KR20220080145A - 연골원성 인간 중간엽 줄기 세포 (msc) 시트 - Google Patents

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KR20220080145A
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테루오 오카노
경숙 김
할리 소프
데이빗 더블유. 그레인저
트래비스 마아크
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유니버시티 오브 유타 리서치 파운데이션
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Abstract

본 발명은 적어도 2층의 밀집 증식된 (confluent) 연골형성 분화 세포를 포함하는 연골원성 세포 시트로서, 상기 세포 시트가 중간엽 줄기 세포 (MSC)로부터 제조되고, 상기 세포 시트의 기저면 상의 연골형성 분화 세포들이 부착 분자를 발현하는 것인, 상기 연골원성 세포 시트에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 a) MSC를 밀집 증식할 때까지 온도 반응성 배양기에서 배양하여 세포 시트를 형성하는 단계; b) 온도를 감소시켜 상기 세포 시트를 분리하고 상기 세포 시트를 수축시켜, 수축된 세포 시트를 형성하는 단계; c) 상기 수축된 세포 시트를 배양 표면과 접촉시키는 단계; 및 d) 상기 배양 표면의 수축된 세포 시트를 연골형성 배지로 처리하고 배양하여 연골원성 세포 시트를 형성하는 단계를 포함하는, 연골원성 세포 시트를 제조하는 방법에 관한 것이다. 연골 조직을 복구하거나 관절 질환을 치료하기 위해 연골원성 세포 시트를 사용하는 방법들도 개시되어 있다.

Description

연골원성 인간 중간엽 줄기 세포 (MSC) 시트
관련 출원
본 출원은 2019년 10월 7일에 출원된 미국 가출원 62/911,441호에 대한 우선권을 주장하며, 이의 전문은 본원에 참고로 포함된다.
기술분야
본 발명은 연골원성 인간 중간엽 줄기 세포 (MSC) 시트에 관한 것이다.
퇴행성 관절 질환, 예컨대 골관절염(OA)은 갈수록 전 세계 인구의 이환율의 원인이 되고 있어 삶의 질을 저하시키고 있다. OA는 아직 잘 밝혀지지 않는 전신성 질병으로, 일단 퇴행이 시작되면 성공적으로 치료하기가 어렵다. 흔히 무릎 관절에 대한 외상성 손상은, 관절 연골의 국소적 결함을 유발할 수 있으며, 이러한 관절 연골의 국소적 결함은 OA 사례들 중 12% 이상을 차지한다. 관절 연골은 직접적인 혈액 공급이 결핍되면 자발적으로 복구할 수 있는 능력이 최소화되기 때문에, 연골 손상은 개입하지 않고는 거의 치유될 수 없다. 건강한 관절 연골은 유리질 구조를 나타내며, 국소 결함 치료의 목적은 손상 부위에서 유리질 유사 표현형으로의 연골 재생을 촉진하는 것이다. 골수 자극 기술, 예컨대 미세골절술은 임상 실습에서 가장 흔히 사용되는 방법이지만; 생성된 혼합 섬유연골 조직은 천연 유리질 연골보다 좋지 않아 연골의 기능성을 저하시킨다. OA를 적절하게 치료하여 이러한 전신적 쇠약성 질환의 발병률을 감소시키기 위해서는, 관절 연골 국소 결함이 OA로 진행되기 전에 상기 해당 부위에서 유리질 연골을 재생시키는 개선된 치료 옵션이 개발되어야 한다.
관절 연골 국소 결함 치료의 결과를 개선하기 위한 시도로, 자가유래의 연골세포 이식이 개발되었다. 이러한 접근 방식들은 해당 환자가 기증자이자 수혜자인 자가 유래의 세포 조달에 의존하기 때문에, 여러 차례의 수술, 기증자 의존적인 세포 품질, 세포 증식 및 제조 시간의 증가로 환자의 부담이 가중된다. 게다가, 이러한 치료법들은 세포 현탁액 또는 씨딩된 스캐폴드를 사용하여 세포를 전달하는데, 이는 표적 조직 부위에 대한 위치선정과 세포 기능의 유지에 있어 좋지 않다. 조직 공학의 진전에 따라 유망한 성과들이 있었음에도 불구하고, 긴 세포 증식 기간 (대규모 생산, 규격 제품), 세포 전달 시스템 (낮은 이식 효율) 등의 여러가지 한계점들은 여전히 해결되지 않은 상태이다.
