KR20130124075A - 심장전구세포의 배양방법 및 그 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 심근절편을 하이드로젤 내에 함입시켜 배양하는 단계 및 하이드로젤만을 분해하여 심근절편으로부터 하이드로젤 내로 이동, 성장한 심장전구세포를 회수하는 단계를 포함하는 심근 유래 심장전구세포의 배양방법, 이에 의해 배양된 심장전구세포, 이의 분화방법 및 이를 포함한 세포치료제, 심장질환 치료제에 관한 것으로, 상기 배양방법에 의해 배양된 심근 유래 심장전구세포는 심근세포, 조골세포, 지방세포, 연골세포, 혈관내피세포, 평활근세포, 신경세포 또는 골격근세포의 다분화 능력이 뛰어날 뿐 아니라, 특별한 분화유도인자가 없어도 심근세포로 자발적으로 분화할 수 있기에, 이를 세포치료제 및 조직공학적 치료제 등의 바이오 신약 생산에 적용 가능하다.

Description

심장전구세포의 배양방법 및 그 용도 {Method for Culture of cardiac progenitor cells and Uses Therefor}
본 발명은 심근 유래 심장전구세포 및 이의 배양방법, 이의 분화방법 및 이를 포함한 세포치료제, 심장질환 치료제에 관한 것이다.
심장은 다양한 원인 인자에 의하여 손상 받으면 제한적으로 재생되는 특성을 지닌 장기이다. 관상동맥질환과 심근경색 등과 같은 허혈성 심질환은 비가역적 심근세포의 죽음과 소실을 유발하고, 그 결과 심장기능이 저하되어 울혈성 심부전과 같은 난치성 심근질환을 유발하게 된다[J Am Coll Cardiol 2000;35:569]. 2006년 통계청의 '2006년 사망 및 사망원인통계결과' 자료에 의하면 한국인 전체 사망 원인 중 심혈관 질환이 차지하는 비중이 23.1%로 심혈관 질환의 심각성을 잘 나타내고 있다[통계청, 사망원인통계연보, 2007]. 최근 노령층인구의 증가와 서구식 식습관으로의 변화는 심혈관 질환이 향후 급속히 증가할 것으로 예측되고 있다. 난치성 심장질환은 전통적인 약물요법과 수술요법으로는 치료되지 않으며, 현재로선 심장이식만이 유일한 치료법이다. 그러나 심장이식이 요구되는 환자의 5% 미만에서만 이식수술을 받을 수 있는 실정이다[Chest 2003;123:2104]. 이러한 난치성 심장질환에 적용될 수 있는 줄기세포 기반의 바이오신약 개발이 절실히 요구되고 있다.
난치성 심근질환에 적용될 수 있는 줄기세포치료제는 배아줄기세포(embryonal stem cells, ESCs), 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells, iPSCs), 그리고 성체줄기세포로 구분할 수 있다. ESCs 및 iPSCs는 심장을 구성할 수 있는 모든 세포, 즉 심근세포(cardiomyocytes, CMCs), 혈관 평활근세포(vascular smooth muscle cells, vSMCs), 그리고 혈관내피세포(endothelial cells, ECs)로 분화할 수 있는 능력을 지닌 세포이다. 그러나 ESCs 및 iPSCs의 임상적 적용은 면역거부반응, 종양형성, 그리고 심근조직으로의 분화조절 등과 기술적 난제들을 극복하여야 된다. 반면 성체줄기세포는 면역거부반응 및 종양의 발생 위험도가 낮아 현제 난치성 심근질환 환자를 대상으로 한 임상적 적용은 모두 성체줄기세포를 기반으로 한 세포치료제이다.
난치성 심근질환에 적용되는 성체줄기세포는 (1) 조혈계 기원 줄기세포, (2) 골수 혹은 제대혈 기원 중간엽줄기세포, (3) 골격근 기원 중간엽줄기세포 혹은 골격근전구세포, (4) 지방조직 기원 중간엽줄기세포, (5) 최근 발견된 심장기원 내재성 심장전구세포(cardiac progenitor cells; CPCs) 등이 세포치료제로 적용되고 있다[Nature 2008;451:937]. 조혈모세포는 골수로부터 천자하여 얻어지는 경우, GM-CSF 투여 후 말초혈액으로부터 동원된 조혈모세포에서 분리하는 경우, 신생아의 제대혈로부터 분리한 조혈계 기원 줄기세포들은 난치성 심근질환을 치료하기 위한 세포치료제로 적용 개발되고 있다. 그러나 조혈계 기원 줄기세포는 체외에서 증폭 배양이 제한적이라 충분한 수의 세포치료제를 확보하기 힘든 단점이 대두되었다. 더불어 조혈계 기원 줄기세포는 심근세포로 직접 분화할 수 있는 능력이 없는 것으로 밝혀졌다. 골수, 제대혈, 골격근, 그리고 지방조직에서부터 분리한 중간엽줄기세포는 조혈계 기원 줄기세포와 비교하여 체외증폭 배양이 가능하여 세포치료제로 갖는 가능성은 크나, 심근세포로의 직접 분화능력은 없어 난치성 심근질환의 치료제로서 그 생물학적 효능이 떨어진다. 반면 심장전구세포는 심근을 구성하는 모든 세포로 분화할 수 있는 유일한 성체줄기세포이며, 체외증폭 능력이 우수하여, 난치성 심근질환 치료제로서 가져할 조건을 모두 충족하는 치료제로 인식되고 있다[Nature 2008;451:937, Circ Res 2011;108:353].
심장전구세포의 분리 및 배양은 종래의 3가지 방법이 적용되고 있다. 첫째, 심근절편을 콜라제네이즈(collagenase), 디스페이즈(dispase), 혹은 트립신(trypsin) 등과 같은 조직분해효소를 처리하여 고형성 심근으로부터 해리된 단일세포군을 분리하는 조직해리과정을 거친 후, 면역학적 방법으로 특정 표지자를 발현하는 세포만을 해리된 단일세포군으로부터 선택적으로 정제하고, 단층배양법으로 정제된 세포를 증폭하는 방법이 있다[Nature 2008;451:937, Circ Res 2011;108:353]. 둘째, 심근을 조직분해효소를 약하게 처리한 후 조직을 느슨하게 만든 후 심근을 2차원 방법으로 배양용기에 파종한 후 배양하는 방법이 있으며 셋째, 두 번째 방법으로 배양하는 과정 중 배양 7일 이후에 형성되는 심장구(cardiosphere)를 선택적으로 분리한 후 심장구를 다시 단층배양법으로 분리하는 방법이 사용되고 있다[Circ Res 2004;95:911].
첫 번째 방법에서 해리된 단일세포로부터 심장전구세포를 정제할 때 사용되는 대표적인 표지자는 c-Kit, Sca-1 등이 있다. 그러나 이들 표지자는 심장전구세포뿐만 아니라 중간엽줄기세포 및 조혈계 세포에서도 발현되는 성체줄기세포의 표지자이며, 또한 이들 표지자가 음성인 심장전구세포도 엄연히 존재하므로 심장전구세포를 분리하기 위한 표지자로선 부적합하다. 현재까지 순수한 심장전구세포를 정제하기 위한 표지자가 밝혀져 있지 않아, 특정 표지자를 이용한 면역학적 방법으로 심장전구세포를 정제하는 방법은 한계가 있다. 또한 면역학적 방법으로 심장전구세포를 정제하기 위한 과정은 단일세포를 분리하기 위한 조직분해효소의 처리과정이 필수적이다. 조직해리과정은 사용한 조직분해효소의 종류, 역가, 반응시간, 반응온도, 사용한 조직의 상태에 따라 얻어지는 단일세포 수는 큰 편차를 나타내며, 또한 조직해리과정 중 세포의 손상은 피할 수 없다는 단점이 널리 제시되었다. 그 결과 조직해리 과정은 표준화하기 어려우며 또한 그 분리 수율이 낮다는 비효율성의 단점이 제시되었다.
두 번째 방법은 배양용기에 파종한 심근절편과 배양용기 간의 안정적인 접촉이 심장전구세포를 분리 배양하기 위한 핵심적 성공요인 중 하나이다. 그러나 조직분해효소로 처리된 심근절편은 조직으로부터 유리된 분해된 세포외기질과 핵산 등에 의하여 배양용기와 안정적인 접촉이 저해되며, 그 결과 심근절편으로부터 유래되는 세포가 부착, 이동, 성장할 있는 기질(substratum)을 안정적으로 제공하지 못하여 안정적인 심장전구세포의 이동과 성장이 저해된다. 또한 파종된 심근절편이 부착되는 기질이 표면적이 제한적이라 그 결과 심장전구세포의 배양용기 내로 이동 성장이 제한적이라는 단점이 대두 되었다.
세 번째 방법은 심장구로부터 심장전구세포를 분리 배양하는 방법이다. 심장구를 획득하기 위해서는 두 번째 방법으로 심근절편을 2차원적으로 배양용기에 파종한 후 7일간 배양하면, 그 이후부터 성장하여 이동하는 작고 둥근 세포를 분리하고, 무혈청(serum-free) 배양환경에서 배양하면 심장구를 얻을 수 있다. 얻어진 심구세포를 혈청이 포함된 배지를 첨가한 후 단층배양법으로 배양하면 심장구로부터 섬유모세포와 같은 형태를 지닌 심장전구세포를 분리 배양할 수 있다. 그러나 이 방법 또한 심근절편의 2차원 파종한 후 배양할 시 단점으로 제기된 문제점을 포함하며, 또한 그 과정이 다단계 복잡한 과정을 거쳐야 되므로 그 효율이 낮다는 문제점이 제기되었다[Circ Res 2004;95:911].
한편, 심근세포로의 분화조절 기전 및 인자의 발굴은 난치성 심장질환의 병인과 치료제 개발에 중요한 과제이다. 그러나 현재까지 심장질환의 병인과 약물개발에 필요한 체외 실험실적 모델은 극히 제한적이다. 심근세포로 분화할 수 있는 능력을 지닌 배아 및 성체줄기세포 혹은 심근전구세포들의 안전적이며 효과적인 분화유도 모델은 단층배양법을 이용한 방법만이 제시되어 있다[Nat Protocols 2009;4:232]. 그러나 종래의 제시된 방법은 2주 이상의 시간이 요구되며, 또한 그 분화유도 효율이 제한적인 단점이 제시되었다. 인체 내 모든 장기 및 세포는 3차원적 구조를 취한다. 세포와 세포 간 그리고 세포와 세포외기질 간의 상호작용을 통하여 세포는 고유의 생물학적 기능을 수행할 수 있다. 그러나 종래의 기술은 세포 혹은 세포외기질과의 상호작용을 제공할 수 없었으며, 그 결과 심근세포로의 분화를 효율적으로 그리고 안정적으로 유도할 수 없었다. 즉, 생체 내 세포가 존재하는 미세구조를 생체 외에서 모방하고 제공할 수 있는 체외배양 방법의 개발은 난치성 심장질환 및 치료제 발굴에 핵심적으로 필요한 기술개발이라 할 수 있다.
심혈관질환 동물모델을 이용하여 줄기세포의 효과에 대한 전임상 연구 및 심근경색 환자를 대상으로 한 임상연구가 진행되고 있으나, 세포치료제의 안정성과 효율성에 대한 연구결과는 상반된 결과가 제시되었다[Nature 2008; 451: 937]. 종래의 상반된 연구결과는 심장 내로 세포치료제의 전달방법 차이에 의하여 발생할 수 있다. 혈관을 통하여 세포치료제를 주입한 경우 주입한 세포 중 0.01% 만이 심근 내로 전달되는 것으로 밝혀졌다. 또한 심근 내로 바로 세포치료제를 주입한 경우도 주입한 전체 세포 중 1% 미만에서 심근 내로 생존하는 것으로 알려졌으며, 나머지 99% 세포는 주입 시 출혈에 의하여 혹은 심근 내 과도한 염증반응에 의하여 소실되거나 혹은 죽어버리는 것으로 알려져 있다. 즉 심장의 병적인 심근 내로 안정적으로 세포치료제를 전달할 수 있는 세포전달기술과 출혈 및 과도한 염증반응으로부터 전달한 세포치료제를 보호할 수 있는 기술개발은 중대한 과제라 할 수 있다.
이에 본 발명에서는 성인으로부터 심근 내 존재하는 심장전구세포를 분리함에 있어 조직분해효소의 사용 없이 줄기세포가 기생하는 심근 내 줄기세포 미세구소를 파괴하지 않으면서, 안정적이고 효율적인 심장전구세포의 분리 배양방법을 제시하고자 하며, 또한 분리 배양한 심장전구세포의 심근세포로의 분화유도 방법과 심근 내로 전달방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 심근절편을 하이드로젤 내에 함입시켜 배양하는 단계;를 포함하는 심근조직 유래 심장전구세포의 배양방법을 제공하고자 하며, 상기 배양방법에 의해 배양된 심근 유래 심장전구세포를 제공하고자 한다.
본 발명은 심장전구세포를 현가세포배양법(suspension cell culture)을 통하여 배양하는 단계;를 포함하는 심근 유래 심장전구세포의 심근세포로의 분화방법을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 심장전구세포 또는 이의 분화된 세포를 유효성분으로 포함하는 세포치료제 및 심장질환 예방, 치료제를 제공하고자 한다.
본 발명은 심근절편을 하이드로젤 내에 함입시켜 배양하는 단계; 및 하이드로젤만을 분해하여 심근절편으로부터 하이드로젤 내로 이동, 성장한 심장전구세포를 회수하는 단계;를 포함하는 심근 유래 심장전구세포의 배양방법을 제공한다.
상기 심근 유래 심장전구세포는 (i) 네스틴 (nestin) 및 Sca-1으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 심장전구세포 표지자 군에 양성인 면역학적 특성; (ii) GATA-4, Nkx-2.5 및 Mef-2c로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 심근세포-특이 전사인자 군에 양성인 면역학적 특성; (iii) CD29, CD44, CD73, CD90 및 CD105로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중간엽줄기세포 표지자 군에 양성인 면역학적 특성; (iv) CD140b, CD146, 및 SMA로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 혈관주위세포 표지자 군에 양성인 면역학적 특성; (v) Lin, CD34 및 CD45로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 조혈계 세포 표지자 군에 음성인 면역학적 특성; (vi) CD31 및 CD34으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 혈관내피세포 표지자 군에 음성인 면역학적 특성; 및 (vii) α-SA(α-sarcometric actinin), MHC(myosin heavy chain), TnI(troponin I) 및 TnT(troponin T)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 심근세포 표지자 군에 음성인 면역학적 특성;으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 면역학적 특성을 지닐 수 있다.
상기 하이드로젤은 그 종류에 있어 특별히 한정된 것은 아니나, 천연고분자로 제조될 수 있다.
상기 하이드로젤은 항섬유소용해제가 포함될 수 있다.
상기 항섬유소용해제는 그 종류에 있어 특별히 한정된 것은 아니나, 아미노카프로이드산(aminocaproid acid), 트란이그제믹산(tranexamic acid), 아프로티닌(aprotinin) 및 아미노메틸벤조익산(aminomethylbenzoic acid)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 하이드로젤 1 ml에 대하여 항섬유소용해제 10 내지 1000㎍을 포함할 수 있다.
상기 하이드로젤은 피브린 하이드로젤이며, 상기 하이드로젤은 0.8 내지 5.0 mg/ml 피브리노겐을 포함할 수 있다.
상기 하이드로젤의 분해는 콜라지나아제, 젤라티나아제, 유로키나아제, 스트렙토키나아제, TPA(tissue plasminogen activator), 플라즈민(plasmin) 및 히알루로니다아제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 효소를 통하여 분해될 수 있다.
