WO2022255836A1 - 조직 내재성 uPAR+/Nestin+ 줄기세포 분리 배양 방법 및 이의 용도 - Google Patents

조직 내재성 uPAR+/Nestin+ 줄기세포 분리 배양 방법 및 이의 용도 Download PDF

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WO2022255836A1
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Definitions

  • the present invention relates to a method for isolating and culturing uPAR+/Nestin+ tissue endogenous stem cells, which play a key role in tissue regeneration and tissue homeostasis in solid tissues, and uses thereof.
  • a conventional method for isolating and culturing stem cells present in solid tissue is a single cell suspension ( A process for manufacturing a single cell suspension) is required.
  • the yield of single cells obtained varies greatly depending on the type of tissue degradation enzyme used, the titer, the reaction time, the reaction temperature, and the type of tissue used.
  • cell damage during the tissue dissociation process has been raised as an unavoidable problem.
  • the tissue dissociation process showed a large difference in cell yield and degree of damage depending on the tissue type, and presented a disadvantage that it was difficult to standardize.
  • the frequency of stem cells in solid tissue is less than 0.1%, and it is widely known that the yield of isolating an effective amount of stem cells through tissue degradation enzymes is extremely low.
  • a subsequent process of separating and purifying the tissue endogenous stem cells from the single cell suspension dissociated from the tissue is required.
  • the process of separating and purifying stem cells uses markers such as c-Kit or Sca-1 to separate cells positive or negative for the marker.
  • markers are markers that are expressed not only in tissue-intrinsic stem cells but also in hematopoietic cells, so unwanted cells can be mixed and separated.
  • stem cells negative for these markers definitely exist, tissue-intrinsic stem cells using specific markers Methods for isolating and purifying cells have limitations.
  • An object of the present invention is to activate tissue endogenous uPAR+/nestin+ stem cells located in solid tissues such as adipose tissue, bone marrow tissue, myocardial tissue, peripheral nerve tissue, skeletal muscle tissue or synovial tissue, induce migratory growth, and isolate to provide a way to do it.
  • Another object of the present invention is to provide tissue endogenous uPAR+ and nestin+ stem cells or a culture solution thereof separated and cultured according to the above method.
  • another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory diseases or autoimmune diseases, comprising the tissue-intrinsic uPAR+ and nestin+ stem cells or their culture medium as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for wound healing or vascular regeneration promotion, comprising the tissue-intrinsic uPAR+ and nestin+ stem cells or their culture medium as an active ingredient.
  • the present invention comprises the steps of (1) preparing a wound repair matrix mimic hydrogel; (2) incorporating the separated tissue sections into the wound repair matrix mimicking hydrogel; and (3) three-dimensionally culturing the wound repair matrix-mimicking hydrogel incorporating the tissue fragment in a culture medium to which a plasminogen activator inhibitor (PAI) is added. provides an activation method.
  • PAI plasminogen activator inhibitor
  • the present invention comprises the steps of (1) preparing a wound repair matrix mimic hydrogel; (2) incorporating the separated tissue sections into the wound repair matrix mimicking hydrogel; (3) three-dimensionally culturing the wound repair matrix mimicking hydrogel incorporating the tissue slice in a culture medium to which PAI is added; (4) removing and washing the three-dimensional culture medium to remove PAI; (5) degrading the wound repair matrix mimicking hydrogel by re-cultivating the PAI-free culture medium with a PAI-free culture medium; and (6) isolating stem cells released from the culture medium.
  • the present invention provides tissue endogenous uPAR+ and nestin+ stem cells or a culture solution thereof, separated and cultured according to the above method.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of inflammatory diseases comprising the tissue-specific uPAR+ and nestin+ stem cells or their culture medium as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of autoimmune diseases comprising the tissue-specific uPAR+ and nestin+ stem cells or their culture medium as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for wound treatment comprising the tissue-endogenous uPAR+ and nestin+ stem cells or their culture medium as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for promoting blood vessel regeneration comprising the tissue-endogenous uPAR+ and nestin+ stem cells or their culture medium as an active ingredient.
  • the present invention relates to a method for separating and culturing tissue-intrinsic uPAR+/Nestin+ stem cells and a use thereof, and provides a method for isolating tissue-intrinsic stem cells present in solid tissues based on uPAR-plasmin activity.
  • the uPAR-plasmin activity of stem cells is closely related to the growth, migration ability, physiological activity, and differentiation ability of stem cells, and can be used as a method for isolating high-titer stem cells.
  • the uPAR+ stem cells isolated from the solid tissue of the present invention have great industrial potential as they can be applied to the production of biopharmaceuticals using secretions including cell therapy agents, tissue engineering therapeutic agents, and exosomes.
  • it can be applied to cell biology, molecular biology basic research and new drug development research related to cell division, migration, growth, and differentiation of tissue endogenous stem cells.
  • Figure 1 shows the expression rates of pFAK, uPAR, nestin, and Ki-67 in constituent cells in organs after in vitro organ culture.
  • 2D monolayer organ culture
  • 3D 3D organ culture
  • AT adipose tissue
  • BM bone marrow
  • Myocar myocardium
  • PN peripheral nerve
  • SM skeletal muscle
  • Syn Synovium. **, p ⁇ 0.01 versus 2D.
  • Figure 2 shows the characteristics of increasing pFAK+, uPAR+, and Nestin+ expressing cells in the myocardium according to 3D myocardial organ culture.
  • Figure 3 shows the characteristics of increasing ki-67 positive cells during cell division in the myocardium according to 3D organ culture.
  • Fig. 5 shows uPAR, nestin and BrdU expression of cells grown in hydrogel after 3D myocardial organ culture.
  • Figure 6 shows the uPAR and nestin expression rates of cells grown by migration into hydrogels after 2 weeks of 3D organ culture.
  • AT adipose tissue
  • BM bone marrow
  • Myocar myocardium
  • PN peripheral nerve
  • SM skeletal muscle
  • Syn Synovium.
  • FIG. 7 shows uPAR mRNA (A) and plasmin activity (B) in organs before and after 3 days of organ culture.
  • AT adipose tissue
  • BM bone marrow
  • Myocar myocardium
  • PN peripheral nerve
  • SM skeletal muscle
  • Syn Synovium. *, p ⁇ 0.05 versus pre-culture; **, p ⁇ 0.01 versus pre-culture.
  • Figure 8 shows that the hydrogel is degraded through the removal of PAI in the culture medium and washing of the culture medium after long-term culture, and the cells that have migrated and grown in the hydrogel are released into the culture medium.
  • Figure 9 shows that the cells that have migrated and grown in the hydrogel are separated from the hydrogel through the removal of PAI in the culture medium and washing of the culture medium, and the free cells are contracted and aggregated (phase contrast micrograph).
  • Figure 10 shows the isolation of free uPAR+ cells in the hydrogel after PAI removal and washing of the culture (paraffin section HE staining and uPAR immunohistochemical staining).
  • Figure 11 shows the cell yield and uPAR expression rate of the cells separated and harvested after PAI removal and culture washing (PAI withdrawn) and separation from the hydrogel after the addition of exogenous Urokinase.
  • AT adipose tissue
  • BM bone marrow
  • Myocar myocardium
  • PN peripheral nerve
  • SM skeletal muscle
  • Syn Synovium. **, p ⁇ 0.01 versus urokinase.
  • FIG. 12 shows the cell yield obtained after repeatedly separating the tissue slices recovered from the hydrogel through repetitive long-term culture after removing PAI and washing the culture.
  • AT adipose tissue
  • BM bone marrow
  • Myocar myocardium
  • PN peripheral nerve
  • SM skeletal muscle
  • Syn Synovium.
  • Figure 13 shows the cell attachment and growth in a monolayer culture environment after seeding the cells harvested after PAI removal and culture washing in a culture container.
  • A Cell aggregates released from the hydrogel after PAI removal and washing.
  • B Cell aggregates harvested from the hydrogel.
  • C-E Attachment and growth of cells at 30 minutes (C), 1 hour (D), and 2 hours (D) after seeding the recovered cells in the culture container (phase contrast micrographs).
  • Figure 15 shows adhesion and growth in a monolayer culture environment of cells released from the hydrogel after removal of PAI and washing of the culture after nerve and myocardial organ culture.
  • FIG. 16 shows immunorepresentation characteristics of cells recovered from hydrogels.
  • A Immunoexpression characteristics of cells released after withdrawal from hydrogel after removal of PAI and washing of culture.
  • B Immunoexpression characteristics of cells released from the hydrogel after exogenous Urokinase treatment.
  • AT adipose tissue
  • BM bone marrow
  • Myocar myocardium
  • PN peripheral nerve
  • SM skeletal muscle
  • Syn Synovium. **, p ⁇ 0.01 versus urokinase (B).
  • FIG. 17 shows the expression rates of hematopoietic cell and vascular endothelial cell markers in cells recovered from the hydrogel.
  • A Expression rate of cells isolated and recovered after removal of PAI and washing of the culture.
  • B Expression rate of cells isolated and recovered after treatment with exogenous Urokinase.
  • AT adipose tissue
  • BM bone marrow
  • Myocar myocardium
  • PN peripheral nerve
  • SM skeletal muscle
  • Syn Synovium. **, p ⁇ 0.01 versus urokinase (B).
  • FIG. 18 shows the self-renewal ability of cells separated and recovered from the hydrogel.
  • A Representative photographs of Colony Forming Unit (CFU).
  • B CFU frequency of cells separated and harvested from hydrogels according to tissue origin. Cells isolated and recovered after treatment with urokinase and exogenous urokinase; Cells isolated and recovered after PAI withdrawal, PAI removal, and culture washing; AT, adipose tissue; BM, bone marrow; Myocar, myocardium; PN, peripheral nerve; SM, skeletal muscle; Syn, Synovium. **, p ⁇ 0.01 versus urokinase.
  • A Population Doubling Time (PDT, cell doubling time).
  • B Population Doubling Level (PDL, cell doubling level).
  • AT adipose tissue;
  • BM bone marrow;
  • Myocar myocardium;
  • PN peripheral nerve;
  • SM skeletal muscle; Syn, Synovium.
  • * p ⁇ 0.05 versus urokinase; **, p ⁇ 0.01 versus urokinase.
  • FIG. 20 shows the Ki-67 expression rate of cells separated and recovered from the hydrogel.
  • FIG. 21 shows the differentiation ability of the cells separated and recovered from the hydrogel into osteoblasts (alizarin red) and adipocytes (Oil Red O).
  • Ostin red alizarin red
  • adipocytes Oleoblasts
  • Cells isolated and recovered after treatment with urokinase and exogenous urokinase Cells isolated and recovered after PAI withdrawal, removal of PAI, and washing of the culture.
  • FIG. 22 shows a comparison of the differentiation abilities of cells separated and recovered from the hydrogel into osteoblasts (alizarin red) and adipocytes (Oil Red O).
  • Ostwald red adipocytes
  • Cells isolated and recovered after PAI withdrawal, PAI removal, and culture washing AT, adipose tissue
  • BM bone marrow
  • Myocar myocardium
  • PN peripheral nerve
  • SM skeletal muscle
  • Syn Synovium. **, p ⁇ 0.01 versus urokinase.
  • Figure 23 shows the tissue regeneration mRNA expression characteristics of the cells separated and recovered from the hydrogel.
  • CB-MSC cord blood-derived mesenchymal stem cells; AT, adipose tissue; BM, bone marrow; Myocar, myocardium; PN, peripheral nerve; SM, skeletal muscle; Syn, Synovium.
  • uPAR- uPAR-negative cells isolated and purified after treatment with exogenous urokinase
  • uPAR+, uPAR+ cells isolated and purified after treatment with exogenous urokinase
  • Cells isolated and harvested after PAI withdrawal, PAI removal and washing of the culture AT, adipose tissue
  • BM bone marrow
  • Myocar myocardium
  • PN peripheral nerve
  • SM skeletal muscle
  • Syn Synovium. *, p ⁇ 0.05 versus uPAR-; **, p, uPAR- versus 0.01. *, p ⁇ 0.05 versus uPAR-; **, p ⁇ 0.01 versus uPAR-.
  • uPAR- uPAR-negative cells isolated and purified after treatment with exogenous urokinase
  • uPAR+, uPAR+ cells isolated and purified after treatment with exogenous urokinase
  • Cells isolated and harvested after PAI withdrawal, PAI removal and washing of the culture AT, adipose tissue
  • BM bone marrow
  • Myocar myocardium
  • PN peripheral nerve
  • SM skeletal muscle
  • Syn Synovium. *, p ⁇ 0.05 versus uPAR-; **, p, uPAR- versus 0.01. *, p ⁇ 0.05 versus uPAR-; **, p ⁇ 0.01 versus uPAR-.
  • FIG. 26 shows the anti-inflammatory ability of cells separated and recovered from the hydrogel. Inhibiting the secretion of TNF ⁇ and IL-1 ⁇ in RAW 264.7 cells sensitized with LPS in the conditioned medium.
  • uPAR+, uPAR+ cells isolated and purified after treatment with exogenous urokinase;
  • Cells isolated and harvested after PAI withdrawal, PAI removal and washing of the culture AT, adipose tissue; BM, bone marrow; Myocar, myocardium; PN, peripheral nerve; SM, skeletal muscle; Syn, Synovium.
  • FIG. 27 shows the growth inducing effect of vascular endothelial cells (HUVEC) and fibroblasts (DF) of the cells separated and recovered from the hydrogel.
  • uPAR+, uPAR+ cells isolated and purified after treatment with exogenous urokinase;
  • uPAR- vascular endothelial cells
  • DF fibroblasts
  • 29 shows a schematic diagram of the present invention compared to the existing technology.
  • the present invention comprises the steps of (1) preparing a hydrogel mimicking a wound repair matrix; (2) incorporating the separated tissue sections into the wound repair matrix mimicking hydrogel; and (3) three-dimensionally culturing the wound repair matrix-mimicking hydrogel incorporating the tissue fragment in a culture medium to which a plasminogen activator inhibitor (PAI) is added. provides an activation method.
  • PAI plasminogen activator inhibitor
  • the wound repair matrix mimicking hydrogel is a fibrin hydrogel in which a 0.25 to 2.5% concentration of a fibrinogen solution and a 0.5 to 5 I.U./mL concentration of a thrombin solution are mixed, and a 0.1 to 0.5% concentration of collagen in the fibrin hydrogel.
  • It may be a fibrin/collagen mixed hydrogel in which the solution is mixed or a fibrin/gelatin mixed hydrogel in which a 0.1 to 0.5% gelatin solution is mixed with the fibrin hydrogel, but is not limited thereto.
  • the tissue may be adipose tissue, bone marrow tissue, myocardial tissue, peripheral nerve tissue, skeletal muscle tissue or synovial tissue, but is not limited thereto.
  • the PAI may be tranexamic acid or aminomethyl benzoic acid, but is not limited thereto.
  • the method activates integrin-FAK cell signal transduction of cells in the tissue to induce cell division and cell growth of tissue endogenous uPAR+ and nestin+ stem cells, but is not limited thereto.
  • the method may induce cell migration and cell growth of the tissue-intrinsic uPAR+ and nestin+ stem cells into the wound repair matrix-mimicking hydrogel, but is not limited thereto.
  • a tissue-specific wound repair matrix is required. It can be prepared using biopolymers by mimicking wound repair matrix components formed by coagulation of blood plasma released from blood vessels after tissue damage.
  • the wound repair matrix may be prepared by using fibrin, collagen, or gelatin alone or in combination.
  • Engineered wound repair substrates have different uPA-plasmin activity depending on the organ, and wound repair substrates resistant to uPA-plasmin activity can be manufactured and used.
  • the wound repair matrix can be prepared by adjusting the content or composition of biopolymers.
  • a wound repair matrix mixed with two or more components such as fibrin-collagen, fibrin-gelatin, or collagen-gelatin may be used.
  • the wound repair matrix of the present invention may be constituted in an amount of 1.0 to 20.0 mg/ml of constituent polymers such as fibrinogen, collagen, and gelatin.
  • the degree of crosslinking can be adjusted to enhance the structural properties of the wound repair matrix, and structural properties can be controlled by adjusting the degree of crosslinking of the wound repair matrix using a crosslinking agent such as Ca++ or Factor XIIIa.
  • Activation of cell signaling pathways is required to induce cell division and growth of stem cells in tissues through in vitro culture. It binds to the cell's integrin ligand and transmits and activates signals that can induce cell growth and migration through the wound repair matrix. It can induce cell division, growth and migration of stem cells in tissue as it supports tissue as a wound repair matrix that can directly bind to cell integrins and transmit signals into cells. Integrin- ⁇ 1-FAK signaling pathway transmits signals through integrin to tissue-intrinsic stem cells and induces activation according to the support of the wound repair matrix, and tissue-intrinsic stem cells increase expression of uPAR and nestin according to the transmitted signals and can induce the division, growth and migration of regenerative stem cells in tissues.
  • the present invention can achieve the above object by preparing a wound repair matrix mimicking hydrogel composed of a polymer having an RGD motif such as fibrin, collagen, gelatin, etc. as a wound repair matrix capable of activating the integrin-FAK cell signaling pathway.
  • the present invention provides a method for inducing cell division, growth and migration of tissue endogenous stem cells by activating the Integrin- ⁇ 1-FAK-uPAR signaling pathway.
  • Signal transduction efficiency to stem cells in tissues is proportional to the density of receptors that can bind integrin ligand.
  • Receptor density that can bind integrin ligand can be achieved by increasing the contact surface with the tissue.
  • the area that can be bonded to cells can be increased, thereby increasing integrin ligand and receptor binding.
  • the efficiency of signal transduction to stem cells in tissues can be increased.
  • the present invention provides a method for activating the Integrin- ⁇ 1-FAK-uPAR signaling pathway by providing an artificial wound repair matrix as a three-dimensional support to tissue.
  • a method of strengthening the signal transduction pathway by providing a three-dimensional bond to tissue slices using a hydrogel capable of sol-gel phase transition as a wound repair substrate.
  • uPA-plasmin activity can vary depending on the tissue, degree of damage and cause. Compared to fat, placenta, and umbilical cord, nervous system tissue has higher uPA-plasmin activity, and as a result, the degree of degradation of wound repair matrix is higher in nervous system tissue.
  • Decomposition of the wound repair matrix can be controlled by adjusting the content of components constituting the wound repair matrix, the molecular weight of the polymer, and the degree of crosslinking.
  • the present invention provides a method for controlling the resistance to uPA-plasmin activity to be increased by increasing the content, molecular weight, and degree of crosslinking of the polymers constituting the wound repair matrix.
  • PAI applicable to the present invention may be selected from the group consisting of aminocaproid acid, tranexamic acid, aprotinin, and aminomethylbenzoic acid.
  • PAI applied to the present invention can be used by adding 10 ⁇ g to 10 mg per ml of hydrogel volume.
  • the present invention provides a method for inducing and supporting the growth and migration of tissue endogenous stem cells during the long-term culture period by adding PAI and maintaining the structural stability of the wound repair matrix.
  • the activity of uPAR-uPA-plasmin in excessive stem cells results in the rapid decomposition of the wound repair matrix-mimicking hydrogel during the in vitro culture process, resulting in the degradation and loss of tissue fragments and the wound repair matrix around the cells.
  • stem cells can attach and migrate Loss of the repair substrate may result, resulting in loss or reduction or loss of cell migration from the tissue into the hydrogel.
  • the present invention controls the excessive plasmin activity of stem cells and tissue slices by adding PAI to control the degradation and loss of excessive wound repair matrix mimicking hydrogel, so that the wound repair matrix mimicking hydrogel physically destroys the tissue slice during the long-term culture period.
  • Provided is a method for maintaining a role as a support substrate and at the same time maintaining a structural and functional role as a substrate on which activated tissue endogenous stem cells can migrate and grow.
  • the present invention comprises the steps of (1) preparing a wound repair matrix mimic hydrogel; (2) incorporating the separated tissue sections into the wound repair matrix mimicking hydrogel; (3) three-dimensionally culturing the wound repair matrix mimicking hydrogel incorporating the tissue slice in a culture medium to which PAI is added; (4) removing and washing the three-dimensional culture medium to remove PAI; (5) degrading the wound repair matrix mimicking hydrogel by re-cultivating the PAI-free culture medium with a PAI-free culture medium; and (6) isolating stem cells released from the culture medium.
  • the wound repair matrix mimicking hydrogel is a fibrin hydrogel in which a 0.25 to 2.5% concentration of a fibrinogen solution and a 0.5 to 5 I.U./mL concentration of a thrombin solution are mixed, and a 0.1 to 0.5% concentration of collagen in the fibrin hydrogel.
  • It may be a fibrin/collagen mixed hydrogel in which the solution is mixed or a fibrin/gelatin mixed hydrogel in which a 0.1 to 0.5% gelatin solution is mixed with the fibrin hydrogel, but is not limited thereto.
  • the tissue may be adipose tissue, bone marrow tissue, myocardial tissue, peripheral nerve tissue, skeletal muscle tissue or synovial tissue, but is not limited thereto.
  • the PAI may be tranexamic acid or aminomethyl benzoic acid, but is not limited thereto.
  • the step (5) induces an increase in uPAR expression in the tissue and decomposes the wound repair matrix mimicking hydrogel through an increase in plasmin activity, but is not limited thereto.
  • tissue-intrinsic uPAR+ and nestin+ stem cells may have enhanced self-renewal ability, in vitro growth ability, differentiation potential, or tissue regeneration inducing ability, but are not limited thereto.
  • the tissue slices recovered from the culture medium in step (5) may further include repeating steps (2) to (5) 1 to 10 times, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a method for selectively isolating uPAR+ stem cells that have migrated and grown into the wound repair matrix.