연골세포의 조달을 자가 유래에서 "규격 제품"의 동종이계 세포 공급원으로 전환하려는 노력이 계속되고 있다. 동종이계 세포 공급원으로서 중간엽 줄기 세포 (MSC)는, 익히 알려진 재생 특성과 면역조절 특성 뿐만 아니라, 특정 표현형을 가진 세포를 제조하기 위한 표준물을 제공한다. 연골원성 계통을 포함하는 MSC 다능성은 3D 구조체, 통상적으로 펠릿 배양물 내에서 연골세포 표현형으로의 시험관내 유도형 분화를 가능하게 한다. MSC의 시험관내 연골형성 세포 분화는 잘 알려져 있으나; 생체 내에서 이식되는 세포의 경우, 이러한 세포들은 효소적으로 분해되어 세포 현탁액으로 전달되거나 스캐폴드 재료에 씨딩된다. 이식 후에 세포의 연골세포 형성 잠재력은 거의 발휘되지 않는데, 그 이유는 세포 환경이 효소적 세포 수확 동안에 그리고 스캐폴드 구조체와 상호작용하는 동안에 변화되기 때문이며, 그런 까닭에 연골 국소 결함 치유를 위한 MSC 적용은 진료소로 가보기도 전에 실패하게 되는 것이다. 연골 재생을 위해 MSC를 사용하는 것이 여러가지 장점들이 있기는 하지만, 분화 잠재력을 보유하여 구조적 또는 연골형성 특성을 저해하지 않으면서 시험관내 분화형 유리질 연골의 이식을 가능케 하는 구조체를 제조하는 방법은 아직 전무하다. MSC 세포 요법의 이식에 대한 주요 장애물들 중 하나는 투여된 세포들을 확실하게 이식하여 국소 편재화를 유지하는 능력이다. 따라서, 숙주 조직에 성공적으로 이식될 수 있는 유리질 유사 특성을 갖는 연골원성 세포 시트의 개발이 필요한 실정이다.
특정 양태에서, 본 발명은 적어도 2층의 밀집 증식된 (confluent) 연골형성 분화 세포를 포함하는 연골원성 세포 시트로서, 상기 세포 시트가 중간엽 줄기 세포 (MSC)로부터 제조되고, 상기 세포 시트의 기저면 상의 연골형성 분화 세포들이 하나 이상의 부착 분자를 발현하는 것인, 상기 연골원성 세포 시트에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 상기 MSC는 인간 골수 MSC (hBM-MSC)이다. 특정 실시형태에서, 상기 세포 시트는 필수적으로 연골형성 분화 세포로 이루어진다. 특정 실시형태에서, 상기 세포 시트 중 세포의 적어도 50%는 연골형성 분화 세포이다. 특정 실시형태에서, 상기 세포 시트는 세포외 기질을 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 세포외 기질은 II형 콜라겐 및 황산화 프로테오글리칸으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 연골형성 분화 세포는 SOX9, 아그레칸, COL2A1, ACAN, COMP 및 BMP2로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 발현한다. 특정 실시형태에서, 상기 세포 시트는 골소강 (lacunae) 구조를 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 하나 이상의 부착 분자는 피브로넥틴 및 라미닌으로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 상기 세포 시트는 연골 표면에 이식된 후 연골 표면에 대해 물리적으로 부착된다.
특정 양태에서, 본 발명은 a) 중간엽 줄기 세포 (MSC)를 밀집 증식할 때까지 온도 반응성 배양기에서 배양하여 세포 시트를 형성하는 단계; b) 온도를 감소시켜 상기 세포 시트를 분리하고 상기 세포 시트를 수축시켜, 수축된 세포 시트를 형성하는 단계; c) 상기 수축된 세포 시트를 배양 표면과 접촉시키는 단계; 및 d) 상기 배양 표면의 수축된 세포 시트를 연골형성 배지로 처리하고 배양하여 연골원성 세포 시트를 형성하는 단계를 포함하는, 연골원성 세포 시트를 제조하는 방법에 관한 것이다.
특정 실시형태에서, 상기 수축된 세포 시트는 적어도 3주간 배양 표면에서 성장시킨다. 특정 실시형태에서, 상기 연골형성 배지는 형질전환 성장 인자 베타 (TGFβ) 및 뼈형성 단백질 (BMP)로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 포함한다. 특정 실시형태에서, 단계 b)의 세포 시트는 해당 세포 시트를 하나 이상의 효소로 처리하지 않고 온도 반응성 배양기로부터 분리한다.
특정 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 연골원성 세포 시트에 관한 것이다.
특정 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 연골원성 세포 시트를 대상체의 조직에 적용하는 단계를 포함하는, 상기 연골원성 세포 시트의 이식을 필요로 하는 대상체에게 상기 연골원성 세포 시트를 이식하는 방법에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 상기 조직은 연골과 뼈로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 상기 연골은 관절 연골이다.
특정 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 연골원성 세포 시트를 대상체의 연골에 적용함으로써, 대상체의 연골 조직을 복구하는 단계를 포함하는, 연골 조직의 복구를 필요로 하는 대상체의 연골 조직을 복구하는 방법에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 상기 연골은 관절 연골이다. 특정 실시형태에서, 상기 대상체는 국소 연골 결함이 있다.
특정 실시형태에서, 상기 대상체는 증상을 보이는 연골 결함이 있다. 특정 실시형태에서, 상기 증상을 보이는 연골 결함은 급성 또는 반복적 외상에 의해 유발된다. 특정 실시형태에서, 상기 대상체는 퇴행성 관절 질환이 있다.