본 발명의 심근 유래 심장전구세포의 배양방법의 일례로, 1) 아미노카프로이드산(aminocaproid acid) 및 트란이그제믹산(tranexamic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 항섬유소용해제가 포함된 피브린 하이드로젤 내에 심근절편을 함입시키는 제 1단계; 2) 성장배양액을 첨가하여 5 내지 30 rpm 속도의 셰이커에서 3차원 장기배양(organ culture)하는 제 2단계; 3) 유로키나아제, 스트렙토키나아제 및 플라즈민으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 분해효소를 처리하여 피브린 하이드로젤만을 분해시킴으로, 심근절편으로부터 하이드로젤 내로 이동, 성장한 심근 유래 심장전구세포 및 심근절편을 회수하는 제 3단계; 및 4) 하이드로젤로부터 회수한 심장전구세포는 단층배양법으로 증폭하는 제 4단계;를 포함할 수 있다.
상기 제 3단계에서 회수된 심근절편을 다시 제 1단계의 하이드로젤 내에 함입시켜 배양할 수 있다.
본 발명은 상기 배양방법에 의해 배양된 심근 유래 심장전구세포이며, 상기 심장전구세포는 (i) 네스틴 (nestin) 및 Sca-1으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 심장전구세포 표지자 군에 양성인 면역학적 특성; (ii) GATA-4, Nkx-2.5 및 Mef-2c로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 심근세포-특이 표지자 군에 양성인 면역학적 특성; (iii) CD29, CD44, CD73, CD90 및 CD105로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중간엽줄기세포 표지자 군에 양성인 면역학적 특성; (iv) CD140b, CD146, 및 SMA로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 혈관주위세포 표지자 군에 양성인 면역학적 특성; (v) Lin, CD34 및 CD45로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 조혈계 세포 표지자 군에 음성인 면역학적 특성; (vi) CD31 및 CD34으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 혈관내피세포 표지자 군에 음성인 면역학적 특성; 및 (vii) α-SA (α-sarcometric actinin), MHC (myosin heavy chain), TnI (troponin I) 및 TnT (troponin T)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 심근세포 표지자 군에 음성인 면역학적 특성;으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 면역학적 특성을 지닐 수 있다.
상기 심장전구세포는 심근세포, 조골세포, 지방세포, 연골세포, 혈관내피세포, 평활근세포, 신경세포 또는 골격근세포로의 분화력을 지닐 수 있다.
본 발명은 상기 심장전구세포를 현가세포배양법 (suspension cell culture)을 통하여 배양하는 단계;를 포함하는 심근 유래 심장전구세포의 심근세포로의 분화방법을 제공한다.
상기 심장전구세포는 자발적으로 심근세포로 분화할 수 있다.
본 발명은 상기 심장전구세포 또는 이의 분화된 세포를 유효성분으로 포함할 수 있다.
상기 세포치료제의 치료대상은 특별히 한정된 것은 아니나, 바람직하게는 심근세포, 조골세포, 지방세포, 연골세포, 혈관내피세포, 평활근세포, 신경세포 및 골격근세포로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 세포의 치료제일 수 있다.
상기 심장전구세포는 항섬유소용해제가 포함된 하이드로젤과 혼합될 수 있다.
상기 세포치료제는 항염증제제, 줄기세포 동원인자 및 혈관성장 유도인자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 더 포함할 수 있다.
본 발명은 상기 심장전구세포 또는 이의 분화된 세포를 유효성분으로 포함하며, 상기 심장전구세포는 항섬유소용해제가 포함된 하이드로젤과 혼합되어 있는 심장질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 심장질환은 심경경색증, 허혈성 심근질환, 일차성 심근질환, 이차성 심근질환 또는 울혈성 심부전증일 수 있다.
본 발명의 심근 유래 심장전구세포는 심장을 구성하는 모든 세포로 분화할 수 있는 다분화 능력과 체외 증식능력이 뛰어나며, 또한 특별한 분화유도인자가 없어도 심근세포로 자발적으로 분화하는 능력이 나타낼 뿐만 아니라, 생체 내 이식된 환경에서도 뛰어난 생존률을 보이므로, 이는 세포치료제 및 조직공학적 치료제 등의 바이오 신약 생산에 적용 가능하여 산업적 이용 가능성이 높다. 또한 본 발며의 심장전구세포는 동원, 이동, 성장, 그리고 심근세포로의 분화에 관계하는 세포생물학적, 분자생물학적 기초 연구와 신약개발 연구에 적용될 수 있다.
도 1은 피브리노겐 농도에 따른 피브린의 미세구조를 나타낸 것으로, 도 1A, 1B는 1.25 mg/ml (0.125%) 피브리노겐 및 0.5 unit/ml 트롬빈으로 제조한 피브린의 형광현미경(A) 및 주사전자현미경(B) 사진을 나타낸 것이고, 도 1C, 1D는 10.0 mg/ml (1%) 피브리노겐 및 0.5 unit/ml 트롬빈으로 제조한 피브린의 형광현미경(C) 및 주사전자현미경(D)을 나타낸 것이고, 도 1E는 피브리노겐 농도에 따른 피브린 공극 크기를 나타낸 도이다. (*, 0.5% 및 1.0% 피브리노겐 군과 비교하여 p < 0.01).
도 2는 심장전구세포에 의한 섬유소용해 작용을 나타낸 것으로, 1.25, 2.5, 5.0, 10.0 mg/ml 피브리노겐과 0.5 unit/ml 트롬빈으로 4가지 유형의 피브린을 제조한 후 50만 개의 심장전구세포를 함입시켜 3차원 배양하고, 심장전구세포에 의하여 분해된 피브리노겐 농도를 측정한 결과를 나타낸 도이다. (*, w/o CPCs 군과 비교하여 p < 0.01).
도 3은 항섬유소용해제에 따른 심장전구세포의 섬유소용해 억제 효과를 나타낸 도이다. (*, 아프로티닌(aprotinin) 및 아미노카프로이드산(aminocaproid acid) 군과 비교하여 p < 0.01).
도 4는 아미노메틸벤조익산 (aminomethylbenzoic acid)에 의한 심장전구세포의 섬유소용해 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 5는 아미노메틸벤조익산 (aminomethylbenzoic acid)가 도입된 하이드로젤 내 심장전구세포의 세포질 형성도를 나타낸 것으로, 하이드로젤 내 피브리노겐 농도가 증가할수록 세포질 형성이 감소되는 위상차현미경(상) 및 형광현미경 사진(하)(도 5A) 및 이를 정량화한 세포질의 길이(도 5B)를 나타낸 도이다. (*, 1.25 및 2.5 mg/ml 피브리노겐 군과 비교하여 p < 0.01).
도 6은 아미노메틸벤조익산 (aminomethylbenzoic acid)가 도입된 하이드로젤 내 심장전구세포의 성장에 관한 도이다. 심장전구세포의 성장은 DNA 함량으로 측정하였으며, 하이드로젤 내 피브리노겐 농도가 증가할수록 DNA 함량이 감소되는 결과이다. (*, 1.25 및 2.5 mg/ml 피브리노겐 군과 비교하여 p < 0.01).
도 7은 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤 내 심근절편의 3차원 장기배양(organ culture)에 관한 것으로, 도 7A는 항섬유소용해제가 도입되지 않은 하이드로젤은 심근절편에 의하여 하이드로젤이 분해되어 3차원적 세포부착 기질이 소실되어 심장전구세포의 이동과 성장이 소실되는 위상차 현미경사진을 나타낸 것이다(No, 하얀색 화살표). 반면 트란이그제믹산(tranexamic acid) 및 아미노메틸벤조익산 (aminomethylbenzoic acid)가 도입된 하이드로젤은 분해되지 않고 심근절편 주위로 세포부착 기질을 안정적으로 제공하여 심장전구세포의 이동과 성장을 지지하는 것을 나타낸 도이다. 도 7B는 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤은 구성 피브리노겐 농도가 증가할수록 심근절편으로부터 세포의 이동 및 성장이 유의하게 감소되는 결과를 나타낸 도이다. (*, 1.25 및 2.5 mg/ml 피브리노겐 군과 비교하여 p < 0.01).
도 8은 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤 내 심근절편의 3차원 장기배양(organ culture)과 이를 통한 심장전구세포의 분리 배양방법의 모식도를 나타낸 도이다.
도 9는 하이드로젤 내 인간 심근절편의 3차원 장기배양(organ culture)을 거쳐 하이드로젤 내로 이동 성장한 세포의 위상차 현미경 사진(위)과 조직화학염색 및 면역화학염색 사진(아래)을 나타낸 도이다.
도 10은 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤 3차원 장기배양(organ culture) 후 심근절편 내 인테그린-매게 signalling pathway 인자들의 활성화에 대한 결과로서, 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤 내 3차원 배양한 심근절편(3D)는 배양 전 심근절편(Fresh) 및 하이드로젤-지지 없이 파종하여 배양한 심근절편(2D)과 비교하여 인테그린-매게 signalling pathway인자의 발현이 유의하게 증가되는 결과를 나타낸 도이다. (*, 'Fresh'군과 비교하여 p < 0.05; #, 'Fresh'군 및 '2D'군과 비교하여 p < 0.05).
도 11은 배양환경에 따른 생쥐, 쥐 및 인간 심근절편(H)에서 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤 내로 이동 성장하는 심장전구세포의 면적을 나타낸 도이다. (*, 'Static'군과 비교하여 p < 0.05).
도 12는 인간 심근절편에서 하이드로젤 내로 이동 성장하는 세포의 심근세포-특이 전사인자가 발현되는 면역학적 특성을 나타내는 면역형광현미경 사진이다.
도 13은 인간 심근절편에서 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤 내로 이동 성장하는 세포의 면역학적 특성을 나타내는 면역화학염색의 현미경 사진이다.
도 14는 심근절편의 3차원 장기배양(organ culture) 후 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤 내로 이동 성장한 심장전구세포의 분리과정(A, B, C) 및 수율(D)을 나타낸 도이다. (*, 2D 군과 비교하여 p < 0.01; #, 3D w/o AMBA 군과 비교하여 p < 0.01).
도 15는 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤 내로 이동 성장한 심장전구세포의 2차원 단층배양 환경에서의 콜로니 형성 능력(A) 및 형태학적 특성(B), 그리고 군집배가시간(C)을 나타낸 도이다.
도 16은 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤로부터 분리한 후 단층배양법으로 증폭하여 얻어진 심장전구세포를 유세포분석기(flow cytometry)로 분석한 면역학적 특성을 나타낸 도이다.
도 17은 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤로부터 분리한 후 단층배양법으로 증폭하여 얻어진 심장전구세포를 면역학적 특성을 나타낸 그래프(도 17A)와 면역형광염색 후 형광현미경으로 분석(도 17B)한 면역학적 특성을 나타낸 도이다.
도 18은 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤로부터 분리한 후 단층배양법으로 증폭하여 얻어진 Nestin-양성 심장전구세포의 면역학적 특성을 나타낸 그래프(도 18A)와 사진(도 18B)을 나타낸 도이다.
도 19는 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤로부터 분리한 심장전구세포의 심장구 형성능력 및 심근세포-특이 단백질의 발현특성을 나타낸 도이다.
도 20은 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤로부터 분리한 후 단층배양법으로 증폭하여 얻어진 심장전구세포를 현가배양시스템에서 심장구 형성을 유도하고, 심근세포로의 분화도를 평가하는 결과를 나타낸 도이다.
도 21은 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤로부터 분리한 후 단층배양법으로 증폭하여 얻어진 심장전구세포에서부터 얻어진 단일클론 기원 심장전구세포의 심근세포, 지방세포, 조골세포, 혈관내피세포로의 분화능력을 나타낸 도이다.
도 22는 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤로부터 분리한 후 단층배양법으로 증폭하여 얻어진 심장전구세포(CPCs)의 혈관성장 및 조직재생 관련 인자의 분비능력을 antibody array 방법으로 분석하여 나타낸 도로서, 골격근줄기세포(MDSCs)를 비교세포로 사용한 결과를 나타내고 있다.
도 23은 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤로부터 분리한 후 단층배양법으로 증폭하여 얻어진 심장전구세포(CPCs)의 혈관성장 및 조직재생 관련 인자의 분비능력을 골격근줄기세포(MDSCs)의 비교하여 분석한 도이다.
도 24는 허혈성 사지경색 모델에서 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤로부터 분리한 후 단층배양법으로 증폭하여 얻어진 심장전구세포(CPCs)의 골격근 재생효과를 나타낸 도이다. 심장전구세포를 주입한 군(오른쪽)에서 주입하지 않은 군(왼쪽)과 비교하여 두드러지는 골격근 재생을 보여주고 있다.
도 25는 허혈성 사지경색 모델에서 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤로부터 분리한 후 단층배양법으로 증폭하여 얻어진 심장전구세포의 신생혈관유도 능력을 나타낸 그래프(도 25B)와 사진(도25A)이다. 심장전구세포를 주입한 군(w/ CPCs)에서 주입하지 않은 군(w/o CPCs)과 비교하여 CD34-양성 미세혈관의 밀도가 두드러지게 증가하는 것을 보여주고 있다.( *, 'W/O CPCs'군과 비교하여 p < 0.05).
도 26은 허혈성 사지경색 모델에서 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤로부터 분리한 후 단층배양법으로 증폭하여 얻어진 심장전구세포의 신생혈관유도 능력을 나타낸 도이다. 심장전구세포를 주입한 생쥐의 혈류속도(w/ CPCs)는 주입하지 않은 생쥐(w/o CPCs)의 혈류속도와 비교하여 유의하게 증가되는 것을 보여주고 있다. (*, 'W/O CPCs'군과 비교하여 p < 0.05; **, 'W/O CPCs'군과 비교하여 p < 0.01).
도 27은 허혈성 사지경색 모델에서 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤로부터 분리한 후 단층배양법으로 증폭하여 얻어진 심장전구세포의 혈관내피세포로의 분화를 보여주는 도이다.
도 28은 허혈성 심근경색 모델내로 주입한 쥐 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤로부터 분리한 후 단층배양법으로 증폭하여 얻어진 심장전구세포의 전달방법에 따른 심근 내 보존력을 보여주는 도이다. (*, 'CPCs'군과 비교하여 p < 0.05).
도 29는 허혈성 심근경색 모델내로 주입한 사람 심장전구세포(hCPCs) 및 전달방법에 따른 심근재생 능력을 보여주는 도이다. 심근경색 유도 2주 후 적출한 심장에서 콜라겐 염색 후 좌심방 두께(LV thickness) 및 섬유화 면적(fibrotic area)을 측정한 결과를 나타내고 있다. (*, control 군과 비교하여 p < 0.05; #, CPCs 군과 비교하여 p < 0.05).
도 30은 허혈성 심근경색 모델내로 주입한 사람 심장전구세포(hCPCs) 및 전달방법에 따른 심근 내 혈관유도능력을 보여주는 도이다. (*, control 군과 비교하여 p < 0.05; #, CPCs 군과 비교하여 p < 0.05).
도 31은 허혈성 심근경색 모델내로 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤(hCPCs+H)을 통하여 주입한 사람 심장전구세포(hCPCs)의 심장 내 심근세포로의 분화능력을 보여주는 도이다.
도 32는 허혈성 심근경색 모델내로 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤(hCPCs+H)을 통하여 주입한 사람 심장전구세포(hCPCs)의 심장 내 혈관 평활근세포로의 분화능력을 보여주는 도이다.
도 33은 허혈성 심근경색 모델내로 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤(hCPCs+H)을 통하여 주입한 사람 심장전구세포(hCPCs)의 심장 내 혈관내피세포로의 분화능력을 보여주는 도이다.
