인자 mRNA는 인터루킨(interleukin; IL)-6, 10 및 형질전환 성장인자(transforming growth factor-b1; TGFB1) 발현을 평가하였다. 신경세포의 생존과 보호, 신경돌기(neurite)의 성장, 수초(myelin)의 생성을 증가시키는 신경활성인자는 뉴트로핀(neurotrophin) 계열, 아교세포 유래 성장인자(glial-Derived growth factor; GDNF) 계열, 에프린(ephrin; EFN) 계열, 섬모 신경 영양 인자(ciliary neurotrophic factor; CNTF) 계열의 mRNA 발현을 평가하였다. 뉴로트로핀(Nurotrophin; NTF) 계열 인자는 신경 성장 인자(nerve growth factor; NGF), 뇌-유래 성장인자(brain-derived growth factor; BDNF) 및 neurotrophin(NTF)-3, 4/5 발현을 분석하였다. GDNF 계열 인자는 GDNF 및 artemin(ARTN) 발현을 분석하였다. EFN 계열 인자는 EFNA1, EFNA2, EFNA3, EFNA4, EFNA5, EFNB1, EFNB2, EFNB3 발현을 분석하였다. CNTF 계열 인자는 CNTF, 백혈병 억제 인자(leukemia inhibitory factor; LIF), IL-6 발현을 분석하였다. 계열이 분류되지 않는 신경활성인자인 뉴레귤린(neuregulin; NRG)-1, 2, 3, 4, 아교세포 성숙인자(glial maturation factor; GMF)-B, G 및 인슐린-유사 성장인자(insulin-like growth factor; IGF)-1 발현을 분석하였다.
도 21에 나타난 바와 같이, 콜라겐/피브린 하이드로젤 내 PN-NCSCs을 함입시킨 후 3일간 부착배양환경에서 배양 후 다층세포시트 내 fibronectin, laminin, collagen type IV와 같은 basal lamina 유형의 세포외기질이 세포 사이로 축적되는 것을 확인할 수 있었으며, fibrin 섬유소도 함께 검출되어, 체외배양을 통하여 PN-NCSCs에서 fibronectin, laminin, collagen type IV이 생성되어 다층세포시트 내 축적시킬 수 있었다.
도 22에 나타난 바와 같이, 콜라겐/피브린 하이드로젤 내 PN-NCSCs을 함입시킨 후 3일간 부착배양환경에서 배양 후 다층세포시트 내 혈관성장인자 mRNA 발현이 BMSC 대비 유의하게 높게 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 혈관내피세포의 성장, 이동, 분화, 및 혈관생성에 관계되는 ANGP-1, -2 및 4 mRNAs는 BMSC 대비 1.9배, 45배, 31배 높게 발현되었다. PDGF-C 및 D 또한 1.9배 alc 4.8배 높게 발현되었으며, VEGF-A, -B 및 C는 9.5배, 1.8배, 1.3배 증가되었다. 이상의 결과는 PN-NCSCs 다층세포시트는 혈관내피세포의 보호, 성장, 이동, 분화, 혈관생성에 관여하는 혈관생성인자를 함유하고 있는 것을 제시한다.
도 23에 나타난 바와 같이, PN-NCSCs 다층세포시트 내 염증반응을 완화하고 억제하는 항염증 관련 mRNA가 유의하게 높게 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 대표적 항염증 사이토카인인 IL-6 및 IL-10은 BMSC 대비 4.2배, 30배 높게 발현되었으며, TGF-β1또한 1.3 배 높게 발현되어, PN-NCSCs 다층세포시트는 염증억제 및 완화에 관여하는 항염증인자를 함유하고 있는 것을 제시한다.
도 24에 나타난 바와 같이, PN-NCSCs 다층세포시트 내 신경세포의 증식, 이동, 분화, 보호를 유도하는 관련 mRNA가 유의하게 높게 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 신경세포 성장, 이동, 보호, 분화에 관계되는 FGF mRNA 아형인 FGF-1, 2, 4, 6, 7, 8, 10~14, 16, 18~20 및 23의 발현이 BMSC와 비교하여 유의하게 증가되어 있어, PN-NCSCs 다층세포시트는 신경세포의 보호 및 성장에 관여하는 인자를 함유하고 있는 것을 제시한다.
도 25에 나타난 바와 같이, PN-NCSCs 다층세포시트 내 신경세포의 증식, 이동, 분화, 보호를 유도하고, 신경돌기 및 수초 형성을 증진하는 관련 mRNA가 유의하게 높게 발현되는 것을 확인할 수 있었다. PN-NCSCs 다층세포시트 내 neurotrophin 계열, GDNF 계열, EFN 계열, CNTF 계열, NRG 및 IGF-1 mRNA는 BMSC 대비 1.2배에서 51배 높게 발현되어, N-NCSCs 다층세포시트는 신경활성인자를 함유하고 있는 것을 제시한다.
도 26에 나타난 바와 같이, PN-NCSCs 다층세포시트 내 신경재생, 신경성장, 신경보호 관련 mRNA가 발현되는 것을 확인할 수 있었다. BMSC와 비교하여 BDNA, NT-3 및 NT-4 mRNA는 PN-NCSCs에서만 유의하게 발현되었으며, GDNF mRNA은 BMSC와 비교하여 발현율이 유의하게 높았다. 또한, 부착배양환경에서 배양기간에 따라 BDNF, NT-3, NT-4 mRNA 발현은 증가하였으나, GDNF 및 NGF mRNA은 배양기간과 관계없이 배양 1일째가 높은 발현되었다. 이상의 결과는 PN-NCSCs 다층세포시트는 신경보호, 신경재생, 축삭돌기 생성에 관여하는 신경활성인자를 함유하고 있는 것을 제시한다.
5) PN - NCSCs 다층세포시트 내 세포-세포 간 및 세포- 세포외기질 간 접합
본 실시예는 PN-NCSCs 다층세포시트의 구조적 안전성을 강화하기 위하여 다층세포시트 내 PN-NCSCs세포간 접합을 유도하는 기술을 제공한다. 실시예 5에서 기술한 방법에 따라 0.5% 콜라겐 용액은 reconstitution buffer (50 mM NaHCO3, 40 mM HEPES, 0.01 N NaOH in DW)와 혼합하여 최종 0.2% 콜라겐 용액을 제조하였다. 인간혈장 유래 피브리노겐(녹십자, 서울, 대한민국)은 0.2% 콜라겐 용액에 피브리노겐(0.5%)-콜라겐(0.2%) 혼합 용액을 제조하였고, 트롬빈(Sigma, St.Louis, MI)은 0.2% 콜라겐 용액에 녹여 최종 0.25 unit/ml 농도의 트롬빈 용액을 제조하였다. 2 × 106 PN-NCSCs 세포를 50 μl 트롬빈/콜라겐 용액과 혼합하여 분산시킨 후 동량의 콜라겐/피브리노젠 용액과 혼합한 후 배양용기에 부착된 10-mm 직경의 O-ring 내로 전달한 후 sol에서 gel이 형성되도록 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 하이드로젤이 형성된 후 PN-NCSCs가 함입된 콜라겐/피브린 혼합 하이드로젤을 O-ring에서 떼어낸 후 물리적 지지가 배제된 환경(부유배양환경, floating culture condition, non-stressed culture conditions)에서 배양한 군과 O-ring 내로 casting한 후 물리적 지지가 유지된 환경(부착배양환경, attached culture condition, stressed culture condition)에서 3일간 배양하였다. DMEM에 1% 송아지 혈청(calf serum, CS), 100 μg/ml 트란제믹산(tranexamic acid), 10 μg/ml 젠타마이신을 함유한 배양액을 첨가하였고, 배양접시는 15 rpm 속도의 오비탈 쉐이커(orbital shaker)에서 3일간 배양하였다. 배양환경에 따른 하이드로젤 내 PN-NCSCs의 특성을 평가하기 위하여 배양 1일, 2일, 3일째 하이드로젤을 수거한 후 1% 중성포르말린에 고정하였고, 파라핀 블록과 절편을 제조하였다. 다층세포시트 내 세포-세포 간 접합과 세포-세포외기질 간 접합을 평가하기 위하여 anti-β-catenin 및 anti-CD29 항체를 이용하여 면역형광염색을 시행하였으며, 공초점 현미경으로 관찰하였다.