  • the degradation of the wound repair matrix due to excessive uPAR-plasmin activity can be controlled through the addition of PAI, a method for recovering cells from the wound repair matrix after the targeted migration and growth of stem cells is achieved is provided. As PAI is removed after washing, the wound repair matrix is degraded using the uPAR-plasmin activity characteristic inherent in stem cells, and the stem cells that have migrated and grown in the matrix are liberated and recovered.
  • the present invention provides a method for isolating uPAR+ stem cells from solid tissue without the use of any exogenous protease and subsequent purification, wherein the wound repair matrix is degraded according to uPAR expression rate and plasmin activity in stem cells by uPAR-plasmin. .
  • the present invention provides a method for recovering tissue slices used for organ culture in a state in which the structure and function are preserved by not using any exogenous tissue degradation enzymes. Tissue fragments recovered after long-term culture are preserved in their structure, and thus, a method of inducing migration of uPAR+ tissue endogenous stem cells into the wound repair matrix through repeated long-term culture is provided.
  • the present invention provides a composition of a wound repair matrix that differs in uPAR-uPA-plasmin activity of tissue endogenous stem cells depending on the tissue and is not lost due to degradation by uPAR-uPA-plasmin activity according to the tissue, and controls excessive degradation.
  • uPAR+/nestin+ tissue endogenous stem cells can be used to manufacture stem cell therapeutic agents and stem cell-derived biopharmaceuticals with high self-replication, in vitro growth, differentiation ability, tissue regeneration-inducing gene expression, blood vessel regeneration and wound repair effects.
  • the present invention provides tissue endogenous uPAR+ and nestin+ stem cells or a culture solution thereof, separated and cultured according to the above method.
  • culture medium includes a medium capable of supporting the growth and survival of stem cells in vitro, secretions of cultured stem cells contained in the medium, and the like.
  • the medium used for the culture includes all conventional mediums used in the art suitable for culturing stem cells.
  • Media and culture conditions can be selected according to the type of cell.
  • the medium used for culture is preferably a cell culture minimum medium (CCMM), and generally contains a carbon source, a nitrogen source, and trace elements.
  • Such cell culture minimal media include, for example, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, ⁇ MEM ( ⁇ Minimal essential Medium), GMEM. (Glasgow's Minimal essential Medium), Iscove's Modified Dulbecco's Medium, etc., but are not limited thereto.
  • the present invention is a form containing all of the stem cells, their secretions, and medium components, a form containing only secretions and medium components, a form in which only secretions are separated and used alone or together with stem cells, or by administering only stem cells It is also possible to use it in a form that produces secretions in the body.
  • the stem cells may be obtained using any method commonly known in the art.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of inflammatory diseases comprising the tissue-specific uPAR+ and nestin+ stem cells or their culture medium as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of autoimmune diseases comprising the tissue-specific uPAR+ and nestin+ stem cells or their culture medium as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for wound treatment comprising the tissue-endogenous uPAR+ and nestin+ stem cells or their culture medium as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for promoting blood vessel regeneration comprising the tissue-endogenous uPAR+ and nestin+ stem cells or their culture medium as an active ingredient.
  • Tissue endogenous uPAR+ and nestin+ stem cells of the present invention can be used as a cell therapy agent for the treatment of specific diseases, and the treatment can be direct treatment or pre-treatment of the molecules.
  • the "cell therapy product” means a product that changes the biological properties of cells by proliferating or selecting living autologous, allogenic, or xenogenic cells in vitro in order to restore the function of cells and tissues or by other methods.
  • Drugs used for treatment, diagnosis, and prevention through a series of actions such as
  • the cell therapy may be administered to the human body through any general route as long as it can reach the target tissue.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be prepared using a pharmaceutically suitable and physiologically acceptable adjuvant in addition to the active ingredient, and the adjuvant includes an excipient, a disintegrant, a sweetener, a binder, a coating agent, an expanding agent, a lubricant, and a glidant. Alternatively, a solubilizer such as a flavoring agent may be used.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be preferably formulated as a pharmaceutical composition by including one or more pharmaceutically acceptable carriers in addition to the active ingredient for administration.
  • acceptable pharmaceutical carriers are sterile and biocompatible, and include saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, albumin injection solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol and One or more of these components may be mixed and used, and other conventional additives such as antioxidants, buffers, and bacteriostatic agents may be added if necessary.
  • diluents, dispersants, surfactants, binders, and lubricants may be additionally added to prepare formulations for injections such as aqueous solutions, suspensions, and emulsions, pills, capsules, granules, or tablets.
  • the pharmaceutical formulation form of the pharmaceutical composition of the present invention may be granules, powders, coated tablets, tablets, capsules, suppositories, syrups, juices, suspensions, emulsions, drops or injectable solutions, and sustained-release preparations of active compounds.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered in a conventional manner through intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, intraperitoneal, intrasternal, transdermal, intranasal, inhalational, topical, rectal, oral, intraocular or intradermal routes.
  • An effective amount of the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention means an amount required for preventing or treating a disease.
  • the type of disease the severity of the disease, the type and amount of the active ingredient and other ingredients contained in the composition, the type of formulation and the patient's age, weight, general health condition, sex and diet, administration time, administration route and composition It can be controlled by various factors including secretion rate, duration of treatment, and drugs used concurrently.
  • the present invention provides a method for isolating stem cells without the use of any exogenous tissue-degrading enzyme and without tissue dissociation during the process of isolating endogenous stem cells from solid tissues. Since no exogenous tissue-degrading enzyme is used, the function and structure of the tissue after isolating the stem cells can be preserved, thus providing a method that can be used as a tissue source capable of repeatedly isolating stem cells from the tissue.
  • Tissue endogenous stem cells are known to account for a very small percentage of cells constituting tissues and are usually less than 0.01%. After tissue damage, the number of somatic cells decreases, and stem cells for replacing or regenerating these cells are activated, and the frequency of stem cells increases compared to before damage. After damage, stem cells in the tissue reproduce themselves through cell division and produce daughter progenitor cells, and daughter stem cells migrate to the damaged area.
  • This patent provides a method for inducing self-renewal and cell division of stem cells in tissue slices by activating the tissue homeostasis mechanism in vivo through in vitro culture, and mobilizing the self-replicating and dividing stem cells in vitro to damaged sites.
  • the present invention maximizes the matrix-cellular integrin interaction through three-dimensional support of the wound repair matrix mimicking hydrogel around the tissue slice to activate stem cells in the tissue, cell division, growth and migration to the wound repair matrix mimic hydrogel and provides a method for isolating stem cells that have migrated into the hydrogel.
  • tissue endogenous stem cells are activated, and the activated stem cells have been reported to have increased expression of uPAR or nestin.
  • Expression of uPAR and nestin has been found to play an important role in the growth and migration of stem cells, and uPAR+ and nestin+ cells are known to play a pivotal role in tissue regeneration. Since the expression of uPAR and nestin is increased in reparative stem cells, uPAR and nestin can be applied as major target markers for stem cell isolation.
  • the present invention provides a method for selectively separating and harvesting uPAR+ stem cells by inducing cell division, growth, and migration of tissue-intrinsic uPAR+ and nestin+ stem cells as a result of matrix-cellular integrin pathway activation through in vitro culture.
  • the present invention provides a common method for isolating tissue-intrinsic uPAR+ and nestin+ stem cells from representative solid tissues such as fat, bone marrow, myocardium, nerve, skeletal muscle, and synovial membrane.
  • Tissue-intrinsic uPAR+ and nestin+ stem cells can be used as regenerative medicine treatments because they have self-renewal, high in vitro growth, multipotential characteristics, and high tissue regeneration ability.
  • the wound repair-imitating hydrogel is prepared by mixing fibrinogen, collagen, gelatin or these polymers.
  • Plasma-derived fibrinogen is dissolved in phosphate-buffered saline (PBS) containing 10 to 50 mM CaCl 2 at a concentration of 2.5 to 10 mg/ml to prepare a fibrinogen solution.
  • Thrombin is dissolved in PBS at a concentration of 1 to 10 units/ml to prepare a thrombin solution.
  • Dermal-derived collagen (Matrix BioScience, Germany) or gelatin (befMatrix Collagen, Nitta Gelatin, Japan) is dissolved in 0.1% (wt./vol.) acetic acid, and a collagen solution having a concentration of 1.0 to 20.0 mg/ml is used.
  • 10X buffer solution (Reconstitution Buffer) for preparing a neutral gelatin or collagen solution is prepared with 50 mM NaHCO 3 , 40 mM HEPES, 0.01 N NaOH and mixed with collagen or gelatin solution in a 9:1 volume to obtain a neutral collagen or gelatin solution. manufacture
  • the wound repair matrix mimicking hydrogel is prepared by preparing a fibrin hydrogel with a 0.25 to 2.5% fibrinogen solution and a 0.5 to 5 I.U./mL thrombin solution, and a 0.1 to 0.5% concentration range of collagen or gelatin solution. are mixed during production of fibrin hydrogel to prepare fibrin/collagen or fibrin/gelatin mixed hydrogel.
  • the organs used for culture are adipose tissue (AT), bone marrow (BM), myocardium (Myocar), peripheral nerve (PN), muscle (skeletal muscle (SM)), synovium (Syn) was used. Approval was obtained from the Institutional Ethics Review Committee for research using brain-dead tissues, and tissues donated from brain-dead individuals were used. Hematoma and fibrous tissue attached to the tissue are removed with scissors, and then the donated tissue is cut into 0.2 to 2 mm 3 pieces using a surgical scalpel. Thereafter, the tissue section is suspended in PBS, centrifuged at 1,000 rpm, and the washing process of removing the supernatant is repeated three times.
  • the tissue sections are suspended in a culture medium and cultured by two organ culture methods.
  • the first method was defined as a monolayer (2D) organ culture method in which tissue fragments suspended in a culture solution were seeded in a culture container and cultured on the surface of the culture container.
  • the second method is defined as a 3D organ culture method in which tissue sections are embedded in fibrin, fibrin/collagen or fibrin/gelatin wound repair matrix-mimicking hydrogel and then cultured in a 3-dimension (3D) environment.
  • tissue sections were mixed with 0.25-2.5% fibrinogen solution, mixed with the same amount of 0.5-5 unit/mL thrombin solution in a 1:1 volume, and then polymerized at 37°C for 1 hour. After roughening, the tissue sections were embedded into the fibrin hydrogel.
  • Fat, bone marrow, heart, and muscle were embedded in tissue sections in a fibrin hydrogel mimicking wound repair matrix with a final 0.25–1.25% fibrinogen solution and 0.25–2.5 unit/mL thrombin solution.
  • Nerve and synovial tissue slices were embedded in a wound repair matrix-mimicking fibrin/collagen or gelatin hydrogel consisting of 0.25–2.5% fibrinogen, 0.1–0.5% collagen or gelatin neutral solution, and 0.25–2.5 unit/mL thrombin solution.
  • tissue sections mixed with the wound repair matrix mimicking hydrogel solution were transferred to a 100-mm to 150-mm culture container and then placed in a 37° C. incubator for 1 hour to convert to a gel after polymerization.
  • Long-term culture medium is 45% v/v DMEM, 45% v/v Ham's F12, 10% fetal bovine serum (FBS, Invitrogen), 20 ng/ml EGF, 2 ng/ml bFGF, 10 ng/ml IGF , 10 ⁇ g/ml gentamicin (Invitrogen).
  • the culture solution was added in an amount corresponding to twice the gel capacity, and after the addition of the culture solution, the culture vessel was placed on an orbital shaker and cultured for 14 days while stirring at a speed of 30 rpm. The culture medium was replaced twice a week.
  • tranexamic acid or aminomethyl benzoic acid a PAI
  • a PAI a PAI
  • tranexamic acid or aminomethyl benzoic acid a PAI
  • a PAI a PAI
  • tranexamic acid or aminomethyl benzoic acid at a concentration of 100 to 250 ⁇ g/mL was added to the culture medium to suppress wound repair matrix mimic hydrogel degradation.
  • tranexamic acid or aminomethyl benzoic acid at a concentration of 250 ⁇ 500 ⁇ g/mL was added to the culture medium and cultured.
  • the constituent cells in the tissue slice are activated, and the activated cells proliferate after cell division to replace or regenerate damaged or lost cells.
  • the integrin cell signal transduction pathway is one of the main mechanisms that induce tissue regeneration, and the integrin cell signal transduction is activated according to the binding of cell ligands, extracellular matrix and receptors.
  • tissue slices in a culture vessel after direct seeding of tissue slices in a culture vessel, monolayer culture (2-dimension, 2D) cultured on the surface of the culture vessel and inside of tissue slices cultured in a 3D (3-dimension, 3D) environment after incorporation into a hydrogel
  • pFAK, uPAR, and nestin proteins which are target factors activated as a result of integrin cell signals, were analyzed in constitutive cells.
  • uPAR a sub-target factor of the integrin signaling pathway
  • 3D physical stimulation of the wound repair matrix-mimicking hydrogel can provide a way to significantly increase cell division and growth by activating the signaling pathways of the constituent cells in the organ.
  • pFAK, uPAR, and nestin were expressed in cells in the interstitial space between mature somatic cells, and pFAK, uPAR, and nestin were expressed in pericytes around capillaries rather than capillary vascular endothelial cells.
  • Ki-67 a cell division marker, was not expressed in mature somatic cells and was expressed in less than 1% before culture. However, after 3D organ culture in vitro, the expression rate of Ki-67 increased in proportion to the culture period, and after 2 weeks of organ culture, the expression rate of Ki-67 in the myocardium was 45.7%. Through this, it was confirmed that division and growth of cells in the myocardium could be induced, and Ki-67 was also mainly expressed in pericytes (FIG. 4).
  • cell division and growth can be induced in the myocardium through the 3D wound repair matrix mimicking hydrogel, and division and growth of pFAK+, uPAR+ and nestin+ pericytes can be induced through long-term culture. confirmed that
  • Example 5> In tissue through 3D organ culture uPAR + and nestin + cellular wound healing temperament Induction of migration and growth into mimetic hydrogels
  • Anti-uPAR MAB807, R&D Systems, USA
  • -nestin MAB5326, Millipore, USA
  • -BrdU 347580, BD Biosciences, USA
  • HRP-conjugated secondary antibody ImmPRESS One-Step Polymer Systems, Vector Laboratories, USA
  • hematoxylin H-3401-500 , Vector Laboratories
  • the wound repair matrix mimicking hydrogel serves as an extracellular matrix that can support cell migration and growth, and this can be achieved through the provision of cell adhesion factors such as fibronectin, collagen, and fibrin, which are essential for cell migration.
  • 3D wound repair matrix hydrogel activates the integrin-pFAK cell signal signal transmission pathway through receptor-ligand binding to induce cell division and growth of uPAR+ and nestin+ cells in the organ, and mimic uPAR+ and nestin+ cells as the wound repair matrix Mobilization, migration and growth can be induced with hydrogels.
  • the cells migrated from the myocardium and grown in the hydrogel had uPAR and nestin expression rates of 88.5% and 95.4%, respectively, and showed the same uPAR+ and nestin+ characteristics as cells that were divided and grown after organ culture in the tissue. More than 89.4% of the cells that migrated into the hydrogel were BrdU-positive, which means that the cells synthesized DNA by uptake of BrdU added during organ culture, so most of the cells in the hydrogel were Prove that the cells in the tissue are cells that have migrated after division and growth. BrdU+ cells were not detected in the myocardium before organ culture, and uPAR+ and nestin+ cells were less than 2%.
  • tissue-intrinsic cells were cells that had undergone cell division, growth, and migration to the hydrogel, and no significant difference was observed depending on the tissue (FIG. 6).
  • the culture medium was removed. After adding DMEM, washing was performed while stirring at 30 rpm for 30 minutes, and the washing solution was removed. This washing process was repeated 3 times. After washing, the cells that migrated and grew in the hydrogel were separated and recovered in the following two ways.
  • the hydrogel was degraded for 2 hours after being added to the culture medium, and the cells and tissue fragments freed from the disintegrated hydrogel were transferred to a tube and then 10 at 3,000 rpm. After centrifugation for 10 minutes, the supernatant was removed, and the collected cell and tissue section pellets were suspended in the culture medium.
  • Cells can be separated and collected from the hydrogel by the PAI withdrawal method. After 14 days of long-term culture, the culture medium was removed and washed three times using DMEM to remove the remaining PAI in the culture medium and hydrogel. After adding fresh culture medium, the culture was incubated for 1 hour while stirring at a speed of 30 rpm, and PAI in the culture medium was not added. Cells separated from the hydrogel were collected using a transfer pipette, transferred to tubes, centrifuged at 3,000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was removed. The collected cells and tissue fragment pellet were suspended in a culture medium.
  • the cells separated and collected from the hydrogel were suspended in a culture medium, and the total number of cells was calculated using a hemocytometer, and the uPAR expression rate of the collected cells was analyzed using flow cytometry.
  • uPAR+/nestin+ cells grown after cell division in the tissue induce migration and growth into the hydrogel, and the cells that migrate and grow within the hydrogel become hydrogels according to the plasmin activity of uPAR+/nestin+ cells themselves without exogenous protease. It is intended to provide a method for selectively separating and collecting uPAR+/nestin+ cells by dissolving the gel through this embodiment.
  • uPAR mRNA expression and plasmin activity were evaluated in tissue sections before and after organ culture. Even before in vitro culture, uPAR mRNA expression and plasmin activity were different according to organs, and uPAR mRNA expression and plasmin activity were higher in myocardium, nerve, and skeletal muscle than in other tissues (FIG. 7). In all tissue sections evaluated after organ culture, uPAR mRNA expression and plasmin activity significantly increased compared to before culture. In particular, mRNA expression and plasmin activity were the highest in myocardium, nerve and skeletal muscle. Since Plasmin activity is proportional to uPAR expression, it is possible to induce an increase in uPAR expression in tissues through organ culture, and provides a method to increase plasmin activity in tissues through increased uPAR after organ culture. do.
  • Plasminogen Activator Inhibitor is added in the culture medium during 3D organ culture, and the added PAI can inhibit hydrogel degradation by controlling excessive plasmin and protease activity in organs and cells.
  • PAI Plasminogen Activator Inhibitor
  • cell division and growth in tissue are induced to move and grow into the hydrogel, and then the PAI is removed from the culture medium and hydrogel through washing and washing. and protease activity alone can induce hydrogel disassembly, and as a result, cells that have migrated and grown in the hydrogel are released, and the freed cells can be separated and collected.
  • PAI withdrawal is performed by removing the PAI-containing culture medium, washing it with DMEM three times to remove the PAI remaining in the hydrogel and organs through the washing process, and adding twice the amount of the hydrogel to the culture medium without PAI. did After 30 minutes of incubation, the hydrogel began to degrade as a result of PAI withdrawal. As the hydrogel disintegrated, the cells that migrated within the hydrogel were released from the hydrogel and aggregated between cells, and after 2 hours of culture, tissue sections and cells that migrated grew. The surrounding hydrogel is completely degraded, resulting in dissociation of the cells within the hydrogel (FIG. 8).
  • the wound repair matrix mimicking hydrogel is lost due to cell-specific plasmin and protease activity, and the cells in the hydrogel are released into the culture medium.
  • the cells released in the culture medium have their cytoplasm contracted and aggregated It can be separated and recovered in the form.
  • Hydrogel degradation can be inhibited through the addition of PAI during long-term culture, and the cells in the hydrogel show a spindle-shaped shape as a result of cytoplasmic expansion.
  • degradation begins from the hydrogel around the cells through PAI withdrawal in the culture medium, and as a result, the cytoplasm of the cells shrinks, and as a result of cell-cell junctions, the cells form aggregates, and the aggregated cells are released into the culture medium. (FIG. 9).
  • Cells that have migrated and grown in the hydrogel can be isolated and harvested after PAI withdrawal or urokinase treatment.
  • the present invention compared and evaluated the usefulness of a method for isolating migratory and grown cells in a hydrogel with PAI withdrawal without urokinase treatment.
  • the uPAR expression rate of cells harvested after PAI withdrawal was significantly higher than that of cells harvested after urokinase treatment (FIG. 11B).
  • the yield of selectively isolating uPAR+ cells from tissues with high uPAR expression and plasmin activity was high. This has high hydrogel degradation activity in uPAR+ cells, and as a result, it can be verified that the method is highly efficient in selectively separating uPAR+ cells by removing PAI and washing.
  • the culture medium was removed. After adding DMEM, washing was performed while stirring at 30 rpm for 30 minutes, and the washing solution was removed. The washing process was repeated three times to remove remaining PAI in the culture medium and hydrogel. After adding fresh culture medium, the culture was incubated for 2 hours while stirring at a speed of 30 rpm, and PAI in the culture medium was not added. Cells and tissue fragments separated from the hydrogel were collected using a transfer pipette, transferred to tubes, centrifuged at 3,000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was removed.
  • tissue fragments precipitate faster than cells as a result of their high specific gravity
  • the cell and tissue fragment pellets are dispersed in DMEM, left for 30 seconds to induce sedimentation of the tissue fragments, and only the supernatant is transferred to a new tube. This process is repeated three times. The harvested cells and tissue sections were separated.
  • Tissue sections separated from the hydrogel by the PAI withdrawal method were re-embedded into the hydrogel, followed by 3D organ culture by the method described in Example 2, and 2 weeks later by the method described in Example 7.
  • Cells and tissue sections that had migrated within the gel were separated and harvested.
  • the tissue fragments recovered after PAI withdrawal were subjected to three more consecutive 3D organ cultures to induce migration and growth of cells in the tissue repeatedly, and the cells in the hydrogel were separated and recovered, and the total number of cells separated and recovered was measured using a hemocytometer.