본 발명은 심근 유래 심장전구세포 및 이의 배양방법, 이의 분화방법 및 이를 포함한 세포치료제, 심장질환 치료제를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
종래에 난치성 심근질환의 치료제로 조혈모세포 혹은 중간엽줄기세포가 통상적으로 사용되고 있는데, 조혈모세포는 체외에서 증폭 배양이 어려우며, 유효한 용량의 조혈모세포를 분리, 정제하기 위해서는 10 L의 골수가 요구되었다. 종래의 중간엽줄기세포의 수득은 고형성 장기인 경우 조직분해과정과 이차적인 중간엽줄기세포의 정제과정이 요구되었으며, 이렇게 얻어진 중간엽줄기세포는 골수 혹은 지방조직 내 유핵세포 백만 개 중 하나의 빈도로 존재하는 것으로 알려져 있으며, 골수 혹은 지방조직 유래 중간엽줄기세포는 1% 미만에서 콜로니를 형성하는 등 세포치료제 용량만큼 체외에서 증폭 능력이 어려운 한계점이 대두되었다. 이에 본 발명자는 상기 문제점을 해결하고자 노력하던 중 본 발명의 배양방법에 의할 때 심장전구세포를 심근의 조직분해과정과 이차적인 심장전구세포의 정제과정 없이도 심근절편으로부터 체외증식능력이 뛰어난 심장전구세포를 높은 수율로 얻을 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 심근절편을 하이드로젤 내에 함입시켜 배양하는 단계; 및 하이드로젤만을 분해하여 심근절편으로부터 하이드로젤 내로 이동, 성장한 심장전구세포를 회수하는 단계;를 포함하는 심근 유래 심장전구세포의 배양방법을 제공한다.
본 발명의 심근 유래 심장전구세포의 배양방법의 일례로, 1) 아미노카프로이드산(aminocaproid acid) 및 트란이그제믹산(tranexamic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 항섬유소용해제가 포함된 피브린 하이드로젤 내에 심근절편을 함입시키는 제 1단계; 2) 성장배양액을 첨가하여 5 내지 30 rpm 속도의 셰이커에서 3차원 장기배양(organ culture)하는 제 2단계; 3) 유로키나아제, 스트렙토키나아제 및 플라즈민으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 분해효소를 처리하여 피브린 하이드로젤만을 분해시킴으로, 심근절편으로부터 하이드로젤 내로 이동, 성장한 심근 유래 심장전구세포 및 심근절편을 회수하는 제 3단계; 및 4) 하이드로젤로부터 회수한 심장전구세포는 단층배양법으로 증폭하는 제 4단계;를 포함할 수 있다.
상기 배양방법은 심장전구세포의 분리 및 배양의 의미를 모두 포함할 수 있다.
상기 심근절편은 특별히 한정된 것은 아니나, 바람직하게는 심근 내 심장전구세포의 이동을 저해하는 심장내막(endocardium)과 심장외막(epicardium)과 같은 해부학적 구조물을 제거한 후 일정크기로 절단한 절편일 수 있다. 조직기원 줄기세포(tissue-resident stem cells)는 주로 미세혈관 벽에 다량 존재하기에, 본 발명에서는 심근 내 심장전구세포의 이동을 저해하는 심장내막과 심장외막을 제거하여 심근 내 미세혈관이 하이드로젤과 직접 접촉할 수 있도록 함으로 심장전구세포의 수득률을 높일 수 있다.
하이드로젤은 친수성 고분자가 공유 또는 비공유 결합으로 가교되어져 형성되는 3차원 망상구조물로서, 상전이가 가능하여 용액상태에서 심근절편과 골고루 혼합이 가능하며, 혼합 후 고형성 젤로 상전이가 되어 심근절편에 안정적인 3차원적 물리적 지지를 제공할 수 있으며, 동시에 심근절편 내 존재하는 심장전구세포가 부착하고, 이동 및 성장할 수 있는 3차원적 세포부착 기질을 제공할 수 있다.
상기 심근절편이 혼합된 액상상태의 하이드로젤에서 고분자의 중합(polymerization) 및 가교(cross-linkage) 반응을 개시하여 젤상태의 하이드로젤로의 상전이 속도는 중합제 및 가교제의 농도, 및 반응온도 조절을 통하여 조절할 수 있다.
상기와 같이 하이드로젤을 통하여 3차원적 세포부착 기질을 제공한 경우에서 하이드로젤은 심근절편에서부터 심장전구세포의 이동과 성장에 필요한 인테그린-β1(integrin-β1) 결합 수용체를 제공하여, 하이드로젤 내로 심장전구세포가 지속적으로 이동, 성장할 수 있는 3차원적 기질을 제공할 수 있다.
세포는 세포외기질과 인테그린-베타1(integrin-β1)와 결합한 후 FAK가 인산화되어 세포신호전달체제가 활성화되어 세포분열이 개시된다. 즉, 심근절편은 부착할 수 있는 세포외기질과의 면적이 넓을수록 세포신호전달체제의 활성도는 증가되어, 그 결과 세포분열은 증가되는데, 상기 하이드로젤은 단층배양법의 제한적인 2차원적 세포부착 기질보다 넓은 3차원적인 세포부착 기질을 제공함으로 심장전구세포가 이동, 성장할 수 있는 충분한 공간을 제공할 수 있어 세포분열이 증가되며, 세포 간 접촉저해(contact inhibition)을 억제하며 장기간 배양이 가능할 수 있다.
상기 하이드로젤의 종류는 특별히 한정된 것은 아니며, 천연고분자, 합성고분자, 및 다양한 고분자를 혼합한 공중합고분자(copolymer)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상으로부터 제조된 것을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 천연고분자로 구성된 하이드로젤일 수 있다.
일례로, 콜라겐(collagen), 젤라틴(gelatin), 콘드로이틴(chondroitin), 하알루로닉산(hyaluronic acid), 알지닌(alginic acid), 메트리젤(MatrigelTM), 키토산(chitosan), 펩티드(peptide), 피브린(fibrin), PGA(polyglycolic acid), PLA(polylactic acid), PEG(polyethylene glycol) 및 폴리아크릴아미드 (polyacrylamide)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게는 콜라겐, 피브린, 메트리젤 및 젤라틴으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 천연고분자로 제조된 하이드로젤일 수 있다.
합성고분자 혹은 공중합고분자로 구성된 하이드로젤은 장시간 분해되지 않아 물리적 기능이 우수하지만 세포의 이동과 성장이 저하되는 취약한 생물학적 기능을 나타내는 반면, 콜라겐, 피브린 등과 같은 천연고분자로 구성된 하이드로젤은 세포의 이동 및 성장이 우수한 생체적합성을 나타내지만 장기 혹은 세포에서 분비되는 섬유소용해효소인 tPA(tissue plasminogen activator) 혹은 uPA(urokinase plasminogen activator)에 의하여 합성고분자 혹은 공중합고분자로 구성된 하이드로젤보다 빨리 분해되는 물리적 취약성을 나타낼 수 있다.
본 발명에서는 세포의 이동 및 성장이 우수하여 생체적합성을 나타내는 천연고분자로 구성된 하이드로젤을 선택하면서도, 항섬유소용해제를 하이드로젤 내에 도입하여 빨리 분해되는 물리적 취약성을 극복할 수 있다.
항섬유소용해제는 세포 또는 조직에서 분비되는 tPA 혹은 uPA에 의한 섬유소용해 작용을 방지할 수 있는데, 상기 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤은 심근세포 혹은 심근절편의 배양과정 중 분비되는 tPA 혹은 uPA에 의하여 하이드로젤이 장기간 분해되지 않는 특성을 가질 수 있기에, 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤은 세포의 이동과 성장에 절대적인 세포부착 기질로서의 기능을 심근절편 장기배양(organ culture)기간 동안 유지할 수 있다.
심장은 위, 장, 골수, 지방조직 등 다른 장기에 비해 높은 tPA 혹은 uPA 등 섬유용해 활성을 나타내어 피브린을 분해할 수 있다. 일 실시예에 나타난 바와 같이, 항섬유소용해제가 도입되지 않은 경우 심근절편에서 분비되는 uPA/tPA에 의하여 하이드로젤이 분해되어, halo가 형성되어 심근절편에서부터 하이드로젤로의 세포의 이동, 성장이 관찰되지 않고 배양용기 표면으로만 세포가 이동, 성장이 이루어지는데 반하여, 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤은 3차원 기질로서의 기능을 유지하고 심장전구세포의 하이드로젤 내로의 이동과 성장이 일어날 수 있다. 그 결과, 심근절편 1 gm에서부터 7일간 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤-지지 3차원 장기(organ)배양 후 얻어지는 심장전구세포 수(3D w/ AMBA)는 1.7 x 107으로, 항섬유소가 도입되지 않은 하이드로젤을 이용한 3차원 장기배양(3D w/o AMBA) 군보다 10 배 이상 높은 수율을 보였다.
상기 항섬유소용해제의 종류는 특별히 한정된 것은 아니며, 아미노카프로이드산(aminocaproid acid), 트란이그제믹산(tranexamic acid), 아프로티닌(aprotinin) 및 아미노메틸벤조익산(aminomethylbenzoic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 트란이그제믹산 및 아미노메틸벤조익산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 아미노메틸벤조익산(aminomethylbenzoic acid), 트란이그제믹산(tranexamic acid)은 아미노카프로이드산, 아프로티닌에 비해 심장전구세포의 섬유소용해 억제효과가 3배 이상 우수하여 피브린 하이드로젤의 물리적 지지 기능을 수행하는데 더 적절할 수 있다.
상기 항섬유소용해제의 농도는 특별히 한정된 것은 아니나, 상기 하이드로젤 1 ml에 대하여 항섬유소용해제 10 내지 1000㎍을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 30 내지 450㎍을 포함할 수 있으며, 가장 바람직하게는 50 내지 200㎍을 포함할 수 있다.
항섬유소용해제의 농도가 감소 될수록 심장전구세포에 대한 독성이 감소될 수 있으며, 농도가 증가할수록 심근에 의한 섬유소용해 효과를 억제하여 3차원적 세포부착기질로서의 역할을 유지할 수 있기에, 상기 농도는 세포독성과 섬유소용해효과를 모두 고려하여 선택한 것일 수 있다. 만일 항섬유소용해제의 용량이 상기보다 낮을 경우 섬유소용해 작용을 충분히 억제하지 못하여 하이드로젤이 용해되어 심장전구세포의 이동 및 성장이 소실될 수 있으며, 항섬유소용해제 용량이 상기보다 높을 경우 섬유소용해 작용을 억제할 수 있으나 고용량에 의한 심근 및 심장전구세포에 독성을 유발하는 문제점을 야기할 수 있다.
상기 항섬유소용해제 첨가시 피브린 하이드로젤 제조시, 피브리노겐의 농도는 특별히 한정된 것은 아니나, 바람직하게는 0.8 내지 5.0 mg/ml, 바람직하게는 1.0 내지 3.5 mg/ml가 적절할 수 있다.
일례로, 상기 피브린은 상기 피브린은 1.25 내지 2.5 mg/ml 피브리노겐과 0.1 내지 2.5 unit/ml 트롬빈으로 제조될 수 있다.
피브리노겐 농도가 상기보다 높으면 제조된 피브린 하이드로젤은 그 미세구조는 치밀하고, 구조 내 공극은 감소하며 분해속도는 늦어지나, 세포의 이동과 성장은 심각히 저해되는 결과를 초래하는 반면, 상기 농도보다 낮은 피브리노겐으로 제조된 피브린 하이드로젤은 배양 과정 중 세포 및 심근절편에서 분비되는 tPA 혹은 uPA 등에 의하여 분해되어 세포의 이동과 성장에 절대적인 3차원적 세포부착 기질로서의 기능을 소실할 수 있다.
상기 성장배양액은 생체 외에서 심장전구세포의 동원, 이동, 성장을 유도할 수 있는 배지를 의미할 수 있고, 포유동물 세포배양에 사용되는 통상의 배지를 모두 포함할 수 있다. 본 발명의 일례로 상업적으로 제조된 세포배양액인 Dulbeccos Minimum Essential Medium(DMEM), RPMI, Hams F-10, Hams F-12, α-Minimal Essential Medium(α-MEM), Glasgow's Minimal Essential Medium, Iscove's Modified Dulbecco's Medium 등을 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 성장배양액 내에는 심장전구세포의 동원, 이동, 성장을 촉진시킬 수 있는 성장인자를 추가로 포함할 수 있으며, 이들 성장인자는 혈청, 즉 인간을 포함한 동물의 혈청, basic fibroblastic growth factor(bFGF), 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 인슐린(Insulin), 상피세포성장인자 (epidermal growth gactor, EGF), leukemia inhibitory factor(LIF), insulin-like growth factor(IGF), platelet-derived growth factor(PDGF), stem cell factor(SCF) 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 성장배양액은 페니실린, 스트렙토마이신, 겐타마이신 등의 항생제를 포함할 수 있다.
본 발명의 일례로, 성장배양액은 DMEM:Hams F12 (1:1) 배양액, 우태아혈청, EGF, bFGF, IGF, 젠타마이신으로 구성될 수 있으며, 보다 구체적으로 70 내지 95 (vol/vol) % DMEM:Hams F12 (1:1) 배양액, 5 내지 15 (vol/vol)% 우태아혈청, 5 내지 50 ng/ml EGF, 0.5 내지 10 ng/ml bFGF, 5 내지 50 ng/ml IGF, 5 내지 50 mg/ml 젠타마이신으로 구성될 수 있다.
종래에 장기(organ)절편의 3차원 배양은 산소 및 영양분 교환을 증진하기 위하여 공기 중에 장기절편을 노출시켜 배양하는 방법과 오비탈 세이커(orbital shaker)에서 역동적(dynamic)으로 배양하는 방법이 존재하였는데, 장기절편을 공기 중에 노출시켜 배양하는 방법은 영양분 공급이 제한적이기에 장기간 배양에는 적합하지 않으며, 또한 역동적 배양은 배양액의 와류에 의하여 배양액으로 노출된 장기절편이 shearing 손상을 받게 되는 문제점이 존재하였다.
그러나 본 발명의 하이드로젤에 함입된 상태로 오비탈 셰이커에 장기(organ)배양시, 심근조직이 하이드로젤에 함입되어 있어 shearing 손상을 받지 않을 수 있고 셰이킹(shaking)을 통해 충분한 산소와 영양분을 공급받아 심장전구세포의 성장을 촉진시킬 수 있다.
셰이킹(shaking) 속도는 특별히 한정된 것은 아니나, 바람직하게는 5 내지 30 rpm 속도일 수 있다.
셰이킹 속도가 상기보다 낮을 때는 산소와 영양분의 공급이 충분히 이루어지지 않을 수 있으며, 상기보다 높을 때는 심근절편에 shearing 손상이 일어날 수 있고 하이드로젤 내의 심장전구세포 배양의 안정성이 손상될 수 있다.