도 27에서 나타난 바와 같이, 세포-세포 간 접합을 담당하는 β-catenin은 PN-NCSCs 세포막을 따라 발현하였으며, 부착배양환경에서 배양기간이 증가할수록 발현이 증가되었다. 또한 세포-세포외기질 간 접합에 관계하는 CD29 또한 부착배양환경에서 배양기간이 증가할수록 그 발현이 증가되었고, 세포막을 따라 선형으로 발현되었다. 이상의 결과는 부착배양환경에서 체외배양을 통하여 하이드로젤 내 PN-NCSCs와 하이드로젤 고분자 사슬과의 결합과 동시에 PN-NCSCs 세포-세포 간 접합을 유도하여 다층시트의 구조적 안전성을 강화할 수 있었다.
< 실시예 6> PN - NCSCs 다층세포시트로부터 유래한 생리활성인자의 신경보호, 신경증식, 축삭생성, 증진, 항염증 효과
1) PN - NCSCs 다층세포시트부터 분비된 생리활성인자를 함유한 조건배지 제조
PN-NCSCs 다층세포시트에서 분비된 생리활성인자의 신경세포의 보호, 증식, 축삭생성 및 항염증 효과를 평가하였다. 실시예 5에서 기술한 방법에 따라 2 × 106 PN-NCSCs 세포를 50 μl 트롬빈/콜라겐 용액과 혼합하여 분산시킨 후 동량의 콜라겐/피브리노젠 용액과 혼합한 후 배양용기에 부착된 10-mm 직경의 O-ring 내로 전달한 후 sol에서 gel이 형성되도록 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 하이드로젤이 형성된 후 PN-NCSCs가 함입된 콜라겐/피브린 혼합 하이드로젤은 부착배양환경에서 3일간 이후 부유배양환경에서 2시간 배양하여 다층세포시트를 제조하였다. 제조한 PN-NCSCs 다층세포시트는 100-mm 배양용기에 옮긴 후 1% 송아지혈청과 99% DMEM으로 구성된 배양액 5 mL을 첨가한 후 24시간 배양하여 조건배지(conditioned media)를 제조하였다. 배양액은 수거한 후 3,000 rpm에서 10분간 원심 분리한 후 상층액을 멸균 튜브에 옮긴 후 PN-NCSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자가 함유된 조건배지를 실험 전까지 냉동 보관하였다. PN-NCSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자의 생물학적 능력을 비교하기 위하여 동일한 방법으로 BMSCs 다층세포시트를 제조하였고, 위 기재한 동일한 방법으로 BMSCs 다층세포시트에서 유래한 생리활성인자가 포함한 조건배지를 제조하였다.
2) PN - NCSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자를 함유한 조건배지의 신경세포 보호능력
PN-NCSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자가 활성산소(Radical Oxygen Species, ROS)에 의한 신경세포 보호능력을 평가하였다. 신경모세포암 유래 세포주인 SH-SY5Y 세포 10만개를 24-멀티웰 배양용기에 파종하였다. PN-NCSCs와 BMSC 다층세포시트에서 분비된 생리활성인자가 함유한 배양액을 첨가하였고, ROS 매개 세포손상을 유도하기 위하여 3 mM H2O2를 첨가한 후 6시간 반응시켰다. 6시간 후 PBS로 3회 세척 후 세포 수를 CelLyticTM MT reagent (Sigma-Aldrich) 로 용해하여 세포수를 Quant-iTTM PicoGreen® dsDNA reagent kit (Molecular probes, Eugene, OR)를 사용하여 형광 마이크로플레이트 리더기(fluorescent microplate reader, SpectraMax M2, Molecular Devices)로 발광(emission) 480 nm, 여기(excitation) 520 nm 파장에서 형광강도를 측정하였다. 측정된 형광강도는 세포 수로 전환하기 위해서 송아지 흉선에서 얻은 DNA를 이용하여 표준곡선을 구하였고, 샘플의 형광강도를 표준곡선을 이용하여 세포 수로 변환하였다. 세포죽음을 평가하기 위해서 SH-SY5Y 세포의 카스파제 3/7 농도를 Apo 3/7 HTSTM assay kit (Cell Technology, Minneapolis, MN)를 사용하여 분석하였다. 과산화수소 (H2O2) 처리 6시간 후, SH-SY5Y 세포를 용해한 샘플 100 μl 를 동량의 2 × caspase 3/7 detection reagent 와 37℃에서 30분간 반응하여 형광 마이크로플레이트 리더기 (fluorescent microplate reader, SpectraMax M2, Molecular Devices)로 발광(emission) 488 nm, 여기(excitation) 530 nm의 파장에서 형광강도를 측정하였다. 대조군으로 1% 송아지 혈청과 99% DMEM이 함유한 배양액을 사용하였다.
도 28에 나타난 바와 같이, NCSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자의 신경세포 보호효과를 확인하기 위해 과산화수소를 처리한 SH-SY5Y 세포에 PN-NCSC 다층세포시트 유래 조건배지를 10%, 50%, 100% 되도록 처리한 후 세포 생존율을 분석하였다. H2O2 처리 후에 SH-SY5Y 생존율은 80% 미만이었으나, PN-NCSCs 및 BMSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자가 함유한 조건배지를 첨가 시 신경세포를 보호하는 효과를 확인할 수 있었다. PN-NCSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자를 함유한 조건배지를 10% 농도로 처리 시 생존율은 84.4% ± 3.2%, 50% 농도로 처리 시 92.4% ± 2.5%, 100% 농도로 처리 시 99.9% ± 7.3%로 PN-NCSC 다층세포시트로부터 유래한 생체활성인자는 농도-의존적으로 ROS-매개 신경세포 보호능력을 확인할 수 있었다. PN-NCSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자는 BMSCs 다층세포시트 유래 생리활성 인자보다 신경세포 보호능력은 높았으나 통계적 유의는 없었다.
도 29에 나타난 바와 같이, ROS 처리로 인한 세포손상과 죽음은 caspase 3/7에 의하여 매개된다. PN-NCSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자의 세포보호 능력을 검증하기 위하여 H2O2 처리 후에 SH-SY5Y caspase 3/7 활성도를 분석하였다. H2O2를 처리 후 SH-SY5Y 세포 내 caspase 3/7 활성도는 유의하게 증가하였다. PN-NCSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자가 함유된 조건배지를 처리 시 SH-SY5Y내 caspase 3/7 활성도는 농도-의존적으로 유의하게 감소하였다 (*, P < 0.05). 또한 BMSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자가 함유한 조건배지 역시 PN-NCSCs 다층세포시트와 동일하게 ROS 매개 caspase 3/7 활성도를 감소시켰으나, 그 감소 정도는 PN-NCSCs 다층세포시트보다 낮았다. 그러나 PN-NCSCs 다층세포시트 내 생리활성인자와 비교하여 caspase 3/7 활성 억제능력의 통계적 유의성은 없었다.