특정 양태에서, 본 발명은 관절 질환의 치료 또는 예방이 필요한 대상체에서 관절 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 본원에 기재된 바와 같은 연골원성 세포 시트를 대상체의 관절에 적용하여 대상체의 관절 질환을 치료 또는 예방하는 단계를 포함하는 것인, 방법에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 상기 관절은 활막성 관절 및 연골 관절로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 상기 활막성 관절은 무릎 관절, 손목 관절, 어깨 관절, 고관절, 팔꿈치 관절, 또는 목 관절이다. 특정 실시형태에서, 상기 관절 질환은 퇴행성 관절 질환이다. 특정 실시형태에서, 상기 관절 질환은 관절 염증, 골관절염, 류마티스 관절염 및 슬개골 연골연화증으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 양태에서, 본 발명은 급성 또는 반복적 외상으로 유발된, 증상을 보이는 연골 결함이 있는 대상체의 골관절염을 예방하는 방법으로서, 본원에 기재된 연골원성 세포 시트를 상기 결함이 있는 연골에 적용하여 상기 대상체의 골관절염을 예방하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 상기 대상체는 인간이다. 특정 실시형태에서, 상기 세포 시트의 연골형성 분화 세포는 대상체에 대해 동종이계성이다. 특정 실시형태에서, 상기 세포 시트의 연골형성 분화 세포는 대상체에 대해 자가 유래성이다.
도 1A-1F는 세포 시트 수축이 구조적 재배열을 촉진한다는 것을 나타낸 것이다. 35 mm 배양 접시의 비수축 (A) 및 수축 세포 시트 (B)의 육안으로 본 대표적인 전체 세포 시트 이미지. 세포 시트 가장자리는 오렌지색 점선으로 표시함. 기준자 = 5 mm. 비수축 (C) 및 수축 (D) 세포 시트에 대한 H&E의 대표적인 단면 조직학. 비수축 시트와 비교한, 수축된 세포 시트의 직경 (E)과 두께 (F). 오차 막대는 평균 ± SD를 의미함 (n = 4: *p<0.05, **p<0.01).
도 2A-2I는 3주차에 hBM-MSC의 분화 가능성을 나타낸 것이다. 대조군 배지 (A-C) 및 연골형성 배지 (D-F)에서 펠릿의 조직학적 단면의 대표적인 이미지. 염색은 산성 뮤신의 경우 알시안 블루 (Alcian blue) (A, D), 황산화 프로테오글리칸의 경우 사프라닌 (Safranin)-O/패스트 그린 (Fast green) (B, E), II형 콜라겐 (유사 적색)의 경우 DAPI (청색)(C, F)으로 수행하였다. 기준자 200 ㎛. Sox9 (G), II형 콜라겐 (H) 및 아그레칸 (I)의 경우, RT-PCR을 사용한 연골형성 유전자 발현 (G-I). 모든 유전자 발현은 GAPDH로 정규화하여 대조군 샘플과 비교하였다. 오차 막대는 평균 ± SD를 의미함 (n = 4: *p<0.05, **p<0.01).
도 3은 조직학, IHC 및 RT-PCR로 표시한, 3주차의 hBM-MSC 단층, 수축 시트 및 펠릿의 연골형성 세포 분화를 나타낸 것이다. (기준자 = 200 ㎛, *p<0.05, **p<0.01).
도 4는 건강한 관절 연골: 유리질 연골 표현형을 나타낸 것이다. 연골 국소 결함 치료의 목적은 생체 내에서 유리질 유사 조직을 대체하거나 재생시키는 것이다. 문헌 [Castagnola, P. et al. JCB (1986)]; [Moore, D. et al. Ortho B. (2019)]; 및 [Akkiraju, H. et al. J Dev Biol. (2016)]을 참조한다.
도 5는 세포 전달 방법으로서 세포 시트를 나타낸 것이다. 세포 전달 방법 (현탁액, 스캐폴드, 펠릿)의 제약으로는 세포의 열악한 보유성 및 천연 연골 조직과의 열악한 상호작용을 들 수 있다. 연골형성 세포 분화를 위한 현재의 수단은 시험관 내에서 유리질 유사 연골 표현형으로의 완전한 분화는 달성하지 못하지만, 표적 조직 부위에 직접 이식은 가능하다.
도 6은 MSC 세포 시트의 장점을 나타낸 것이다. MSC를 가지고 세포 시트 기술을 사용하면, 연골형성 배지를 사용하여 시험관내 배양하는 동안 유리질 유사 표현형으로 분화할 수 있게 해주는 스캐폴드 완전 무함유 3D 구조체와, 구조적 특성이나 유리질 유사 표현형을 저해하지 않으면서 해당 표적 조직 부위에 직접 이식할 수 있는 연골형성 구조체를 만드는 것이 가능하다.