상기 하이드로젤만의 선택적 분해는 하이드로젤 구성 고분자만을 선택적으로 분해할 수 있는 고분자-특이 분해효소를 배양액 내에 첨가하여 이루어질 수 있다. 상기 고분자-특이 분해효소는 특별히 한정된 것은 아니나, 콜라지나아제(collagenase), 젤라티나아제(gelatinase), 유로키나아제(urokinase), 스트렙토키나아제(streptokinase), TPA(tissue plasminogen activator), 플라즈민(plasmin) 및 히알루노니데이즈 (hyaluronidase)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 일례로, 콜라겐 하이드로젤, 젤라틴 하이드로젤, 혹은 매트리젤 하이드로젤을 사용하여 본 발명의 심근절편을 3차원 장기배양(organ culture)한 경우는 콜라지나아제 혹은 젤라티나아제를 배양액 내로 첨가하여 상기 하이드로젤을 선택적으로 분해시킬 수 있으며, 피브린으로 구성된 하이드로젤을 사용한 경우는 유로키나아제, 스트렙토키나아제 혹은 플라즈민 군에서 하나 이상을 선택하여 배양액 내로 첨가하여 피브린으로 구성된 하이드로젤을 선택적으로 분해시킬 수 있으며, 히아루닌산 하이드로젤은 히알루노니데이즈를 사용하여 하이드로젤만을 선택적으로 분해시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 하이드로젤 구성 고분자-특이 분해효소를 배양액에 첨가하는 것은 심장전구세포 및 심근절편에 어떠한 구조적 파괴 혹은 세포독성을 나타내지 않았고, 회수된 세포의 95%이상이 생존할 수 있다.
일례로, 콜라겐 혹은 젤라틴 하이드로젤의 선택적 분해를 위하여 콜라겐 혹은 젤라틴 하이드로젤 1 ml 당 0.1 내지 1 mg의 콜라게네이즈 중량을 배양액 내로 첨가할 수 있다.
일례로, 유로키나아제, 스트렙토키나아제 혹은 프라즈민은 심장전구세포 혹은 심근절편의 구조적 물질을 분해하지 않으며 피브린만을 선택적으로 분해할 수 있으며, 하이드로젤 1 ml 당 100 내지 10,000 unit의 유로키나아제 혹은 스트렙토키나아제를 첨가할 수 있다.
일 실시예로, 유로키나아제 혹은 스트렙토키나아제의 피브린 분해효과를 증진시키기 위하여 30 내지 37℃에서 30분 내지 3시간 동안 반응시킬 수 있다.
상기 분해효소를 처리하여 하이드로젤만을 선택적으로 분해한 후, 하이드로젤내로 이동, 성장한 심장전구세포와 어떠한 구조적 손상이 없는 심근절편을 회수할 수 있다.
상기 하이드로젤로부터 회수한 심장전구세포를 증폭시킬 수 있는데, 이러한 증폭방법은 특별히 한정된 것은 아니나, 바람직하게는 단층배양법에 의할 수 있다. 본 발명의 일례로, 하이드로젤로부터 회수한 심장전구세포를 배양용기에 파종 후, 배양용기 표면적의 60 내지 90%를 차지하면, 이들 세포를 트립신 (trypsin)-EDTA로 처리하여 배양용기에서부터 떼어내고, 다시 새로운 배양용기에 파종하는 계대배양(subculture)을 통하여 치료용량에 필요한 세포 수만큼 증폭배양할 수 있다.
또한, 상기 하이드로젤만을 선택적으로 분해하여 회수한 심근절편을 다시 하이드로젤 내로 함입시켜 반복적으로 3차원 장기배양(organ culture)을 시행하여 반복적으로 심장전구세포의 분리, 배양이 가능하며, 배양이 끝나고 회수시 하이드로젤만을 선택적으로 분해하기에 심근절편의 구조가 온전히 보존된 상태를 유지할 수 있다.
심근질환 환자로부터 심근조직을 생검하는 방법인 심도자술(cardiac catheterization)은 많은 양의 심근절편을 취할 수 없기에 얻어진 소량의 심근조직으로부터 안정적 그리고 효과적으로 심장전구세포를 분리 배양할 수 있는 방법이 종래부터 중요한 과제가 되어왔다.
상기에서 기술한 바와 같이, 본 발명의 하이드로젤을 이용한 심장전구세포의 배양방법은 심장질환 환자로부터 소량의 심근을 단 한 번 생검한 후에는 이를 무한 반복하여 배양할 수 있으므로, 위험부담이 있는 반복적 심근의 채취 없이 심장질환 치료에 필요한 양의 심장전구세포를 분리할 수 있다는 장점이 있다.
본 발명에 있어서, 심근절편의 3차원 장기배양(organ culture)기간은 특별히 한정된 것은 아니나, 바람직하게는 1 내지 28일 동안 이루어질 수 있고, 바람직하게는 3일 내지 14일간 이루어질 수 있다. 상기 하이드로젤-지지 3차원 심근절편의 장기배양(organ culture)은 배양 12시간째부터 심장전구세포가 심근절편으로부터 하이드로젤 내로 이동 성장을 유도할 수 있다.
상기 심근 유래 심장전구세포의 배양방법에 의해 수득된 심장전구세포는 (i) 네스틴 (nestin) 및 Sca-1으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 심장전구세포 표지자 군에 양성인 면역학적 특성; (ii) GATA-4, Nkx-2.5 및 Mef-2c로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 심근세포-특이 전사인자 표지자 군에 양성인 면역학적 특성; (iii) CD29, CD44, CD73, CD90 및 CD105로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중간엽줄기세포 표지자 군에 양성인 면역학적 특성; (iv) CD140b, CD146, 및 SMA로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 혈관주위세포 표지자 군에 양성인 면역학적 특성; (v) Lin, CD34 및 CD45로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 조혈계 세포 표지자 군에 음성인 면역학적 특성; (vi) CD31 및 CD34으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 혈관내피세포 표지자 군에 음성인 면역학적 특성; 및 (vii) α-SA (α-sarcometric actinin), MHC (myosin heavy chain), TnI (troponin I) 및 TnT (troponin T)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 심근세포 표지자 군에 음성인 면역학적 특성;으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 면역학적 특성을 지닐 수 있다.
심장을 구성하는 세포는 20% 내지 30%는 심근세포이며, 나머지 70% 내지 80%는 섬유모세포, 평활근세포, 혈관내피세포, 조혈계 세포, 그리고 심장전구세포로 구성되고, 이들 중 0.03% 정도가 심장전구세포임이 제기되었다. 그러므로 종래의 통상적인 방법은 심장을 콜라지나아제와 같은 조직분해효소를 처리하여 심장을 구성하는 세포를 단일 세포로 분리하고, 면역학적 방법을 이용하여 심장전구세포를 이질적인 세포군으로부터 정제하는 단계를 필연적으로 요구되었다. 조직해리과정은 표준화하기 어렵고 사용한 조직분해효소의 종류, 역가, 반응시간, 반응온도, 사용한 조직의 상태에 따라 얻어지는 단일세포 수는 큰 편차를 나타내며, 또한 조직해리과정 중 세포의 손상은 피할 수 없으며, 이렇게 얻어진 세포에서 심장줄기세포는 0.03% ~ 0.7% (WO 2004/019767 [paragraph-0168]에서는 0.03 ~ 0.08%; Circ Res 2011;108:857에서는 0.7%)로 심장줄기세포가 아닌 세포로부터 심장줄기세포를 정제 분리하기 위하여 후속적인 면역학적 방법이 필연적으로 요구되었는데 반해, 본 발명의 상기 심장전구세포 배양방법에 의해 얻어진 세포는 고순도의 심장전구세포로, 특별한 추가적인 면역학적 정제방법이 불필요할 뿐만 아니라, 본 배양방법은 단순하고 조직해리과정을 거치지 않아 세포 손상이 일어나지 않아 회수된 세포의 95% 이상이 생존율을 보이고 1gm의 심근절편을 7일간 배양시 1.7ㅧ107의 수득율을 나타내어, 종래의 심장전구세포 배양방법에 비해 압도적으로 우수한 수득율을 나타낼 수 있다.
본 발명은 상기 배양방법에 의해 배양된 심근조직 유래 심장전구세포를 제공하며, 상기 심장전구세포는 (i) 네스틴 (nestin) 및 Sca-1으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 심장전구세포 표지자 군에 양성인 면역학적 특성; (ii) GATA-4, Nkx-2.5 및 Mef-2c로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 심근세포-특이 전사인자 표지자 군에 양성인 면역학적 특성; (iii) CD29, CD44, CD73, CD90 및 CD105로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중간엽줄기세포 표지자 군에 양성인 면역학적 특성; (iv) CD140b, CD146, 및 SMA로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 혈관주위세포 표지자 군에 양성인 면역학적 특성; (v) Lin, CD34 및 CD45로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 조혈계 세포 표지자 군에 음성인 면역학적 특성; (vi) CD31 및 CD34으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 혈관내피세포 표지자 군에 음성인 면역학적 특성; 및 (vii) α-SA (α-sarcometric actinin), MHC (myosin heavy chain), TnI (troponin I) 및 TnT (troponin T)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 심근세포 표지자 군에 음성인 면역학적 특성;으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 면역학적 특성을 지니는 심근조직 유래 심장전구세포를 제공한다.
상기 심장전구세포의 배양방법에서 하이드로젤 내로 이동 성장한 세포의 95% 이상에서 심장전구세포 표지자인 nestin 또는 Sca-1에 양성으로 발현될 수 있고, 심근세포-특이 전사인자인 GATA-4, Nkx-2.5, 그리고 MEF-2c는 95% 이상의 세포에서 검출되나, 혈관내피세포, 조혈계 세포, 평활근세포와 같은 심장을 구성하는 체세포의 오염은 1% 미만일 수 있고 후기 심근세포 표지자인 α-SA, TNI, desmin 및 MHC을 발현되지 않을 수 있다.
또한, 상기 심장전구세포는 중간엽줄기세포의 표지자인 CD29, CD44, CD73, CD90 및 CD105로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 표지자와 혈관주위세포 표지자인 CD140b, CD146, 및 SMA로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 표지자를 발현하는데 반하여, 조혈계 세포 표지자인 Lin, CD34, CD45, CD56 등은 음성이었고, 신경계 세포 및 성숙한 심근세포 표지자인 CD56 및 혈관내피세포 표지자인 CD31 및 CD34은 발현하지 않는 특성을 보였다.
본 발명의 심장전구세포는 혈관주위세포 기원 중간엽줄기세포와 동등한 면역표면학적 특성을 보였다. 상기 심장전구세포의 생체 외 분화능력은 골수의 중간엽줄기세포와 유사한 특성을 보여, 심근유래 심장전구세포는 심근-기원 중간엽줄기세포로 분류할 수 있다.
상기 심장전구세포는 다양한 조직, 장기로의 분화력이 뛰어날 수 있으며, 일례로 심근세포, 조골세포, 지방세포, 연골세포, 혈관내피세포, 평활근세포, 신경세포 또는 골격근세포로의 분화력을 지닐 수 있다.
상기 심장전구세포의 골격근세포, 조골세포, 지방세포, 연골세포, 혈관내피세포 및 신경세포로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 세포로의 분화는 당업계에 공지된 분화유도 조건 또는 배지에서 배양함으로 이루어질 수 있다.
상기 심장전구세포는 심근세포로 직접 분화할 수 있는 능력을 지닌데 반하여, 조혈모세포 및 중간엽줄기세포는 심근세포로 직접 분화할 수 있는 능력은 입증되지 않았다.
또한, 종래 기술로 분리한 심장전구세포는 자발적인 심근세포로의 분화능력은 제한적이며, 전체 심장전구세포 중 10% 미만에서 심근세포로 분화하는 것으로 알려져 있는데 반해, 본 발명의 심근유래 심장전구세포는 70% 이상에서 자발적으로 심근세포로 분화할 수 있으며, 85%에서 혈관내피세포로 분화할 수 있는 능력을 보였고, 20%에서 평활근세포로 분화할 수 있는 능력을 보였다.
본 발명의 배양방법에 의해 배양, 분리된 심장전구세포의 70%에서 콜로니를 형성할 수 있으며, 200번 이상 세포분열을 할 수 능력을 보였고, 하나의 세포가 두 개의 세포로 분열하는 배가시간이 30 내지 60시간으로 체외 성장능력이 뛰어날 수 있다.
본 발명은 상기 심장전구세포를 현가세포배양법(suspension cell culture)을 통하여 배양하는 단계;를 포함하는 심근조직 유래 심장전구세포의 심근세포로의 분화방법을 제공한다.
상기 심장전구세포는 골수 혹은 지방조직 기원 중간엽줄기세포와 같은 분화특성을 지닌 세포로써, 분화 가능한 세포는 특별히 한정되는 것은 아니며, 조골세포, 지방세포, 연골세포, 혈관내피세포, 평활근세포, 신경세포 및 골격근세포로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 세포로 분화될 수 있다.
또한, 상기 심장전구세포가 자발적으로 분화 가능한 세포는 그 종류에 있어서 특별히 한정된 것은 아니나, 바람직하게는 심장을 구성하는 심근세포로 자발적으로 분화할 수 있다.
종래 기술로 분리한 심장전구세포는 자발적인 심근세포로의 분화능력은 제한적이며, 전체 심장전구세포 중 10% 미만에서 심근세포로 분화하는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 심근유래 심장전구세포는 70% 이상에서 자발적으로 심근세포로 분화할 수 있으며, 85%에서 혈관내피세포로 분화할 수 있는 능력을 보였고, 20%에서 평활근세포로 분화할 수 있는 능력을 보였다. 종래의 심근재생 세포치료제인 중간엽줄기세포 및 조혈모세포는 심장을 구성하는 세포로 분화할 수 있는 능력이 결여되어 직접적인 심근재생 기능은 없으며, 간접적인 심장보호 기능만이 제시되었다. 그러나 본 발명의 심장전구세포는 심근을 재생하기 위한 모든 세포로 직접적 그리고 자발적으로 분화할 수 있는 능력을 지녀, 심장재생을 위한 세포치료제로서 이상적인 세포원으로 적용될 수 있다.
심장전구세포의 심근세포로의 분화는 단층배양환경에서 심근세포와 공배양하거나 5-아자시티진(5-azacytidine), 옥시토신(oxytocin)을 이용하여 심근세포로 분화를 유도하는 방법들이 적용되었다. 그러나 종래 방법은 심근세포로의 분화유도 효능이 제한적이며, 특정 줄기세포의 심근세포로의 분화능력을 검증하기 위한 효과적인 방법이 아니다. 생체 내 모든 세포 및 조직은 3차원적 구조로 존재하며, 세포-세포 간 그리고 세포-세포외기질 간 상호작용에 의하여 그 기능을 유지한다. 즉, 종래의 2차원적 단층배양 환경은 생체 내 환경과 상이하며, 세포-세포 간 그리고 세포-세포외기질 간 상호작용을 지지할 수 없으며, 그 결과 심근세포로의 분화를 유도하는데 한계가 있었다.
현가세포배양법은 세포를 세포배양액에 현탁한 후 세포가 부착되지 않도록 처리된 배양용기에 심장전구세포가 3차원적 구조로 배열하도록 유도한 배양법으로, 세포-세포 간 그리고 세포-세포외기질 상호작용을 통하여 세포가 3차원적 미세구조를 취하도록 유도할 수 있다. 또한, 특별한 외부적 분화 유도물질 없이도 상기 심장전구세포는 현가세포배양법을 통해 자발적으로 심근세포로 분화를 유도할 수 있다.
일례로, 천개의 심장전구세포를 세포배양액 1 ml에 현탁한 후 세포가 부착되지 않도록 처리된 배양용기에 심장전구세포가 3차원적 구조로 배열하도록 유도할 수 있다. 상기 방법으로 세포가 3차원 구조를 취하도록 유도한 후 1일에서 4주간, 바람직하게는 3일에서 2주간 배양하여 심근세포로 분화를 유도할 수 있으며, 상기 현가세포배양법은 3차원 구조를 통하여 파종된 세포와 세포 간 그리고 세포와 세포외기질 간 상호작용을 지지할 수 있다.