3) PN - NCSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자를 함유한 조건배지의 신경세포 성장유도 능력
PN-NCSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자의 신경세포 성장유도 능력을 평가하기 위해, 96-멀티웰 세포배양용기에 2만개의 SH-SY5Y 세포를 파종하였고, PN-NCSCs 혹은 BMSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자를 함유한 조건배지를 10%, 50%, 100% 농도로 첨가한 후 3일간 배양하였다. 배양 3일 후 세포 수를 측정하기 위하여 CelLyticTM MT reagent (Sigma-Aldrich)로 세포를 용해한 후 Quant-iTTM PicoGreen® dsDNA reagent kit (Molecular probes, Eugene, OR)를 사용하여 형광 마이크로플레이트 리더기(fluorescent microplate reader, SpectraMax M2, Molecular Devices)로 발광(emission) 480 nm, 여기(excitation) 520 nm의 파장에서 형광강도를 측정한 후 세포수를 산정하였다. 또한 PN-NCSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자의 신경세포 성장유도 능력을 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU; Sigma-Aldrich) uptake rate로 평가하였다. 배양액 내 10 μM 농도의 BrdU를 매일 배양액 내로 첨가한 후 3일간 배양하였으며, 배양 3일 후 세포는 2% 완충 포르말린 용액으로 고정한 다음 PBS로 3번 세척하였다. 항체의 비특이적 반응을 억제하기 위해서 5% bovine serum albumin으로 30분간 처리한 후 anti-BrdU 일차 항체를 사용하여 상온에서 2시간 반응 하였다. PBS로 3회 세척 후 Dylight 488-conjugated 이차항체를 상온에서 30분간 반응시키고 10 μg/ml DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole, Invitrogen) 용액으로 핵을 염색하였다. 이후 ProLongGold antifade reagent (Molecular Probe)로 봉입하여 공초점 현미경으로 BrdU의 발현여부를 평가하였다. 1000개 이상의 세포를 분석하여 핵에서 발현되는 BrdU uptake를 평가하였다.
도 30에 나타난 바와 같이, PN-NCSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자를 함유한 배양액 50%로 SH-SY5Y를 처리 시 DNA 함량은 126.2 ng/ml ± 1.9 ng/ml (*, P < 0.01), 100%로 처리 시 126.8 ng/ml ± 8.6 ng/ml로, PN-NCSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자를 함유하지 않은 배양액 혹은 BMSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자를 함유한 배양액을 처리한 군과 비교하여 유의하게 DNA양이 증가하였다. 그러나 PN-NCSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자를 함유한 배양액 10%로 SH-SY5Y를 처리 시 DNA 함량의 증가는 미미하였다. 이상의 결과는 PN-NCSCs 다층세포시트에서 유래한 생리활성인자가 신경세포의 성장을 촉진하는 능력을 확인할 수 있었다.
도 31에 나타난 바와 같이, PN-NCSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자를 함유한 조건배지로 처리 시 SH-SY5Y 세포의 BrdU uptake rate는 생리활성인자를 포함하지 않은 군(vehicle)과 BMSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자 함유 조건배지로 처리한 군과 비교하여 유의하게 증가하였다.
도 32에 나타난 바와 같이, PN-NCSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자를 함유한 조건배지의 농도가 증가함에 따라서 SH-SY5Y 세포의 BrdU uptake rate가 유의하게 농도-의존적으로 증가하였다(*,P < 0.05). PN-NCSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자가 함유한 조건배지 농도가 50%일 경우 BrdU uptake rate가 72.3% ± 6.1% (*, P < 0.05), 100%일 경우 69.7% ± 5.1% (*, P < 0.05)로 생리활성인자가 함유하지 않은 배양액으로 처리한 세포보다 유의하게 증가되었다. 또한 BMSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자 함유한 조건배지로 배양한 세포보다 BrdU uptake rate가 유의하게 높아, PN-NCSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자가 신경세포의 성장을 증진시키는 특성을 보유한 것을 확인할 수 있었다.
4) PN - NCSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자를 함유한 조건배지의 신경세포 축삭성장 과 시냅스 유도능력
PN-NCSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자의 신경 축삭 형성에 대한 효과를 평가하기 위해서 cm2당 3천개의 밀도로 SH-SY5Y 세포주를 12-멀티웰 세포배양용기에 파종하여 PN-NCSCs 혹은 BMSC다층세포시트 유래 조건배지를 10%, 50%, 100% 농도로 처리하여 7일간 배양하였다. 신경성장인자인 NGF (nerve growth factor)를 50 ng/ml 농도로 처리한 군과 1% 송아지혈청과 99% DMEM 배양액으로 처리한 군을 대조군으로 비교하였다. 배양 7일 후 세포는 2% 완충 포르말린액으로 10분간 고정한 뒤 PBS 로 3번 세척하였다. 세포막을 투과시키는 0.1% Triton X-100 용액이 포함된 PBS 로 5분간 처리한 다음, 1 μg/ml 농도의 Oregon Green® 514-conjugated phalloidin (Molecular Probes)를 처리하여 세포질 내 actin filament를 염색하였다. 100개의 세포를 무작위로 선택하여 공초점 형광현미경으로 이미지화하여 축삭의 길이와 축삭 내 branching 수를 Image J 프로그램을 이용하여 평가하였다.
도 33에 나타난 바와 같이, NCSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자를 함유한 조건배지는 SH-SY5Y 세포의 축삭형성을 현저히 증가시켰다. 그러나 BMSCs 다층세포시트 유래 조건배지, 대조군인 1% 송아지혈청 혹은 NGF로 처리한 SH-SY5Y 세포의 축삭의 형성은 미미하였다.
도 34에서 나타난 바와 같이, PN-NCSCs 다층세포시트 유래 조건배지로 처리한 경우 SY-SH5Y 세포의 축삭형성은 농도에 의존적으로 증가하였다. 100% PN-NCSCs 다층세포시트 유래 조건배지로 처리한 경우 SH-SY5Y 축삭의 길이는 1% 송아지혈청(vehicle)과 BMSCs 다층세포시트 유래 조건배지와 비교하여 유의하게 증가하였다(*, P < 0.01).
도 35에 나타난 바와 같이, 신경세포의 축삭의 branching 수를 동시에 분석하였다. 대조군인 1% 송아지혈청(vehicle)과 BMSCs 다층세포시트 유래 조건배지로 처리한 SH-SY5Y 세포의 축삭 branching 수와 비교하여 NCSCs 다층세포시트 유래 조건배지로 처리한 세포에서 유의하게 증가하였으며(*, P < 0.05, **, P < 0.01), 조건배지 농도 의존적으로 branching 수가 증가되었다. 이상의 결과는 NCSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자는 신경세포의 보호, 성장, 축삭형성에 유의하게 증가시키는 신경활성 능력을 보유하고 있는 것을 확인할 수 있었다.
5) PN - NCSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자가 함유된 조건배지의 항염증 능력
PN-NCSCs다층세포시트 유래 생리활성인자의 염증억제 능력을 평가하기 위해서, rat의 복강에서 얻은 peritoneal monocytes를 사용하였다. Sprague Dawley rat 의 복강에 0.9% 생리식염수(NaCl saline) 30 ml 주입한 후 다시 흡입하여, 원심분리를 통하여 monocyte를 분리하였다. 96-멀티웰 세포배양용기에 4 × 105 개의 monocyte를 파종하고, 1 μM 농도의 lipopolysaccharide (LPS; Sigma-Aldrich)를 24시간 처리하였다. LPS 처리시 PN-NCSCs 다층세포시트 혹은 BMSCs 다층세포시트 유래 조건배지를 10%, 50%, 100% 농도로 동시에 첨가하여 1일간 배양하고, monocyte 에서 분비되는 염증성 사이토카인인 TNF-α (tumor necrosis factor-alpha) 및 IL-1β (interleukin-1β) 양을 ELISA kit (R&D Systems, Minneapolis, MN)을 사용하였으며, 염증성 사이토카인 함량은 마이크로플레이트 리더기(fluorescent microplate reader, SpectraMax M2, Molecular Devices)를 이용하여 측정하였다.