  • tissue sections with preserved structures are recovered, and the recovered tissue sections are subjected to repeated organ culture to isolate cells that have migrated into the hydrogel after organ culture and grown. and provide a method for collection.
  • Treatment with an exogenous protease such as urokinase can degrade the hydrogel and the infiltrated tissue slice, resulting in the loss of the structural and functional microenvironment of the tissue slice.
  • the PAI withdrawal method is a method capable of preserving the structural and functional microenvironment of tissue slices infiltrated together with cells that have migrated and grown in the hydrogel after 3D organ culture. It can be confirmed that this is a method for isolating tissue-intrinsic cells with high efficiency and stability.
  • 3D organ culture After embedding fat, bone marrow, myocardium, nerve, skeletal muscle, and synovial tissue sections in fibrin or fibrin/collagen hydrogel, 3D organ culture was performed. The long-term culture solution was added twice as much as the hydrogel capacity, and the culture vessel was placed on an orbital shaker and cultured for 14 days while stirring at a speed of 30 rpm. To inhibit hydrogel degradation, tranexamic acid, a PAI, was added to the culture medium every day.
  • the culture medium was removed. After adding DMEM, the mixture was washed for 30 minutes while stirring at a speed of 30 rpm, and this washing process was repeated three times. Cells that migrated and grew in the hydrogel after washing were collected after separating the cells by the PAI withdrawal or urokinase method presented in Example 6. After 14 days of long-term culture, the culture medium was removed and washed three times using DMEM to remove the remaining PAI in the culture medium and hydrogel. After adding fresh culture medium, the culture was incubated for 1 hour while stirring at a speed of 30 rpm, and PAI in the culture medium was not added. Cells separated from the hydrogel were collected using a transfer pipette, transferred to tubes, centrifuged at 3,000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was removed. The collected cells and tissue fragment pellet were suspended in a culture medium.
  • Urokinase treatment is performed after washing three times, adding 1,000 unit/mL urokinase to the culture medium, dissolving the hydrogel for 2 hours, collecting cells and tissue fragments freed from the disintegrated hydrogel, transferring them to a tube at 3,000 rpm for 10 minutes After centrifugation, the supernatant was removed, and the collected cell and tissue section pellets were suspended in the culture medium.
  • the cells separated and collected from the hydrogel were seeded at 5,000 cells per cm2 in a polystyrene culture container, and then the culture medium was added.
  • the adhesion and growth characteristics of the cells separated and collected from the hydrogel in a monolayer culture environment were evaluated using a microscope.
  • FIG. 13A After PAI withdrawal, it was confirmed that cell aggregates were formed after being released from the hydrogel (FIG. 13A), and the collected cells were suspended in a culture medium and composed of small circular aggregates (FIG. 13B), and seeded in a PS culture container to form a monolayer. cultured in the environment. Cells harvested in an aggregated state adhered to the culture vessel 30 minutes after seeding (FIG. 13C), the cytoplasm of the cells seeded 1 hour after seeding expanded (FIG. 13D), and the cells were stably attached after 2 hours of culture. and growth of cells around the cell aggregates was confirmed (FIG. 13E).
  • tissue sections such as fat, bone marrow, myocardium, nerve, skeletal muscle, and synovial membrane
  • cells could be stably separated and collected through PAI withdrawal. It was confirmed that all the cells collected within 30 minutes adhered to the culture vessel and stably expanded the cytoplasm, and there was no significant difference according to the tissue (FIG. 14).
  • the culture medium was removed. After adding DMEM, the mixture was washed for 30 minutes while stirring at a speed of 30 rpm, and this washing process was repeated three times. After washing, the cells that migrated and grew in the hydrogel were collected after separating the cells by the PAI withdrawal method. After 14 days of long-term culture, the culture medium was removed and washed three times using DMEM to remove the remaining PAI in the culture medium and hydrogel. After adding fresh culture medium, the culture was incubated for 1 hour while stirring at a speed of 30 rpm, and PAI in the culture medium was not added. Cells separated from the hydrogel were collected using a transfer pipette, transferred to tubes, centrifuged at 3,000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was removed. The collected cells and tissue fragment pellet were suspended in a culture medium.
  • MSC Mesenchymal stem cell
  • Cells grown by migration from the hydrogel as a result of urokinase treatment or PAI withdrawal can be separated and collected. Regardless of the cell collection method, the cells grown in the hydrogel from all cultured tissues showed the same immunorepresentation characteristics as mesenchymal stem cells, with CD29, CD73, CD105, and CD140b expression rates of 90% or more (FIG. 16A). There was no difference in the expression rate of mesenchymal stem cell markers in the cells separated and collected from the hydrogel according to the separation method.
  • Hematopoietic cells and vascular endothelial cells present in tissues may be mixed during the process of separating cells from tissues, and the degree of mixing of these cells may be confirmed by identifying CD31+, CD34+, and CD45+ cells.
  • the expression rate of CD31, CD34, and CD45 was less than 1%, but the cells separated and collected after treatment with Urokinase were 2.8 ⁇ 7.0%, confirming a high mixing of hematopoietic cells and vascular endothelial cells. could (FIG. 17).
  • the method selectively separates and collects uPAR+ and nestin+ cells that have migrated from the tissue into the hydrogel through PAI withdrawal, and at the same time, mixing of hematopoietic cells and vascular endothelial cells during the separation process can be minimized. .
  • CFU colony forming assay
  • the frequency of CFU formation was different depending on the tissue type, in all tissue sections, the cells separated and collected from the hydrogel through PAI withdrawal were significantly higher than those collected after treatment with urokinase (FIG. 18). In particular, cells derived from cardiac muscle, nerve and skeletal muscle showed high colony formation ability compared to cells derived from other tissues. In the case of cells isolated after urokinase treatment, the CFU frequency was 3.1 ⁇ 8.4%, but cells isolated by the PAI withdrawal method had a high CFU frequency of 8.8 ⁇ 37.9%.
  • Self-renewal ability is one of the main characteristics of stem cells, and 3D organ culture can activate stem cells in tissues to induce migration and growth into hydrogels. Stem cells with high self-replication titer can be selectively separated and collected, which is a result proving that uPAR+/nestin+ cells with high plasmin activity are stem cells with high titer (FIG. 18).
  • the cells separated and collected from the hydrogel were transferred to tubes, centrifuged at 3,000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was removed. The cell precipitate was resuspended in the culture medium and then adjusted to a density of 1.0E+06 cells per mL.
  • cell doubling time population doubling time, PDT
  • cell doubling level population doubling level, PDL
  • 3,000 cells per cm 2 were seeded in a T75 flask, cultured for 7 days, and cells were collected after treatment with trypsin/EDTA, and the total number of cells was calculated using a hemocytometer.
  • PDT and PDL were calculated and compared through the number of disseminated cells, the total number of harvested cells, and the culture period.
  • Ki-67 a cell cycle marker
  • In vitro cell growth ability was compared and analyzed by analyzing the anti-Ki67 expression rate by flow cytometry.
  • Ki-67 expression was analyzed by flow cytometry to verify the high growth ability of the cells separated and collected from the hydrogel after PAI withdrawal treatment. Since the Ki-67 marker refers to cells in the cell cycle, the higher the Ki-67 expression rate, the higher the cell growth ability. Cells obtained through PAI withdrawal showed a high Ki-67 expression rate of 58.5 to 75.4%, which was significantly higher than 33.6 to 48.7% in cells obtained after urokinase treatment (FIG. 20).
  • PAI withdrawal is a method for selectively isolating cells with high in vitro growth potential, which supports that uPAR+/nestin+ cells with high plasmin activity are cells with high growth potential.
  • the cells separated and collected from the hydrogel were transferred to tubes, centrifuged at 3,000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was removed. The cell precipitate was resuspended in the culture medium and then adjusted to a density of 1.0E+06 cells per mL. The ability of the cells in the hydrogel to differentiate into adipocytes and osteoblasts was evaluated. After seeding 2.0E+05 cells in a 24-well culture dish, 10% CS, 0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (Sigma), 80 ⁇ M indomethacin (Sigma), 1 ⁇ M DEX, 5 ⁇ g/ml in 90% DMEM After adding mL insulin-added differentiation medium, it was cultured for 14 days.
  • the degree of differentiation of stem cells into adipocytes was examined by staining with 0.5% Oil Red O (Sigma) solution, which is an indicator of fat accumulation in the cytoplasm, for 1 hour at room temperature 2 weeks after differentiation induction, and the triglyceride content in the cytoplasm was measured using the Triglyceride-Glo kit (Promega). evaluated using In order to evaluate the ability to differentiate into osteoblasts, 2.0E+05 cells were seeded in a 24-well culture container, and then ⁇ containing 1 ⁇ M DEX, 50 ⁇ M Ascorbic Acid, 10 mM ⁇ -glycerol phosphate, and 10% calf serum. After adding -MEM, differentiation was induced by culturing for 2 weeks. Whether or not to differentiate into osteoblasts was stained after 2 weeks of induction of differentiation by adding Alizarin Red (Sigma), and the degree of mineral deposition was measured by optical density by measuring absorbance at 520 nm.
  • Oil Red O Sigma
  • FIG. 21 shows that cells separated and collected from the bone marrow were differentiated into osteoblasts (left) and adipocytes (right), and then calcium phosphate crytal accumulation and deposition were confirmed by alizarin red staining, and differentiation into adipocytes was induced.
  • the accumulation of lipids in the cytoplasm of cells can be confirmed by oil red O staining. It was confirmed that all cells derived from all tissue sections had the ability to differentiate into osteoblasts and adipocytes.
  • osteoblast and adipocyte differentiation abilities were compared and evaluated through the OD values measured after dissolving deposited or accumulated mineral cryostal and fat vacuole.
  • OD values measured after dissolving deposited or accumulated mineral cryostal and fat vacuole.
  • the ability of cells separated and collected from the hydrogel by PAI withdrawal to differentiate into osteoblasts and adipocytes was significantly higher than that of cells isolated and collected after treatment with urokinase (FIG. 22).
  • Differentiation into osteoblasts showed high ability in bone marrow, cardiac muscle, and skeletal muscle-derived cells, and differentiation into adipocytes showed high ability in fat, skeletal muscle, and synovial membrane.
  • the cells separated and collected from the hydrogel were transferred to tubes, centrifuged at 3,000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was removed.
  • the cell precipitate was resuspended in the culture medium and then adjusted to a density of 1.0E+06 cells per mL. After seeding 5.0E+06 cells in a T175 flask and culturing for 3 days, 1 mL of TRIzol was added, cell lysate was collected, and stored frozen at -20°C until total RNA was isolated.
  • Total RNA was extracted and purified using the PureLink RNA kit (Thermo Fisher), and cDNA was synthesized using reverse transcriptase.
  • bFGF Basic FGF
  • HGF HGF
  • IGF IGF
  • SDF-1 mRNA expression which plays a major role in tissue protection and regeneration
  • CB-MSC cord blodd-derived mesenchymal stem cells
  • the target mRNA gene was amplified through real-time gene amplification using a target mRNA specific primer and SYBR Green Real-Time PCR kit, and the mRNA expression rate compared to cord blood-derived mesenchymal stem cells (CB-MSC) was evaluated by the 2- ⁇ Ct method.
  • tissue regeneration inducing ability of the collected cells was compared and analyzed through the expression of related mRNAs.
  • tissue regeneration inducing ability of the collected cells was compared and analyzed through the expression of related mRNAs.
  • gene expression inducing tissue regeneration was different. Expression of these genes was high in cardiomyocyte, nerve and skeletal muscle-derived cells. HGF and SDF-1 mRNA were high in cardiomyocyte-derived cells, but IGF in nerve-derived cells. mRNA expression was high [Fig. 23].
  • the expression of all tissue regeneration genes was significantly higher in the cells isolated and collected by PAI withdrawal compared to the cells isolated and collected after urokinase treatment.
  • uPAR+ cells have Ki-67 expression of 40.8 ⁇ 82.4%, which is significantly higher than that of uPAR- cells, Ki-67 expression of 28.1 ⁇ 45.7%. (Fig. 25, right). Cardiac, nerve, and skeletal muscle-derived uPAR+ cells showed higher CFU formation ability and Ki-67 expression compared to other tissues.
  • Anti-inflammatory ability was evaluated using conditioned media containing factors secreted from cells.
  • conditioned media containing factors secreted from cells.
  • UK+uPAR+, UK+uPAR- and PAI withdrawal cells were cultured for 1 week after adding DMEM/F12 serum-free medium seeded with 40,000 cells per cm 2 in a T175 flask.
  • RAW 264.7 cells were suspended in 90% RPMI 1640/10% calf serum, and 100,000 cells per cm 2 were seeded in a 12-multiwell plate and cultured for 1 day.
  • RAW 264.7 cells were sensitized by adding 100 ⁇ g/mL LPS to the culture.
  • the anti-inflammatory ability was evaluated by adding the conditioned medium to the culture medium at a ratio of 1:10.
  • Anti-inflammatory evaluation indicators were compared and evaluated by measuring the levels of TNF ⁇ and IL-1 ⁇ secreted from RAW 264.7 cells by ELISA method.
  • RAW 264.7 cells showed a 5-fold increase in TNF ⁇ and IL-1 ⁇ secretion levels after LPS stimulation. Substances secreted from tissue endogenous stem cells separated and collected from the hydrogels were confirmed to have the ability to inhibit inflammatory cytokine separation of RAW 264.7 cells by 30 to 70% (FIG. 26).
  • the conditioned medium prepared from UK+uPAR+ cells and PAI withdrawal cells showed significantly higher TNF ⁇ and IL-1 ⁇ secretion inhibition ability than UK+uPAR ⁇ cells. Regardless of the tissue of origin, uPAR+ cells showed higher anti-inflammatory effects compared to uPAR- cells.
  • vascular endothelial cells human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were used, and human dermal fibroblasts (DF) were used.
  • the growth-inducing effect of the conditioned medium on the cells was tested.
  • a conditioned medium prepared by the method described in Example 16 was prepared and the efficacy was tested.
  • HUVEC cells and DFs were suspended in 99% DMEM/1% calf serum culture medium, and 4,000 cells per cm2 were seeded in a 24-multiwell plate.
  • the conditioned medium was added at a ratio of 1:9 to the culture medium and cultured for 3 days, and the number of cells after culture was measured using the PicoGreen dsDNA quantitation kit (Invitrogen).
  • the cell growth effect was compared and analyzed by calculating the increase in the number of cells seeded first.
  • the conditioned medium prepared from UK+uPAR+ and PAI withdrawal cells was confirmed to have an effect on promoting HUVEC and DF growth, and showed a significantly higher potency than the conditioned medium prepared from UK+uPAR- cells by more than 30%, but the UK+uPAR+ There was no difference in potency between PAI withdrawal cells (FIG. 27).
  • the conditioned media obtained from myocardial, nerve, and skeletal muscle-derived stem cells were confirmed to have a high growth inducing effect compared to other tissue-derived stem cells.
  • the cytoprotective effect was tested using conditioned media prepared from UK+uPAR- cells, UK+uPAR+ cells, and cells separated and harvested after PAI withdrawal. After suspending HUVECs and DFs in 99% DMEM/1% calf serum culture medium, 5,000 cells per cm 2 were seeded in a 24-multiwell plate. One hour before the induction of H 2 O 2 -mediated cell damage, the conditioned medium was added at a ratio of 1:9 to the culture medium. Cell damage was induced by adding 0.01% H 2 O 2 , and after 6 hours of damage induction, the culture medium was removed and washed twice with PBS. The degree of cell damage was evaluated by annexin V expression rate, and after reacting FITC-conjugated annexin V (BD Biosciences) with the cells, the apoptotic cells were analyzed by flow cytometry.
  • the expression rate of annexin V in HUVECs and DFs treated with UK+uPAR+ cell conditioned medium was 28.7 ⁇ 45.1%, which showed a significantly higher cytoprotective effect than 42.1 ⁇ 71.3% in cells treated with UK+uPAR- cell conditioned medium.
  • a significant difference from the PAI withdrawal cell-derived conditioned medium could not be confirmed.
  • the present invention is achieved through long-term culture supported by artificial wound repair matrix (engineered provisional matrix).
  • Tissue slices are embedded in an artificial provisional matrix and the integrin-FAK cell signaling pathway is activated through the provisional matrix to induce cell division and growth of tissue endogenous stem cells.
  • the stem cells in the tissue move to the provisional matrix and the growth increases in proportion to the activity of uPAR-uPA-plasmin.
  • Excessive provisional matrix decomposition can be controlled through the addition of PAI to control the result of inhibition and cessation of stem cell migration due to decomposition and loss of provisional matrix due to excessive uPAR-uPA-plasmin activity.
  • the present invention provides a technology for isolating and culturing uPAR+ stem cells without the use of any tissue degradation protein and stem cell purification process using markers by using the migration and degradation characteristics of provisional matrix according to uPAR expression.
  • the present invention can be applied to the isolation and culture of uPAR+ stem cells present in solid tissues such as bone marrow, fat, skeletal muscle, heart, peripheral nerves, spinal cord, brain, lung, liver, joint membrane, umbilical cord, placenta, and periodontium.
  • solid tissues such as bone marrow, fat, skeletal muscle, heart, peripheral nerves, spinal cord, brain, lung, liver, joint membrane, umbilical cord, placenta, and periodontium.
  • the present invention provides a method for isolating and culturing stem cells through repeated long-term culture by isolating stem cells without any tissue degradation enzyme treatment so that the tissue fragments used for organ culture can preserve their structure intact.
  • the present invention shows the characteristic of positively expressing common stem cell markers along with uPAR among uPAR-positive tissue endogenous stem cells.
  • mesenchymal stem cell markers CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105 are expressed positively, but hematopoietic stem cell or vascular endothelial cell markers are negative.
  • uPAR-positive stem cells derived from peripheral nerve, spinal cord, and brain tissue show the characteristics of simultaneously expressing markers such as nestin, p75, Sox10, and Sox2.
  • the uPAR-positive stem cells of the present invention show biological characteristics of high secretion of physiologically active factors acting on migration, growth factors, anti-inflammatory factors, stem cell mobilization factors, and tissue regeneration.
  • the uPAR-positive stem cells of the present invention have a high multipotential ability to differentiate into tissue-constituting cells.

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Abstract

본 발명은 조직 내재성 uPAR+/Nestin+ 줄기세포 분리 배양 방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 고형성 조직 내 존재하는 조직 내재성 줄기세포의 uPAR-plasmin 활성도를 기반으로 분리하는 방법을 제공한다. 줄기세포의 uPAR-plasmin 활성도는 줄기세포의 성장, 이동능력, 생리활성도, 그리고 분화능력과 밀접한 관계가 제시되어 고역가 줄기세포를 분리하는 방법으로 활용할 수 있다. 본 발명의 고형성 조직으로부터 분리한 uPAR+ 줄기세포는 세포치료제, 조직공학 치료제, 엑소좀을 포함한 분비물을 이용한 바이오 신약 생산에 적용 가능하여 산업적 가능성이 크다. 또한 본 발명에 있어서, 조직 내재성 줄기세포의 세포분열, 이동, 성장, 그리고 분화에 관계하는 세포생물학적, 분자생물학적 기초 연구와 신약개발 연구에 적용될 수 있다.

Description

조직 내재성 uPAR+/Nestin+ 줄기세포 분리 배양 방법 및 이의 용도
본 발명은 고형성 조직 내 조직 재생 및 조직 항상성에 핵심 역할을 담당하는 uPAR+/Nestin+ 조직 내재성 줄기세포를 분리 배양하는 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
고형성 조직 내 존재하는 줄기세포를 분리 배양하기 위한 통상적 방법은 조직분해 효소(protease) 처리를 통하여 조직을 분해하고 조직을 구성하는 세포를 하나하나 떼어내는 조직해리(tissue dissociation) 후 단일세포 부유액(single cell suspension)을 제조하는 공정이 요구된다. 조직해리 과정은 사용한 조직분해 효소 종류, 역가, 반응시간, 반응온도, 사용한 조직의 종류에 따라 얻어지는 단일세포 수율은 큰 편차를 나타내며, 더불어 조직해리 과정 중 세포 손상은 피할 수 없는 문제로 제기되었다. 그 결과 조직해리 과정은 조직유형에 따라 세포 수율과 손상 정도는 큰 차이를 보이고 표준화하기 어려은 단점이 제시되었다. 특히 고형성 조직 내 줄기세포 빈도는 0.1% 미만으로 조직분해 효소를 통하여 유효한 수량의 줄기세포를 분리할 수 있는 수율이 극히 저조한 한계점은 널리 알려져 있다.
조직으로부터 해리된 단일세포 부유액으로부터 조직 내재성 줄기세포를 분리 정제하는 후속적 공정이 요구된다. 줄기세포를 분리 정제하는 과정은 c-Kit 내지 Sca-1과 같은 표지자를 이용하여 해당 표지자가 양성 혹은 음성인 세포를 분리하게 된다. 그러나 이들 표지자는 조직 내재성 줄기세포뿐만 아니라 조혈계 세포에서도 발현되는 표지자이어서 원하지 않는 세포들이 혼재되어 분리될 수 있으며, 또한 이들 표지자가 음성인 줄기세포가 엄연히 존재하므로 특정 표지자를 이용한 조직 내재성 줄기세포를 분리 정제하는 방법은 한계가 있다.