이외에도 상기 현가세포배양법은 심장전구세포 및 심근세포로의 분화할 수 있는 체세포, 배아줄기세포, 혹은 역분화만능줄기세포의 심근세포로의 분화능력을 검증하기 위한 평가시스템으로 활용할 수 있으며, 심근세포로의 분화를 유도하는 물질 혹은 인자의 분화유도 능력을 규명할 수 있는 평가시스템으로도 활용될 수 있다.
상기 현가세포배양법을 통해 분화된 심근세포는 α-SA, TnI(troponin I), TnT(troponin T), α-MHC(α-myosin heavy chain), β-MHC(β-myosin heavy chain), MLC2a(myosin light chain-2 atrium) 및 MLC2v(myosin light chain-2 ventricle)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 표지자 군에 양성인 면역학적 특성을 지닐 수 있다.
본 발명은 상기 심장전구세포 또는 이의 분화된 세포를 유효성분으로 포함하는 세포치료제를 제공한다.
심장전구세포는 특별한 분화과정을 거치지 않고 바로 세포치료제로 이용될 수 있으며, 또는 치료를 하고자 목적하는 세포로 분화하여 이용할 수 있다.
상기 세포치료제에서의 세포는 특별히 한정된 것은 아니나, 일례로 상기 세포는 심근세포, 조골세포, 지방세포, 연골세포, 혈관내피세포, 평활근세포, 신경세포 및 골격근세포로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 세포를 포함할 수 있다.
상기 세포치료제의 심장전구세포 또는 이의 분화된 세포를 세포치료제로 이용하는 방법은 특별히 한정하는 것은 아니나, 종래의 당업계에 공지된 방법에 의할 수 있으나, 바람직하게는 상기 심장전구세포를 생분해성 지지체 혹은 운반체에 담아 제공될 수 있다.
상기 생분해성 지지체 혹은 운반체는 숙주에 실질적인 해로운 반응을 유발하지 않으며 생물학적으로 분해될 수 있는 것으로, 생물학적 시스템으로부터 자연적으로 제거될 수 있고/있거나 생물학적 시스템에 화학적으로 혼입될 수 있는 것일 수 있다.
상기 생분해성 지지체 혹은 운반체는 그 종류에 있어 특별히 한정된 것은 아니나, 바람직하게는 하이드로젤일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤일 수 있다.
상기 심장전구세포는 항섬유소용해제가 포함된 하이드로젤과 혼합되어 사용될 수 있다.
상기 하이드로젤은 구성 고분자 및 항섬유소용해제 농도를 조절하여 생체 내에서 분해속도를 조절할 수 있다. 상기 하이드로젤은 세포주입 시 혈액 내로 소실되는 단점을 방지할 수 있으며, 또한 손상부위 내 염증세포 및 효소에 의한 세포손상을 감소시킬 수 있다.
상기 세포치료제는 추가적으로 항염증제제, 줄기세포 동원인자 및 혈관성장 유도인자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 더 포함할 수 있다.
상기 항염증제제는 하이드로젤이 이식된 심장전구세포를 과도한 염증반응으로부터 보호하기 위하여 사용될 수 있고, 줄기세포 동원인자 또는 혈관성장 유도인자를 포함하여 심근 내 줄기세포의 동원 및 혈관성장을 유도함으로 세포재생 효과를 증대시킬 수 있다.
상기 항염증제제는 특별히 한정된 것은 아니나, 일례로 COX 억제제, ACE 억제제, 살리실산염(salicylate) 및 덱사메타손(dexamethasone)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 줄기세포 동원 인자는 특별히 한정된 것은 아니나, 일례로 IGF, bFGF, PDGF 및 EGF로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 혈관성장 유도인자는 특별히 한정된 것은 아니나, 일례로 EGF, PDGF, VEGF, ECGF 및 엔지오제닌(angiogenin)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 세포치료제는 하나 이상의 희석제를 포함할 수 있는데, 상기 희석제는 특별히 한정된 것은 아니나, 생리식염수, PBS(Phosphate Buffered Saline), HBSS(Hank's balanced salt solution) 등의 완충용액, 혈장 또는 혈액성분 등이 있을 수 있으며, 상기 희석제 외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 상기 심장전구세포 또는 이의 분화된 세포를 유효성분으로 포함하는 심장질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
심장질환, 일례로 심경경색증, 허혈성 심근질환, 일차성 심근질환, 이차성 심근질환, 울혈성 심부전증 환자에 적용될 수 있는 세포치료제로 유효한 용량은 천만 개 내지 일억 개의 세포가 요구된다.
난치성 심근질환의 치료제로 조혈모세포 혹은 중간엽줄기세포가 통상적으로 사용되고 있다. 조혈모세포는 체외에서 증폭 배양이 어려우며, 유효한 용량의 조혈모세포를 분리, 정제하기 위해서는 10 L의 골수가 요구된다. 중간엽줄기세포는 골수 혹은 지방조직 내 유핵세포 백만 개 중 하나의 빈도로 존재하는 것으로 알려져 있고, 골수 혹은 지방조직 유래 중간엽줄기세포는 1% 미만에서 콜로니를 형성하고, 하나의 세포가 두 개의 세포로 분열하는 시간은 60시간 이상으로 유효한 치료제 용량만큼 체외에서 증폭 능력이 어려운 한계점이 대두되었다. 또한 조혈모세포 및 중간엽줄기세포는 심근세포로 직접 분화할 수 있는 능력은 입증되지 않았다.
본 발명의 배양방법에 의할 때 100 mg의 심근에서부터 7일 이내에 백만 개의 심장전구세포를 분리할 수 있으며, 2주간 단층배양법을 통하여 천만 개 이상의 심장전구세포를 증폭 배양할 수 있을 뿐만 아니라, 상기 배양된 심장전구세포는 70%에서 콜로니를 형성할 수 있으며 200번 이상 세포분열을 할 수 있는 능력을 보여, 단시간 내에 심장질환 치료제로 사용할 수 있는 유효량을 획득할 수 있다.
상기 약학 조성물에서 심장전구세포 또는 이의 분화된 세포는 특별히 한정된 것은 아니나, 항섬유소용해제가 포함된 하이드로젤과 혼합되어 사용될 수 있다.
종래에 심장질환 치료용 치료제 혹은 줄기세포치료제는 직접 손상된 심근부위에 주입하거나 혹은 혈관 내로 주입하는 방법이 적용되고 있다. 상기 치료제를 손상된 심근부위로 직접 주입 시 손상부위의 과도한 염증세포 및 효소에 의한 손상, 저산소증에 의한 손상, 주입 시 혈관으로의 소실 등에 의하여, 주입한 세포의 1% 미만에서 손상부위에 전달되는 문제점이 제기되었다. 혈관 내로 주입된 치료제는 모세혈관이 풍부한 장기인 간(liver), 비장(spleen), 그리고 폐(lung)을 통과하지 못하여, 손상된 심장으로 회귀되는 세포 수는 전체 주입된 세포의 0.1% 미만인 문제점이 제기되었다.
그러나 본 발명의 항섬유소용해제가 포함된 하이드로젤은 용액상태에서 심장전구세포와 혼합되어 심근 내로 주입 후 상전이 되어 젤을 형성하여 효과적으로 심근 내로 심장전구세포를 전달할 수 있다. 상기 하이드로젤을 통하여 심장전구세포를 주입한 경우는 심장전구세포 단독으로 주입한 경우보다 세포전달 효과를 5배 이상 증진시킬 수 있다. 상기 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤을 통하여 이식한 경우 주입한 세포의 5% 이상에서 손상된 심근 내로 이동하여 직접적인 심근재생 효과를 나타내었다.
일 실시예에서 나타난 바와 같이, 인간 심장전구세포(CPCs)만을 주입한 쥐에서는 심근 내 세포가 차지하는 면적은 5% 미만인데 반하여, 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤을 통하여 전달한 심장전구세포(CPCs+H)의 경우 인간 심장전구세포만을 주입한 경우보다 약 3배 이상 넓은 면적에서 분포하는 것을 확인할 수 있다.
본 발명의 심근유래 심장전구세포는 체외 증식능력, 자발적인 심근세포로의 분화능력을 지녀 심장질환의 예방 또는 치료제로 효과적으로 활용될 수 있다.
일 실시예에서 나타난 바와 같이, 하이드로젤을 통하여 주입한 심장전구세포는 심근세포, 혈관내피세포 및 혈관, 평활근세포로 분화하여 심근 및 혈관을 직접적으로 재생하는 기능을 나타낼 수 있다.
상기 심장질환은 특별히 한정된 것은 아니나, 바람직하게는 급성 및 만성 심경경색증, 허혈성 심근질환, 일차성 심근질환, 이차성 심근질환, 울혈성 심부전증 등에 이용될 수 있다.
상기 심장전구세포 또는 이의 분화된 세포를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 약학조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 방법(예: 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science, 최신판; Mack Publishing Company, Easton PA)을 참조할 수 있다.
상기 약학조성물의 투여방법은 특별히 한정되는 것은 아니며, 일례로, 주사제의 형태로 제조될 수 있고, 외과적인 수술을 통하여 손상된 심장조직에 직접 이식될 수 있으며, 정맥에 투여될 수 있는데, 상기 투여된 심장전구세포는 손상된 심장조직으로 이동할 수 있다.
상기 약학조성물에 추가적으로 항염증제제, 줄기세포 동원인자 및 혈관성장 유도인자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 더 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시한 것으로 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예>
실시예 1. 피브리노겐 농도조절을 통한 하이드로젤 미세구조의 조절
하이드로젤 내 미세구조를 조절하기 위하여, 피브리노겐 농도를 조절하여 4가지 유형의 피브린을 제조하였다. 인간혈장에서 분리한 피브리노겐(녹십자, 서울, 대한민국)은 10 mM CaCl2가 포함된 DMEM 배지에 녹여 2.5, 5.0, 10.0, 20.0 mg/ml 등 4가지 농도의 피브리노겐 용액을 제조하였다. 피브리노겐 1:50(중량) 비율의 Alexa Fluor 488-conjugate 피브리노겐(Invitrogen, Calsbad, CA)을 피브리노겐 용액에 첨가하였다. 트롬빈(Sigma, St. Louis, MI)는 DMEM에 녹여 최종 1 unit/ml 농도의 트롬빈 용액을 제조하였다. 4가지 농도의 피브리노겐 용액과 트롬빈 용액을 1:1(용량) 비율로 혼합한 후 10㎕ 혼합액을 유리슬라이드에다 옮긴 후 37℃에서 2시간 동안 가교반응을 거친 후 최종 1.25, 2.5, 5.0, 10.0 mg/ml 피브리노겐과 0.5 unit/ml 트롬빈으로 구성된 4가지 유형의 피브린 하이드로젤을 제조하였고, 하이드로젤의 미세구조는 confocal microscope 및 주사전사현미경으로 관찰하였다.
하이드로젤의 미세구조는 피브리노겐 농도가 증가할수록 치밀해 지며, 섬유소의 두께는 증가하였으며, 하이드로젤의 공극크기는 감소하였다(도1). 1.25 mg/ml 피브리노겐 농도로 제조한 하이드로젤 공극 크기는 25 nm이나, 5 mg/ml 및 10 mg/ml 피브리노겐으로 제조한 하이드로젤의 공극크기는 12.3 nm 및 7.5 nm로 유의하게 감소되었다 (p < 0.05).
실시예 2. 심장전구세포의 섬유소용해 작용
실시예 1의 방법으로 피브리노겐 농도에 따라 4가지 조성의 하이드로젤을 제조하였다. 피브리노겐 1:50(중량) 비율의 Alexa Fluor 488-conjugate 피브리노겐(Invitrogen, Calsbad, CA)를 피브리노겐 용액에 첨가하였다. 심장전구세포는 4가지 농도의 피브리노겐 용액 100㎕ 용량당 2x105 세포와 혼합한 후 100㎕의 트롬빈 용액과 혼합한 후 2시간 동안의 가교반응을 거쳤다. 하이드로젤이 형성된 후 300㎕의 세포배양액을 첨가한 후 심장전구세포를 1일간 배양하였다. 심장전구세포가 포함되지 않은 하이드로젤은 동일한 조성으로 제조하여 대조군으로 사용하였다. 하이드로젤 내 포함된 피브린의 분해정도는 세포배양액으로 방출된 Alexa Fluor 488-conjugate량을 fluorometer로 측정하여 분석하였다.
도 2에서 나타난 바와 같이, 심장전구세포가 포함된 하이드로젤(w/CPCs)은 배양 2시간째부터 분해되기 시작하였으며, 배양 1일 후 모든 하이드로젤은 완전히 분해되었다. 반면 대조군은 분해정도는 5% 미만이었고, 피브리노겐 농도에 따른 분해정도의 차이는 관찰할 수 없었다.
실시예 3 항섬유소용해제제에 따른 심장전구세포의 섬유소용해 억제효과
항섬유소용해제는 Sigma사에서 구입하였다. 실시예 2에 기술한 방법으로 심장전구세포는 항섬유소용해제가 함유한 피브린 하이드로젤 내로 함입시킨 후 1일간 배양하였으며, 피브린 분해정도를 분석하였다.
도 3에서 나타난 바와 같이, 아프로티닌(aprotinin) 및 아미노카프로이드산(aminocaproid acid)가 도입된 피브린 하이드로젤은 심장전구세포에 의하여 95% 및 80% 이상 분해되어, 아프로티닌(aprotinin) 및 아미노카프로이드산(aminocaproid acid)는 심장전구세포에 의한 섬유소용해 작용을 억제하는 효과는 미미하였다. 반면 트란이그제믹산(tranexamic acid) 및 아미노메틸벤조익산 (aminomethylbenzoic acid)가 도입된 하이드로젤은 심장전구세포에 의한 섬유소용해 작용에 저항성을 보였으며, 전체 하이드로젤의 30% 미만에서 하이드로젤이 분해되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4 항섬유소용해제 농도에 따른 심장전구세포의 하이드로젤의 분해 억제효과
실시예 2의 동일한 방법으로 심장전구세포가 포함된 피브리노겐 용액 100㎕와 0.2, 0.1, 0.2, 0.5, 1 mg/ml 농도의 아미노메틸벤조익산 (aminomethylbenzoic acid)이 포함된 트롬빈 용액 100㎕을 혼합하였다. 하이드로젤이 완전히 형성된 후 심장전구세포를 1일간 배양하였으며, 배양이 끝난 후 포르말린 용액으로 고정한 후 toluidine blue 염색을 시행하였으며, 피브린 하이드로젤 및 세포의 상태를 분석하였다.
도 4에서 나타난 바와 같이, 아미노메틸벤조익산 (aminomethylbenzoic acid)가 포함되지 않은 하이드로젤은 심장전구세포에 의하여 하이드로젤이 완전히 용해되어 3차원적 세포부착 기질을 제공하지 못했으며, 세포는 배양용기 바닥에 2차원적으로 배열되었다. 반면 0.1 및 0.2 mg/ml 농도의 아미노메틸벤조익산 (aminomethylbenzoic acid)는 심장전구세포에 의한 섬유소용해 효과를 억제하여 3차원적 세포부착 기질로서의 역할을 유지할 수 있었다. 그러나 0.5 및 1.0 mg/ml 농도의 아미노메틸벤조익산 (aminomethylbenzoic acid)는 심장전구세포의 섬유소용해 작용은 억제할 수 있었으나, 세포독성으로 인한 심장전구세포의 손상을 유발하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤 조성에 따른 심장전구세포의 거동 및 성장
실시예 1과 같이 2.5, 5.0, 10.0, 20.0 mg/ml 등 4가지 농도의 피브리노겐 용액을 제조하였고, 피브리노겐 용액 내 100 ㎍/ml 농도의 아미노메틸벤조익산 (aminomethylbenzoic acid)를 첨가하였다. 실시예 2와 같이 4가지 농도의 피브리노겐 용액과 심장전구세포가 포함된 트롬빈 용액을 1:1(용량) 비율로 혼합한 후 가교반응을 거쳤다. 하이드로젤이 형성된 후 심장전구세포를 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤 내에서 3일간 배양하였다. 심장전구세포의 cytoplasmic spreading을 평가하기 위하여 1 ㎍/ml Alexa Fluor 488-conugated Phalloidine(Invitrogen)과 30분간 반응킨 후 confocal microscope 및 위상차현미경으로 분석하였다. 하이드로젤 내 심장전구세포의 성장정도는 dsDNA PicoGreen Quantitation Kit를 이용하여 평가하였다.