도 36 및 도 37에 나타난 바와 같이, NCSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자의 유의한 항염증효과를 검증할 수 있었다. LPS 처리를 통하여 monocyte의 활성화를 유도한 후 NCSC 다층세포시트 유래 조건배지를 처리하였고, monocyte에서 분비되는 TNF-α 함량은 1% 송아지혈청(vehicle)으로 처리시 2.1 ng/ml ± 0.2 ng/ml 였으나, NCSCs 다층세포시트 유래 조건배지 10%, 50%, 100% 처리시 TNF-α 함량은 각각 1.6 ng/ml ± 0.2 ng/ml, 1.0 ng/ml ± 0.0 ng/m, 0.7 ng/ml ± 0.1 ng/ml으로 조건배지 농도가 증가함에 따라서 monocyte의 TNF-α 분비를 유의하게 억제시키는 것을 확인할 수 있었다(*, P < 0.05). 동시에 PN-NCSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자를 함유한 조건배지는 monocyte의 IL-1β 분비를 유의하게 농도 의존적으로 억제하였다. PN-NCSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자를 함유한 조건배지 10%, 50%, 100% 농도로 처리시 monocyte의 IL-1β 분비함량은 각각 0.9 ng/ml ± 0.1 ng/ml, 0.7 ng/ml ± 0.1 ng/ml, 0.5 ng/ml ± 0.1 ng/ml로 조건배지를 처리하지 않은 경우 IL-1β 분비함량인 1.1 ng/ml ± 0.2 ng/ml 보다 유의하게 낮았다. 또한 PN-NCSCs 다층세포시트 유래 조건배지는 BMSCs 다층세포시트 유래 조건배지보다 monocyte의 TNF-α 및 IL-1β 분비를 유의하게 감소시켰다. 이상의 결과는 PN-NCSCs 다층세포시트에서 분비되는 생리활성인자는 염증반응을 억제하는 능력을 확인할 수 있었다.
< 실시예 7> 손상된 척수로의 PN-NCSCs 다층세포시트의 경막 외 이식 및 척수재생/보호 능력
1) 척수손상 동물모델
척수손상 동물모델은 인제대학교의 동물실험운영위원회의 승인을 얻은 후 일반사육 조건에서 유지되는 240-260 g의 Sprague Dawley rat을 사용하였다. 척수 손상은 8번에서 10번 흉추(thoracic spine)의 극돌기(spinous process)를 제거한 다음 9번 흉추 극돌기 위치에서 경막 (dura mater)의 손상 없이 동맥류 클립(S&T Vascular Clamps; Fine Science Tools, British Columbia, 캐나다)을 사용하여 1분간 10 g/mm2 강도의 힘으로 척수(spinal cord) 손상을 주었다. PN-NCSCs 다층세포시트 혹은 BMSCs 다층세포시트를 손상된 척수의 경막 위로 이식하였다. 척수손상 후 지혈을 위해서 젤라틴 스폰지(Spongostan®, Johnson & Johnson Medical, Skipton, UK)를 덮은 다음 절개부위를 봉합하였다. 수술 후 항생제로 50 μg 겐타마이신(유한, 서울, 대한민국)을 3일간 근육 내(intra muscular)로 주사하였고, 진통제로 2 mg buprenorphine hydrochloride (Reckitt and Colman, Richmond, VA)을 2일간 피하(subcutaneous)로 주사하였다. 하루에 2번 방광을 눌러 인위적으로 배뇨를 실시하였다.
2) 척수 내 PN - NCSCs 다층세포시트의 생착
실시예 5에 기술된 동일한 방법으로 PN-NCSCs 다층세포시트를 제조하였다. 생체 내 이식한 PN-NCSCs을 추적하기 위하여 PN-NCSCs를 1 μM CM-DiI (Molecular Probe)로 표지하였다. CM-DiI로 라벨링된 2 × 106 혹은 2 × 107 PN-NCSCs은 50 μl 트롬빈/콜라겐 용액과 혼합하여 분산시킨 후 동량의 콜라겐/피브리노젠 용액과 혼합한 후 배양용기에 부착된 10-mm 직경의 O-ring 내로 전달한 후 sol에서 gel이 형성되도록 37℃ 에서 2시간 동안 반응시켰다. 하이드로젤이 형성된 후 PN-NCSCs가 함입된 콜라겐/피브린 혼합 하이드로젤을 O-ring 물리적 지지 하에 부착배양환경에서 15 rpm 속도의 오비탈 쉐이커(orbital shaker) 위에 놓고 3일간 배양하였다. 배양액의 조성은 DMEM에 1% 송아지 혈청(calf serum, CS), 100 μg/ml 트란제믹산(tranexamic acid), 10 μg/ml 젠타마이신을 함유한 배양액을 사용하였다. 이후 O-ring에서 떼어낸 후 부유배양환경에서 2시간 동안 배양 후 PN-NCSCs 다층세포시트를 제조하였다. 이후 손상된 척수부위로 이식한 후 이식 3일째 IVIS Lumina XR In Vivo Imaging System (Perkin Elmer, 서울, 대한민국)을 이용하여 영상을 획득하였다. 영상을 획득한 후 이식된 척수 및 다층세포시트를 회수하여 2% 중성 포르말린에 고정하고, 파라핀 블록 및 절편을 취득하였다. 이식된 PN-NCSCs 다층세포시트 내 혈관생성을 평가하기 위하여 anti-α-smooth muscle actin (SMA) 항체를 이용하여 면역형광염색을 시행하였고, isotype-matched Alexa Fluor 488-conjugated 이차항체를 상온에서 30분간 반응하였고, 10 μg/ml DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole, Invitrogen) 용액으로 핵을 염색하였다. 이후 ProLong Gold antifade reagent (Molecular Probe)로 봉입하여 공초점 레이저주사현미경으로 발현여부를 평가하였다.
도 38에 나타난 바와 같이, In Vivo Imaging System을 이용하여 획득한 손상척수 및 이식한 PN-NCSCs 다층세포시트 영상이다. PN-NCSCs 다층세포시트는 손상척수 부위에 안정적으로 부착되어 있었으며, 이식된 PN-NCSCs에서 유래한 형광강도는 세포 수와 비례하여 증가되었다. 이상의 결과는 PN-NCSCs 다층세포시트를 통하여 국소적으로 손상된 척수의 경막 위로 안정적으로 이식할 수 있음을 확인하였다.
도 39에 나타난 바와 같이, 이식 3일 후에 PN-NCSCs 다층세포시트는 손상된 척수 경막 위로 안정적으로 융합되어 있었다. 손상된 척수는 손상부위에 잘 부착되어 있었다. 경막 위로 이식한 다층세포시트 내 CM-DiI로 라벨링된 PN-NCSCs는 50% 이상으로 구성되어 있었다. CM-DiI 양성 세포는 세포질과 핵 구조가 잘 유지되어 있어 생존하고 있다는 것을 확인할 수 있었다. 다층세포시트 내로 혈액세포를 함유한 미세혈관이 형성되는 것을 확인되었다. SMA를 이용하여 혈관구조를 표지하였으며, PN-NCSCs 다층세포시트 내로 미세혈관이 생성되는 것을 확인함에 따라 이식한 PN-NCSCs 다층세포시트가 생착된 것을 검증할 수 있었다. PN-NCSCs 다층세포시트 내 형성된 미세혈관은 SMA에 양성이었지만, CM-DiI은 발현되지 않아 다층세포시트 내 미세혈관은 recipient에서 기원한 것을 반영하는 소견이다. 이는 이식한 세포의 혈관으로의 직접적인 분화가 아닌 다층세포시트로부터 분비된 생리활성인자에 의해서 주위 조직으로부터 이동, 성장해온 혈관임을 알 수 있다. 또한 이는 이식된 PN-NCSCs 다층세포시트는 이식부위와 혈관순환이 이루어져 손상된 척수부위에 생착되었음을 알 수 있다. 또한 이식된 PN-NCSCs 다층세포시트는 척수 경막 위에서만 관찰되었고, 손상된 척수 부위 내로 이주되는 것은 발견할 수 없었다.