본 발명의 목적은 지방 조직, 골수 조직, 심근 조직, 말초 신경 조직, 골격근 조직 또는 활액막 조직 등의 고형성 조직 내 위치하는 조직 내재성 uPAR+/nestin+ 줄기세포를 활성화하고, 이동 성장을 유도하고, 분리하는 방법을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 따라 분리배양된 조직 내재성 uPAR+ 및 nestin+ 줄기세포 또는 이의 배양액을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 조직 내재성 uPAR+ 및 nestin+ 줄기세포 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 염증 질환 또는 자가면역질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 조직 내재성 uPAR+ 및 nestin+ 줄기세포 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 창상 치료 또는 혈관 재생 촉진용 약학조성물을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (1) 창상수복기질 모방 하이드로젤을 제조하는 단계; (2) 분리된 조직 절편을 상기 창상수복기질 모방 하이드로젤 내로 함입시키는 단계; 및 (3) 상기 조직 절편이 함입된 창상수복기질 모방 하이드로젤을 플라스미노겐 활성 억제제(plasminogen activator inhibitor; PAI)가 첨가된 배양액에서 3차원 배양하는 단계를 포함하는 조직 내재성 uPAR+ 및 nestin+ 줄기세포의 활성화 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (1) 창상수복기질 모방 하이드로젤을 제조하는 단계; (2) 분리된 조직 절편을 상기 창상수복기질 모방 하이드로젤 내로 함입시키는 단계; (3) 상기 조직 절편이 함입된 창상수복기질 모방 하이드로젤을 PAI가 첨가된 배양액에서 3차원 배양하는 단계; (4) 상기 3차원 배양액을 제거하고 세척하여 PAI를 제거하는 단계; (5) 상기 PAI가 제거된 배양물을 PAI가 함유되지 않은 배양액으로 재배양하여 상기 창상수복기질 모방 하이드로젤을 분해시키는 단계; 및 (6) 상기 재배양액 내에 유리된 줄기세포를 분리하는 단계를 포함하는 조직 내재성 uPAR+ 및 nestin+ 줄기세포의 분리배양 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 따라 분리배양된 조직 내재성 uPAR+ 및 nestin+ 줄기세포 또는 이의 배양액을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조직 내재성 uPAR+ 및 nestin+ 줄기세포 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 염증 질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조직 내재성 uPAR+ 및 nestin+ 줄기세포 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 자가면역질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조직 내재성 uPAR+ 및 nestin+ 줄기세포 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 창상 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조직 내재성 uPAR+ 및 nestin+ 줄기세포 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 혈관 재생 촉진용 약학조성물을 제공한다.
본 발명은 조직 내재성 uPAR+/Nestin+ 줄기세포 분리 배양 방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 고형성 조직 내 존재하는 조직 내재성 줄기세포의 uPAR-plasmin 활성도를 기반으로 분리하는 방법을 제공한다. 줄기세포의 uPAR-plasmin 활성도는 줄기세포의 성장, 이동능력, 생리활성도, 그리고 분화능력과 밀접한 관계가 제시되어 고역가 줄기세포를 분리하는 방법으로 활용할 수 있다. 본 발명의 고형성 조직으로부터 분리한 uPAR+ 줄기세포는 세포치료제, 조직공학 치료제, 엑소좀을 포함한 분비물을 이용한 바이오 신약 생산에 적용 가능하여 산업적 가능성이 크다. 또한 본 발명에 있어서, 조직 내재성 줄기세포의 세포분열, 이동, 성장, 그리고 분화에 관계하는 세포생물학적, 분자생물학적 기초 연구와 신약개발 연구에 적용될 수 있다.
도 1은 체외 장기(臟器)배양 후 장기 내 구성세포의 pFAK, uPAR, nestin, Ki-67 발현율을 나타낸다. 2D, 단층 장기(臟器)배양; 3D, 3D 장기(臟器)배양; AT, 지방 조직(adipose tissue); BM, 골수(bone marrow); Myocar, 심근(myocardium); PN, 말초 신경(peripheral nerve); SM, 골격근(skeletal muscle); Syn, 활액막(Synovium). **, p < 0.01 대비 2D.
도 2는 3D 심근 장기(臟器)배양에 따른 심근 내 pFAK+, uPAR+ 및 Nestin+ 발현 세포가 증가되는 특성을 나타낸다.
도 3은 3D 장기(臟器)배양에 따른 심근 내 세포분열 중인 ki-67 양성 세포가 증가되는 특성을 나타낸다.
도 4는 3D 심근 장기(臟器)배양 기간에 따라 심근 내 pFAK, uPAR, nestin, ki-67 양성 세포 수가 비례하여 증가되는 것을 나타낸다. **, p < 0.01 대비 0 d (배양전).
도 5는 3D 심근 장기(臟器)배양 후 하이드로젤로 이동 성장한 세포의 uPAR, nestin 및 BrdU 발현을 나타낸다.
도 6은 3D 장기(臟器)배양 2주 후 하이드로젤로 이동 성장한 세포의 uPAR 및 nestin 발현율을 나타낸다. AT, 지방 조직(adipose tissue); BM, 골수(bone marrow); Myocar, 심근(myocardium); PN, 말초 신경(peripheral nerve); SM, 골격근(skeletal muscle); Syn, 활액막(Synovium).
도 7은 장기(臟器)배양 전 및 배양 3일 후 장기 내 uPAR mRNA(A) 및 plasmin 활성도(B)를 나타낸다. AT, 지방 조직(adipose tissue); BM, 골수(bone marrow); Myocar, 심근(myocardium); PN, 말초 신경(peripheral nerve); SM, 골격근(skeletal muscle); Syn, 활액막(Synovium). *, p < 0.05 대비 pre-culture(배양 전); **, p < 0.01 대비 pre-culture(배양 전).
도 8은 장기(臟器)배양 후 배양액 내 PAI 제거 및 배양물 세척을 통하여 하이드로젤이 분해되고, 하이드로젤 내 이동 성장한 세포가 배양액 내로 유리되는 것을 나타낸다.
도 9는 배양액 내 PAI 제거 및 배양물 세척을 통하여 하이드로젤 내 이동 성장한 세포가 하이드로젤로부터 떨어져 나와 유리된 세포가 수축되고 및 응집되는 것을 나타낸다(위상차 현미경 사진).
도 10은 PAI 제거 및 배양물 세척 후 하이드로젤 내 uPAR+ 세포가 유리되는 분리를 나타낸다(파라핀 조직절편 HE 염색 및 uPAR 면역조직화학염색).
도 11은 PAI 제거 및 배양물 세척(PAI withdrawn)과 외인성 Urokinase 첨가 후 하이드로젤로부터 분리 후 수거한 세포 수율과 분리 수거한 세포의 uPAR 발현율을 나타낸다. AT, 지방 조직(adipose tissue); BM, 골수(bone marrow); Myocar, 심근(myocardium); PN, 말초 신경(peripheral nerve); SM, 골격근(skeletal muscle); Syn, 활액막(Synovium). **, p < 0.01 대비 urokinase.
도 12는 PAI 제거 및 배양물 세척 후 회수한 조직 절편은 반복적 장기(臟器)배양을 통하여 하이드로젤로부터 반복적으로 분리 후 수거한 세포 수율을 나타낸다. AT, 지방 조직(adipose tissue); BM, 골수(bone marrow); Myocar, 심근(myocardium); PN, 말초 신경(peripheral nerve); SM, 골격근(skeletal muscle); Syn, 활액막(Synovium).
도 13은 PAI 제거 및 배양물 세척 후 수거한 세포를 배양용기에 파종 후 단층 배양환경에서 세포의 부착과 성장을 나타낸다. A, PAI 제거 및 수세 후 하이드로젤로부터 유리된 세포의 응집체. B, 하이드로젤로부터 수거한 세포 응집체. C-E, 회수한 세포를 배양용기에 파종 후 30분(C), 1시간(D) 및 2시간(D)째 세포의 부착 및 성장(위상차 현미경 사진).
도 14는 지방 조직, 골수, 심근, 신경, 골격근 및 활액막 장기(臟器)배양 후 PAI 제거 및 배양물 세척 후 하이드로젤로 유리한 세포(상)와 회수한 세포를 파종 후 배양용기에 부착하고 성장하는 모습을 종 후 부착하고 성장(하)하는 결과를 나타낸다(위상차 현미경 사진).
도 15는 신경 및 심근 장기(臟器)배양 후 PAI 제거 및 배양물 세척 후 하이드로젤로부터 유리된 세포의 단층배양 환경에서 부착과 성장을 나타낸다.
도 16은 하이드로젤로부터 회수한 세포의 면역표현 특성을 나타낸다. A, PAI 제거 및 배양물 세척 후 하이드로젤로부터 withdrawal 후 유리된 세포의 면역표현 특성. B, 외인성 Urokinase 처리 후 하이드로젤로부터 유리된 세포의 면역표현 특성. AT, 지방 조직(adipose tissue); BM, 골수(bone marrow); Myocar, 심근(myocardium); PN, 말초 신경(peripheral nerve); SM, 골격근(skeletal muscle); Syn, 활액막(Synovium). **, p < 0.01 대비 urokinase (B).
도 17은 하이드로젤로부터 회수한 세포의 조혈세포 및 혈관내피세포 표지자 발현율을 나타낸다. A, PAI 제거 및 배양물 세척 후 분리 회수한 세포의 발현율. B, 외인성 Urokinase 처리 후 분리 회수한 세포의 발현율. AT, 지방 조직(adipose tissue); BM, 골수(bone marrow);Myocar, 심근(myocardium); PN, 말초 신경(peripheral nerve); SM, 골격근(skeletal muscle); Syn, 활액막(Synovium). **, p < 0.01 대비 urokinase (B).
도 18은 하이드로젤로부터 분리 회수한 세포의 자기복제 능력을 나타낸다. A; Colony Forming Unit (CFU) 대표적 사진. B; 조직 기원에 따른 하이드로젤로부터 분리 수거한 세포의 CFU 빈도. Urokinase, 외인성 urokinase 처리 후 분리 회수한 세포; PAI withdrawal, PAI 제거 및 배양물 세처 후 분리 회수한 세포; AT, 지방 조직(adipose tissue); BM, 골수(bone marrow); Myocar, 심근(myocardium); PN, 말초 신경(peripheral nerve); SM, 골격근(skeletal muscle); Syn, 활액막(Synovium). **, p < 0.01 대비 urokinase.
도 19는 하이드로젤로부터 분리 회수한 세포의 체외 성장능력을 나타낸다. A; Population Doubling Time(PDT, 세포배가시간). B; Population Doubling Level(PDL, 세포배가수준). Urokinase, 외인성 urokinase 처리 후 분리 회수한 세포; PAI withdrawal, PAI 제거 및 배양물 세처 후 분리 회수한 세포; AT, 지방 조직(adipose tissue); BM, 골수(bone marrow); Myocar, 심근(myocardium); PN, 말초 신경(peripheral nerve); SM, 골격근(skeletal muscle); Syn, 활액막(Synovium). *, p < 0.05 대비 urokinase; **, p < 0.01 대비 urokinase.
도 20은 하이드로젤로부터 분리 회수한 세포의 Ki-67 발현율을 나타낸다. Urokinase, 외인성 urokinase 처리 후 분리 회수한 세포; PAI withdrawal, PAI 제거 및 배양물 세처 후 분리 회수한 세포; AT, 지방 조직(adipose tissue); BM, 골수(bone marrow), Myocar, 심근(myocardium); PN, 말초 신경(peripheral nerve); SM, 골격근(skeletal muscle); Syn, 활액막(Synovium). **, p < 0.01 대비 urokinase.
도 21은 하이드로젤로부터 분리 회수한 세포의 조골세포(alizarin red) 및 지방세포(Oil Red O)로의 분화능력을 나타낸다. Urokinase, 외인성 urokinase 처리 후 분리 회수한 세포; PAI withdrawal, PAI 제거 및 배양물 세처 후 분리 회수한 세포.
도 22는 하이드로젤로부터 분리 회수한 세포의 조골세포(alizarin red) 및 지방세포(Oil Red O)로의 분화능력 비교를 나타낸다. Urokinase, 외인성 urokinase 처리 후 분리 회수한 세포; PAI withdrawal, PAI 제거 및 배양물 세처 후 분리 회수한 세포; AT, 지방 조직(adipose tissue); BM, 골수(bone marrow); Myocar, 심근(myocardium); PN, 말초 신경(peripheral nerve); SM, 골격근(skeletal muscle); Syn, 활액막(Synovium). **, p < 0.01 대비 urokinase.
도 23은 하이드로젤로부터 분리 회수한 세포의 조직재생 mRNA 발현특성을 나타낸다. Urokinase, 외인성 urokinase 처리 후 분리 회수한 세포; PAI withdrawal, PAI 제거 및 배양물 세처 후 분리 회수한 세포; CB-MSC, cord blood-derived mesenchymal stem cells; AT, 지방 조직(adipose tissue); BM, 골수(bone marrow); Myocar, 심근(myocardium); PN, 말초 신경(peripheral nerve); SM, 골격근(skeletal muscle); Syn, 활액막(Synovium). *, p < 0.05 대비 urokinase; **, p < 0.01 대비 urokinase.
도 24는 하이드로젤로부터 분리 회수한 세포의 plasmin 활성도 및 nestin 발현율을 나타낸다. uPAR-, 외인성 urokinase 처리 후 분리 정제한 uPAR 음성 세포; uPAR+, 외인성 urokinase 처리 후 분리 정제한 uPAR+ 세포; PAI withdrawal, PAI 제거 및 배양물 세척 후 분리 수거한 세포; AT, 지방 조직(adipose tissue); BM, 골수(bone marrow); Myocar, 심근(myocardium); PN, 말초 신경(peripheral nerve); SM, 골격근(skeletal muscle); Syn, 활액막(Synovium). *, p < 0.05 대비 uPAR-; **, p , 0.01 대비 uPAR-. *, p < 0.05 대비 uPAR-; **, p < 0.01 대비 uPAR-.
도 25는 하이드로젤로부터 분리 회수한 세포의 자기복제(CFU) 및 체외 성장(Ki-67) 능력을 나타낸다. uPAR-, 외인성 urokinase 처리 후 분리 정제한 uPAR 음성 세포; uPAR+, 외인성 urokinase 처리 후 분리 정제한 uPAR+ 세포; PAI withdrawal, PAI 제거 및 배양물 세척 후 분리 수거한 세포; AT, 지방 조직(adipose tissue); BM, 골수(bone marrow); Myocar, 심근(myocardium); PN, 말초 신경(peripheral nerve); SM, 골격근(skeletal muscle); Syn, 활액막(Synovium). *, p < 0.05 대비 uPAR-; **, p , 0.01 대비 uPAR-. *, p < 0.05 대비 uPAR-; **, p < 0.01 대비 uPAR-.
도 26은 하이드로젤로부터 분리 회수한 세포의 항염증 능력을 나타낸다. 조건배지의 LPS로 감작한 RAW 264.7 세포의 TNFα 및 IL-1β의 분비 억제효력. uPAR-, 외인성 urokinase 처리 후 분리 정제한 uPAR 음성 세포; uPAR+, 외인성 urokinase 처리 후 분리 정제한 uPAR+ 세포; PAI withdrawal, PAI 제거 및 배양물 세척 후 분리 수거한 세포; AT, 지방 조직(adipose tissue); BM, 골수(bone marrow); Myocar, 심근(myocardium); PN, 말초 신경(peripheral nerve); SM, 골격근(skeletal muscle); Syn, 활액막(Synovium). *, p < 0.05 대비 uPAR-; **, p , 0.01 대비 uPAR-. *, p < 0.05 대비 uPAR-; **, p < 0.01 대비 uPAR-.
도 27은 하이드로젤로부터 분리 회수한 세포의 혈관내피세포(HUVEC) 및 섬유아세포(DF) 성장 유도효력을 나타낸다. uPAR-, 외인성 urokinase 처리 후 분리 정제한 uPAR 음성 세포; uPAR+, 외인성 urokinase 처리 후 분리 정제한 uPAR+ 세포; PAI withdrawal, PAI 제거 및 배양물 세척 후 분리 수거한 세포; AT, 지방 조직(adipose tissue); BM, 골수(bone marrow); Myocar, 심근(myocardium); PN, 말초 신경(peripheral nerve); SM, 골격근(skeletal muscle); Syn, 활액막(Synovium). *, p < 0.05 대비 uPAR-; **, p , 0.01 대비 uPAR-. *, p < 0.05 대비 uPAR-; **, p < 0.01 대비 uPAR-.
도 28은 하이드로젤로부터 분리 회수한 세포의 혈관내피세포(HUVEC) 및 섬유아세포(DF) 세포보호 효력을 나타낸다. uPAR-, 외인성 urokinase 처리 후 분리 정제한 uPAR 음성 세포; uPAR+, 외인성 urokinase 처리 후 분리 정제한 uPAR+ 세포; PAI withdrawal, PAI 제거 및 배양물 세척 후 분리 수거한 세포; AT, 지방 조직(adipose tissue); BM, 골수(bone marrow); Myocar, 심근(myocardium); PN, 말초 신경(peripheral nerve); SM, 골격근(skeletal muscle); Syn, 활액막(Synovium). *, p < 0.05 대비 uPAR-; **, p , 0.01 대비 uPAR-. *, p < 0.05 대비 uPAR-; **, p < 0.01 대비 uPAR-.
도 29는 기존 기술 대비 본 발명의 모식도를 나타낸다.
본 발명은 (1) 창상수복기질 모방 하이드로젤을 제조하는 단계; (2) 분리된 조직 절편을 상기 창상수복기질 모방 하이드로젤 내로 함입시키는 단계; 및 (3) 상기 조직 절편이 함입된 창상수복기질 모방 하이드로젤을 플라스미노겐 활성 억제제(plasminogen activator inhibitor; PAI)가 첨가된 배양액에서 3차원 배양하는 단계를 포함하는 조직 내재성 uPAR+ 및 nestin+ 줄기세포의 활성화 방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 창상수복기질 모방 하이드로젤은 0.25 ~ 2.5% 농도의 피브리노겐 용액 및 0.5 ~ 5 I.U./mL 농도의 트롬빈 용액이 혼합된 피브린 하이드로젤, 상기 피브린 하이드로젤에 0.1 ~ 0.5% 농도의 콜라겐 용액이 혼합된 피브린/콜라겐 혼합 하이드로젤 또는 상기 피브린 하이드로젤에 0.1 ~ 0.5% 농도의 젤라틴 용액이 혼합된 피브린/젤라틴 혼합 하이드로젤일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 조직은 지방 조직, 골수 조직, 심근 조직, 말초 신경 조직, 골격근 조직 또는 활액막 조직일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는 상기 PAI는 트라넥사민산(tranexamic acid) 또는 아미노메틸 벤조익산(aminomethyl benzoic acid)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 방법은 조직 내 세포의 인테그린(integrin)-FAK 세포신호 전달을 활성화시켜, 조직 내재성 uPAR+ 및 nestin+ 줄기세포의 세포분열 및 세포성장을 유도할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 방법은 상기 조직 내재성 uPAR+ 및 nestin+ 줄기세포의 창상수복기질 모방 하이드로젤 내로 세포이동 및 세포성장을 유도할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 uPAR+ 및 및 nestin+ 조직 내재성 줄기세포를 창상수복기질로의 이동을 유도하기 위하여 조직 맞춤 창상수복기질이 요구된다. 조직손상 후 혈관으로부터 유리된 혈장이 응고되어 형성되는 창상수복기질 성분을 모방하여 생체고분자를 이용하여 제조할 수 있다. 본 발명은 창상수복기질은 피브린, 콜라겐, 젤라틴을 단독 혹은 혼합하여 제조할 수 있다. 공학적 창상수복기질은 장기에 따라 uPA-plasmin 활성도는 차이가 나며, uPA-plasmin 활성에 저항성을 지닌 창상수복기질을 제조하여 사용할 수 있다. 창상수복기질은 생체고분자의 함량 혹은 조성을 조절하여 제조할 수 있다. 즉, 피브린-콜라겐, 피브린-젤라틴, 콜라겐-젤라틴 등 두 가지 이상 성분으로 혼합한 창상수복기질을 사용할 수 있다. 본 발명의 창상수복기질은 구성 고분자인 피브리노겐, 콜라겐, 젤라틴 구성 고분자는 1.0에서 20.0 mg/ml 함량으로 구성할 수 있다. 창상수복기질의 구조적 특성을 강화하기 위하여 가교도를 조절할 수 있으며, Ca++ 혹은 Factor XIIIa와 같은 가교제를 이용하여 창상수복기질의 가교 정도를 조절하여 구조적 물성을 조절할 수 있다.
체외배양을 통하여 조직 내 줄기세포의 세포분열과 성장을 유도하기 위하여 세포신호전달 경로의 활성화가 요구된다. 세포의 integrin ligand와 결합하여 세포의 성장과 이동을 유도할 수 있는 신호를 창상수복기질을 통하여 전달하고 활성 할 수 있다. 세포의 integrins와 직접 결합하여 세포 내로 신호를 전달할 수 있는 창상수복기질로 조직을 지지함에 따라 조직 내 줄기세포의 세포분열, 성장과 이동을 유도할 수 있다. Integrin-β1-FAK 신호전달 경로는 창상수복기질 지지에 따라 integrin을 통하여 조직 내재성 줄기세포에 신호를 전달하고 활성화를 유도하고, 조직 내재성 줄기세포는 전달된 신호에 따라 uPAR 및 nestin 발현이 증가되고, 조직 내재생 줄기세포의 분열, 성장과 이동을 유도할 수 있다. 본 발명은 integrin-FAK 세포신호전달 경로를 활성화할 수 있는 창상수복기질은 피브린, 콜라겐, 젤라틴 등과 같은 RGD motif를 가진 고분자로 구성된 창상수복기질 모방 하이드로젤을 제조하여 상기 목적을 달성할 수 있다.