도 5에서 나타난 바와 같이, 1.25 및 2.5 mg/ml 피브리노겐으로 구성된 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤 내 심장전구세포는 cytoplasmic spreading이 3차원적으로 뻗어 있었다. 반면 5.0 mg/ml 이상의 피브리노겐으로 구성된 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤 내의 심장전구세포는 cytoplasmic spreading이 감소되었으며, 특히 10.0 mg/ml 피브리노겐으로 구성된 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤 내의 심장전구세포의 cytoplsmic spreading은 이루어지지 않았다. 정량적 평가에서도 생리적 농도의 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤 내 심장전구세포의 cytoplasmic spreading이 5.0 mg/ml 이상의 피브리노겐으로 구성된 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤 내의 심장전구세포보다 유의하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다(*, p < 0.01)(도 5B).
도 6 에서 나타난 바와 같이, 피브리노겐 농도가 증가할수록 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤 내의 심장전구세포의 성장은 유의하게 감소하였다. 생리적 농도로 제조된 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤 내에서 심장전구세포의 성장이 유의하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다(*, p < 0.01).
실시예 6 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤 조성에 따른 심근절편 내 심장전구세포의 하이드로젤 내로 이동 및 성장
실시예 5와 같이 2.5, 5.0, 10.0, 20.0 mg/ml 등 4가지 농도의 피브리노겐 용액을 제조하였고, 피브리노겐 용액 내 100 ㎍/ml 농도의 아미노메틸벤조익산 (aminomethylbenzoic acid) 혹은 tranexamic aicd를 첨가하였다. 뇌사자의 심장으로부터 외심막 및 내심막을 제거한 후 심근층만을 분리하였다. 심근은 면도칼을 이용하여 1 내지 3 mm3 크기의 절편으로 잘게 절단한 후 DMEM 용액으로 3차례 세척하였다. 1 unit/ml 농도의 트롬빈 용액 0.5 ml 당 10개의 절편이 포함되도록 심근절편을 첨가하였다. 4가지 농도의 피브리노겐 용액과 심근절편이 포함된 트롬빈 용액을 1:1(용량) 비율로 혼합한 후 1 ml 혼합액을 6-multiwell tissue culture plate에 옮긴 후 중합 및 가교반응을 거쳤다. 하이드로젤이 형성된 후 2 ml의 세포배양액을 첨가한 후 심근절편을 3차원 하이드로젤 내에서 3일간 장기(organ)배양하였다. 배양이 끝난 후 3% 포르말린 용액으로 고정한 후 위상차 현미경으로 촬영하여 심장절편에서 하이드로젤 내로의 심장전구세포의 이동과 성장을 평가하였다.
도 7에서 나타난 바와 같이, 항섬유소용해제가 포함되지 않은 하이드로젤은 심근절편에 의하여 분해되는 것을 확인할 수 있었다(도7 No). 저농도의 피브리노겐 용액으로 제조한 하이드로젤은 심근절편에 의하여 용해되는 하이드로젤의 면적이 5.0 및 10.0 mg/ml 농도의 피브리노겐으로 제조한 하이드로젤의 용해면적보다 높았다. 그러나 아미노메틸벤조익산 (aminomethylbenzoic acid) 혹은 트란이그제믹산(tranexamic acid) 등의 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤은 심근절편으로 안정적인 3차원적 세포부착 기질을 장기배양(organ culture) 기간 중 제공할 수 있었다.
피브리노겐 농도가 높아질수록 심근절편에서부터 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤 내로의 심장전구세포의 이동과 성장은 현저하게 감소되었다(도 8B). 1.25 mg/ml 피브리노겐으로 제조한 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤 내로 심근절편에서 심장전구세포의 이동과 성장은 배양 1일 이전부터 관찰되기 시작하였으나, 5 mg/ml 농도 이상의 피브리노겐으로 제조한 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤 내로 심장전구세포의 이동과 성장은 배양 2일 이후부터 관찰되었다. 형태계측학적 분석에서도 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤 조성 내 피브리노겐 농도가 증가할수록 심근절편으로부터 하이드로젤 내로의 심장전구세포의 이동과 성장은 유의하게 감소되었다(p < 0.01)(도 7B).
실시예 7 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤-지지 심근절편의 3차원 장기배양(organ culture)
본 실시예에서 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤은 2.0 mg/ml 피브리노겐, 0.5 unit/ml 트롬빈, 100 ㎍/ml 아미노메틸벤조익산 (aminomethylbenzoic acid)의 조성으로 제조하였다. 실시예 7과 같은 방법으로 심근절편은 하이드로젤 내 3차원 장기배양하였다. 세포배양액은 90% (vol/vol) DMEM, 10% 우태아혈청, 20 ng/ml EGF, 5 ng/ml bFGF, 10 ng/ml IGF, 10 ㎍/ml gentamicin(Invitrogen)로 구성하였다. 세포배양액을 첨가한 후 배양용기는 orbital shaker위에서 15 내지 30 rpm 속도로 교반하면서 1주간 배양하였다. 2일마다 신선한 세포배양액으로 교체하였다. 심근절편 장기(organ)배양을 통하여 하이드로젤 내로 이동, 성장한 심장전구세포 및 심근절편은 선택적으로 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤을 분해시켜 하이드로젤로부터 회수하였다. 회수한 심장전구세포는 통상적인 방법으로 2차원 단층배양법으로 증폭 배양하였고, 회수한 심근절편은 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤 내로 다시 함입시킨 후 동일한 방법으로 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤-지지 3차원 장기(organ)배양을 반복하였다. 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤 내로 이동한 세포의 특성과 배양한 심근절편의 구조를 검사하기 위하여, 장기(organ)배양 후 통상적인 방법으로 파라핀 블록을 제조하였으며, Hematoxylin eosin 염색과 면역조직화학염색을 시행하였다. 하이드로젤 내로 이동 성장한 세포를 추적연구하기 위하여 장기(organ)배양 과정 중 1 μM bromodeoxyuridine(BrdU, Sigma)를 배양 3일간 첨가하였으며, 이후 BrdU을 uptake한 세포는 면역화학염색을 통하여 검출하였다. 심근절편을 하이드로젤 지지 없이 단순하게 2차원적으로 파종하여 배양한 경우(2D)와 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤 내로 함입시켜 3차원 장기배양(3D)하였다. 배양 1일 후 심근절편만을 회수하여 단백질을 분리한 후 인테그린 신호전달체제의 활성화를 western blotting 방법으로 분석하였다.
도 9에서 나타난 바와 같이, 장기(organ)배양 1일 이전부터 심근절편으로부터 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤 내로 심장전구세포의 이동과 성장이 관찰되기 시작하였다. 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤 내로 이동 성장한 세포는 전형적인 섬유모세포와 유사한 방추상 모양을 보였다(도8E). 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤을 선택적으로 분해시킨 후 심장전구세포를 안정적으로 회수할 수 있었으며, 배양용기에 파종하였을 때 파종한 세포의 90%이상에서 배양용기로 부착하였다. 장기(organ)배양 7일 이전에 심근절편에서 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤 내로 이동 성장한 세포는 방추상 모양을 보였다(도 9). 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤 내로 이동 성장한 세포의 90%이상에서 proliferating cell nuclear antigen(PCNA)가 발현되었으며, 또한 90% 이상의 세포에서 BrdU의 발현이 관찰되어, 하이드로젤 내로 이동 성장한 세포는 장기(organ)배양과정 중 체외에서 세포분열을 통하여 이동 성장한 세포임을 확인할 수 있었다(도 9, BrdU 및 PCNA).
도 10에서 나타난 바와 같이, 배양 전 심근절편(도 10A, Fresh)은 배양 전 인테그린 세포신호전달체제가 활성화되지 않는 것을 western blot 결과에서 보여주고 있다. 심근절편을 하이드로젤 지지 없이 파종방법으로 장기(organ)배양하였을 시(도 10A, 2D) 인테그린 세포전달체제가 활성화되었으나, 활성화되는 정도는 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤-지지 3차원 장기(organ)배양(도 10A, 3D)과 비교하였을 시 유의하게 낮은 것을 확인할 수 있었다. 정량적인 방법으로 인테그린 신호전달체제의 활성도를 분석한 결과에서 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤-지지 3차원 장기(organ)배양법은 단순한 2차원적 파종방법의 장기(organ)배양법과 비교하여 유의하게 심근절편 내 인테그린 신호전달체제가 활성화되는 것을 확인할 수 있었다(도 10B). 이상의 결과는, 3차원 하이드로젤-지지 장기(organ)배양은 인테그린 신호전달체제의 활성화를 유도하여 심근 내 줄기세포의 성장을 유도할 수 있는 것을 확인할 수 있었다.
도 11에서 나타난 바와 같이, 역동적 환경에서 하이드로젤-지지 3차원 장기(organ)배양은 산소 및 영양분 공급을 촉진시킬 수 있었으며, 그 결과 심근절편에서부터 하이드로젤 내로 이동성장한 심장전구세포가 차지하는 면적이 정적인 환경에서 장기(organ)배양한 경우보다 30% 이상 유의하게 증가되었다(p < 0.01).
실시예 8 심근절편에서 항섬유소용해제가 도입된 창상기질 모방 하이드로젤 내로 이동 심장전구세포의 특성
1) In vitro BrdU-labelling 분석
실시예 8과 동일한 방법으로 심근절편은 항섬유소용제가 도입된 하이드로젤 내로 함입시킨 후 3차원 장기(organ)배양법으로 배양하였으며, 배양 시작 1일부터 3일까지 세포배양액 내로 1 μM BrdU(Sigma)를 첨가하였다. 배양 1주 후 파라핀 블록을 제조하였으며, 파라핀 절편은 anti-Nkx-2.5(Abcam, Cambridge, MA) 혹은 anti-GATA-4(Abcam)을 포함한 일차항체와 각각 반응시켰다. 이후 상기 절편은 isotype-matched Alexa Fluor 488-conjugated 이차항체와 반응시켰다. 이후 절편은 다시 anti-BrdU(Sigma)와 반응시킨 후 isotype-matched Alexa Fluor 594-conjugated 이차항체와 반응시켰다. DAPI(Invitrogen)으로 핵을 염색한 후 confocal microscope로 관찰하였다.
도 12에서 나타난 바와 같이, 하이드로젤 내로 이동 성장한 세포는 심근세포-특이 전사인자인 GATA-4 및 Nkx-2.5가 발현되었다. 심근세포-특이 전사인자 및 줄기세포 표지자가 발현되는 세포는 모두 BrdU에 양성으로, 3차원 하이드로젤-지지 장기(organ)배양으로 심근절편에서부터 심근세포로 분화할 수 있는 심장전구세포를 이동과 성장을 유도할 수 있었다.
2) 하이드로젤 내로 이동 성장한 심장전구세포의 면역표면학적 특성
상기 in vitro BrdU-labelling 분석을 위하여 제조한 파라핀 블록을 이용하여 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤 내로 이동 성장한 세포의 면역표면학적 특성을 분석하였다. 면역화학염색에 사용한 일차항체는 심장전구세포 표지자인 nestin, 중간엽줄기세포 표지자인 CD105, 혈관주위세포 표지자인 CD140b, CD146, 그리고 SMA, 조혈계 세포 표지자인 CD34, 혈관내피세포 표지자인 CD31를 이용하였다.
도 13에서 나타난 바와 같이, 하이드로젤 내로 이동 성장한 세포는 심근세포 사이의 간질에서부터 이동 성장하는 것을 확인할 수 있었다. 하이드로젤 내로 이동한 모든 세포는 심장전구세포, 중간엽줄기세포, 및 혈관주위세포 표지자가 발현되었으나, 조혈계 세포 및 혈관내피세포 표지자는 모두 음성이었다.
실시예 9 하이드로젤 내로 이동 성장한 심장전구세포의 회수 및 증폭배양
실시예 7에서 기술한 방법으로 1주일간 심근절편을 배양하였다. 배양용기는 phosphate-buffered saline(PBS)로 3차례 10분간 실온에서 세척하였고, 이후 20% 송아지혈청이 포함된 DMEM로 1차례 수세하였다. 하이드로젤 10 ml 당 20 ml의 20% 송아지혈청이 포함된 DMEM과 10,000 unit의 urokinase(녹십자, 서울, 대한민국)을 배양용기에 첨가하였다. 배양용기는 orbital shaker 위에 놓고 37℃, 15 rpm 속도로 30분간 교반하였다. 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤이 느슨해지고 분해된 후 transfer pipette을 이용하여 배양용기로부터 심장전구세포 및 심근절편을 50 ml 코니칼 튜브에 옮겼다. 이후 200 x g에서 10분간 원심분리한 후 상층액은 제거하였다. 10 ml의 세포배양액을 첨가한 후 transfer pipette을 이용하여 분산시켰다. 100 mm 구경을 가진 cell strainer (BD Bioscience, 서울, 대한민국)을 이용하여 심장전구세포와 심근절편을 분리하였다. 회수한 세포 수는 PicoGreen dsDNA Quantitation Kit를 이용하여 분석하였고, 장기(organ)배양한 심근절편 중량으로 보정하였다. 통상적인 방법으로 심근절편은 조직분해효소로 처리한 후 분리한 후 세포 수는 상기의 동일한 방법으로 측정하였다. 심장전구세포는 다시 200 x g에서 10분간 원심분리한 후 상층액은 제거하고, 세포층은 세포배양액으로 분산시켰다. 심장전구세포는 cm2 당 만개의 밀도로 배양용기에 파종하여 통상적인 단층배양법을 통하여 증폭 배양하였다.
도 14에서 나타난 바와 같이, urokinase 처리 전 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤 내로 이동 성장한 심장전구세포는 방추상 모양으로 3차원적으로 분포하고 있다(도 14A). Urokinase 처리 30분 후 세포부착 기질이 분해되어, 심장전구세포는 세포질이 수축되어 둥근 형태를 취하며, 개개로 흩어져 분포하였다(도 14B). 이들 세포를 분리한 후 세포배양 용기에 파종하면 심장전구세포는 30분 이내에 단층으로 배양용기 표면에 부착하여 성장하였다(도 14C). 심근절편 1 gm에서부터 7일간 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤-지지 3차원 장기(organ)배양 후 얻어지는 심장전구세포 수(3D w/ AMBA)는 1.7 x 107으로, 심근절편을 조직분해과정 이후 얻어지는 세포 수(2D)에 비하여 20배 높은 수율을 보였으며, 항섬유소가 도입되지 않은 하이드로젤을 이용한 3차원 장기배양(3D w/o AMBA) 군보다 10 배 이상 높은 수율을 보였다 (p < 0.01).