3) 척수 내 PN - NCSCs 다층세포시트의 장기 생존율
척수 내 PN-NCSCs 다층세포시트로 이식한 PN-NCSCs 의 장기간 생존율을 평가하기 위하여 green fluorescent protein (GFP) 유전자를 함유한 lentivirus로 PN-NCSCs을 감염시켰고, GFP 유전자를 함유한 PN-NCSCs을 이용하여 실시예 5에 기술된 동일한 방법으로 PN-NCSCs 다층세포시트를 제조하였다. GFP 유전자를 함유한 2 × 106 PN-NCSCs은 50 μl 트롬빈/콜라겐 용액과 혼합하여 분산시킨 후 동량의 콜라겐/피브리노젠 용액과 혼합한 후 배양용기에 부착된 10-mm 직경의 O-ring 내로 전달한 후 sol에서 gel이 형성되도록 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 하이드로젤이 형성된 후 PN-NCSCs가 함입된 콜라겐/피브린 혼합 하이드로젤을 O-ring 물리적 지지 하에 부착배양환경에서 15 rpm 속도의 오비탈 쉐이커(orbital shaker) 위에 놓고 3일간 배양하였다. 배양액의 조성은 DMEM에 1% 송아지 혈청(calf serum, CS), 100 μg/ml 트란제믹산(tranexamic acid), 10 μg/ml 젠타마이신을 함유한 배양액을 사용하였다. 이후 O-ring에서 떼어낸 후 부유배양환경에서 2시간 동안 배양 후 PN-NCSCs 다층세포시트를 제조하였다. 이후 손상된 척수부위로 이식한 후 이식 3일, 7일, 14일, 28일째 손상된 척수 부를 채취하여 2% 중성 포르말린에 고정하고, 파라핀 블록 및 절편을 취득하였다. 파라핀 절편은 anti-GFP 항체를 이용하여 면역화학염색을 시행하였고, isotype matched HRP-conjugated 이차항체를 상온에서 30분간 반응한 후 diaminobenzidine을 이용하여 발색하였다. 이후 hematoxylin으로 핵을 염색하였다. 또한 이식된 PN-NCSCs의 생체 내 분화특성을 평가하기 위하여 이중 면역형광염색을 시행하였다.
도 40에 나타난 바와 같이, 손상된 척수의 경막 위로 이식한 PN-NCSCs 다층세포시트가 잔존하는 것을 확인할 수 있었다. 이식 3일째 경막 위로 GFP 양성 세포의 밀도가 가장 높았으나, 시간이 경과할수록 GFP 양성 세포 수는 유의하게 감소되었다. 척수 내로 이동한 GFP 양성 세포는 관찰할 수 없었다. GFP 양성 세포의 밀도는 이식 3일째 128.4 /mm2 ± 21.5 /mm2이었으나, 이식 7일째 98.1 /mm2 ± 12.1 /mm2, 이식 14일째 56.2 /mm2 ± 9.8 /mm2, 이식 28일째 11.5 /mm2 ± 3.6 /mm2이었다. 경막 위의 GFP 양성 세포는 세포의 구조가 온전히 유지되어 생존하고 있는 것을 확인할 수 있었고, 방추상 모양으로 세포질의 경계는 명확하지 않은 섬유아세포와 유사한 형태학적 특성을 보였다.
도 41에 나타난 바와 같이 경막 위로 이식된 PN-NCSCs은 섬유아세포 및 혈관내피세포로 분화하는 특성을 나타내었다. 신경세포 표지자(Tuj1), 성상세포 표지자(GFAP), 핍지세포 표지자(A2B5 및 MBP), 슈반세포 표지자(MPZ)를 동시에 발현되는 GFP 양성 PN-NCSCs은 발견되지 않았다. 반면 GFP 양성 PN-NCSCs은 미세혈관 구조의 내강을 덮고 있으며 동시에 혈관내피세포 표지자인 CD34가 양성으로 혈관내피세포로 분화하여 미세혈관을 직접 형성하는 것을 확인할 수 있었다. 동시에 대부분의 GFP 양성 세포는 SMA가 양성으로 신경 내 섬유아세포 혹은 창상수복 과정 중 나타나는 근섬유모세포(myofibroblast)와 유사한 면역표현 특성을 보였다.
< 실시예 8> PN - NCSCs 다층세포시트의 척수기능 복구
1) 척수손상 동물의 운동능력 회복
실시예 7와 동일한 방법으로 척수손상 모델을 제조하였으며, 실시예 5와 같이 동일한 방법으로 PN-NCSCs 다층세포시트를 제조한 후 손상된 척수 경막 위로 이식하였다. 이식 후 84일 동안 척수손상 동물의 운동능력은 100 cm × 100 cm 박스에 동물을 위치한 후 Basso, Beattie 및 Bresnahan (BBB) 평가체제에 의거하여 평가하였다. 동물 별 운동능력은 비디오로 녹화하여 뒷다리의 운동을 최저 0점에서 최대 21점까지 관절의 움직임, 관절의 조화, 체중의 지지 정도에 따라 2명의 다른 연구자가 평가하였다. BMSCs 다층세포시트로 치료받은 동물군과 아무런 치료를 행하지 않은 동물군을 대조군으로 이용하였다.
도 42에 나타난 바와 같이, PN-NCSCs 다층세포시트 혹은 BMSC 다층세포시트로 치료받은 척수손상 동물에서 운동기능 회복이 이식 7일째부터 유의하게 회복되었다. 이식 14일째 PN-NCSCs 다층세포시트로 치료받은 척수손상 동물에서 BMSCs 다층세포시트로 치료받은 동물 혹은 아무런 치료를 받지 않은 동물과 비교하여 유의하게 운동기능의 회복이 관찰되었다. 이식 14일째 하지 관절 모두 움직임을 나타내었고, 이식 36일째 평균 14.7 점 ± 1.1 점수로 무게를 지탱할 수 있게 되었다. 이후 이식 63일째까지 PN-NCSCs로 치료받은 척수손상 동물에서 지속적인 운동기능 회복이 관찰되었으나, 그 이후 유의한 운동기능 회복은 관찰되지 않았다.
2) 척수손상 동물의 물리적 감각능력 회복
실시예 7와 동일한 방법으로 척수손상 모델을 제조하였으며, 실시예 5와 같이 동일한 방법으로 PN-NCSCs 다층세포시트를 제조한 후 손상된 척수 경막 위로 이식하였다. 동물의 감각능력 평가를 위해서, 척수손상 동물은 20 cm x 20 cm아크릴 벽과 바닥은 철망으로 제조된 박스 내로 옮겼다. 박스 내에서 동물은 15분간 적응시킨 다음 Dynamic Plantar Aesthesiometer (Ugo Basile, Comerio, Italy)을 사용하여 발바닥 표면에 물리적 자극을 주었다. 철망 사이를 통과하여 가는 필라멘트로 초당 2.5 g의 힘으로 최대 50 g의 무게를 밀어 올려 발을 떼는 순간을 무게를 측정하였다. 각 다리는 두 번씩 측정하여 높은 점수를 적용하고 네 번 반복하여 평균을 구하였다. 모든 측정은 수술 후 0일에서 매주 실시하여 반응 정도를 측정하여 물리적 이질통(allodynia) 유무를 확인하였다.