본 발명은 조직 내재성 줄기세포의 세포분열, 성장과 이동은 Integrin-β1-FAK-uPAR 신호전달경로를 활성화하여 유도하는 방법을 제공한다. 조직 내 줄기세포로의 신호전달 효율은 integrin ligand와 결합할 수 있는 수용체의 밀도와 비례한다. Integrin ligand와 결합할 수 있는 수용체 밀도는 조직과 접촉면을 높임으로써 달성할 수 있다. 2차원보다 3차원 환경을 제공하여 결과적으로 세포와 접합할 수 있는 면적을 증가함으로써 integrin ligand와 수용체 결합을 증가시킬 수 있다. 그 결과 조직 내 줄기세포로 신호전달 효율을 높일 수 있다. 본 발명은 인공적 창상수복기질을 3차원적 지지를 조직에 제공하여 Integrin-β1-FAK-uPAR 신호전달경로를 활성화하는 방법을 제공한다. 이를 위하여 sol-gel 상전이 할 수 있는 하이드로젤을 창상수복기질로 조직절편에 3차원적 결합을 제공하여 신호전달경로를 강화하는 방법을 제공한다.
uPA-plasmin 활성도는 조직, 손상 정도와 원인에 따라 달라질 수 있다. 지방, 태반, 제대와 비교하여 신경계 조직은 uPA-plasmin 활성도가 높으며, 그 결과 창상수복기질의 분해 정도는 신경계 조직이 높다. 창상수복기질의 분해는 창상수복기질을 구성하는 구성 성분의 함량, 고분자 분자량, 가교 정도를 조절하여 제어할 수 있다. 본 발명은 창상수복기질 구성 고분자의 함량, 분자량, 그리고 가교 정도를 높여 증가시킬 uPA-plasmin 활성도에 대한 저항도를 조절하는 방법을 제공한다. 더불어 PAI 첨가를 통하여 uPA-plasmin 활성도를 조절하여 지속적으로 창상수복기질에서 조직 내 줄기세포의 활성, 성장 과 이동을 유도하는 방법을 제공한다. 본 발명에 적용할 수 있는 PAI는 아미노카프로이드산(aminocaproid acid), 트란이그제믹산(tranexamic acid), 아프로티닌(aprotinin) 및 아미노메틸벤조익산(aminomethylbenzoic acid)로 이루어진 군에서 선택할 수 있다. 본 발명에 적용되는 PAI는 하이드로젤 용량 ml 당 10 μg~ 10 mg 농도를 첨가하여 사용할 수 있다. 그 결과 본 발명은 PAI 첨가와 창상수복기질의 구조적 안정성을 유지하여 조직 내재성 줄기세포의 성장과 이동은 장기배양 기간 중 유도 지지하는 방법을 제공한다.
과도한 줄기세포의 uPAR-uPA-plasmin의 활성도는 체외 배양과정 중 창상수복기질 모방 하이드로젤의 급격한 분해 결과 조직절편 및 세포 주위 창상수복기질이 분해 소실되며, 그 결과 줄기세포가 부착하고 이동할 수 있는 칭싱수복기질이 소실되는 결과가 초래되어, 조직으로부터 하이드로젤 내로 세포 이동이 소실 혹은 감소 혹은 소실되는 결과를 초래할 수 있다. 본 발명은 과도한 창상수복기질 모방 하이드로젤의 분해 및 소실을 제어하기 위하여 PAI를 첨가하여 줄기세포 및 조직절편의 과도한 plasmin 활성도를 제어하여 창상수복기질모방 하이드로젤이 장기배양 기간 중 조직절편을 물리적으로 지지 기질로서 역할을 유지하고, 동시에 활성화된 조직 내재성 줄기세포가 이동 성장할 수 있는 기질로서의 구조 기능적 역할을 유지 지속하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (1) 창상수복기질 모방 하이드로젤을 제조하는 단계; (2) 분리된 조직 절편을 상기 창상수복기질 모방 하이드로젤 내로 함입시키는 단계; (3) 상기 조직 절편이 함입된 창상수복기질 모방 하이드로젤을 PAI가 첨가된 배양액에서 3차원 배양하는 단계; (4) 상기 3차원 배양액을 제거하고 세척하여 PAI를 제거하는 단계; (5) 상기 PAI가 제거된 배양물을 PAI가 함유되지 않은 배양액으로 재배양하여 상기 창상수복기질 모방 하이드로젤을 분해시키는 단계; 및 (6) 상기 재배양액 내에 유리된 줄기세포를 분리하는 단계를 포함하는 조직 내재성 uPAR+ 및 nestin+ 줄기세포의 분리배양 방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 창상수복기질 모방 하이드로젤은 0.25 ~ 2.5% 농도의 피브리노겐 용액 및 0.5 ~ 5 I.U./mL 농도의 트롬빈 용액이 혼합된 피브린 하이드로젤, 상기 피브린 하이드로젤에 0.1 ~ 0.5% 농도의 콜라겐 용액이 혼합된 피브린/콜라겐 혼합 하이드로젤 또는 상기 피브린 하이드로젤에 0.1 ~ 0.5% 농도의 젤라틴 용액이 혼합된 피브린/젤라틴 혼합 하이드로젤일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 조직은 지방 조직, 골수 조직, 심근 조직, 말초 신경 조직, 골격근 조직 또는 활액막 조직일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 PAI는 트라넥사민산(tranexamic acid) 또는 아미노메틸 벤조익산(aminomethyl benzoic acid)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 (5) 단계는 상기 조직 내 uPAR 발현 증가를 유도하고, 플라스민(plasmin) 활성도 증가를 통해, 상기 창상수복기질 모방 하이드로젤을 분해시킬 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 조직 내재성 uPAR+ 및 nestin+ 줄기세포는 자기복제능, 체외 성장능, 분화능 또는 조직재생 유도능이 증진된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 (5) 단계의 재배양액으로부터 회수된 조직 절편은 상기 (2) 단계 내지 (5) 단계를 1 내지 10회 반복하는 과정을 더 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 창상수복기질 내로 이동과 성장한 uPAR+ 줄기세포를 선택적으로 분리하는 방법을 제공한다. PAI 첨가를 통하여 과도한 uPAR-plasmin 활성에 의하여 창상수복기질이 분해되는 것을 제어할 수 있으나, 목표로 한 줄기세포의 이동과 성장이 달성된 후 창상수복기질로부터 세포를 회수하는 방법을 제공한다. PAI를 세척 후 제거함에 따라 줄기세포 내재 uPAR-plasmin 활성 특성을 이용하여 창상수복기질이 분해되어 기질 내 이동 성장한 줄기세포가 유리되어 회수하는 방법을 제공한다. 본 발명은 uPAR-plasmin에 의하여 줄기세포에서 uPAR 발현율 및 plasmin 활성도에 따라 창상수복기질이 분해되고, 어떠한 외인성 protease 사용 없이 그리고 후속적 정제과정 없이 고형성 조직으로부터 uPAR+ 줄기세포를 분리하는 방법을 제공한다.
본 발명은 어떠한 외인성 조직분해효소를 사용하지 않음으로써 장기배양에 사용한 조직절편의 구조와 기능이 보존된 상태로 회수하는 방법을 제공한다. 장기배양 후 회수한 조직절편은 그 구조가 보존되어 반복적 장기배양을 통하여 uPAR+ 조직 내재성 줄기세포를 창상수복기질 내로 이동을 유도하여 회수하는 방법을 제공한다.
본 발명은 조직에 따라 조직 내재성 줄기세포의 uPAR-uPA-plasmin 활성도가 차이가 나며, 조직에 따른 uPAR-uPA-plasmin 활성도에 분해되어 소실되지 않는 창상수복기질의 조성을 제공하며, 과도한 분해를 제어할 수 있는 조직에 따른 PAI 유형과 농도를 제공한다.
최종 창상수복기질 모방 하이드로젤 내 이동 성장한 uPAR+/nestin+ 조직 내재성 줄기세포를 PAI 수세 및 제거(PAI withdrawal)함으로써 후속적인 정제 과정없이 고 순도 줄기세포를 분리하는 방법을 제공한다. uPAR+/nestin+ 조직 내재성 줄기세포는 높은 자기복제, 체외 성장, 분화 능력, 조직재생 유도 유전자 발현, 혈관재생 및 창상수복 효력을 지닌 줄기세포치료제 및 줄기세포 유래 바이오 의약품 제조에 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 따라 분리배양된 조직 내재성 uPAR+ 및 nestin+ 줄기세포 또는 이의 배양액을 제공한다.
본 발명에 있어서, "배양액"은 생체 외에서 줄기세포 성장 및 생존을 지지할 수 있게 하는 배지, 상기 배지에 포함된 배양된 줄기세포의 분비물 등을 포함한다. 배양에 사용되는 배지는 줄기세포의 배양에 적절한 당 분야에서 사용되는 통상의 배지를 모두 포함한다. 세포의 종류에 따라 배지와 배양 조건을 선택할 수 있다. 배양에 사용되는 배지는 바람직하게는 세포 배양 최소 배지(cell culture minimum medium: CCMM)로, 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 이런 세포 배양 최소 배지에는 예들 들어, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, αMEM(α Minimal essential Medium), GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium), Iscove's Modified Dulbecco's Medium 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다.
한편, 본 발명은 상기 줄기세포, 이의 분비물, 배지 성분을 모두 포함하는 형태, 분비물 및 배지성분만을 포함하는 형태, 분비물만을 분리하여 단독으로 또는 줄기세포와 함께 사용하는 형태, 또는 줄기세포만을 투여하여 체내에서 분비물을 생성하는 형태로 사용하는 것도 모두 가능하다.
상기 줄기세포는 통상적으로 당업계에 공지된 어떠한 방법을 이용하여 획득할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 조직 내재성 uPAR+ 및 nestin+ 줄기세포 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 염증 질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조직 내재성 uPAR+ 및 nestin+ 줄기세포 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 자가면역질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조직 내재성 uPAR+ 및 nestin+ 줄기세포 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 창상 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조직 내재성 uPAR+ 및 nestin+ 줄기세포 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 혈관 재생 촉진용 약학조성물을 제공한다.
본 발명의 조직 내재성 uPAR+ 및 nestin+ 줄기세포는 특정 질환의 치료를 위한 세포치료제로 이용될 수 있으며, 상기 처리는 상기 분자들의 직접적인 처리 또는 전-처리일 수 있다.
상기 "세포치료제"란, 세포와 조직의 기능을 복원하기 위하여 살아 있는 자가(autologous), 동종(allogenic), 이종(xenogenic) 세포를 체외에서 증식, 선별하거나 여타 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등 일련의 행위를 통하여 치료, 진단, 예방 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다.
상기 세포 치료제는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 인체에 투여될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등의 가용화제를 사용할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 투여를 위해서 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 포함하여 의약 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 약제 제제 형태는 과립제, 산제, 피복정, 정제, 캡슐제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있다. 본 발명의 의약 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다. 본 발명의 의약 조성물의 유효성분의 유효량은 질환의 예방 또는 치료 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.
본 발명은 고형성 조직 내재성 줄기세포를 분리하는 과정 중 어떠한 외인성 조직분해 효소의 사용 없이 그리고 조직해리 과정 없이 줄기세포를 분리하는 방법을 제공한다. 외인성 조직분해 효소 사용하지 않으므로 줄기세포를 분리한 후 조직은 그 기능과 구조를 보존할 수 있어 반복적으로 조직에서부터 줄기세포를 분리할 수 있는 조직원으로 사용할 수 있는 방법을 제공한다.
조직 내재성 줄기세포는 조직을 구성하는 세포 중 차지하는 비율이 극소수이며 통상 0.01% 미만인 것으로 알려져 있다. 조직손상 후 체세포 수는 감소하며, 이들 세포를 대체 혹은 재생하기 위한 줄기세포는 활성화되어 줄기세포 빈도는 손상 전과 비교하여 증가하게 된다. 손상 후 조직 내 줄기세포는 세포분열을 통하여 자가복제 후 후손 줄기세포(daughter progenitor cells)를 생산하며, daughter stem cells은 손상부위로 이동하게 된다. 본 특허는 체외 배양을 통하여 생체 내 조직항상성 기전을 활성화하여 조직절편 내 줄기세포를 자가복제 및 세포분열을 유도하고, 체외에서 자가복제 및 분열한 줄기세포를 손상 부위로 동원하는 방법을 제공한다.
조직손상 후 손상된 조직 주위로 창상수복기질(provisional matrix)이 형성되며, 이들 기질을 통하여 matrix-cellular integrin pathway가 활성화되고, 그 결과 조직손상에 작용하는 줄기세포는 세포분열 후 손상 부위로 이주하여 조직재생 기전이 시작된다. 본 발명은 창상수복기질 모방 하이드로젤을 조직절편 주위로 3차원적 지지를 통하여 matrix-cellular integrin 상호작용을 극대화하여 조직 내 줄기세포를 활성화하고 세포분열, 성장과 창상수복기질 모방 하이드로젤로의 이주를 유도하고, 하이드로젤 내 이주한 줄기세포를 분리하는 방법을 제공한다.
조직손상의 반응으로 조직 내재성 줄기세포는 활성화되고, 활성화된 줄기세포는 uPAR 혹은 nestin 발현이 증가되는 특성이 보고되었다. uPAR 및 nestin 발현은 줄기세포의 성장과 이주에 중요한 역할을 담당하는 것이 밝혀졌으며, uPAR+ 및 nestin+ 세포는 조직재생에 중추적 임무를 수행하는 것으로 알려졌다. uPAR 및 nestin은 reparative 줄기세포에서 발현이 증가되므로 uPAR 및 nestin은 줄기세포 분리에 있어 주요 표적 표지자로 적용할 수 있다. 본 발명은 체외배양을 통하여 matrix-cellular integrin pathway 활성화 결과 조직 내재성 uPAR+ 및 nestin+ 줄기세포의 세포분열, 성장 및 이주를 유도하여 uPAR+ 줄기세포를 선택적으로 분리 수거하는 방법을 제공한다.
더불어 본 발명은 줄기세포의 활성화 및 자극에 대한 생리적 반응의 결과 uPAR-plasmin-MMP 활성도에 따라 3차원 배양 시 제공한 창상수복기질 모방 하이드로젤 내로 이동과 성장을 유도한 후 하이드로젤 내 이동 성장한 줄기세포의 uPAR 발현 및 plasmin 활성도 특성에 따라 외인성 조직분해 효소 없이 하이드로젤로부터 세포를 분리 수거하는 방법을 제공한다.
본 발명은 지방, 골수, 심근, 신경, 골격근, 활액막등 대표적 고형성 조직으로부터 조직 내재성 uPAR+ 및 nestin+ 줄기세포를 분리하는 공통적 방법을 제공한다. 조직 내재성 uPAR+ 및 nestin+ 줄기세포는 자기복제, 높은 체외 성장, 다 분화 특성, 높은 조직재생 능력을 지녀 재생의료 치료제로써 사용할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
<실시예 1> 창상수복기질 모방 하이드로젤 제조
창상수복 모방 하이드로젤은 피브리노겐, 콜라겐, 젤라틴 혹은 이들 고분자들 혼합하여 제조한다. 혈장 유래 피브리노겐은 2.5에서 10 mg/ml 농도로 10에서 50 mM CaCl2를 포함한 phosphate-buffered saline(PBS)에 녹여 피브리노겐(fibrinogen) 용액을 제조한다. 트롬빈(Thrombin)은 1에서 10 unit/ml 농도로 PBS에 녹여 트롬빈(thrombin) 용액을 제조한다.
진피 유래 콜라겐(Matrix BioScience, Germany) 혹은 젤라틴 (befMatrix Collagen, Nitta Gelatin, Japan) 은 0.1 % (wt./vol.) 아세트산 (acetic acid)에 녹여 1.0 ~ 20.0 mg/ml 농도의 콜라겐 용액을 이용한다. 중성 젤라틴 혹은 콜라겐 용액을 제조하기 위한 10X 완충용액(Reconstitution Buffer)은 50 mM NaHCO3, 40 mM HEPES, 0.01 N NaOH로 제조하여 콜라겐 혹은 젤라틴 용액과 9:1 용량으로 혼합하여 중성 콜라겐 혹은 젤라틴 용액을 제조한다.
창상수복기질 모방 하이드로젤은 0.25 ~ 2.5% 농도의 피브리노겐(fibrinogen) 용액과 0.5 ~ 5 I.U./mL 농도 트롬빈(thrombin) 용액으로 피브린 하이드로젤을 제조하고, 0.1 ~ 0.5% 농도 범위의 콜라겐 혹은 젤라틴 용액을 피브린 하이드로젤 제조 시 혼합하여 피브린/콜라겐 혹은 피브린/젤라틴 혼합 하이드로젤을 제조한다.
< 실시예 2> 단층(2-dimension, 2D) 및 3차원(3-dimension, 3D) 장기(臟器)배양
배양에 사용한 장기는 지방(adipose tissue, AT), 골수(bone marrow, BM), 심근(Myocardium, Myocar), 신경(peripheral nerve, PN), 근육(skeletal muscle, SM), 활액막(synovium, Syn)을 사용하였다. 기관윤리심의위원로부터 뇌사자 유래 조직을 이용한 연구에 대한 승인을 획득하였으며, 뇌사자로부터 기증받아 조직을 사용하였다. 조직 주변에 붙어있는 혈종, 섬유성 조직은 가위로 제거한 후 공여받은 조직은 수술용 scalpel을 이용하여 0.2 내지 2 mm3 크기로 잘게 절편을 낸다. 이후 조직절편은 PBS으로 현탁하고 1,000 rpm에서 원심분리한 후 상층액을 제거하는 세척과정을 3차례 반복한다.
세척 후 조직절편은 배양액에 현탁한 후 두 가지 장기(臟器)배양법으로 배양한다. 첫 번째 방법은 배양액에 현탁한 조직절편을 배양용기에 파종하여 배양용기 표면에서 배양하는 경우를 단층(monolayer, 2D) 장기(臟器)배양법으로 정의하였다.
두 번째 방법은 피브린, 피브린/콜라겐 혹은 피브린/젤라틴 창상수복기질 모방 하이드로젤 내 조직절편을 함입한 후 3차원(3-dimension, 3D) 환경에서 배양하는 방법을 3D 장기(臟器)배양법으로 정의하였다. 3차원 장기(臟器)배양법은 조직절편은 0.25~2.5% 피브리노겐 용액과 혼합한 후 동량의 0.5~5 unit/mL 트롬빈 용액과 1:1 용량으로 혼합한 후 37℃에서 1시간 동안 중합 과정을 거친 후 피브린 하이드로젤 내로 조직절편을 함입하였다. 지방, 골수, 심장, 근육은 최종 0.25~1.25% 피브리노겐 용액과 0.25~2.5 unit/mL 트롬빈 용액으로 창상수복기질 모방 피브린 하이드로젤 내 조직절편을 함입하였다. 신경 및 활액막 조직절편은 0.25~2.5% 피브리노겐과 0.1~0.5% 콜라겐 혹은 젤라틴 중성용액, 0.25~2.5 unit/mL 트롬빈 용액으로 구성된 창상수복기질 모방 피브린/콜라겐 혹은 젤라틴 하이드로젤 내 조직절편을 함입하였다.
창상수복기질 모방 하이드로젤 용액과 혼합한 조직절편은 100-mm 내지 150-mm 배양 용기로 옮긴 후 37℃ 인큐베이터에서 1시간 거치하여 중합 과정 후 겔로 전환했다. 장기 배양액은 45% v/v DMEM, 45% v/v Ham’s F12, 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS, Invitrogen), 20 ng/ml EGF, 2 ng/ml bFGF, 10 ng/ml IGF, 10 μg/ml 젠타마이신(gentamicin, Invitrogen)로 구성하였다. 배양액은 젤 용량의 2배에 해당하는 용량을 첨가하고, 배양액을 첨가한 후 배양 용기는 orbital shaker 위에 놓은 후 30rpm 속도로 교반하면서 14일간 배양하였다. 배양액은 1주일에 2회 배양액을 교체하였다.
하이드로젤 분해를 억제하기 위하여 PAI인 tranexamic acid 혹은 aminomethyl benzoic acid를 10 ~ 500 μg/mL 농도로 배양하는 기간 중 매일 배양액에 첨가하였다. 지방, 골수, 심장 및 골격근 장기(臟器)배양은 100 ~ 250 μg/mL 농도의 tranexamic acid 혹은 aminomethyl benzoic acid을 배양액에 첨가하여 창상수복기질 모방 하이드로젤 분해를 억제하였다. 말초신경 및 활액막의 경우 250 ~ 500 μg/mL 농도의 tranexamic acid 혹은 aminomethyl benzoic acid을 배양액 내 첨가하여 배양하였다.
< 실시예 3> 장기(臟器)배양에 따른 장기 내 pFAK , uPAR , nestin , Ki -67 발현
2D 및 3D 장기(臟器)배양 7일 후 배양한 지방조직, 골수, 심근, 신경, 골격근, 활액막 조직절편을 배양용기 혹은 하이드로젤로부터 회수하였다. 4% 중성 포르말린 용액을 이용하여 2시간 고정한 후 파라핀 블록을 제조하였다. 파라핀 블록으로부터 4 μm 두께의 절편을 박절한 후 면역화학염색을 시행하였다.
배양 조직 내 integrin-FAK 세포신호 전달경로의 활성 정도를 평가하기 위하여 anti-phospho FAK(3283, Cell Signaling Technology, USA; pFAK), anti-uPAR (MAB807, R&D Systems, USA) 및 Ki-67 (M7240, DAKO, USA) 등의 일차항체를 이용하여 발현을 평가하였다. 일차항체와 반응 후 3차례 수세를 거치고 HRP-conjugated 2차항체(ImmPRESS One-Step Polymer Systems, Vector Laboratories, USA)와 반응한 후 DAB을 기질로 사용하여 발색한 후 Hematoxylin(H-3401-500, Vector Laboratories)로 대조염색 후 발현율 및 양성세포 위치를 평가하였다.