실시예 10. 하이드로젤로부터 회수한 심장전구세포의 단층배양환경에서의 성장 특성
회수한 심장전구세포의 체외 증폭능력은 colony forming unit-fibroblast (CFU-F)와 군집배가시간 (population doubling time, PDT)의 분석을 통하여 평가하였다. CFU-F의 형성능력은 하이드로젤로부터 회수한 세포를 5 cells/cm2 밀도의 60-mm 배양 접시에 파종한 후 성장배양배지를 첨가한 후 11일간 배양한 후 형성된 콜로니 수를 측정하였다. 심장전구세포의 PDT를 측정하기 위해, 2 ⅹ 103 세포들을 48-멀티웰(multiwell) 배양용기에 파종하였고, 배양 1일째와 5일째 세포는 CelLyticTM 용액(Sigma)으로 용해하였고, 용해된 샘플 내 DNA 함량은 PicoGreen dsDNA Quantitation Kit을 사용하여 측정하였다. 형광 마이크로플레이트 리더기(fluorescent microplate reader, SynergyTM HT; Bio-Tek Instruments, Neufahrn, Germany)를 사용하여 발광 (emission) 485nm, 여기 (excitation) 540nm의 파장에서 형광강도를 측정하였다. 측정된 DNA 함량은 표준곡선을 이용하여 세포수로 변환하였다. PDT는 다음 공식에 따라 산정하였다. PDT=[(days in exponential phase)/((logN2-logN1)/log2)] 이때, N1은 지수성장기의 초기의 세포수이며, N2는 지수성장기의 말기에서의 세포수이다.
도 15에 나타난 바와 같이, 하이드로젤로부터 회수한 심장전구세포는 단층배양환경에서 방추상 모양을 나타내었다(도 15B). 심장전구세포는 70%에서 CFU-F를 형성할 수 있었다(도 15A). 심장전구세포는 20회 이상 계대배양이 가능하였고 200번 이상 세포 분열할 수 있는 능력을 지는 것을 확인할 수 있었다. 또한 심장전구세포의 군집배가시간은 30 내지 60시간 이내로 단층배양 환경에서 뛰어난 세포분열 능력을 확인할 수 있었다(도 15C).
실시예 11. 하이드로젤로부터 회수한 인간 심장전구세포의 면역표면학적 특성
1) 유세포분석기를 이용한 심장전구세포의 면역표면학적 특성
인간 심근절편에서 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤 내로 이동 성장한 심장전구세포는 단층배양법으로 증폭하였으며, 계대배양 3번째 세포를 대상으로 세포표면학적 특성을 분석하였다. 십만 개 세포는 형광표지자와 결합된 항-인간 항체들로 CD14, CD29, CD31, CD34, CD73, CD90, CD133과 반응시켰다. 비접합된 항체들인 CD105 (R&D Systems), c-kit (DAKO, Glosrup, Denmark), Flk-1, PDGFR-β(CD140b; Abcam, Cambridge, MA), CD146 (Abcam), MHC(Abcam), SMA(DAKO), nestin(Abcam)은 10만개 세포와 30분간 반응시킨 후 형광표지자와 결합된 2차 항체와 반응시켰다. 각 항체에 대한 양성률은 FACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA) 유세포분석기 (flow cytometer, 이하 FCM으로 명함)을 사용하여 분석하였으며, 최소 만개 이상의 세포에서 발현율을 분석하였다.
도 16에 나타난 바와 같이, 심근절편 기원 심장전구세포는 95% 이상에서 심장전구세포 표지자인 nestin 및 Sca-1에는 양성이었으나, c-kit은 검출되지 않았다. 또한 계대배양을 통하여 증폭한 심장전구세포는 CD29, CD44, CD73, CD90, 및 CD105과 같은 중간엽줄기세포 표지자에 양성이었으나, CD14, CD34, CD45, c-kit, Flk-1, 및 CD133 조혈계 세포 표지자는 모두 음성이었다. 상기 심장전구세포는 MHC-I 표지자는 95% 이상에서 양성으로 발현되었으나, MHC-II 표지자는 음성으로, 타가에게 심장전구세포를 이식할 수 있는 면역학적 조건은 충족하였다. CD140b, CD146, 그리고 SMA 등의 혈관주위세포 표지자는 심장전구세포에서 모두 발현되었으나, 발현빈도는 표지자마다 다소 차이를 보였다.
2) 면역형광염색 방법을 이용한 심장전구세포의 면역표면학적 특성
심장전구세포 10만 개를 세포원심분리기(cytocentrifuge, Cyto-Tek, Sakura, Tokyo, Japan)를 이용하여 유리슬라이드에 부착시켰다. 심근세포-특이 전사인자인 GATA-4 및 Nkx-2.5 단백질 발현은 실시예 8에서 기술한 동일한 방식으로 세포면역형광염색을 시행한 후 사진을 촬영하였고, 1,000 개 이상의 세포에서 양성인 세포 수를 산정하였다. 더불어 심근세포 표지자인 α-SA 및 CD56, 혈관내피세포 표지자인 CD31 및 vWF, 평활근세포 표지자인 SMA를 세포면역형광염색을 시행한 후 양성률을 산정하였다.
도 17에 서 심장전구세포는 심근세포-특이 전사인자인 GATA-4 및 Nkx-2.5 단백질이 90% 이상의 세포에서 발현되어, 심근세포로의 분화능력을 지닌 것을 확인할 수 있었다. 그러나 심장전구세포는 α-SA와 같은 분화 혹은 성숙한 심근세포에서 발현되는 단백질은 검출할 수 없었다. 계대배양을 통하여 증폭된 심장전구세포는 SMA 발현율은 감소되었으며, SMA가 발현되는 세포는 평활근세포와 유사한 형태를 취하여 평활근세포로의 분화능력을 지닌 것을 확인할 수 있었다. 또한 심장전구세포는 미성숙 혈관내피세포에서 발현되는 CD31은 8%에서 양성이었으나, 성숙한 혈관내피세포에서 발현되는 표지자인 vWF는 음성으로, 심장전구세포가 혈관내피세포로의 분화능력을 지닌 것을 확인할 수 있었다.
3) 심장전구세포의 Nestin 양성세포의 면역표면학적 특성
계대배양 3번째 심장전구세포는 실시예8과 같은 방법으로 염색하였다. 슬라이드는 anti-nestin과 반응한 후 isotype-matched Alexa Fluor 488-conjugated 이차항체와 반응시켰다. 이후 슬라이드는 anti-CD140b, anti-GATA-4, anti-Nkx-2.5, anti-α-SA, anti-SMA 등과 각각 반응시킨 후 isotype-matched Alexa Fluor 594-conjugated 이차항체와 반응시켰다. DAPI로 핵을 염색한 후 confocal microscope로 관찰하였다. 총 1000개의 세포를 산정하여 nestin 양성 심장전구세포에서 해당 단백질의 발현율을 산정하였다.
도 18에서 나타난 바와 같이, nestin 양성 심장전구세포는 혈관주위세포 표지자인 CD140b 및 심근세포-특이 전사인자인 GATA-4 및 Nkx-2.5가 80% 세포에서 발현되었다. 그러나 nestin 양성 심장전구세포는 심근세포 표지자인 α-SA의 발현은 관찰되지 않았으나, 평활근세포 표지자인 SMA는 발현되었다.
실시예 12. 체외증폭 배양한 심장전구세포의 심근세포로의 분화능력
1) 심장구(Cardiosphere) 형성능력
본 실시예는 하이드로젤로부터 회수하여 단층배양 환경에서 증폭 배양한 심장전구세포의 심장구 형성능력을 규명하였다. 20만 개의 심장전구세포는 fibronectin이 코팅된 6-multiwell 배양용기에 파종하였다. 심장구 형성을 유도하기 위한 배지는 98% (vol/vol) DMEM, 2% (vol/vol) B27(Invitrogen), 20 ng/ml EGF, 20 ng/ml bFGF로 구성하였다. 배지 첨가 후 3일간 배양하였으며, 심장구의 형성여부는 위상차 현미경으로 판정하였다. 또한 심장구를 형성한 심장전구세포는 면역형광염색을 통하여 단백질 발현특성을 분석하였다.
도 19에서 나타난 바와 같이, 배양 2일부터 심장전구세포는 심장구(CS)를 형성하였으나, 배양기간이 증가할수록 심장구의 크기는 증가하지 않았다. 심장구를 구성하는 심장전구세포는 후기 심근세포에서 발현되는 α-SA, MHC, TnI, TnT가 발현되었다.
2) 현가세포배양법(suspension cell culture)을 이용한 심근세포로의 분화 평가시스템
2만개 내지 10만개의 심장전구세포를 심근분화배지로 현탁한 후 세포부착 및 단백질부착이 억제하는 하이드로젤이 코팅된 24-multiwell tissue culture 용기 (Ultra-Low Attachment Surface, Corning, Lowell, MA)에 파종한 후 배양하였다. 심근분화배지 내에 1 mM의 Wnt3a 혹은 Dkk1을 첨가하여 심장전구세포를 현가세포배양 환경 혹은 종래의 단층배양 환경에서 배양하였다. 배양 1일과 3일 후에 심장전구세포를 회수하여 RNA를 분리하였고 AMV-역전사효소(Promega)를 이용해 cDNA를 합성하였다. 심장구 형성과 Wnt 신호전달체계조절에 의한 심근세포 분화능력을 평가하기 위해서 bone morphogenetic protein 2 (BMP2), SOX17, ANP, α-MHC, β―MHC, MLC2a, MLC2v(myosin light chain-2 ventricle)의 mRNA 발현정도를 실시간 중합효소연쇄반응을 통하여 확인하였다.
도20에서 나타난 바와 같이, 현가세포배양 환경에서 심장전구세포는 심근세포로의 분화를 증진시키는 인자인 BMP2 및 Sox17 mRNA 발현이 단층배양 환경과 비교하여 유의하게 증가되는 것을 확인할 수 있었다. BMP2와 SOX17 mRNA 발현은 Wnt3a 첨가에 의해 발현양이 증가되었으나, Dkk1에 의해 발현양이 감소되었다. 또한 후기 심근세포 표지자인 arterial natriuretic peptide(ANP), α-MHC, β-MHC, MLC-2a(myosin light chain-2 atrium), MLC2v(myosin light chain-2 ventricle)의 mRNA 발현정도는 단층배양방법보다 현가세포배양환경에서 현저히 증가되는 것을 확인할 수 있었으며, 또한 Wnt3a에 의해서 크게 증가하였고 반대로 Dkk1의 처리에 의해서 감소함을 관찰할 수 있었다. 뿐만 아니라 심장구를 형성한 그룹에서 유전자들의 mRNA 발현양상은 배양 1일 보다는 배양 3일째에 증가함을 보여주었다.
실시예 13. 단일클론 기원 심장전구세포의 생체 외 다분화능력
1) 단일클론 심장전구세포의 분리 및 증폭 배양
5명의 다른 기증자로부터 기증받은 심근에서부터 분리한 심장전구세포를 96-multiwell tissue culture plate에 well당 0.5개로 파종한 뒤 성장배양배지를 첨가하여 배양하였다. 배양 24시간 후에 단일세포 만이 포함된 well만을 선택하여 배양하였다. 배양용기가 파종된 세포가 성장하여 군집이 이루어지면, 세포를 trypsin을 이용하여 용기로부터 때어낸 후 24-multiwell tissue culture plate로 옮겨 배양하였다. 세포가 80~90%의 밀도로 성장하였을 시 다시 6-multiwell tissue culture plate로 옮겨 증폭 배양시킨다. 이렇게 얻은 단일클론 심장전구세포는 평균적으로 69.8ㅁ5.6%의 클론형성 능력을 보여주었고 이 중 20개 이상의 클론을 선별하여 심근세포, 지방세포, 혈관내피세포로의 분화능력을 평가하였다.
2) 심근세포로의 분화능력
실시예 12의 2)에서 기술하였던 현가세포배양법을 이용하여 단일클론 기원 심장전구세포의 심근세포로의 분화능력을 규명하였다. 심장구를 형성한 후 8일간 심근분화 유도배지 (98.9% DMEM, 1% CS, 0.1% DMSO, 50μM ascorbic acid)를 첨가하여 분화를 유도하였다. 심근세포로의 분화유도 후에 심장구 형성여부로 심근세포로의 분화도를 평가하였다.
도 21의 사진에서 제시하듯이 단일클론 기원 심장전구세포는 심장구를 형성하며 심근세포-특이 단백질을 발현하여 심근세포로 분화할 수 있는 능력을 확인할 수 있었으며, 단일클론 기원 심장전구세포의 72%에서 심장구를 형성하여 심근세포로 분화할 수 있음을 확인할 수 있었다.
3) 지방세포로의 분화능력
단일클론 기원 심장전구세포의 지방세포로 분화능력을 평가하기 위해서 이십만 개의 세포를 24-multiwell tissue culture plate에 파종한 뒤 90% DMEM에 10% CS, 0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (Sigma), 80μM indomethacin (Sigma), 1μM dexamethasone (Sigma), 5 ㎍/ml insulin (Sigma)이 첨가된 배지에서 14일 동안 배양하였다. 단일클론 기원 심장전구세포의 지방세포로의 분화여부는 세포내 지방축적의 지표인 0.5% Oil Red O(Sigma)용액을 상온에서 1시간 염색하여 세포질 내 지방질의 축적여부로 판정하였다.
도 21에서 제시하듯이 모든 단일클론에서 기원한 심장전구세포는 지방세포로의 분화능력을 지닌 것을 확인할 수 있었다.
4) 혈관내피세포로의 분화능력
단일클론 기원 심장전구세포를 혈관내피세포로 분화시키기 위해서 이십만 개의 세포를 2.5 mg/ml 피브리노겐 및 0.5 U/ml 트롬빈로 구성된 300㎕ 피브린 하이드로젤위에 파종하였다. 혈관내피세포로의 분화는 98.5% DMEM, 1% CS, 0.5%DMSO, 10 ng/ml VEGF (R&D systems), 10 ng/ml EGF, 10 ng/ml bFGF로 구성된 혈관내피세포분화배지를 첨가하여 7일간 배양하였다. 파종 2시간 후에 모세혈관-유사 망상구조 형성여부 및 혈관내피세포 표지자의 발현여부로 판정하였다.
도 21에서 제시하듯이 모든 단일클론에서 기원한 심장전구세포는 모두 모세혈관 망상구조를 형성하였으며 혈관내피세포의 표지자인 CD31에도 양성인 반응을 보였다.
실시예 14. 체외증폭 배양한 심장전구세포의 분비특성
심장전구세포 혹은 근육줄기세포는 각각 백만 개를 100-mm 크기의 배양용기에 파종한 후 1% 우태아혈청이 포함된 DMEM을 첨가한 후 1일간 배양하였다. 배양 후 배양상층액을 수거하여 100 x g에서 원심분리한 후 세포배양액을 정제하였다. Antibody arrays membrane은 제공된 blocking buffer로 30분간 실온에서 blocking하였다. 이후 정제한 배양상층액은 array membrane과 4℃에서 16시간 동안 반응시킨 후 washing buffer로 3회 세척하였다. 이후 antibody array membrane은 biotin-conjugated antibody과 실온에서 1시간 반응시키고 washing buffer로 세척 후 horseradish peroxidase (HRP)-conjugated streptavidin을 실온에서 2시간 반응시켰다. 발색을 위하여 detection buffer를 적용하고 LAS3000 system을 통해 영상을 획득하였다. 심장전구세포와 근육줄기세포 간의 혈관생성인자들의 발현정도를 비교하기 위하여 signal intensity MultiGauge v2.2 프로그램을 통해 비교 분석하였다.