도 43에 나타난 바와 같이, 이식 5주 이후부터 PN-NCSCs 다층세포시트를 이식한 척수신경 손상 백서의 감각능력은 다층세포시트를 이식하지 않은 척수손상 동물과 BMSCs 다층세포시트를 이식한 동물과 비교하여 유의하게 향상되었다(*, P < 0.05). 이식 4주까지 PN-NCSCs 혹은 BMSCs 다층세포시트로 치료받은 척수손상 동물에서 이질통(allodynia)이 발생하였으며 필라멘트에 대한 과도한 반응을 보였다. 그러나 이식 5주 이후부터 필라멘트에 대한 과민한 감각반응과 이질통이 유의하게 완화되었으나, 다층세포시트를 이식하지 않은 동물에서 백서의 감각능력은 급격하게 감소하였으며 심각한 이질통을 나타내었다. 이러한 결과는 PN-NCSCs 다층세포시트를 척수 손상모델에 이식하였을 때 감각능력이 향상되는 것을 확인할 수 있었다.
3) 척수손상 동물의 전기생리 기능 회복
실시예 7와 동일한 방법으로 척수손상 모델을 제조하였으며, 실시예 5와 같이 동일한 방법으로 PN-NCSCs 다층세포시트를 제조한 후 손상된 척수 경막 위로 이식하였다. 동물의 신경생리 기능은 머리 부위의 피하층과 경골신경에 probe를 위치시킨 후 운동신경전도 및 감각신경전도를 평가하였다.
도 44에 나타난 바와 같이, PN-NCSCs 다층세포시트로 치료받은 척수손상 동물에서 운동신경전도 기능의 유의한 회복을 관찰할 수 있었다. 척수손상 2주 후 PN-NCSCs 다층세포시트로 치료받은 동물에서 운동전기 신호는 75.8% 검출되었으나, 아무런 치료를 받지 않은 동물에서는 32.4%만 운동전기 신호가 검출되었다. 그러나 손상 4주 후 대조군과 PN-NCSCs 다층세포시트로 치료받은 군에 있어 운동전기 신호는 75%로 유의한 차이는 없었다. 또한 손상 2주째 PN-NSCS 다층세포시트로 치료받은 동물에서 유의하게 빠른 운동전기 신호 속도(latency)가 관찰되었으며, 손상 4주째 PN-NCSCs 다층세포시트 치료 동물에 있어 전기신호의 증폭(amplitude)가 유의하게 높았다. 그러나 대조군 혹은 PN-NCSCs 다층세포시트 치료동물 모두에서 감각신경 전기신호는 검출되지 않았다. 이상의 결과는 PN-NCSCs 다층세포시트는 척수손상에 있어 운동기능, 감각기능, 그리고 전기생리 기능의 유의한 회복을 유도하는 치료효과를 확인할 수 있었다.
< 실시예 9> PN - NCSCs 다층세포시트의 척수기능 복구
실시예 7와 동일한 방법으로 척수손상 모델을 제조하였으며, 실시예 5와 같이 동일한 방법으로 PN-NCSCs 다층세포시트를 제조한 후 손상된 척수 경막 위로 이식하였다. 척수손상 동물에 PN-NCSCs 다층세포시트를 이식한 후 2주 및 4주째 척수를 채취한 후 형태학적 방법으로 척수 손상과 재생 정도를 평가하였다.
1) PN - NCSCs 다층세포시트의 척수손상 보호작용
척수 손상 2주 및 4주째 척수를 손상부를 중심으로 꼬리쪽 4 mm와 머리쪽 4 mm를 포함한 척수를 채취하여 2% 중성포르말린에 6시간 고정한 후 종측 방향으로 파라핀 블록과 파라핀 절편을 취득하였다. 연속적 파라핀 절편을 이용하여 hematoxylin and eosin (H&E) 및 Luxol fast blue (LFB) 염색을 실시하였다. Luxon fast blue (LFB) 염색은 1 % 농도의 luxol fast blue (Solvent Blue 38; Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 56℃ 에서 2시간 반응하였다. 염료의 과염색을 제거하기 위해서 95% ethyl alcohol로 세척한 후 회질과 백질의 색상 대비를 증가시기키 위해서 0.05% lithium carbonate solution을 사용하여 30초간 반응 하였다. 70% ethyl alcohol로 30초간 상온에서 세척한 다음 crystal violet으로 핵을 염색하였다. 모든 염색을 종료한 후 슬라이드는 Malinol (Muto Chemical, Tokyo, Japan)을 사용하여 커버글라스를 봉입하고, 염색된 슬라이드는 NanoZoomer (Hamamatsu Photonics, Tokyo, Japan)을 사용하여 영상을 이미지화하였다. 형태계측학적 측정은 Image J software (NIH, Bethesda, MD)을 이용하여 손상된 척수 내 손상 정도를 분석하였다. 공동(cavity) 병변은 hematoxylin eosin 염색 슬라이드를 이용하여 면적을 산정하였고, 탈수초(demyelination) 병변은 LFB 염색을 이용하여 면적을 측정하였으며, 손상중심부에서 꼬리 방향으로 4 cm 그리고 머리부위로 2 cm에 해당하는 척수 전체 면적 당 낭 병변 및 탈수초 병변을 백분율로 표기하였다.
도 45에 나타난 바와 같이, PN-NCSCs 다층세포시트를 척수신경 손상 모델에 이식 후 2주째 손상 동물의 척수손상 부위의 구조형태학적 회복을 나타내었다. 아무런 치료를 받지 않은 척수손상 동물인 경우 척수 내 공동 크기는 77.9% ± 6.8%이었으나, PN-NCSCs 다층세포시트를 이식한 동물에서 손상 후 척수 내 공동 크기는 55.9% ± 4.3%로 유의하게 감소하였다. 또한 탈수초 병변은 대조군의 경우 73.0% ± 9.1%였으나, PN-NCSCs 다층세포시트로 치료받은 동물은 58.1% ± 5.5%으로 유의하게 감소하였다.
도 46에 표시한 바와 같이, 척수손상 4주 후 PN-NCSCs 다층세포시트로 치료받은 척수손상 동물에 있어 대조군과 비교하여 척수손상 정도는 유의하게 감소되었다. 척수손상 2주째와 비교하여 4주째 공동의 크기는 감소하였으며 아교반흔으로 대체되었다. PN-NCSCs 다층세포시트로 치료받은 척수의 공동크기는 대조군과 비교하여 유의하게 감소되었다. 탈수초 병변도 2주째와 비교하여 감소하였으며, PN-NCSCs 다층세포시트로 치료받은 군에 있어 수초재생이 유의하게 증가되었다.
2) PN - NCSCs 다층세포시트의 손상된 척수 내 축삭재생 작용
척수 손상 2주 후 Bodian's silver 염색 후 축삭돌기 섬유의 수를 손상부위에서 확인하였다. Bodian's silver 염색은 파라핀 절편을 Protargol-S solution (Polysciences Inc., Warrington, PA) 을 사용하여 37℃에서 16시간 반응한 다음 증류수로 세척하였다. 0.1 % 농도의 hydroquinone (Sigma-Aldrich)과 0.05 % 농도의 sodium sulfite (Sigma-Aldrich)가 포함된 reducing solution 을 사용하여 5분간 반응한 후 차례대로 0.5 % 농도의 gold chloride (Sigma-Aldrich)를 5 분, 0.5% 농도의 oxalic acid (Sigma-Aldrich)를 10분간 반응하였다. 그런 다음 0.05% 농도의 sodium thiosulfate (Sigma-Aldrich)가 포함된 5% 농도의 hypo solution으로 3분간 반응 후 봉입하여 NanoZoomer (Hamamatsu Photonics, Tokyo, Japan)을 이용하여 이미지화하였다. 획득한 영상은 척수 회질의 앞뿔(ventral horn), 뒷뿔(dorsal horn), 가쪽회질(lateral gray matter) 영역을 선정하여 손상부위에서 축삭이 차지하는 밀도를 백분율로 표기하였다.