체외 장기(臟器)배양에 따라 조직절편 내 구성 세포는 활성되고, 활성된 세포는 세포분열 후 증식하여 손상 혹은 소실된 세포를 대체 혹은 재생하는 조직항상성 기전이 작동된다. Integrin 세포신호 전달경로는 조직재생을 유도하는 주요 기전중 하나이고, integrin 세포신호 전달은 세포 리간드와 세포외기질과 수용체의 결합에 따라 활성된다. 본 실시예는 조직절편을 배양용기에 직접 파종한 후 배양용기 표면에서 배양한 단층배양(2-dimension, 2D)과 하이드로젤 내 함입 후 3D(3-dimension, 3D) 환경에서 배양한 조직절편 내부 구성세포에서 integrin 세포신호의 결과 활성화되는 표적 인자인 pFAK, uPAR 및 nestin 단백질 발현을 분석하였다.
3D 장기(臟器)배양 후 조직절편 내 pFAK 발현율은 2D 장기(臟器)배양 대비 유의하게 높은 것을 확인할 수 있었다. 조직 유형에 따른 장기(臟器)배양 후 pFAK 발현율은 차이는 확인되었으며, 심근, 신경 및 골격근에서 3D 장기(臟器)배양 후 pFAK 발현이 유의하게 높게 발현되었다(도 1A).
Integrin 신호전달 경로의 하위 표적 인자인 uPAR 발현 또한 pFAK와 유사한 경향으로 3D 장기(臟器)배양 환경에서 유의하게 높게 발현되었으며, 심근, 신경 및 골격근에서 높은 발현을 확인할 수 있었다(도 1B).
Integrin 신호전달을 통하여 장기 내 구성 세포의 세포분열과 성장을 유도할 수 있다. 재생 혹은 세포분열 중인 세포에서 특징적으로 발현되는 nestin 및 Ki-67 발현을 통하여 세포 재생능력과 세포 성장능력을 평가하였다. 3D 장기(臟器)배양 후 조직절편 내 구성 세포의 nestin 발현은 2D 장기(臟器)배양 후 조직 내 nestin 발현과 비교할 때 유의하게 그 발현율이 높았다(도 1C). 세포분열 표지자인 Ki-67 발현율 또한 3D 장기(臟器)배양 후 조직절편에서 유의하게 높았다(도 1D).
체외 장기(臟器)배양을 통하여 장기를 구성하는 세포의 세포분열 및 성장을 유도할 수 있으며, integrin과 결합할 수 있는 ligand를 3D 배양환경을 통하여 integrin 신호전달을 최대화할 수 있고, downstream 표적 인자인 pFAK 및 uPAR 발현을 강화할 수 있으며, 그 결과 3D 장기(臟器)배양은 2D 장기(臟器)배양과 비교하여 유효하게 높은 조직절편 내 구성 세포의 세포분열과 세포성장을 유도하는 것을 확인하였다.
창상수복기질 모방 하이드로젤의 3D 물리적 자극은 장기 내 구성 세포의 신호전달 경로를 활성화하여 세포의 분열과 성장을 유의미하게 증가시킬 방법을 제공할 수 있다.
< 실시예 4> 3D 장기(臟器)배양 후 조직 내 pFAK +, uPAR + 및 nestin + 세포의 위치 및 특성
3D 장기(臟器)배양 전(0 d) 혹은 배양 3, 5, 7 및 14일 후 배양한 심근 조직절편을 하이드로젤로부터 회수하였다. 4% 중성 포르말린 용액을 이용하여 2시간 고정한 후 파라핀 블록을 제조하였다. 파라핀 블록으로부터 4 μm 두께의 절편을 박절한 후 면역화학염색을 시행하였다. 배양 후 조직 내 integrin-FAK 세포신호 전달경로의 활성 정도를 평가하기 위하여 anti-phospho FAK(3283, Cell Signaling Technology, USA; pFAK), anti-uPAR (MAB807, R&D Systems, USA), nestin (MAB5326, Millipore, USA) 및 Ki-67 (M7240, DAKO, USA) 등의 일차항체를 이용하여 발현을 평가하였다. 일차항체와 반응 후 3차례 수세를 거치고 HRP-conjugated 2차항체 (ImmPRESS One-Step Polymer Systems, Vector Laboratories, USA)와 반응한 후 DAB을 기질로 사용하여 발색한 후 Hematoxylin(H-3401-500, Vector Laboratories)로 대조염색 후 발현율 및 양성세포 위치를 평가하였다.
심근을 창상수복기질 모방 하이드로젤 내 함입 후 3D 장기(臟器)배양을 시행한 후 심근 내 pFAK+, uPAR+ 및 nestin+ 세포 특성을 규명하였다. 배양 전 pFAK, uPAR 및 nestin 발현율은 6% 미만이었다. 그러나 3D 장기(臟器)배양 후 배양 기간과 비례하여 pFAK, uPAR 및 nestin 양성 세포의 수는 유의하게 증가하였다. 배양 2주 후 조직절편 내 pFAK, uPAR 및 nestin 발현율은 30% 이상이었다(도 2 및 도 3). pFAK, uPAR 및 nestin은 성숙한 체세포 사이 간질에 있는 세포에서 발현되었고, 모세혈관 혈관내피세포 보다 모세혈관 주위 혈관주위세포에서 pFAK, uPAR, nestin이 발현되었다.
세포분열 표지자인 Ki-67은 성숙한 체세포에서 발현되지 않았으며, 배양 전 1% 미만에서 발현되었다. 그러나 체외 3D 장기(臟器)배양 후 Ki-67 발현율은 배양 기간과 비례하여 증가하였으며, 장기(臟器)배양 2주 후 심근 내 Ki-67 발현율은 45.7%로 3D 장기(臟器)배양을 통하여 심근 내 세포의 분열과 성장을 유도할 수 있다는 결과를 확인할 수 있었으며, Ki-67 또한 혈관주위세포에서 주로 발현되었다(도 4).
본 실시예는 3D 창상수복기질 모방 하이드로젤을 통하여 심근 내 세포분열과 성장을 유도할 수 있으며, 장기(臟器)배양을 통하여 pFAK+, uPAR+ 및 nestin+ 혈관주위세포의 분열과 성장을 유도할 수 있는 것을 확인하였다.
< 실시예 5> 3D 장기(臟器)배양을 통한 조직 내 uPAR + 및 nestin + 세포의 창상수복기질 모방 하이드로젤 내로 이동 및 성장 유도
피브린 혹은 피브린/콜라겐 하이드로젤 내 지방, 골수, 심근, 신경, 골격근 및 활액막 조직절편을 함입한 후 3D 장기(臟器)배양을 시행하였다. 장기 배양액은 하이드로젤 용량의 2배를 첨가하고, 배양 용기는 orbital shaker 위에 놓은 후 30rpm 속도로 교반하면서 14일간 배양하였다. 하이드로젤 분해를 억제하기 위하여 PAI를 배양액에 첨가하였다. 체외 배양 중 세포 분열한 세포를 라벨 하기 위하여 5 μM bromodeoxyuridine(B5002, Sigma-Aldrich, USA)를 배양액에 7일간 매일 첨가하였다. 배양액은 1주일에 2회 배양액을 교체하여 2주간 배양하였다.
3D 장기(臟器)배양 3, 7 및 14일 후 배양한 조직 및 하이드로젤을 동시에 회수하였다. 4% 중성 포르말린 용액을 이용하여 2시간 고정한 후 파라핀 블록을 제조하였다. 파라핀 블록으로부터 4 μm 두께의 절편을 박절한 후 면역화학염색을 시행하였다.
하이드로젤 내 이동 성장한 세포의 uPAR, nestin 및 BrdU 발현을 평가하기 평가하기 위하여 anti-uPAR (MAB807, R&D Systems, USA), -nestin (MAB5326, Millipore, USA) 및 -BrdU (347580, BD Biosciences, USA) 1차 항체를 사용하였다. 일차항체와 반응 후 3차례 수세 과정을 거치고 HRP-conjugated 2차 항체(ImmPRESS One-Step Polymer Systems, Vector Laboratories, USA)와 반응한 후 DAB을 기질로 사용하여 발색하였고, Hematoxylin(H-3401-500, Vector Laboratories)로 대조염색 후 발현율을 평가하였다.
창상수복기질 모방 하이드로젤은 세포의 이동과 성장을 지지할 수 있는 세포외기질로의 역할을 담당하고 있으며, 세포 이동에 필수적인 세포 부착 인자인 fibronectin, collagen, fibrin 등의 제공을 통하여 이를 달성할 수 있다. 3D 창상수복기질 하이드로젤을 통하여 수용체-리간드 결합을 통하여 integrin-pFAK 세포신호 신호전달 전달경로를 활성화하여 장기 내 uPAR+ 및 nestin+ 세포의 세포분열과 성장을 유도하고, uPAR+ 및 nestin+ 세포를 창상수복기질 모방 하이드로젤로 동원, 이동과 성장을 유도할 수 있다.
3D 심근 장기(臟器)배양 기간과 비례하여 하이드로젤 내로 이동 성장하는 세포가 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 5). 하이드로젤 내 이동 성장한 세포는 방추상 모양으로 하이드로젤과 결합하여 세포질이 확장되는 것을 확인할 수 있다.
심근으로부터 하이드로젤 내 이동 성장한 세포는 uPAR 및 nestin 발현율이 88.5% 및 95.4% 이상으로, 조직 내 장기(臟器)배양 후 세포분열 및 성장한 세포와 동일한 uPAR+ 및 nestin+ 특성을 보인 것을 확인할 수 있다. 하이드로젤 내 이동한 세포 89.4% 이상에서 BrdU 양성으로, 이는 장기(臟器)배양 중 첨가한 BrdU를 uptake 하여 DNA를 합성한 세포임을 의미하므로, 하이드로젤 내 세포 대다수는 장기(臟器)배양 후 조직 내 세포가 분열 및 성장 후 이동한 세포임을 증명한다. 장기(臟器)배양 전 심근에서는 BrdU+ 세포는 검출되지 않았으며, uPAR+ 및 nestin+ 세포는 2% 미만이었다.
지방, 골수, 심근, 신경, 골격근 및 활액막 조직절편의 3D 장기(臟器)배양 2주 후 창상수복기질 모방 하이드로젤 내 세포는 90% 전후 uPAR 양성이고 90% 이상 BrdU 양성으로 장기(臟器)배양을 통하여 조직 내재성 세포는 세포분열 및 성장하고 하이드로젤로 이동한 세포임을 확인할 수 있었으며, 조직에 따른 유의한 차이는 관찰되지 않았다(도 6).
<실시예 6> 3D 장기(臟器)배양 후 하이드로젤 내 이동 성장한 세포의 분리
피브린 혹은 피브린/콜라겐 하이드로젤 내 지방, 골수, 심근, 신경, 골격근 및 활액막 조직절편을 함입한 후 3D 장기(臟器)배양을 시행하였다. 장기 배양액은 하이드로젤 용량의 2배를 첨가하고, 배양 용기는 orbital shaker 위에 놓은 후 30 rpm 속도로 교반하면서 14일간 배양하였다. 하이드로젤 분해를 억제하기 위하여 PAI을 배양기간 중 매일 첨가하여 하이드로젤 내 이동 성장한 세포의 PA 활성에 따라 창상수복기질 모방 하이드로젤 분해를 억제하였다.
3D 장기(臟器)배양 후 수거한 조직절편의 uPAR mRNA 및 plasmin 활성도를 평가하였다. 10 mg 조직절편으로부터 tissue lysate를 제조한 후 plasmin 활성도는 Plasmin Activity Assay Kit(ab204728, abcam)을 이용하여 분석하였다. Tissue lyate에 fluorescent substrate를 첨가한 후 37℃에서 20분간 반응 후 형광강도를 측정하여 plasmin 활성도를 측정하였다. Plasmin 활성도는 다음의 수식(△RFU360/450nm = (RFU2-RFU2BG)-(RFU1-RFU1BG))으로 산정하였다. 조직절편 내 uPAR mRNA 발현율은 10 mg 조직절편으로부터 total RNA을 추출한 후 역전사효소반응 후 cDNA를 생성하고 real time qPCR을 통하여 분석하였다.
3D 장기(臟器)배양 14일 후 배양액을 제거하였다. DMEM을 첨가한 후 30 rpm 속도로 30분간 교반하면서 세척하였으며, 세척액은 제거하였다. 이 세척과정을 3회 반복하였다. 세척 후 하이드로젤 내 이동 성장한 세포는 다음과 같은 두 가지 방법으로 분리 회수하였다. 첫 번째 방법은 배양액에 1,000 unit/mL urokinase를 첨가한 후 배양용기에 첨가한 후 2시간 동안 하이드로젤을 분해하고, 분해된 하이드로젤로부터 유리된 세포 및 조직절편은 tube로 옮긴 후 3,000 rpm에서 10분간 원심분리 후 상층액을 제거하고, 수거한 세포 및 조직절편 pellet은 배양액으로 현탁하였다.
PAI withdrawal 방법으로 하이드로젤로부터 세포를 분리 및 수거할 수 있다. 14일간 장기(臟器)배양 후 배양액을 제거한 후 DMEM을 이용하여 3회 세척하여 배양액 및 하이드로젤 내 남아있는 PAI를 제거하였다. 신선한 배양액을 첨가한 후 30 rpm 속도로 교반하면서 1시간 배양하였으며, 배양액 내 PAI는 첨가하지 않는다. 하이드로젤로부터 분리되어 유리되는 세포는 transfer pipette을 이용하여 수거한 후 tubes 옮긴 후 3,000 rpm에서 10분간 원심분리 후 상층액을 제거하고, 수거한 세포 및 조직절편 pellet은 배양액으로 현탁하였다.
하이드로젤로부터 분리 수거한 세포는 배양액으로 현탁한 후 hemocytometer를 총 세포수를 산정하였으며, 수거한 세포는 flow cytometry를 이용하여 uPAR 발현율을 분석하였다.
3D 장기(臟器)배양 후 조직 내 세포분열 후 성장한 uPAR+/nestin+ 세포는 하이드로젤 내로 이동 및 성장을 유도하고, 하이드로젤 내 이동 성장한 세포를 외인성 protease 없이 uPAR+/nestin+ 세포 자체의 plasmin 활성도에 따라 하이드로젤을 분해하여, uPAR+/nestin+ 세포를 선택적으로 분리하여 수거하는 방법을 본 실시예를 통하여 제공하고자 한다.
장기(臟器)배양 전후 조직절편 내 uPAR mRNA 발현 및 plasmin 활성도를 평가하였다. 체외 배양 전에도 장기에 따라 uPAR mRNA 발현 및 plasmin 활성도는 차이가 있었으며, 심근, 신경 및 골격근에서 uPAR mRNA 발현 및 plasmin 활성도가 다른 조직보다 높았다(도 7). 장기(臟器)배양 후 평가한 모든 조직절편에서 배양 전과 비교하여 uPAR mRNA 발현 및 plasmin 활성도가 유의하게 증가하였다. 특히 심근, 신경 및 골격근에서 mRNA 발현과 plasmin 활성도가 가장 높게 측정되었다. Plasmin 활성도는 uPAR 발현과 비례적 관계이므로 장기(臟器)배양을 통하여 조직 내 uPAR 발현 증가를 유도할 수 있으며, 장기(臟器)배양 후 uPAR 증가를 통하여 조직 내 plasmin 활성도를 증가시키는 방법을 제공한다.
3D 장기(臟器)배양 중 배양액 내 Plasminogen Activator Inhibitor(PAI)를 첨가하며, 첨가한 PAI는 장기 및 세포의 과도한 plasmin 및 protease 활성을 조절하여 하이드로젤 분해를 억제할 수 있다. 장기(臟器)배양을 통하여 조직 내 세포분열 및 성장한 세포를 하이드로젤 내로 이동과 성장을 유도한 후 PAI를 배양액 및 하이드로젤에서부터 수세 및 세척 과정을 통하여 제거(withdrawal)하면 장기 및 세포 내재성 plasmin 및 protease 활성만으로도 하이드로젤 분해를 유도할 수 있고, 그 결과 하이드로젤 내 이동 성장한 세포가 유리되고, 유리된 세포를 분리 및 수거가 가능하다.
PAI withdrawal은 PAI를 함유한 배양액을 제거한 후 DMEM으로 3회 세척을 통하여 하이드로젤 및 장기 내 잔존하는 PAI를 세척 과정을 통하여 제거하고, PAI가 포함되지 않은 배양액을 하이드로젤 용량 2배를 첨가하여 배양하였다. 배양 30분 후 하이드로젤은 PAI withdrawal 결과 분해되기 시작하였으며, 하이드로젤이 분해되면서 하이드로젤 내 이동 성장한 세포는 하이드로젤로부터 유리되어 세포-세포 간 응집하게 되며, 배양 2시간 후 조직절편 및 이동 성장한 세포 주위 하이드로젤은 완전히 분해되며, 그 결과 하이드로젤 내 세포가 해리되는 결과가 초래된다(도 8). 본 실시예를 통하여 PAI withdrawal만으로 세포 내재성 plasmin 및 protease 활성으로 창상수복기질 모방 하이드로젤이 소실되고, 하이드로젤 내 세포는 배양액 내로 유리되며, 그 결과 배양액 내 유리된 세포는 세포질이 수축되고 응집된 형태로 분리 회수할 수 있다.
장기(臟器)배양 중 PAI 첨가를 통하여 하이드로젤 분해를 억제할 수 있으며, 하이드로젤 내 세포는 세포질 확장의 결과 방추형 모양을 보인다. 그러나 배양액 내 PAI withdrawal을 통하여 세포 주변의 하이드로젤부터 분해되기 시작하며, 그 결과 세포는 세포질이 수축하게 되며 세포-세포 간 접합의 결과 세포는 응집체가 형성되며, 응집된 세포는 배양액 내로 유리되게 된다(도 9).
조직학적 방법에서 PAI withdrawal 전 하이드로젤 내 세포는 세포질이 확장된 모양을 확인할 수 있으나, PAI withdrawal 후 하이드로젤이 분해되기 시작되면 세포가 부착할 수 있는 하이드로젤이 소실되어, 세포-세포 간 접합의 결과 세포는 응집되며 하이드로젤로부터 분리되어 유리되는 것을 검증할 수 있다(도 10). 하이드로젤로부터 유리되어 응집한 세포 모두 uPAR를 발현하는 특성을 보여, uPAR 발현이 높을수록 plasmin 활성도가 증가되며, PAI withdrawal만으로도 하이드로젤 내 uPAR+ 세포를 분리할 수 있는 근거를 확인할 수 있었다(도 10).
하이드로젤 내 이동 성장한 세포는 PAI withdrawal 혹은 urokinase 처리 후 분리해서 수거할 수 있다. 본 발명은 urokinase 처리 없이 PAI withdrawal로도 하이드로젤 내 이동 성장한 세포를 분리하는 방법의 유용성을 비교 평가하였다.
실시예를 통하여 PAI withdrawal 방법으로도 urokinase 처리를 통하여 세포 수와 동등한 세포를 분리하고 수거할 수 있는 결과를 확인할 수 있었다(도 11A). 조직 100 mg당 2주간 장기(臟器)배양 후 2백만 개 이상의 세포를 분리 수거할 수 있었으며, urokinase 처리 후 수거한 세포 수보다 낮았지만 유의한 차이는 없었다.
그러나 PAI withdrawal 후 수거한 세포의 uPAR 발현율은 urokinase 처리 후 수거한 세포보다 유의하게 높았다(도 11B). 특히 uPAR 발현율 및 plasmin 활성도가 높은 조직에서 uPAR+ 세포를 선택적으로 분리하는 수율이 높았다. 이는 uPAR+ 세포에서 하이드로젤 분해 활성도가 높고, 그 결과 PAI 제거 및 세척으로 uPAR+ 세포를 선택적으로 분리 효율이 높은 방법임을 검증할 수 있었다.
< 실시예 7> 3D 장기(臟器)배양 후 회수한 조직절편의 반복적 장기(臟器)배양 및 세포 분리
피브린 혹은 피브린/콜라겐 하이드로젤 내 지방, 골수, 심근, 신경, 골격근 및 활액막 조직절편을 함입한 후 3D 장기(臟器)배양을 시행하였다. 장기 배양액은 하이드로젤 용량의 2배를 첨가하고, 배양 용기는 orbital shaker 위에 놓은 후 30 rpm 속도로 교반하면서 14일간 배양하였다. 하이드로젤 분해를 억제하기 위하여 PAI을 배양기간 중 매일 첨가하여 하이드로젤 내 이동 성장한 세포의 plasmin 활성에 따라 창상수복기질 모방 하이드로젤 분해를 억제하였다.
3D 장기(臟器)배양 14일 후 배양액을 제거하였다. DMEM을 첨가한 후 30 rpm 속도로 30분간 교반하면서 세척하였으며, 세척액을 제거하였다. 3회 세척 과정을 반복하여 배양액 및 하이드로젤 내 남아있는 PAI를 제거하였다. 신선한 배양액을 첨가한 후 30 rpm 속도로 교반하면서 2시간 배양하였으며, 배양액 내 PAI는 첨가하지 않는다. 하이드로젤로부터 분리되어 유리되는 세포 및 조직절편을 transfer pipette을 이용하여 수거한 후 tubes 옮긴 후 3,000 rpm에서 10분간 원심분리 후 상층액을 제거하였다. 조직절편이 높은 비중의 결과 세포보다 빨리 침전되므로, 세포 및 조직절편 pellet을 DMEM으로 분산 시킨 후 30 초간 거치하면서 조직절편의 침전을 유도하고 상층액만을 새로운 tube로 옮기며, 이 과정을 3차례 반복하여 수거한 세포 및 조직절편을 분리하였다.