도 7은 세포 시트의 연골형성 세포 분화를 나타낸 것이다. hBM-MSC는 비수축된 시트로서가 아닌, 수축된 시트로서 유리질 유사 연골형성 잠재력을 나타낸다.
도 8은 층상 구조에 따른 세포 시트 두께의 조절을 나타낸 것이다. 수축 이외에도, 층상 구조를 통해 세포 시트 구조체의 두께와 3차원성을 조절할 수 있다.
도 9는 인간 골수 유래의 중간엽 줄기 세포 (hBM-MSC) 시트의 이식가능한, 스캐폴드 무함유의 3D 유리질 유사 연골 조직의 시험관 내 유전자 조작을 나타낸 것이다. 상기 접근 방식은, 세포 시트 조직 공학을 사용하여 온도 반응성 배양 접시 (TRCD)에서 자발적인 분리 후 세포 시트 수축을 통해 스캐폴드가 없는 3D MSC 세포 구조체를 제조한다. 이 기술은 3D 수축 시트를 세포 배양 삽입체에 재도말하여 3주간 연골형성 배지로 유도함으로써 유리질 유사 연골 표현형으로의 시험관 내 분화를 가능하게 한다. 분화 후 표적 조직에 시트를 직접 이식하는 것은 시트 구조체의 구조나 연골형성 특성을 손상시키지 않고도 가능하다.
도 10A-10F는 세포 시트 수축이 2D 세포 배양에 비해서 세포골격 재배열과 연골형성유발 신호전달을 촉진한다는 것을 보여주고 있다. 세포골격의 팔로이딘/F-액틴 (녹색) 염색과 DAPI (청색) 핵 염색을 사용한, 0일째의 연골형성 유도 전에 전체 접시 (하향식) (a) 2D 배양 및 (b) 3D 수축 시트에 대한 대표적인 공초점 이미지. (c) 세포골격 구조 마커인 β-액틴, (d) 세포-세포 마커인 β-카테닌, 및 연골형성 ECM 마커인 (e) BMP2와 (f) COMP에 대한 정량적 실시간 PCR 유전자 발현. 모든 유전자 발현은 GAPDH로 정규화하여 2D 세포 배양 0일째의 대조군 샘플과 비교하였다. 오차 막대는 평균 ± SD를 의미함 (n = 4) (*p<0.05, **p<0.01).
도 11A-11T는 세포 시트 수축이 hBM-MSC의 연골형성 세포 분화의 향상을 자극함을 나타낸 것이다. 분리 후 시트 수축 전 (2D 배양)과 후 (3D 세포 시트)의 연골형성 유도된 hBM-MSC 시트간 비교. 3주 (a-f) 대조군 배지 및 (g-l) 연골형성 배지에서 hBM-MSC 구조체의 조직학적 단면에 대한 대표적인 이미지. 염색은 (a,b,g,h) 황산화 프로테오글리칸의 경우 사프라닌-O/패스트 그린, (c,d,i,j) II형 콜라겐 (유사 적색)의 경우 DAPI (청색), (e,f,k,l) I형 콜라겐 (적색)의 경우 DAPI (청색)으로 하였다. 세포골격의 팔로이딘/F-액틴 (녹색) 염색과 DAPI (청색) 핵 염색을 사용한, 3주간의 연골형성 유도된 (m) 2D 배양 및 (n) 3D 세포 시트에 대한 전체 접시 (하향식)의 대표적인 공초점 이미지. 0일째 (회색 막대) 및 3주차 (검은색 막대) 분화에서 2D 배양과 3D 세포 시트에 있어서의 세포 시트의 (o) 두께 및 (p) 선형 핵 밀도. (q) SOX9, (r) 아그레칸 및 (s) II형 콜라겐에 대한 정량적 실시간 PCR을 이용한 연골형성 유전자 발현. (t) 상대적 유전자 발현의 비율로서 나타낸 I형에 대한 II형 콜라겐의 비율. 모든 유전자 발현은 GAPDH로 정규화하여 2D 배양 3주 대조군 샘플과 비교하였다. 오차 막대는 평균 ± SD (n = 4)를 의미함 (ns: p≥0.05, *p<0.05, **p<0.01).
도 12A-12U는 표준 펠릿 배양물과 비교한 3D hBM-MSC 세포 시트에 있어서 시간 경과에 따른 연골형성 세포 분화의 진행을 나타낸 것이다. (a-h) 황산화 프로테오글리칸의 경우 사프라닌-O/패스트 그린, 및 (i-p) MMP13 (녹색)의 경우 DAPI (청색)로 염색한, 0일 내지 3주간 연골형성 배지에서 (a-d, i-l) 펠릿 및 (e-h, m-p) 3D 세포 시트에 대한 조직학적 단면의 대표적인 이미지. DAPI (청색)를 사용하여 (q) II형 콜라겐 (유사 적색) 및 (r) I형 콜라겐 (적색)에 대해 염색한, 연골형성 배지에서 3주차의 펠릿 및 3D 세포 시트의 조직학적 단면의 대표적인 이미지. (s) 연골형성 유전자 발현: SOX9, II형 콜라겐 및 아그레칸; (t) 비대성 및 섬유연골 유전자 발현: X형 콜라겐 및 MMP13; (u) 세포-세포 상호작용 발현: β-카테닌에 대한 펠릿 (청색 점선) 및 3D 세포 시트 (검정색 실선)의 정량적 실시간 PCR. 모든 유전자 발현은 GAPDH로 정규화하여 단일 세포 0일째의 대조군 샘플과 비교하였다. 오차 막대는 평균 ± SD를 의미함 (n = 4). (*p<0.05, **p<0.01).