도 47에 나타난 바와 같이, 척수손상 2주째 척수 내 축삭을 Bodian's silver로 염색하였고, 형태계측 방법을 축삭 밀도를 평가한 결과이다. PN-NCSCs 다층세포시트를 이식한 척수손상 동물에서 손상된 척수 내 축삭의 재생성이 회질의 앞뿔, 뒷뿔, 그리고 가쪽회질 모두에서 대조군과 비교하여 유의하게 증가되었다. 특히 PN-NCSCs 다층세포시트를 치료받은 척수는 손상 중심부에 있어 축삭의 재생성이 관찰되었으나, 대조군의 경우 축삭의 재형성을 관찰하기 어려웠다.
3) PN - NCSCs 다층세포시트의 손상된 척수 내 신경회로 복구
축삭 재생 정도를 선행 신경추적(anterograde neural tracing)을 통하여 신경회로 복구 정도를 평가하였다. PN-NCSCs 다층세포시트 이식 2주 후 대뇌의 운동신경 피질에 10% biotinylated dextran amine (BDA, 10,000 M.W., Molecular Probe) 10 μl를 주사하였다. BDA 주사 2주 후 손상된 척수를 채취하여 4% 중성포르말린에 6시간 고정한 후 파라핀 블록과 절편을 제작하였다. 파라핀 절편은 HRP가 중합된 streptavidin (innogenex)와 반응시킨 후 DAB로 발색하였다. NanoZoomer (Hamamatsu Photonics, Tokyo, Japan)을 이용하여 영상을 수득하였고, 획득한 영상은 척수 회질의 앞뿔(ventral horn), 뒷뿔(dorsal horn), 가쪽회질(lateral gray matter) 영역을 선정하여 손상부위에서 축삭이 차지하는 밀도를 백분율로 표기하였다.
도 48 및 도 49에 나타난 바와 같이, 척수손상 4주 후 PN-NCSCs 다층세포시트를 이식받은 동물에서 운동감각 피질에 주입한 BDA를 함유한 축삭이 유의하게 증가되었다. 척수손상 중심부의 BDA 양성 축삭의 밀도는 감소 되어 있었으며, PN-NCSCs 다층세포시트 이식여부에 따른 유의한 차이는 없었다. 그러나 척수손상 중심부에서 머리 쪽 그리고 꼬리 쪽 경계부의 척수 내로는 BDA 양성 축삭 밀도는 PN-NCSCs 다층세포시트를 이식 받은 동물에 있어 유의하게 증가되었다. 이상의 결과는 척수손상 시 PN-NCSCs 다층세포시트는 척수손상으로 인한 공동형성과 탈수초를 완화시키며, 동시에 축삭의 형성을 촉진시켜 척수구조의 보존과 회복을 증진시키는 작용기전을 확인할 수 있었다.
< 실시예 10> PN - NCSCs 다층세포시트의 항염증 및 신경활성 능력
PN-NCSCs 다층세포시트의 생체 내 염증 억제효과를 평가하기 위해서, 실시예 7과 같이 척추손상을 유도한 후 실시예 5와 동일한 방법으로 PN-NCSCs 다층세포시트를 제조한 후 손상된 척수 경막 위로 이식하였다. PN-NCSCs 다층세포시트 이식 3일 후 손상된 척수 중심부를 포함하여 머리 그리고 꼬리 쪽 1 cm 길이의 척수를 채취하였다. 채취한 척수는 0.1 M phenylmethylsulfonyl fluoride (Sigma-Aldrich)와 protease inhibitor cocktail (Sigma-Aldrich)을 첨가한 CelLyticTM MT reagent로 척수를 용해시켰다. 이후 4℃에서 12,000 rpm으로 15분간 원심분리하여 상층액을 회수하였다. 회수한 상층액 내 염증성 사이토카인인 TNF-α 및 IL-1β 함량을 ELISA kit (R&D Systems, Minneapolis, MN)를 사용하여 분석하였다. 손상 척수 내 신경활성 유전자인 BDNF, GDNF, NGF, NT-3, NT-4 mRNA 발현은 실시간 중합효소반응(real time polymerase chain reaction) 방법으로 평가하였다. 척수손상 중심부를 포함한 머리 및 꼬리 쪽 1 cm 길이의 척수를 채취한 후 가위로 잘게 잘랐다. 이후 TRIzol에 넣은 후 조직분해를 시킨 후 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA는 역전사효소를 이용하여 보합 DNA를 제조한 후 PCR 반응을 하였다.
도 50에 나타난 바와 같이, PN-NCSCs 다층세포시트를 이식 받은 척수 내 염증성 사이토카인의 분비가 유의하게 낮게 측정되었다. 척수손상 3일 후에 척수는 염증반응에 관여하는 TNF-α 및 IL-1β의 분비가 증가되었으며, 대조군과 비교하여 PN-NCSCs 다층세포시트를 이식받은 동물에서 TNF-α (55.9 pg/ml ± 4.6 pg/ml, *, P < 0.05) 및 IL-1β (261.8 pg/ml ± 4.5 pg/ml, *, P < 0.05) 함량이 유의하게 감소하였다. PN-NCSC 다층세포시트와 동일하게 BMSCs 다층세포시트로 치료받은 척수손상 동물에서 TNF-α 및 IL-1β의 분비가 대조군과 비교하여 유의하게 감소되어 있었으며, 다층세포시트 구성 세포원에 따라 유의한 차이는 발견할 수 없었다.
도 51에 나타난 바와 같이, 손상 받기 전 척수와 비교하여 손상 후 척수 내 신경활성 mRNA 발현은 증가하였다. 특히 PN-NCSCs 다층세포시트를 이식받은 손상척수 내 GDNF, NT-3 및 NT-4 mRNA는 대조군과 BMSCs 다층세포시트로 치료받은 군과 비교하여 유의하게 중가 하였다. 이상의 결과는 PN-NCSCs 다층세포시트는 손상된 척수 내로 항염증인자 및 신경활성인자를 분비하여 손상된 척수를 보호하고 신경재생을 증진시키는 약리작용을 지닌 것을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (28)

  1. (1) 신경능선줄기세포(neural crest stem cells, NCSCs)를 분리하여 배양하는 단계;
    (2) 상기 배양된 신경능선줄기세포를 최종 농도 0.1% 내지 1%의 콜라겐 및 최종 농도 0.1% 내지 1%의 피브리노겐을 함유하는 콜라겐 및 피브리노겐 혼합 하이드로젤 내로 함입시키는 단계;
    (3) 상기 신경능선줄기세포가 함입된 콜라겐 및 피브리노겐 혼합 하이드로젤을 물리적 지지가 유지되는 부착배양조건에서 배양하는 단계; 및
    (4) 상기 (3) 단계에서 배양된 콜라겐 및 피브리노겐 혼합 하이드로젤을 물리적 지지가 배제된 부유배양조건에서 배양하는 단계를 포함하는 신경능선줄기세포의 다층세포시트 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 신경능선줄기세포는 말초신경(peripheral nerve, PN)으로부터 분리된 것을 특징으로 하는 신경능선줄기세포의 다층세포시트 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 (2) 단계는 배양된 신경능선줄기세포를 용액 상태의 콜라겐 및 피브리노겐 혼합 하이드로젤에 혼합한 후, 젤 상태로 전환시켜 신경능선줄기세포를 콜라겐 및 피브리노겐 혼합 하이드로젤 내에 3차원적으로 균일하게 분포시키는 것을 특징으로 하는 신경능선줄기세포의 다층세포시트 제조방법.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, 상기 (2) 단계의 배양된 신경능선줄기세포는 트롬빈 및 콜라겐 혼합용액에 첨가된 것을 특징으로 하는 신경능선줄기세포의 다층세포시트 제조방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 (2) 단계의 배양된 신경능선줄기세포는 1 × 106/ml 내지 1 × 108/ml의 밀도인 것을 특징으로 하는 신경능선줄기세포의 다층세포시트 제조방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 (3) 단계의 물리적 지지가 유지되는 부착배양조건은 신경능선줄기세포가 함입된 하이드로젤을 원형, 직사각형, 혹은 정사각형 형태의 몰드 내로 캐스팅(casting)하여 물리적으로 지지되는 조건에서 배양하는 것을 특징으로 하는 신경능선줄기세포의 다층세포시트 제조방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 (3) 단계의 부착배양조건은 세포-세포 간 접합과 세포-하이드로젤 고분자 간 접합을 유도하는 것을 특징으로 하는 신경능선줄기세포의 다층세포시트 제조방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 (3) 단계의 부착배양조건에서의 배양은 신경능선줄기세포에서 생성되어 분비되는 세포외기질 (extracellular matrix, ECM)을 콜라겐 및 피브리노겐 혼합 하이드로젤 내로 축적하는 것을 특징으로 하는 신경능선줄기세포의 다층세포시트 제조방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 세포외기질은 피브로넥틴(fibronectin), 라미닌(laminin) 및 콜라겐 타입 IV(collagen type IV)로 이루어진 것을 특징으로 하는 신경능선줄기세포의 다층세포시트 제조방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 (3) 단계의 부착배양조건에서의 배양은 