PAI withdrawal 방법으로 하이드로젤로부터 분리한 조직절편은 다시 하이드로젤 내에 함입시킨 후 실시예 2에서 기술한 방법으로 3D 장기(臟器)배양을 수행하였고, 2주 후 실시예 7에서 기술한 방법으로 하이드로젤 내 이동 성장한 세포 및 조직절편을 분리 수거하였다. PAI withdrawal 후 회수한 조직절편은 3차례 더 연속적인 3D 장기(臟器)배양을 통하여 과정을 반복적으로 조직 내 세포를 이동 성장을 유도하여 하이드로젤 내 세포를 분리 회수하였으며, 분리 회수한 총 세포수를 hemocytometer를 이용하여 측정하였다.
본 실시예는 PAI withdrawal 후 구조가 보존된 조직절편을 회수하고, 회수한 조직절편을 반복적인 장기(臟器)배양을 시행하여, 장기(臟器)배양 후 하이드로젤 내로 이동 후 성장한 세포를 분리하고 수거하는 방법을 제공한다. Urokinase와 같은 외인성 protease 처리는 하이드로젤과 더불어 함입된 조직절편이 분해될 수 있으며, 그 결과 조직절편의 구조 기능적 미세환경이 소실될 수 있다.
본 실시예는 PAI withdrawal을 통하여 외인성 protease 처리 없이 조직 내 성장 후 이동한 세포 및 조직절편을 분리하고 수거하였으며, 동시에 회수한 조직절편도 반복적인 장기(臟器)배양을 시행하였다. 장기(臟器)배양 후 회수한 조직절편을 사용하여 3번의 연속적 장기(臟器)배양을 시행하였고, 처음 장기(臟器)배양과 유사한 수율로 세포를 수거할 수 있는 결과를 확인하였다(도 12). PAI withdrawal 방법은 3D 장기(臟器)배양 후 하이드로젤 내 이동 성장한 세포와 더불어 함입한 조직절편의 구조 기능적 미세환경을 보존할 수 있는 방법임을 확인할 수 있으며, 반복적인 장기(臟器)배양을 통하여 조직 내재성 세포를 고효율 그리고 안정적으로 분리하는 방법임을 확인할 수 있다.
< 실시예 8> PAI withdrawal 및 urokinase 처리 후 하이드로젤로부터 분리한 세포의 배양
피브린 혹은 피브린/콜라겐 하이드로젤 내 지방, 골수, 심근, 신경, 골격근 및 활액막 조직절편을 함입한 후 3D 장기(臟器)배양을 시행하였다. 장기 배양액은 하이드로젤 용량의 2배를 첨가하고, 배양 용기는 orbital shaker 위에 놓은 후 30 rpm 속도로 교반하면서 14일간 배양하였다. 하이드로젤 분해를 억제하기 위하여 PAI인 tranexamic acid을 배양액에 매일 첨가하였다.
3D 장기(臟器)배양 14일 후 배양액을 제거하였다. DMEM을 첨가한 후 30 rpm 속도로 교반하면서 30분간 세척하였으며, 이 세척과정을 3회 반복하였다. 세척 후 하이드로젤 내 이동 성장한 세포는 실시예 6에서 제시한 PAI withdrawal 혹은 urokinase 방법으로 세포를 분리 후 수거하였다. 14일간 장기(臟器)배양 후 배양액을 제거한 후 DMEM을 이용하여 3회 세척하여 배양액 및 하이드로젤 내 남아있는 PAI를 제거하였다. 신선한 배양액을 첨가한 후 30 rpm 속도로 교반하면서 1시간 배양하였으며, 배양액 내 PAI는 첨가하지 않는다. 하이드로젤로부터 분리되어 유리되는 세포는 transfer pipette을 이용하여 수거한 후 tubes 옮긴 후 3,000 rpm에서 10분간 원심분리 후 상층액을 제거하고, 수거한 세포 및 조직절편 pellet은 배양액으로 현탁하였다.
Urokinase 처리는 3차례 세척 후 배양액에 1,000 unit/mL urokinase를 첨가한 후 2시간 동안 하이드로젤을 분해하고, 분해된 하이드로젤로부터 유리된 세포 및 조직절편은 수거하여 tube로 옮긴 후 3,000 rpm에서 10분간 원심분리 후 상층액을 제거하고, 수거한 세포 및 조직절편 pellet은 배양액으로 현탁하였다.
하이드로젤로부터 분리 수거한 세포는 polystyrene 배양용기 cm2 당 5,000개의 세포를 파종한 후 배양액을 첨가하였다. 단층배양 환경에서 하이드로젤로부터 분리 수거한 세포의 부착과 성장 특성을 현미경을 이용하여 평가하였다.
PAI withdrawal 후 하이드로젤로부터 유리되어 세포 응집체를 형성되는 것을 확인할 수 있었고(도 13A), 수거한 세포는 배양액으로 현탁한 후 작은 원형의 응집체로 구성되며(도 13B), PS 배양용기에 파종하여 단층 환경에서 배양하였다. 세포 간 응집된 상태로 수거한 세포는 파종 30분 후 배양용기에 부착하였으며(도 13C), 파종 1시간 후 파종한 세포의 세포질은 확장되었고(도 13D), 배양 2시간 후 세포는 안정적으로 부착하고 세포응집체 주변 세포가 성장하는 것을 확인할 수 있었다(도 13E).
지방, 골수, 심근, 신경, 골격근, 활액막 등 모든 조직절편의 장기(臟器)배양 후 PAI withdrawal을 통하여 세포를 안정적으로 분리 수거할 수 있었으며, 수거한 세포는 배양액과 혼합 후 배양용기에 파종하면 30분 이내에 수거한 세포 모두 배양용기에 부착하고 세포질이 안정적으로 확장하는 것을 확인할 수 있었으며, 조직에 따른 유의한 차이는 없었다(도 14).
단층환경에서 파종 배양하는 세포는 높은 성장률을 보였으며, 배양 2일 후 파종된 세포 주변으로 성장하여 주변으로 확대되었으며, 단층배양 환경에서도 PAI withdrawal을 통하여 분리 수거한 세포는 단층환경에서 배양 시에도 높은 성장률이 유지되는 것을 확인할 수 있었다(도 15).
<실시예 9> PAI withdrawal 후 분리한 세포의 면역표현 특성
피브린 혹은 피브린/콜라겐 하이드로젤 내 지방, 골수, 심근, 신경, 골격근 및 활액막 조직절편을 함입한 후 3D 장기(臟器)배양을 시행하였다. 장기 배양액은 하이드로젤 용량의 2배를 첨가하고, 배양 용기는 orbital shaker 위에 놓은 후 30 rpm 속도로 교반하면서 14일간 배양하였다. 하이드로젤 분해를 억제하기 위하여 PAI인 tranexamic acid을 농도로 배양액에 첨가하며 배양하였다.
3D 장기(臟器)배양 14일 후 배양액을 제거하였다. DMEM을 첨가한 후 30 rpm 속도로 교반하면서 30분간 세척하였으며, 이 세척과정을 3회 반복하였다. 세척 후 하이드로젤 내 이동 성장한 세포는 PAI withdrawal 방법으로 세포를 분리 후 수거하였다. 14일간 장기(臟器)배양 후 배양액을 제거한 후 DMEM을 이용하여 3회 세척하여 배양액 및 하이드로젤 내 남아있는 PAI를 제거하였다. 신선한 배양액을 첨가한 후 30 rpm 속도로 교반하면서 1시간 배양하였으며, 배양액 내 PAI는 첨가하지 않는다. 하이드로젤로부터 분리되어 유리되는 세포는 transfer pipette을 이용하여 수거한 후 tubes 옮긴 후 3,000 rpm에서 10분간 원심분리 후 상층액을 제거하고, 수거한 세포 및 조직절편 pellet은 배양액으로 현탁하였다.
PAI withdrawal 방법 혹은 urokinase 처리 후 분리 수거한 세포는 PBS에 현탁한 후 flow cytometry를 이용하여 면역표현 특성을 분석하였다. 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cells, MSC) 표지자인 CD29, CD44, CD105, CD140b와 더불어 uPAR 및 nestin 발현율을 평가하였다. 조혈세포 표지자로 CD34 및 CD45, 혈관내피세포 표지자로 CD31을 이용하여 해당 표지자 발현율을 평가하였다.
Urokinase 처리 혹은 PAI withdrawal의 결과 하이드로젤로부터 이동 성장한 세포를 분리 후 수거할 수 있다. 세포를 수거하는 방법과 관계없이 배양한 모든 조직에서부터 하이드로젤 내 이동 성장한 세포는 CD29, CD73, CD105 및 CD140b 발현율이 90% 이상으로 중간엽줄기세포와 동일한 면역표현 특성을 보였다(도 16A). 하이드로젤로부터 분리 수거한 세포의 중간엽줄기세포 표지자의 발현율은 분리방법에 따른 차이는 없었다.
그러나 본 실시예에서 모든 조직절편의 장기(臟器)배양 후 PAI withdrawal 처리로 분리 수거한 세포에서 uPAR 및 nestin 발현율은 90% 이상의 발현율을 보였다. 반면 urokinase 처리 후 수거한 세포의 경우 30 ~ 67% 범위의 발현율을 보였다. 하이드로젤 내 uPAR+ 및 nestin+ 세포의 높은 plasmin 활성도 특성에 따라 PAI withdrawal을 통하여 선택적으로 분리하고 수거할 수 있는 결과를 확인할 수 있었다. 반면 urokinase 처리는 하이드로젤 내 다양한 면역표현 특성을 지닌 세포이 혼합되어 수거되는 것을 확인할 수 있었다(도 16B).
조직 내 존재하는 조혈세포 및 혈관내피세포는 조직으로부터 세포를 분리하는 과정 중 혼합될 수 있으며, CD31+, CD34+ 및 CD45+ 세포를 확인하여 이들 세포의 혼합 정도를 확인할 수 있다. PAI withdrawal 방법으로 하이드로젤로부터 분리 수거한 세포의 경우 CD31, CD34 및 CD45 발현율은 1% 미만이나, Urokinase 처리 후 분리 수거한 세포는 2.8 ~ 7.0%로 조혈세포 및 혈관내피세포의 혼합이 높은 것을 확인할 수 있었다(도 17).
본 실시예를 통하여 PAI withdrawal을 통하여 조직으로부터 하이드로젤 내로 이동한 uPAR+ 및 nestin+ 세포를 선택적으로 분리하고 수거하는 방법임을 확인할 수 있었으며, 동시에 분리과정 중 조혈세포 및 혈관내피세포의 혼합은 최소화할 수 있었다.
< 실시예 10> PAI withdrawal 후 분리 수거한 uPAR +/ nestin + 세포의 자기복제 능력
피브린 혹은 피브린/콜라겐 하이드로젤 내 지방, 골수, 심근, 신경, 골격근 및 활액막 조직절편을 함입한 후 2주간 3D 장기(臟器)배양을 시행한 후 실시예 6에 기술된 PAI withdrawal 및 urokinawe 방법으로 하이드로젤 내 이동 성장한 세포를 분리 수거하였다.
하이드로젤로부터 분리 수거한 세포는 tubes 옮긴 후 3,000 rpm에서 10분간 원심분리 후 상층액을 제거하였다. 세포 침전물은 배양액으로 부유한 후 mL 당 1.0E+06 세포 밀도로 맞추었다. 하이드로젤로부터 분리 수거한 세포의 자기복제 능력을 검증하기 위하여 colony forming assay(CFU)를 통하여 평가하였다. 100-mm 배양용기에 6,000 개의 세포를 파종한 후 2주간 배양하였고, 배양 후 1% crystal violet으로 염색하였다. 세척 후 2 mm 이상 직경의 colony 수를 측정하였다.
조직 유형에 따른 CFU 형성빈도는 차이는 있었으나, 모든 조직절편에서 PAI withdrawal을 통하여 하이드로젤로부터 분리 수거한 세포에서 urokinase 처리 후 수거한 세포와 비교하여 유의하게 높았다(도 18). 특히 심근, 신경 및 골격근으로부터 유래한 세포는 다른 조직에서 유래한 세포와 비교하여 높은 colony 형성 능력을 보였다. Urokinase 처리 후 분리한 세포의 경우 CFU 빈도는 3.1 ~ 8.4%이었으나, PAI withdrawal 방법으로 분리한 세포는 8.8 ~ 37.9%로 높은 CFU 빈도를 지닌 것으로 확인되었다.
자기복제 능력은 줄기세포의 주요 특성 중 하나이며, 3D 장기(臟器)배양은 조직 내 줄기세포를 활성화하여 하이드로젤 내로 이동 성장을 유도할 수 있으며, 하이드로젤 내 줄기세포는 PAI withdrawal 방법을 통하여 자가복제 역가가 높은 줄기세포를 선택적으로 분리 수거할 수 있으며, 이는 plasmin 활성도가 높은 uPAR+/nestin+ 세포가 높은 역가의 줄기세포임을 증명하는 결과이다(도 18).
<실시예 11> PAI withdrawal 후 분리한 세포의 체외 성장 능력
피브린 혹은 피브린/콜라겐 하이드로젤 내 지방, 골수, 심근, 신경, 골격근 및 활액막 조직절편을 함입한 후 2주간 3D 장기(臟器)배양을 시행한 후 실시예 6에 기술된 PAI withdrawal 및 urokinase 방법으로 하이드로젤 내 이동 성장한 세포를 분리 수거하였다.
하이드로젤로부터 분리 수거한 세포는 tubes 옮긴 후 3,000 rpm에서 10분간 원심분리 후 상층액을 제거하였다. 세포 침전물은 배양액으로 부유한 후 mL 당 1.0E+06 세포 밀도로 맞추었다. 하이드로젤로부터 분리 수거한 세포의 체외 성장능력을 검증하기 위하여 세포배가시간(population doubling time, PDT) 및 세포배가수준(population doubling level, PDL)을 분석하여 평가하였다. T75 flask에 cm2 당 3,000개의 세포를 파종한 후 7일간 배양한 후 trypsin/EDTA 처리 후 세포를 수집하였고, hemocytometer를 통하여 총세포수를 계산하였다. 파종세포 수, 수거 총세포수, 배양기간을 통하여 PDT 및 PDL을 계산하여 비교하였다. PDT는 다음 공식에 따라 산정하였다. PDT=[(배양시간)/((logN2-logN1)/log2)] 수식을 이용하여 산정하였으며, N1은 파종 시 세포수이며, N2는 배양 후 수거한 세포수이다. PDL은 다음 공식에 따라 계산하였다. PDL = [PDL0 + 3.322(logN2-logN1)] 수식을 이용하였고, N1은 파종 시 세포수이고, N2는 세포 배양 후 수거한 세포수이다.
체외 성장능력이 높을 수로 배양 중인 세포에서 세포주기 표지자인 Ki-67 발현율이 높다. 체외 세포성장 능력은 anti-Ki67 발현율을 flow cytometry로 분석하여 비교 분석하였다.
Urokinase 혹은 PAI withdrawal 처리 후 하이드로젤로부터 이동 성장한 세포를 분리하고 수거한 세포의 체외 성장능력을 비교 분석하였다. PAI withdrawal을 통하여 분리 수거한 세포에서 urokinase 처리 후 확보한 세포와 비교하여 PDT는 유의하게 낮았으며 PDL은 유의하게 높았다. 자기복제 능력과 동일한 경향으로 PAI withdrawal을 통하여 분리 수거한 세포의 낮은 PDT 및 높은 PDL로 뛰어난 체외 성장능력을 지닌 세포임을 확인할 수 있었다(도 19).
PAI withdrawal 처리 후 하이드로젤로부터 분리 수거한 세포의 높은 성장능력을 검증하기 위하여 Ki-67 발현율을 flow cytometry를 통하여 분석하였다. Ki-67 표지자는 세포주기 중인 세포를 의미하므로 Ki-67 발현율이 높을수록 세포성장 능력이 높다는 것을 의미하는 지표이다. PAI withdrawal을 통하여 확보한 세포는 58.5 ~ 75.4%의 높은 Ki-67 발현율을 보였으며, 이는 urokinase 처리 후 확보한 세포에서의 33.6 ~ 48.7%와 비교하여 유의하게 높았다(도 20).
이상의 결과 PAI withdrawal은 높은 체외 성장능력을 지닌 세포를 선택적으로 분리하는 방법임을 확인할 수 있으며, 이는 plasmin 활성도가 높은 uPAR+/nestin+ 세포가 높은 성장능력을 지닌 세포임을 지지하는 결과이다.
<실시예 12> PAI withdrawal 후 분리한 세포의 분화능력
피브린 혹은 피브린/콜라겐 하이드로젤 내 지방, 골수, 심근, 신경, 골격근 및 활액막 조직절편을 함입한 후 2주간 3D 장기(臟器)배양을 시행한 후 실시예 6에 기술된 PAI withdrawal 및 urokinawe 방법으로 하이드로젤 내 이동 성장한 세포를 분리 수거하였다.
하이드로젤로부터 분리 수거한 세포는 tubes 옮긴 후 3,000 rpm에서 10분간 원심분리 후 상층액을 제거하였다. 세포 침전물은 배양액으로 부유한 후 mL 당 1.0E+06 세포 밀도로 맞추었다. 하이드로젤 내 세포의 지방세포 및 조골세포로의 분화능력을 평가하였다. 2.0E+05 세포를 24-well 배양용기에 파종한 후 90% DMEM에 10% CS, 0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (Sigma), 80 μM indomethacin (Sigma), 1 μM DEX, 5 μg/mL insulin이 첨가된 분화배지를 첨가한 후 14일 동안 배양하였다. 줄기세포의 지방세포로의 분화정도는 분화 유도 2주 후에 세포질 내 지방축적의 지표인 0.5% Oil Red O (Sigma)용액을 상온에서 1시간 염색하여 세포질 내 triglyceride 함량을 Triglyceride-Glo kit(Promega)를 이용하여 평가하였다. 조골세포로의 분화능력은 평가하기 위해서 2.0E+05개 세포를 24-well 배양용기에 파종한 후 1 μM DEX, 50 μM Ascorbic Acid, 10 mM β-glycerol phosphate, 10% calf serum을 함유한 α-MEM을 첨가한 후 2주간 배양하여 분화를 유도하였다. 조골세포로의 분화여부는 분화 유도 2주 후 Alizarin Red(Sigma)을 첨가한 후 염색하였으며, 미네랄의 침착 정도는 520 nm에서 흡광도를 측정하여 optical density로 비교 분석하였다.
도 21은 골수로부터 분리 수거한 세포를 조골세포(좌) 및 지방세포(우)로 분화를 유도한 후 calcium phosphate crytal 축적과 침착을 alizarin red 염색을 통하여 확인할 수 있으며, 지방세포로 분화를 유도한 세포는 세포질 내 지방질의 축적을 oil red O 염색을 통하여 확인할 수 있다. 모든 조직절편에서 유래한 세포 모두에서 조골세포 및 지방세포로의 분화능력을 지닌 것을 확인할 수 있었다.
침착 혹은 축적된 mineral cryostal 및 fat vacuole을 용해 후 측정한 OD 수치를 통하여 조골 및 지방세포포의 분화능력을 비교 평가하였다. 모든 조직절편에서 PAI withdrawal로 하이드로젤로부터 분리 수거한 세포에서 조골세포 및 지방세포로의 분화 능력이 urokinase 처리 후 분리 수거한 세포보다 유의하게 높은 것을 확인할 수 있었다(도 22). 조골세포로의 분화는 골수, 심근, 골격근 유래 세포에서 높은 능력을 보였으며, 지방세포로의 분화는 지방, 골격근 및 활액막에서 높은 능력을 보였다. 그러나 조직절편 유래와 관계없이 PAI withdrawal 방법으로 하이드로젤로부터 분리 회수한 세포에 유의하게 높은 조골세포 및 지방세포로의 분화능력을 확인함에 따라, plasmin 활성도가 높은 uPAR+/nestin+ 세포에서 다 분화능력이 높은 줄기세포임을 확인할 수 있었다.
<실시예 13> PAI withdrawal 후 분리한 세포의 조직재생 유도능력
피브린 혹은 피브린/콜라겐 하이드로젤 내 지방, 골수, 심근, 신경, 골격근 및 활액막 조직절편을 함입한 후 2주간 3D 장기(臟器)배양을 시행한 후 실시예 6에 기술된 PAI withdrawal 및 urokinawe 방법으로 하이드로젤 내 이동 성장한 세포를 분리 수거하였다.
하이드로젤로부터 분리 수거한 세포는 tubes 옮긴 후 3,000 rpm에서 10분간 원심분리 후 상층액을 제거하였다. 세포 침전물은 배양액으로 부유한 후 mL 당 1.0E+06 세포 밀도로 맞추었다. T175 flask에 5.0E+06 세포를 파종한 후 3일간 배양한 후 TRIzol 1 mL을 첨가한 후 cell lysate를 수거하였고, total RNA를 분리하기 전까지 -20도 냉동 보관하였다. PureLink RNA 키트(Thermo Fisher)을 이용하여 total RNA를 추출 정제하였으며, 역전사효소(Reverse Transcriptase)을 이용하여 cDNA를 합성하였다. 조직보호 및 재생에 주요 역할을 담당하는 basic FGF(bFGF), HGF, IGF, SDF-1 mRNA 발현은 제대혈 유래 중간엽줄기세포(cord blodd-derived mesenchymal stem cells, CB-MSC) 대비 발현율로 계산하여 비교 평가하였다. Target mRNA 특이 시발체와 SYBR Green Real-Time PCR kit를 이용하여 실시간 유전자 증폭을 통하여 Target mRNA 유전자를 증폭하였으며, 제대혈 유래 중간엽줄기세포 (CB-MSC) 대비 mRNA 발현율을 2-ΔΔCt방법으로 평가하였다.