도 13A-13F는 FBS 코팅된 표면으로 분화 후 3D 수축된 hBM-MSC 세포 시트와 펠릿 배양물에 대한 조작과 2차 부착 능력을 나타낸 것이다. FBS 코팅 표면으로 (a) 옮기기 전과 (b) 옮긴 후 3일째에 3주 분화된 3D 시트의 사프라닌-O로 염색된 조직학적 단면의 대표적인 이미지. (c) 옮긴 후 0-72시간째에 시트 가장자리에 대한 대표적인 위상차 이미지. 오렌지색 점선으로 나타낸 세포 시트 가장자리로부터의 세포 이동. (d) 2차 FBS 코팅된 배양 접시에 1시간 부착 및 6시간 연속 배양 후, 3주 분화된 펠릿과 3D 세포 시트의 부착 효능 (n = 6). 구조체 부착 = ((부착된 구조체의 수) / (이동 시도한 구조체의 수)) *100. DAPI 핵 염색한 부착 분자인 라미닌의 발현과 국소 편재화에 대한 3주 분화된 (e) 수축 시트 및 (f) 펠릿 배양물의 대표적인 IHC 단면 이미지. 노란색 점선으로 나타낸 부착 표면 ((e) 세포 시트의 기저면 및 (f) 펠릿 배양물 주변).
도 14A-14D는 신선한 생체외 인간 연골 조각으로의 분화 후 3D 수축된 hBM-MSC 세포 시트에 대한 이식 특성을 나타낸 것이다. (a) 35 mm 배양 접시에서 3주 분화 후 세포 시트. (b) 생체 외 인간 관절 연골 샘플에 이식된 형태. 오렌지색 점선으로 나타낸 이동된 세포 시트 사분면. DAPI로 대비 염색한 (c) 사프라닌-O/패스트-그린 및 (d) 세포 부착 분자인 라미닌에 대한, 신선한 생체 외 인간 관절 연골 (hAC)에 자연적으로 부착된 3주의 연골형성 3D hBM-MSC 시트 (CS)의 대표적인 단면 조직 및 IHC 염색.
도 15A-15F는 생체내 연골형성 분화 세포 시트의 이식 능력을 나타낸 것이다. 누드 (RNU) 랫트 뒷다리 활차구에서의 2 mm 국소 결함 (A)과 이식된 3주의, 연골세포를 형성하도록 분화된 유리질 유사 인간 MSC 유래 세포 시트 (B)를 육안으로 본 이미지. 세포 시트는 결함이 생기는 시점에 이식하였다. 이식 2주 후, 무릎 관절을 수거하여 (C) 세포 시트 이식 능력을 평가하였다. 이식 후 2주째에 랫트 국소 결함에 있어서 3주의 분화된 인간 세포 시트에 대한, 사프라닌-O (D), 헤마톡실린 & 에오신 (E) 및 인간 특이적 비멘틴 면역조직화학 염색 (F)을 사용한 대표적인 단면 조직학적 분석. 양성 사프라닌-O 염색 (적색)은 이식 부위 (D)에서 세포 시트의 양성 유리질 유사 특성이 유지되고 있음을 보여주고 있다. H&E 염색은 숙주 조직 (E)과 통합되었음을 나타내고 있다. 세포 시트 내 이식된 인간 세포는 인간 특이적 비멘틴에 대해 양성인데, 이는 이식 부위 (F)에 생착되어 유지되고 있음을 의미한다. 기준자 = 200 mm.
본 발명은 온도 반응성 배양기 상의 세포 시트로서 중간엽 줄기 세포의 제조에 대해서 설명하고 있으며, 시험관 내에서 유리질 유사 연골 표현형으로 분화하는 세포 시트의 능력을 입증하고 있다. 또한, 본 발명은 해당 구조체의 구조적 또는 연골형성 특성을 손상시키지 않으면서 해당 표적 조직 부위에 대한 세포 시트의 이식 능력을 입증하고 있다.
차세대 세포 전달 방법으로서, 세포 시트 조직 공학은 온도 반응성 배양기를 사용하여 스캐폴드가 없는 다세포 구조체를 제조한다. 재생 세포는 재현가능한 생리학적 특성과 확장가능한 제조 방법을 이용하여 온전한 시트로 수확한다. 세포 시트는 내인성 세포 기질, 수용체 및 부착 단백질을 보유하여, 세포 생존력과 소통을 향상시키고, 내인성 세포 환경을 유지하며, 봉합 없이도 생체 재료와 생체 표면에 자발적인 부착을 가능하게 한다. 세포 구조나 기능을 손상시키지 않으면서 수확 후 시트 조작과 층상구조 수립도 가능하다.