신경능선줄기세포에서 생성되어 분비되는 안지오포이에틴(angiopoietin; ANGPT)-1, 안지오포이에틴-2, 안지오포이에틴-3 및 안지오포이에틴-4로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 안지오포이에틴 계열, 혈관내피세포 성장인자(vascular endothelial growth factor; VEGF) 또는 혈소판-유래 성장인자(platelet-derived growth factor; PDGF)의 혈관성장인자를 콜라겐 및 피브리노겐 혼합 하이드로젤 내로 축적하는 것을 특징으로 하는 신경능선줄기세포의 다층세포시트 제조방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 (3) 단계의 부착배양조건에서의 배양은 신경능선줄기세포에서 생성되어 분비되는 인터루킨(interleukin; IL)-6, IL-10 또는 형질전환 성장인자(transforming growth factor-β; TGF-β)의 항염증인자를 콜라겐 및 피브리노겐 혼합 하이드로젤 내로 축적하는 것을 특징으로 하는 신경능선줄기세포의 다층세포시트 제조방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 (3) 단계의 부착배양조건에서의 배양은 신경능선줄기세포에서 생성되어 분비되는 신경 성장 인자(nerve growth factor; NGF), 뇌-유래 성장인자(brain-derived growth factor; BDNF), 뉴트로핀-3(neurotrophin-3; NT-3) 및 NT-4/5로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 뉴트로핀 계열; 신경교세포주-유래 신경영양인자(glial cell line-derived neurotrophic factor; GDNF) 또는 아테민(artemin; ARTN)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 GDNF 계열; 에프린(ephrin; EFN) A1, 에프린 A2, 에프린 A4, 에프린 A5, 에프린 B1, 에프린 B2 및 에프린 B3로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 에프린 계열; 섬모 신경 영양 인자(ciliary neurotrophic factor; CNTF), 백혈병 억제 인자(leukemia inhibitory factor; LIF) 및 IL-6으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 CNTF 계열; 아교세포 성숙인자(glial maturation factor; GMF); 뉴레귤린(neuregulin; NRG) 또는 인슐린-유사 성장인자(insulin-like growth factor; IGF)-1의 신경활성인자를 콜라겐 및 피브리노겐 혼합 하이드로젤 내로 축적하는 것을 특징으로 하는 신경능선줄기세포의 다층세포시트 제조방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 (3) 단계의 부착배양조건에서의 배양은 신경능선줄기세포에서 생성되어 분비되는 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor; FGF)-7, FGF-9, FGF-16, FGF-19, FGF-12, FGF-5, FGF-6 및 FGF-14로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 FGF 계열의 신경보호인자 또는 성장인자를 콜라겐 및 피브리노겐 혼합 하이드로젤 내로 축적하는 것을 특징으로 하는 신경능선줄기세포의 다층세포시트 제조방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 (4) 단계의 부유배양조건은 세포-매개 하이드로젤 수축을 유도하여, 하이드로젤 내 수분을 방출시키는 것을 특징으로 하는 신경능선줄기세포의 다층세포시트 제조방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 신경능선줄기세포의 다층세포시트는 10층 내지 50층으로 이루어진 것을 특징으로 하는 신경능선줄기세포의 다층세포시트 제조방법.
  18. 신경능선줄기세포가 함입된 콜라겐 및 피브리노겐 혼합 하이드로젤, 상기 신경능선줄기세포에서 분비되어 축적된 세포외기질; 안지오포이에틴(angiopoietin; ANGPT)-1, 안지오포이에틴-2, 안지오포이에틴-3 및 안지오포이에틴-4로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 안지오포이에틴 계열, 혈관내피세포 성장인자(vascular endothelial growth factor; VEGF) 또는 혈소판-유래 성장인자(platelet-derived growth factor; PDGF)의 혈관성장인자; 인터루킨(interleukin; IL)-6, IL-10 또는 형질전환 성장인자(transforming growth factor-β; TGF-β)의 항염증인자; 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor; FGF)-7, FGF-9, FGF-16, FGF-19, FGF-12, FGF-5, FGF-6 및 FGF-14로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 FGF 계열의 신경보호인자 또는 성장인자 및 신경 성장 인자(nerve growth factor; NGF), 뇌-유래 성장인자(brain-derived growth factor; BDNF), 뉴트로핀-3(neurotrophin-3; NT-3) 및 NT-4/5로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 뉴트로핀 계열; 신경교세포주-유래 신경영양인자(glial cell line-derived neurotrophic factor; GDNF) 또는 아테민(artemin; ARTN)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 GDNF 계열; 에프린(ephrin; EFN) A1, 에프린 A2, 에프린 A4, 에프린 A5, 에프린 B1, 에프린 B2 및 에프린 B3로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 에프린 계열; 섬모 신경 영양 인자(ciliary neurotrophic factor; CNTF), 백혈병 억제 인자(leukemia inhibitory factor; LIF) 및 IL-6으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 CNTF 계열; 아교세포 성숙인자(glial maturation factor; GMF); 뉴레귤린(neuregulin; NRG) 또는 인슐린-유사 성장인자(insulin-like growth factor; IGF)-1의 신경활성인자를 포함하는 신경능선줄기세포의 다층세포시트.
  19. 삭제
  20. 제18항에 있어서, 상기 신경능선줄기세포는 1 × 106/ml 내지 1 × 108/ml의 밀도인 것을 특징으로 하는 신경능선줄기세포의 다층세포시트.
  21. 제18항에 있어서, 상기 신경능선줄기세포의 다층세포시트는 10층 내지 50층으로 이루어진 것을 특징으로 하는 신경능선줄기세포의 다층세포시트.
  22. 제18항에 따른 신경능선줄기세포의 다층세포시트 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 척수 손상 질환 치료용 약학 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 상기 조성물은 손상된 신경 내 축색(axon) 및 수초(myelin) 생성을 증진시키는 것을 특징으로 하는 척수 손상 질환 치료용 약학 조성물.
  24. 제22항에 있어서, 상기 조성물은 손상된 신경 내 염증반응을 억제시키는 것을 특징으로 하는 척수 손상 질환 치료용 약학 조성물.
  25. 제22항에 있어서, 상기 조성물은 손상된 신경 내 혈관생성을 증진시키는 것을 특징으로 하는 척수 손상 질환 치료용 약학 조성물.
  26. 제18항에 따른 신경능선줄기세포의 다층세포시트 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 뇌 손상 질환 치료용 약학 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 상기 조성물은 신경세포 손상을 억제하고, 신경세포 성장 및 분화를 촉진하는 것을 특징으로 하는 뇌 손상 질환 치료용 약학 조성물.
  28. 제18항에 따른 신경능선줄기세포의 다층세포시트 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 말초신경 손상 질환 치료용 약학 조성물.
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