Urokinase 혹은 PAI withdrawal 처리 후 하이드로젤로부터 이동 성장한 세포를 분리하고 수거한 세포의 조직재생 유도능력은 관련 mRNA 발현을 통하여 비교 분석하였다. 기원한 조직에 따라 조직재생을 유도하는 유전자 발현의 달랐으며, 심근, 신경 그리고 골격근 유래 세포에서 이들 유전자 발현이 높았으며, HGF 및 SDF-1 mRNA는 심근 유래 세포가 높았으나, 신경 유래 세포에서는 IGF mRNA 발현이 높았다 [도면23]. PAI withdrawal로 분리 수거한 세포에서 urokinase 처리 후 분리 수거한 세포 대비 모든 조직재생 유전자 발현이 유의하게 높았다. 이런 결과는 uPAR 발현은 높은 조직재생 조절 유전자 발현과 비례적 연관성을 확인할 수 있다.
<실시예 14> uPAR+ 세포의 plasmin 활성도 및 nestin 발현율
피브린 혹은 피브린/콜라겐 하이드로젤 내 지방, 골수, 심근, 신경, 골격근 및 활액막 조직절편을 함입한 후 2주간 3D 장기(臟器)배양을 시행한 후 실시예 6에 기술된 urokinase 방법으로 하이드로젤 내 이동 성장한 세포를 분리 수거하였다. 이후 FACSAria(BD Bioscience)를 통하여 uPAR+ (UK+uPAR+)와 uPAR- (UK+uPAR-) 세포를 분리하여 7일간 단층환경에서 배양한 후 plasmin 활성도와 nestin 발현율을 평가하였다. PAI withdrawal 방법으로 하이드로젤로부터 분리 수거한 세포는 uPAR 발현율이 90% 이상이므로 이차적인 uPAR+ 세포를 분리하지 않았다. Plasmin 활성도는 실시예 6에서 기시한 방법에 따라 시행하였으며, nestin 발현율은 flow cytometry를 이용하여 평가하였다.
uPAR+ 세포에서 유의하게 높은 plasmin 활성도를 확인할 수 있었다(도 24, 좌). Urokinase 처리 후 분리 배양한 UK+uPAR+ 세포와 PAI withdrawal 후 분리 배양한 세포에서 UK+uPAR- 세포와 비교하여 유의하게 높은 plasmin 활성도를 보였다. 기원한 조직에 따라 세포의 plasmin 활성도는 차이가 있었으며, 심근, 신경 및 골격근에서 높았으며, 조직 내재성 세포의 기원한 조직에 따라 plasmin 활성도가 결정되는 특성을 보였다.
이상의 결과는 uPAR+ 세포에서 plasmin 활성도와 nestin 발현율과 밀접한 연관성을 확인할 수 있었다.
<실시예 15> uPAR+ 세포의 자기복제 및 체외 성장 능력
피브린 혹은 피브린/콜라겐 하이드로젤 내 지방, 골수, 심근, 신경, 골격근 및 활액막 조직절편을 함입한 후 2주간 3D 장기(臟器)배양을 시행한 후 실시예 6에 기술된 urokinase 방법으로 하이드로젤 내 이동 성장한 세포를 분리 수거하였다. 이후 FACSAria(BD Bioscience)를 통하여 uPAR+ (UK+uPAR+)와 uPAR- (UK+uPAR-) 세포를 분리하여 7일간 단층환경에서 배양한 후 자가복제 및 성장 능력을 평가하였다. PAI withdrawal 방법으로 하이드로젤로부터 분리 수거한 세포는 uPAR 발현율이 90% 이상이므로 이차적인 uPAR+ 세포를 분리하지 않았다. 자가복제 능력은 실시예 10에 기시한 방법에 따라 시행하였으며, 성장능력은 Ki-67 발현율을 flow cytometry를 이용하여 평가하였다.
uPAR+ 세포에서 유의하게 높은 자기복제 능력을 확인할 수 있었다. UK+uPAR+ 세포 및 PAI withdrawal 세포에서 CFU 빈도는 12.5 ~ 37.5% 였으나, UK+uPAR- 세포에서는 3.1 ~ 8.8% 빈도였으며, uPAR+ 세포에서 유의하게 높은 자가복제 능력을 보유한 것을 확인할 수 있었다(도 25 좌).
자기복제 능려과 체외 성장능력은 밀접한 연관성을 지니며, uPAR+ 세포에 Ki-67 발현율이 40.8 ~ 82.4%로 uPAR- 세포에서 Ki-67 발현율 28.1 ~ 45.7% 보다 유의하게 높은 성장능력을 보유한 것을 확인할 수 있었다(도 25, 우). 심근, 신경 및 골격근 유래 uPAR+ 세포에서 타 기원 조직과 비교하여 CFU 형성 능력과 Ki-67 발현율이 높았다.
<실시예 16> uPAR+ 세포의 항염증 능력
피브린 혹은 피브린/콜라겐 하이드로젤 내 지방, 골수, 심근, 신경, 골격근 및 활액막 조직절편을 함입한 후 2주간 3D 장기(臟器)배양을 시행한 후 실시예 6에 기술된 urokinase 방법으로 하이드로젤 내 이동 성장한 세포를 분리 수거하였다. 이후 FACSAria(BD Bioscience)를 통하여 uPAR+ (UK+uPAR+)와 uPAR- (UK+uPAR-) 세포를 분리하여 7일간 단층환경에서 배양한 후 항염증 능력을 평가하였다. PAI withdrawal 방법으로 하이드로젤로부터 분리 수거한 세포는 uPAR 발현율이 90% 이상이므로 이차적인 uPAR+ 세포를 분리하지 않았다.
항염증 능력은 세포에서 분비된 인자를 포함한 조건배지(conditioned media)를 이용하여 평가하였다. 조건배지를 제조하기 위하여 UK+uPAR+, UK+uPAR- 및 PAI withdrawal 세포는 T175 flask에 cm2 당 40,000개 세포를 파종한 DMEM/F12 무혈청배지를 첨가한 후 1주간 배양하였다.
RAW 264.7 세포는 90% RPMI 1640/10% calf serum에 현탁한 후 cm2 당 100,000개 세포를 12-multiwell plate에 파종하여 1일간 배양하였다. 100 μg/mL LPS을 배양액에 첨가하여 RAW 264.7 세포를 감작시켰다. LPS 감작 시 조건배지를 배양액과 1:10 비율로 첨가하여 항염증 능력을 평가하였다. 항염증 평가 지표는 RAW 264.7 세포에서 분비되는 TNFα 및 IL-1β 분리 수준을 ELISA 방법으로 측정하여 비교 평가하였다.
RAW 264.7 세포는 LPS 자극 후 TNFα 및 IL-1β 분비 수준이 5배 증가하였다. 하이드로젤로부터 분리 수거한 조직 내재성 줄기세포에서 분비하는 물질은 RAW 264.7 세포의 염증성 사이토카인 분리를 30 ~ 70% 억제하는 능력을 확인할 수 있었다(도 26). UK+uPAR+ 세포 및 PAI withdrawal 세포에서 제조한 조건배지는 UK+uPAR- 세포 대비 유의하게 높은 TNFα 및 IL-1β 분비 억제 능력을 보였다. 기원한 조직과 무관하게 uPAR+ 세포는 uPAR- 세포와 비교하여 높은 항염증 효력을 확인할 수 있었다.
<실시예 17> uPAR+ 세포의 혈관내피세포 및 섬유아세포 성장 유도효력
피브린 혹은 피브린/콜라겐 하이드로젤 내 지방, 골수, 심근, 신경, 골격근 및 활액막 조직절편을 함입한 후 2주간 3D 장기(臟器)배양을 시행한 후 실시예 6에 기술된 urokinase 방법으로 하이드로젤 내 이동 성장한 세포를 분리 수거하였다. 이후 FACSAria(BD Bioscience)를 통하여 uPAR+ (UK+uPAR+)와 uPAR- (UK+uPAR-) 세포를 분리하여 7일간 단층환경에서 배양한 후 항염증 능력을 평가하였다. PAI withdrawal 방법으로 하이드로젤로부터 분리 수거한 세포는 uPAR 발현율이 90% 이상이므로 이차적인 uPAR+ 세포를 분리하지 않았다.
혈관내피세포는 human umbilical vein endothelial cell(HUVEC)을 사용하였으며, 인간 진피 유래 섬유아세포(dermal fibroblast, DF)를 사용하였다. 조건배지의 해당 세포의 성장 유도효력을 시험하였다. 실시예 16에서 기시된 방법으로 제조한 조건배지를 제조하여 효력을 시험하였다. HUVEC 세포 및 DF는 99% DMEM/1% calf serum 배양액에 현탁한 후 cm2 당 4,000개 세포를 24-multiwell plate에 파종하였다. 조건배지는 배양액과 1:9의 비율로 첨가한 후 3일간 배양하였고, 배양 후 세포수는 PicoGreen dsDNA quantitation kit(Invitrogen)을 이용하여 측정하였다. 세포성장 효력은 최초 파종한 세포 수 대비 증가되는 비율(fold)를 계산하여 비교 분석하였다.
UK+uPAR+ 및 PAI withdrawal 세포에서 제조한 조건배지는 HUVEC 및 DF 성장을 촉진하는 효력이 확인되었으며, UK+uPAR- 세포에서 제조한 조건배지 대비 30% 이상 유의하게 높은 효력을 나타내었으나, UK+uPAR+와 PAI withdrawal 세포 간의 효력은 차이가 없었다(도 27). 특히 심근, 신경 및 골격근 유래 줄기세포에서 얻어진 조건배지는 다는 조직 유래 줄기세포와 비교하여 높은 성장 유도효력을 확인할 수 있었다.
<실시예 18> uPAR+ 세포의 혈관내피세포 및 섬유아세포 보호 효력
피브린 혹은 피브린/콜라겐 하이드로젤 내 지방, 골수, 심근, 신경, 골격근 및 활액막 조직절편을 함입한 후 2주간 3D 장기(臟器)배양을 시행한 후 실시예 6에 기술된 urokinase 방법으로 하이드로젤 내 이동 성장한 세포를 분리 수거하였다. 이후 FACSAria(BD Bioscience)를 통하여 uPAR+ (UK+uPAR+)와 uPAR- (UK+uPAR-) 세포를 분리하여 7일간 단층환경에서 배양한 후 항염증 능력을 평가하였다. PAI withdrawal 방법으로 하이드로젤로부터 분리 수거한 세포는 uPAR 발현율이 90% 이상이므로 이차적인 uPAR+ 세포를 분리하지 않았다.
UK+uPAR- 세포, UK+uPAR+ 세포 및 PAI withdrawal 후 분리 수거한 세포에서 각각 제조한 조건배지를 사용하여 세포보호 효력을 시험하였다. HUVEC 및 DF를 99% DMEM/1% calf serum 배양액에 현탁한 후 cm2 당 5,000개 세포를 24-multiwell plate에 파종하였다. H2O2 매개 세포손상 유도 1시간 전 조건배지는 배양액과 1:9의 비율로 첨가하였다. 0.01% H2O2를 첨가하여 세포손상을 유도하였고, 손상 유도 6시간 후 배양액을 제거한 후 PBS로 2회 세척하였다. 세포손상 정도는 annexin V 발현율로 평가하였으며, FITC-conjugated annexin V(BD Biosciences)을 세포와 반응시킨 후 사멸화된 세포를 flow cytometry로 분석하였다.
UK+uPAR+ 세포 및 PAI withdrawal 처리 후 수거 세포에서 제조한 조건배지는 UK+uPAR- 세포 유래 조건배지와 비교하여 H2O2 매개 HUVEC 및 DF 세포죽음을 유의하게 보호할 수 있는 결과를 확인하였다(도 28). 기원한 조직에 따라 세포보호 효력의 차이는 관찰되었으며, 심근, 신경 및 골격근 유래 세포에서 HUVEC 및 DF 세포보호 효력이 높았다. UK+uPAR+ 세포 조건배지로 처리한 HUVEC 및 DF에서 annexin V 발현율은 28.7 ~ 45.1%으로 UK+uPAR- 세포 조건배지로 처리한 세포의 경우 42.1 ~ 71.3% 보다 유의하게 높은 세포보호 효력을 나타내었으나, PAI withdrawal 세포 유래 조건배지와는 유의미한 차이는 확인할 수 없었다. 이런 결과는 uPAR 발현은 높은 세포보호 효력과 연관성을 확인할 수 있으며, PAI withdrawal 만으로도 세포보호 효력이 높은 세포를 분리 배양할 수 있는 근거를 확인하였다.
본 발명은 인공 창상수복기질(engineered provisional matrix) 지지 장기배양을 통하여 이루어진다. 조직절편을 인공 provisional matrix 내 함입하고 provisional matrix를 통하여 integrin-FAK 세포신호전달 경로를 활성화하여 조직 내재성 줄기세포의 세포분열과 성장을 유도한다. 장기배양 과정을 통하여 조직 내 줄기세포가 provisional matrix로 이동 성장은 uPAR-uPA-plasmin 활성도와 비례하여 증가한다. 과도한 uPAR-uPA-plasmin 활성에 따라 provisional matrix가 분해 소실되어 줄기세포 이동이 저해 중단되는 결과를 제어하기 위하여 PAI 첨가를 통하여 과도한 provisional matrix 분해를 조절할 수 있다. Provisional matrix 내로 줄기세포의 이동과 성장이 목표로 한 수준에 도달된 후 PAI 첨가를 중단함으로서 uPAR+ 줄기세포를 분리할 수 있는 기술을 제공한다. PAI 첨가 중단에 따라 uPAR-uPA-plasmin 및 MMP 활성화에 따라 uPAR+ 줄기세포가 provisional matrix로부터 해리되어 배양액 내로 유리되는 결과가 도출된다. 본 발명은 uPAR 발현에 따른 provisional matrix의 이동과 분해 특성을 이용하여 어떠한 조직분해 단백질의 사용과 표지자를 이용한 줄기세포 정제 과정 없이 uPAR+ 줄기세포를 분리 배양할 수 있는 기술을 제공한다.
본 발명은 골수, 지방, 골격근, 심장, 말초신경, 척수, 뇌, 폐, 간, 관절막, 제대, 태반, 치주 등의 고형성 조직 내 존재하는 uPAR+ 줄기세포의 분리배양에 적용할 수 있다. 본 발명은 어떠한 조직분해효소 처리 없이 줄기세포를 분리함으로써 장기배양에 사용한 조직절편은 그 구조가 온전히 보존할 수 있어 반복적 장기배양을 통하여 줄기세포를 분리배양할 수 있는 방법을 제공한다.
본 발명은 uPAR 양성 조직 내재성 줄기세포 중 uPAR과 더불어 통상적 줄기세포 표지자가 양성으로 발현하는 특성을 나타낸다. 골수, 지방, 근육, 심장, 관절막, 재대, 태반의 경우 중간엽줄기세포 표지자인 CD29, CD44, CD73, CD90, CD105가 양성으로 발현되나, 조혈모세포 혹은 혈관내피세포 표지자는 음성인 특성을 지닌다. 본 발명은 말초신경, 척수, 뇌 조직에서 유래한 uPAR 양성 줄기세포는 nestin, p75, Sox10, Sox2 등의 표지자가 동시에 발현되는 특성을 보인다.
본 발명의 uPAR 양성 줄기세포는 이동, 성장인자, 항염증인자, 줄기세포 동원인자 증 조직재생에 작용하는 생리활성 인자의 분비 능력이 높은 생물학적 특성을 보인다.
본 발명의 uPAR 양성 줄기세포는 조직 구성 세포로의 분화능력이 높은 다 분화능력을 지닌다.

Claims (18)

  1. (1) 창상수복기질 모방 하이드로젤을 제조하는 단계;
    (2) 분리된 조직 절편을 상기 창상수복기질 모방 하이드로젤 내로 함입시키는 단계; 및
    (3) 상기 조직 절편이 함입된 창상수복기질 모방 하이드로젤을 플라스미노겐 활성 억제제(plasminogen activator inhibitor; PAI)가 첨가된 배양액에서 3차원 배양하는 단계를 포함하는 조직 내재성 uPAR+ 및 nestin+ 줄기세포의 활성화 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 창상수복기질 모방 하이드로젤은 0.25 ~ 2.5% 농도의 피브리노겐 용액 및 0.5 ~ 5 I.U./mL 농도의 트롬빈 용액이 혼합된 피브린 하이드로젤, 상기 피브린 하이드로젤에 0.1 ~ 0.5% 농도의 콜라겐 용액이 혼합된 피브린/콜라겐 혼합 하이드로젤 또는 상기 피브린 하이드로젤에 0.1 ~ 0.5% 농도의 젤라틴 용액이 혼합된 피브린/젤라틴 혼합 하이드로젤인 것을 특징으로 하는 조직 내재성 uPAR+ 및 nestin+ 줄기세포의 활성화 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 조직은 지방 조직, 골수 조직, 심근 조직, 말초 신경 조직, 골격근 조직 또는 활액막 조직인 것을 특징으로 하는 조직 내재성 uPAR+ 및 nestin+ 줄기세포의 활성화 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 PAI는 트라넥사민산(tranexamic acid) 또는 아미노메틸 벤조익산(aminomethyl benzoic acid)인 것을 특징으로 하는 조직 내재성 uPAR+ 및 nestin+ 줄기세포의 활성화 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 방법은 조직 내 세포의 인테그린(integrin)-FAK 세포신호 전달을 활성화시켜, 조직 내재성 uPAR+ 및 nestin+ 줄기세포의 세포분열 및 세포성장을 유도하는 것을 특징으로 하는 조직 내재성 uPAR+ 및 nestin+ 줄기세포의 활성화 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 방법은 상기 조직 내재성 uPAR+ 및 nestin+ 줄기세포의 창상수복기질 모방 하이드로젤 내로 세포이동 및 세포성장을 유도하는 것을 특징으로 하는 조직 내재성 uPAR+ 및 nestin+ 줄기세포의 활성화 방법.
  7. (1) 창상수복기질 모방 하이드로젤을 제조하는 단계;
    (2) 분리된 조직 절편을 상기 창상수복기질 모방 하이드로젤 내로 함입시키는 단계;
    (3) 상기 조직 절편이 함입된 창상수복기질 모방 하이드로젤을 PAI가 첨가된 배양액에서 3차원 배양하는 단계;
    (4) 상기 3차원 배양액을 제거하고 세척하여 PAI를 제거하는 단계;
    (5) 상기 PAI가 제거된 배양물을 PAI가 함유되지 않은 배양액으로 재배양하여 상기 창상수복기질 모방 하이드로젤을 분해시키는 단계; 및
    (6) 상기 재배양액 내에 유리된 줄기세포를 분리하는 단계를 포함하는 조직 내재성 uPAR+ 및 nestin+ 줄기세포의 분리배양 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 창상수복기질 모방 하이드로젤은 0.25 ~ 2.5% 농도의 피브리노겐 용액 및 0.5 ~ 5 I.U./mL 농도의 트롬빈 용액이 혼합된 피브린 하이드로젤, 상기 피브린 하이드로젤에 0.1 ~ 0.5% 농도의 콜라겐 용액이 혼합된 피브린/콜라겐 혼합 하이드로젤 또는 상기 피브린 하이드로젤에 0.1 ~ 0.5% 농도의 젤라틴 용액이 혼합된 피브린/젤라틴 혼합 하이드로젤인 것을 특징으로 하는 조직 내재성 uPAR+ 및 nestin+ 줄기세포의 분리배양 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 조직은 지방 조직, 골수 조직, 심근 조직, 말초 신경 조직, 골격근 조직 또는 활액막 조직인 것을 특징으로 하는 조직 내재성 uPAR+ 및 nestin+ 줄기세포의 분리배양 방법.
  10. 제7항에 있어서, 상기 PAI는 트라넥사민산(tranexamic acid) 또는 아미노메틸 벤조익산(aminomethyl benzoic acid)인 것을 특징으로 하는 조직 내재성 uPAR+ 및 nestin+ 줄기세포의 분리배양 방법.
  11. 제7항에 있어서, 상기 (5) 단계는 상기 조직 내 uPAR 발현 증가를 유도하고, 플라스민(plasmin) 활성도 증가를 통해, 상기 창상수복기질 모방 하이드로젤을 분해시키는 것을 특징으로 하는 조직 내재성 uPAR+ 및 nestin+ 줄기세포의 분리배양 방법.
  12. 제7항에 있어서, 상기 조직 내재성 uPAR+ 및 nestin+ 줄기세포는 자기복제능, 체외 성장능, 분화능 또는 조직재생 유도능이 증진된 것을 특징으로 하는 조직 내재성 uPAR+ 및 nestin+ 줄기세포의 분리배양 방법.
  13. 제7항에 있어서, 상기 (5) 단계의 재배양액으로부터 회수된 조직 절편은 상기 (2) 단계 내지 (5) 단계를 1 내지 10회 반복하는 과정을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조직 내재성 uPAR+ 및 nestin+ 줄기세포의 분리배양 방법.
  14. 제7항 내지 제13항 중 어느 한 항의 방법에 따라 분리배양된 조직 내재성 uPAR+ 및 nestin+ 줄기세포 또는 이의 배양액.
  15. 제14항에 따른 조직 내재성 uPAR+ 및 nestin+ 줄기세포 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 염증 질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
  16. 제14항에 따른 조직 내재성 uPAR+ 및 nestin+ 줄기세포 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 자가면역질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
  17. 제14항에 따른 조직 내재성 uPAR+ 및 nestin+ 줄기세포 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 창상 치료용 약학조성물.
  18. 제14항에 따른 조직 내재성 uPAR+ 및 nestin+ 줄기세포 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 혈관 재생 촉진용 약학조성물.
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