본원에 설명된 연골원성 세포 시트는, 인간 연골로 이동하여 해당 세포 시트와 연골 사이의 계면에 정렬된 세포 부착 단백질 (예: 라미닌)과 함께 연골 표면에 부착되는 것으로 입증되었다. 이러한 결과로부터, 본 발명자들은, 어떠한 효소 없이도 세포를 수확할 수 있고 세포 부착 단백질을 보유하는 세포 시트의 장점으로 인해, 분화된 세포 시트가 어떠한 구조적 변화나 손상 없이 표적 조직에 쉽게 이식될 수 있음을 예상할 수 있다.
본원에 기술된 연골원성 세포 시트는, 중간엽 줄기 세포 (MSC)를 밀집 증식할 때까지 온도 반응성 배양기에서 배양하여 단층 세포 시트를 형성하는 단계; 온도를 감소시켜 상기 세포 시트를 분리하여 다수의 세포층을 갖는 수축된 세포 시트를 형성하는 단계; 상기 수축된 세포 시트를 배양 표면과 접촉시키는 단계; 및 상기 배양 표면의 수축된 세포 시트를 연골형성 배지로 처리하는 단계에 의해 제조한다. 본원에 설명된 연골원성 세포 시트는 3차원 구조로, 연골형성 세포 분화에 있어 중요하다. 본원에 사용된 "3차원 세포 시트" 또는 "3D" 세포 시트라는 용어는, 다수의 세포층을 포함하고 단층 세포 시트에 대해 재구성된 액틴 세포골격 (예컨대, 세포 지지체 상의 단층 배양물 중에 있어서 더 이상 장력이 없기 때문에 덜 정렬된 액틴 세포골격)을 갖고/갖거나, 단층 세포 시트에 비해 더 둥글고 덜 신장된 세포/핵을 갖는 연골원성 세포 시트를 지칭한다. 또한, 세포 시트는 이들의 안정적인 환경으로 인해 비대성을 억제한다. 세포 시트에 보유된 세포 부착 단백질들 덕분에 분화된 세포 시트를 목표 부위 (즉, 연골)에 이식하는 것이 가능하였다.
3D 세포 시트로서의 인간 골수 MSC (hBM-MSC)의 상당한 연골형성 능력은, 예를 들어 관절 연골 국소 결함 치료에 사용될 수 있는 스캐폴드가 없는 3D 연골형성 구조체를 개발하기 위한 강력한 기반을 제공한다. 세포 시트 수축 후 세포골격 재배열은 연골형성 증가에 대해 가능한 기전이다. 연골형성을 위한 3D 세포 시트 구조의 추가적인 조정은 시트 층상구조화를 통해 가능하다. 본 발명은 분화된 3D 연골원성 세포 시트를 생체 외 연골에 성공적으로 이식시키면서도 양성 연골형성 특성을 유지하는 것을 입증하고 있다. 또한, 본 발명은 연골세포를 형성하도록 분화된 유리질 유사 인간 MSC 유래 세포 시트가 생체내 연골에 성공적으로 이식되어 유리질 유사 특성을 유지하면서 숙주 조직과 통합될 수 있음을 입증하고 있다.
I. 중간엽 줄기 세포 (MSC)
중간엽 줄기 세포 (MSC)는, 주로 이들의 독특한 면역 조절 역할과 재생 능력으로 인해, 광범위한 쇠약성 질환을 치료하는 놀랄만한 임상적 잠재력을 가지고 있다 (Caplan and Sorrell, 2015, Immunol Lett 168(2): 136-139). 본원에 기재된 방법에 사용하기에 적절합한 MSC로는 골수, 탯줄, 제대혈, 지아 (limb bud), 치아 조직 (예: 어금니), 지방 조직, 근육 및 양수의 MSC를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 연골형성 잠재력이 있는 모든 MSC를 사용할 수 있다.
특정 실시형태에서, 중간엽 줄기 세포는 인간 골수 중간엽 줄기 세포 (hBM-MSC)이다. 본원에서 "인간 골수 중간엽 줄기세포" 또는 "hBM-MSC"라는 용어는 인간 골수에서 분리한 중간엽 줄기 세포를 의미한다. hBM-MSC를 분리하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Baghaei et al., 2017, Gastroenterol Hepatol Bed Bench. 10(3): 208-213] (전문이 본원에 참고로 포함됨)에 설명되어 있다. 분리 및 정제 공정에 사용되는 BM-MSC의 가장 중요한 특성은, 플라스틱 세포 배양 플레이트에 물리적으로 부착된다는 점이다. MSC의 분리 및 집적을 위해 다양한 기술들, 예컨대 항체 기반 세포 분류법, 저밀도 및 고밀도 배양 기법, 양성 음성 선별법, 빈번한 배지 교체 및 효소 분해 접근법이 사용되어 왔다.