도 22은 human antibody array를 통해 분석한 인자들과 심장전구세포 혹은 근육줄기세포에서 분비되는 혈관생성인자들의 발현특성을 보여주는 도이다. 도 23은 심장전구세포와 근육줄기세포 간의 발현특성을 정량화하여 비교분석한 도이다. 본 실시예에서는 총 44개의 조직재생 관련 인자들을 분석하였으며, 심장전구세포는 근육줄기세포와 비교하여 다양한 인자들을 분비하였다. 특히 이들 인자들 중 leptin, insulin-like growth factor I (IGF-I), placenta growth factor (PIGF), epithelial neutrophil-activating peptide-78 (ENA-78), urokinase plasminogen activator receptor (uPAR), matrix metalloproteinase-1 (MMP-1), granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), interferon gamma (IFN-γ), interleukin-6 (IL-6), interleutin-8 (IL-8), interleutkin-1α (IL-1α), epidermal growth factor (GM-CSF), growth-regulated protein (GRO)은 근육유래줄기세포에 비해 심장전구세포에서 2배 이상의 높게 분비하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 15. 체외증폭 배양한 심장전구세포의 혈관재생 능력
심장전구세포의 생체 내 혈관유도능력을 규명하기 위하여 마우스 허혈성 하지모델을 채택하였다. 9~10주령의 수컷 BALB/c 마우스의 대퇴동맥을 결찰하고 다음 날 CM-DiI이 표지된 이백만개의 심장전구세포를 하지근육 내로 주입하였다. 주입한 심장전구세포에 의한 혈관유도능력은 laser doppler를 이용하여 발바닥의 미세혈류속도를 측정하여 판정하였다. 하지근육의 허혈성 손상은 헤마톡실린-에오신 염색을 통하여 평가하였다. 또한 하지근육 내 미세혈관밀도는 혈관내피세포 표지자인 CD34를 이용해 면역형광염색을 실시하였으며, 단위 면적당 미세혈관밀도를 정량화하였다.
도 24는 허혈성 사지경색 마우스의 하지근육 조직사진으로, 심장전구세포를 주입하지 않은 마우스(w/o CPCs)의 경우 사지근육의 괴사가 두드러지게 증가하였으나(왼쪽), 심장전구세포를 주입한 마우스의 하지근육(w/CPCs)은 허혈성 손상이 감소하였으며, 재생되는 골격근이 증가하는 것을 확인할 수 있었다(오른쪽). 도 25은 허혈성 하지근육 내 CD34 양성 미세혈관밀도를 나타내는 도이다. 심장전구세포를 주입한 사지경색 근육(오른쪽)에서 CD34 양성 미세혈관이 주입하지 않은 사지경색 근육(왼쪽)과 비교하여 증가된 것을 확인할 수 있었다. CD34 양성 미세혈관의 밀도는 심장전구세포를 주입한 그룹에서 생성된 혈관의 수가 2배 이상 증가되었음을 알 수 있었다(*, p < 0.01). 도 26은 대퇴동맥 결찰 후 하루째는 발바닥의 미세혈류속도는 심장전구세포 주입여부와 관계없이 차이를 보이지 않았다. 그러나 세포 주입 5일 및 11일에 측정한 미세혈류속도는 심장전구세포를 주입한 마우스에서 유의하게 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 도 27은 주입한 심장전구세포의 생체 내 역할을 규명하기 위하여 2백만 개의 심장전구세포를 CM-DiI으로 라벨링한 후 하지경색 마우스 내로 주입하였으며, 주입한 심장전구세포의 분화특성을 추적한 도이다. 주입한 심장전구세포가 미세혈관을 도포하고 있는 CD34 양성 혈관내피세포로 분화하는 것을 나타내고 있다. CM-DiI의 신호가 CD34의 신호와 일치하였으므로 허혈성 하지모델에 주입한 심장전구세포의 대부분이 혈관내피세포로 분화되었음을 관찰할 수 있었다.
실시예 16. 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤을 이용한 심장전구세포의 심장 내 전달 방법
심근 내 이식전 심장전구세포는 CM-DiI으로 표지하였다. Sprague-Dawley 쥐의 좌측하방 관상동맥을 결찰하여 급성심근 경색을 유도하였다. CM-DiI로 표지한 이백만개의 인간 심장전구세포는 5 mg/ml 피브리노겐 용액과 혼합한 후 동량의 1 unit/ml 트롬빈 용액과 혼합하였다. 이후 혼합액은 1 ml 실린지를 이용하여 심근 내로 주입하였으며, 심근 내 주입되자 바로 젤이 형성되도록 하였다. CM-DiI으로 표기된 인간 심장전구세포는 생리식염수에 현탁한 후 주입한 쥐를 대조군으로 사용하였다. 주입된 인간 심장전구세포의 심근 내 전달효과를 평가하기 위하여 세포주입 1일 후 심장을 적출하였으며, 적출한 심장은 3 mm 두께로 절단한 후 형광스케너(Typhoon, Amersham, UK)로 CM-DiI 시그널을 측정하였다. Image J 프로그램을 이용하여 심근 내 주입한 세포에서 방출되는 시그널의 면적을 산정하였다.
도 28에서 나타난 바와 같이, 인간 심장전구세포(CPCs)만을 주입한 쥐에서는 심근 내 세포가 차지하는 면적은 5% 미만이었으나, 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤을 통하여 전달한 심장전구세포(CPCs+H)의 경우는 심근면적 10% 이상에서 분포하고 있는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 17. 심장전구세포의 심근재생 능력
급성심근경색 모델은 실시예 16과 같이 Sprague Dawley 쥐의 좌측 하방 관상동맥을 결찰하여 유도하였다. 결찰된 관상동맥 하부로 심근의 부종과 괴사를 확인한 후 심근 내로 2백만 개의 인간 심장전구세포를 생리식염수에 현탁한 후 주입한 군과 하이드로젤과 혼합하여 주입한 군으로 나누어 진행하였다(실시예 17 참조). 인간 심장전구세포에 대한 면역거부반응을 제어하기 위하여 매일 면역억제제(100 mg/kg, cyclosporin)을 주사하였다. 인간 심장전구세포 주입 2주 후 심장을 적출하였고, 파라핀 블록을 제조하였다. 이후 파라핀 절편을 취하여 콜라겐 염색을 시행하였으며, Image J 프로그램을 이용하여 좌측 심방의 두께를 산정하였으며, 섬유화된 심근 면적을 계산하였다. 심장 내 미세혈관의 밀도를 산정하기 위하여 SMA 항체를 이용하여 면역형광염색을 시행하였다. 심근 내 주입한 심장전구세포의 조직재생 및 분화특성을 규명하기 위하여 이중 면역형광염색을 시행하였다. 인간세포에만 반응하는 항-인간미토콘드리아항체(anti-human mitochondria antigen, HMA)을 이용하여 심근 내 주입한 인간 심장전구세포를 표지하였다. 심근세포로의 분화는 troponin I(TNI), 평활근세포로의 분화는 SMA, 혈관내피세포로의 분화는 isolectin B4(Isolectin)을 이용하여 표지하였다. HMA는 Alexa Fluor-594-conjugated 이차항체로 시그널을 검출하였으며, TNI, SMA, 혹은 Isolectin은 Alexa Fluor-488-conjugated 이차항체로 시그널을 검출하였다. .
도 29에서 나타난 바와같이, 심장전구세포를 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤을 이용하여 주입한 쥐(CPCs+H)에서 생리적 식염수만 주입한 쥐(Control) 및 심장전구세포를 생리적 심염수로 현탁한 후 주입한 쥐(CPCs)과 비교하여 심근 손상이 유의하게 감소되었으며, 심근재생은 유의하게 증가되었다. 좌심방 벽두께(LV thickness)는 하이드로젤을 통하여 심장전구세포가 이식한 쥐에서 가장 두꺼웠다. 반면 생리식염수 혹은 심장전구세포 만을 주입한 쥐에서 좌심방 벽의 두께는 감소하였으며, 좌심방은 확장되어 있었다. 또한 심근경색 후 섬유화 정도(Fibrotic area)는 항섬유소용해제가 도입된 창상기질 하이드로젤과 함께 심장전구세포를 주입한 심장에서 유의하게 감소되었다.
도 30에서 나타난 바와 같이, 심장전구세포(CSCs)가 주입된 심근 내 미세혈관밀도는 생리적 식염수(Control) 만을 주입한 심장에서 가장 낮았으며, 반면 심장전구세포를 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤을 통하여 주입한 심장(CSCs+H)에서 가장 높았다.
도 32에서 나타난 바와같이, 인간 심장전구세포는 HMA(빨간색)에 의하여 검출되었으며, 이들 인간 심장전구세포는 심근세포에 특징적으로 발현되는 TNI가 동시에 발현되는 것을 확인하여 심근세포로 분화하는 것을 확인할 수 있었다. 또한,HMA(빨강)로 표기된 인간 심장전구세포는 혈관벽을 구성하는 SMA 양성(초록) 평활근세포와 동일한 위치에 존재하여, 주입한 인간 심장전구세포가 혈관 평활근세포로 분화하는 것을 확인할 수 있었다. 그리고, 도 33에서 나타난 바와 같이, HMA 양성(빨강)인 인간 심장전구세포는 심근 내에서 관상구조를 뛰며 동시에 혈관내피세포 표지자인 Isolectin(초록)을 동시에 발현하는 것을 확인할 수 있었으며, 이는 주입한 인간 심장전구세포가 혈관내피세포로 분화하여 혈관을 형성하는 것을 확인할 수 있었다.

Claims (20)

  1. 심근절편을 하이드로젤 내에 함입시켜 배양하는 단계; 및 하이드로젤만을 분해하여 심근절편으로부터 하이드로젤 내로 이동, 성장한 심장전구세포를 회수하는 단계;를 포함하는 심근 유래 심장전구세포의 배양방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 심근 유래 심장전구세포는 (i) 네스틴 (nestin) 및 Sca-1으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 심장전구세포 표지자 군에 양성인 면역학적 특성; (ii) GATA-4, Nkx-2.5 및 Mef-2c로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 심근세포-특이 전사인자 표지자 군에 양성인 면역학적 특성; (iii) CD29, CD44, CD73, CD90 및 CD105로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중간엽줄기세포 표지자 군에 양성인 면역학적 특성; (iv) CD140b, CD146, 및 SMA로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 혈관주위세포 표지자 군에 양성인 면역학적 특성; (v) Lin, CD34 및 CD45로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 조혈계 세포 표지자 군에 음성인 면역학적 특성; (vi) CD31 및 CD34으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 혈관내피세포 표지자 군에 음성인 면역학적 특성; 및 (vii) α-SA(α-sarcometric actinin), MHC(myosin heavy chain), TnI(troponin I) 및 TnT(troponin T)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 심근세포 표지자 군에 음성인 면역학적 특성;으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 면역학적 특성을 지니는, 심근 유래 심장전구세포의 배양방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 하이드로젤은 천연고분자로 제조된, 심근 유래 심장전구세포의 배양방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 하이드로젤은 항섬유소용해제가 포함된, 심근 유래 심장전구세포의 배양방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 항섬유소용해제는, 아미노카프로이드산(aminocaproid acid), 트란이그제믹산(tranexamic acid), 아프로티닌(aprotinin) 및 아미노메틸벤조익산(aminomethylbenzoic acid)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 심근 유래 심장전구세포의 배양방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 하이드로젤 1 ml에 대하여 항섬유소용해제 10 내지 1000㎍을 포함하는, 심근 유래 심장전구세포의 배양방법.
  7. 제1에 있어서, 상기 하이드로젤은 피브린 하이드로젤이며, 상기 하이드로젤은 0.8 내지 5.0 mg/ml 피브리노겐을 포함하는, 심근 유래 심장전구세포의 배양방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 하이드로젤의 분해는 콜라지나아제, 젤라티나아제, 유로키나아제, 스트렙토키나아제, TPA(tissue plasminogen activator), 플라즈민(plasmin) 및 히알루로니다아제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 효소를 통하여 분해되는, 심근 유래 심장전구세포의 배양방법.
  9. 제1항에 있어서,
    1) 아미노카프로이드산(aminocaproid acid) 및 트란이그제믹산(tranexamic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 항섬유소용해제가 포함된 피브린 하이드로젤 내에 심근절편을 함입시키는 제 1단계;
    2) 성장배양액을 첨가하여 5 내지 30 rpm 속도의 셰이커에서 3차원 장기배양(organ culture)하는 제 2단계;
    3) 유로키나아제, 스트렙토키나아제 및 플라즈민으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 분해효소를 처리하여 피브린 하이드로젤만을 분해함으로, 심근절편으로부터 하이드로젤 내로 이동, 성장한 심근 유래 심장전구세포 및 심근절편을 회수하는 제 3단계; 및
    4) 하이드로젤로부터 회수한 심장전구세포는 단층배양법으로 증폭하는 제 4단계;를 포함하는 심근 유래 심장전구세포의 배양방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 제 3단계에서 회수된 심근절편을 다시 제 1단계의 하이드로젤 내에 함입시켜 배양하는, 심근 유래 심장전구세포의 배양방법.
  11. 제1항 내지 제 10항 중 어느 한 항의 배양방법에 의해 배양된 심근 유래 심장전구세포이며,
    상기 심장전구세포는 (i) 네스틴 (nestin) 및 Sca-1으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 심장전구세포 표지자 군에 양성인 면역학적 특성; (ii) GATA-4, Nkx-2.5 및 Mef-2c로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 심근세포-특이 전사인자 표지자 군에 양성인 면역학적 특성; (iii) CD29, CD44, CD73, CD90 및 CD105로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중간엽줄기세포 표지자 군에 양성인 면역학적 특성; (iv) CD140b, CD146, 및 SMA로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 혈관주위세포 표지자 군에 양성인 면역학적 특성; (v) Lin, CD34 및 CD45로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 조혈계 세포 표지자 군에 음성인 면역학적 특성; (vi) CD31 및 CD34으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 혈관내피세포 표지자 군에 음성인 면역학적 특성; 및 (vii) α-SA (α-sarcometric actinin), MHC (myosin heavy chain), TnI (troponin I) 및 TnT (troponin T)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 심근세포 표지자 군에 음성인 면역학적 특성;으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 면역학적 특성을 지니는 심근 유래 심장전구세포.
  12. 제11항에 있어서, 상기 심장전구세포는 심근세포, 조골세포, 지방세포, 연골세포, 혈관내피세포, 평활근세포, 신경세포 또는 골격근세포로의 분화력을 지닌, 심근 유래 심장전구세포.
  13. 제11항 또는 제12항의 심장전구세포를 현가세포배양법 (suspension cell culture)을 통하여 배양하는 단계;를 포함하는 심근 유래 심장전구세포의 심근세포로의 분화방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 심장전구세포는 자발적으로 심근세포로 분화할 수 있는, 심근 유래 심장전구세포의 심근세포로의 분화방법.
  15. 제11항 또는 제12항의 심장전구세포 또는 이의 분화된 세포를 유효성분으로 포함하는 세포치료제.
  16. 제15항에 있어서, 상기 세포치료제는 심근세포, 조골세포, 지방세포, 연골세포, 혈관내피세포, 평활근세포, 신경세포 및 골격근세포로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 세포의 치료제인, 세포치료제.
  17. 제15항에 있어서, 상기 심장전구세포는 항섬유소용해제가 포함된 하이드로젤과 혼합된, 세포치료제.
  18. 제15항에 있어서, 상기 세포치료제는 항염증제제, 줄기세포 동원인자 및 혈관성장 유도인자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 더 포함하는, 세포치료제.
  19. 제11항 또는 제12항의 심장전구세포 또는 이의 분화된 세포를 유효성분으로 포함하며, 상기 심장전구세포는 항섬유소용해제가 포함된 하이드로젤과 혼합되어 있는 심장질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 심장질환은 심경경색증, 허혈성 심근질환, 일차성 심근질환, 이차성 심근질환 또는 울혈성 심부전증인, 심장질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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