간략히 설명하면, 인간 골수는 환자로부터 수득하여 무균 상태로 수집할 수 있다. 연막 (buffy coat)은 원심분리 (450 x g, 10분)로 분리하여 1.5 mL의 PBS에 현탁시킨 후, 배양에 사용한다. 분리된 연막을 동일한 부피의 Ficoll (GE health care, 미국) 상에 적층한 후, 원심분리한다 (400×g, 20분). 경계면의 세포들을 제거하고, 멸균 PBS 중에서 2회 세척한다. 인간 골수 전구세포를, 10% FBS와 페니실린/스트렙토마이신 (각각 50 U/mL와 50 mg/mL, 미국 칼스바드 소재의 Gibco-Invitrogen)이 보충된 DMEM 배지에서 조직 처리된 배양 플레이트에서 배양한다. 상기 플레이트를 5% CO2를 함유하는 가습 대기에서 48시간 동안 37℃로 유지한다. 배지를 교환하기 위해, 플레이트를 PBS로 세척하여 부착되지 않은 세포들을 제거하고 배지를 교체한다. 상기 배양액은 1회 배지 교환하여 추가로 1주일간 유지한다. 부착 세포들의 특성을 분석하기 위해, 뼈 모세포 분화 배지 (모두 Sigma에서 입수) 중에서 밀집 증식된 인간 MSC를 3주간 배양하여 뼈 모세포 분화를 유도하고, 3주 후에 상기 세포들을 알리자린으로 염색한다. 지방세포 분화를 유도하기 위해, 밀집 증식된 MSC를 분화 배지 중에서 1~3주간 배양하고, S Red Oil (Sigma)로 지질 액적 염색을 수행한다. 유세포 분석은 국제 세포 치료제 학회 (ISCT)에서 제정한 MSC 표준을 사용하여 MSC의 면역 프로파일을 평가하는데 사용한다. 세포 (P2-3)를 수확하고, 펠릿화하여, 1% 소혈청 알부민 (PBS 중 BSA)에 재현탁시킨 후, 계수한다. 세포들을 PE (피코에리트린)과 CD14, CD34, CD45, CD90, CD105 및 CD73에 접합시킨 항체들 (ebioscience, 독일)로 직접 염색한다. 모든 분석에는 마우스 IgG1 K Iso 대조군 (ebioscience, 독일)이라는 동형 일치된 적절한 대조군 항체를 사용한다. Cell Quest 소프트웨어 (Becton Dickinson, 영국)를 사용하여 FACS 유세포 분석에 대하여 세포들을 분석한다. 상기 인용한 문헌 [Baghaei et al., 2017]을 참조한다.
인간 MSC의 또 다른 적절한 공급원은 탯줄로, 이는 출생 후 폐기되어 쉽게 얻을 수 있는 논쟁의 여지가 없는 치료용 줄기 세포 공급원을 제공한다 (El Omar et al., 2014, Tissue Eng Part B Rev 20(5): 523-544). 인간 탯줄 MSC (hUC-MSC)는 현탁액으로서 인간 임상 시험에서 안전성과 효능이 검증된 바 있다 (Bartolucci et al., 2017, Circ Res, 121(10),1192-1204). 더욱이, hUC-MSC는 실험 동물 질환 모델에서 성공적으로 사용되어 왔다 (Zhang et al., 2017, Cytotherapy 19(2): 194-199).
탯줄로부터 MSC를 분리하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 미국 특허 9,903,176호 (전문이 본원에 참고로 포함됨)에 설명되어 있다. 인간의 탯줄은 탯줄 동맥, 탯줄 정맥, 와튼 젤리 (Wharton's Jelly) 및 상피하층을 포함한다. 일부 실시형태에서, hUC-MSC는 인간 탯줄의 상피하층으로부터 분리된다. 일부 실시형태에서, hUC-MSC는 인간 탯줄의 와튼 젤리로부터 분리된다. 다양한 세포 마커들을 사용하여 상피하층에서 분리된 hUC-MSC들을 식별할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 상피하층으로부터 분리된 hUC-MSC는 CD29, CD73, CD90, CD146, CD166, SSEA4, CD9, CD44, CD146 및 CD105로부터 선택된 하나 이상의 세포 마커들을 발현한다. 특정 실시형태에서, hUC-MSC는 CD73을 발현한다. 일부 실시형태에서, 상피하층으로부터 분리된 hUC-MSC는 CD45, CD34, CD14, CD79, CD106, CD86, CD80, CD19, CD117, Stro-1, HLA-DR, HLA-DP 및 HLA-DQ로부터 선택된 하나 이상의 세포 마커들을 발현하지 않는다. 특정 실시형태에서, hUC-MSC는 HLA-DR, HLA-DP 또는 HLA-DQ를 발현하지 않는다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 세포 시트는 낮은 HLA 발현 수준, 예컨대, 세포 시트에서 MSC 중 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2% 또는 0.1% 미만이 HLA (예컨대, HLA-DR, HLA-DP 및/또는 HLA-DQ)를 발현하는 수준의 중간엽 줄기 세포 (MSC)로 제조된다.
II. MSC로부터 생성된 연골원성 세포 시트
특정 양태에서, 본 발명은 중간엽 줄기 세포 (MSC)로부터 제조된 연골원성 세포 시트에 관한 것이다. 본원에서 사용된 "연골원성 (chondrogenic) 세포 시트"라는 용어는, 연골형성 분화 세포를 포함하는 세포 시트를 생성하기 위해, 시험관 내 온도 반응성 세포 배양 지지체 상에서 중간엽 줄기 세포를 성장시키고, 연골형성을 유도하는 하나 이상의 성장 인자 (예: 형질전환 성장 인자 베타 (TGFβ) 및/또는 뼈형성 단백질 (BMP))로 세포 시트를 처리함으로써 수득된 세포 시트를 지칭한다. 본원에서 사용된 "연골형성 분화 세포 (chondrogenically differentiated cells)"라는 용어는, 세포외 기질 (ECM)에서 sox9, II형 콜라겐, 아그레칸 및 황산화 프로테오글리칸을 발현하는 MSC로부터 유래된 세포들을 가리킨다.
상기 연골원성 세포 시트는 적어도 2층의 밀집 증식된, 연골형성 분화 세포, 예를 들어 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10층의 밀집 증식된, 연골형성 분화 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 세포 시트의 기저면 상의 연골형성 분화 세포는 라미닌을 발현한다. 본원에 사용된 "기저면"이라는 용어는, 세포 시트를 배양하는 동안 고체 세포 배양 지지체와 접촉하고 있는 세포 시트의 면을 가리킨다. 세포 시트를 숙주에 이식하는 동안, 세포 시트의 기저면은 숙주의 연골 조직과 접촉하도록 배치된다. 라미닌은 세포외 기질로 분비되는 고분자량의 이종삼량체 단백질이다. 이러한 이종삼량체 단백질들은 교차하여, 다른 세포막 및 세포외 기질 분자들, 예컨대 다른 라미닌에 결합할 수 있는 교차형 구조를 형성한다. 따라서, 라미닌은 세포 부착에 중요한 역할을 한다.
일부 실시형태에서, 상기 연골원성 세포 시트는 연골 표면에 이식된 후 연골 표면에 물리적으로 부착된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 상기 연골원성 세포 시트는 해당 연골 세포 시트를 연골 표면에 이식한 후 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 6시간, 12시간, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 후에 연골 표면에 부착되었다.
일부 실시형태에서, 상기 연골원성 세포 시트는 유리질 유사 연골 표현형을 갖는다. 유리질 유사 연골 표현형의 특징으로는, 이에 제한되지는 않지만, II형 콜라겐 및 (전단력, 압축력 및 인장력에 대한 저항을 가능하게 하는) 프로테오글리칸을 포함하는 세포외 기질 (ECM), SOX9, 아그레칸 및 COL2A1의 발현, I형 콜라겐의 낮은 발현, 높은 COL2A1/COL1A1 비율, 골소강 구조의 핵, 둥근 세포 구조, 및 ECM에 비해 낮은 세포 밀도를 포함한다.
일부 실시형태에서, 연골원성 세포 시트의 연골형성 분화 세포는 응집되어 있거나 물리적으로 연속되어 있다. 일부 실시형태에서, 연골원성 세포 시트를 제조하는데 사용되는 MSC는 인간 골수 MSC이다. 본원에 기재된 연골원성 세포 시트는, 온도 반응성 배양 접시 (TRCD) 상에서 MSC를 배양하는 단계, 어떠한 효소 처리 없이 온도 변화에 의해 온전한 시트로서 MSC를 수확하는 단계, 세포 시트를 수축시킨 후 하나 이상의 성장 인자 (예: TGFβ 및/또는 BMP)로 해당 세포 시트를 처리하여 연골형성을 유도하는 단계에 의해 제조될 수 있다. 상기 MSC 시트는 조직 유사 구조, 액틴 필라멘트, 세포외 기질, 세포간 단백질 및 높은 세포 생존력 (이들은 모두 개선된 세포 생존력 및 세포 기능과 관련이 있음)을 보유함으로써 자신의 무결성과 형태를 유지한다. 이에 따라, 본원에 기재된 연골원성 세포 시트는 세포 생존력과 세포 기능을 개선하는 구조적 특징, 예컨대 천연 세포외 기질, 세포 부착 단백질 및 세포 연접 단백질을 포함할 수 있다. 따라서, 본원에 기술된 방법에 의해 제조된 연골원성 세포 시트는 다른 방법들에 의해 생성된 세포 시트에 비해 몇 가지 유익한 특성들을 갖는다. 예를 들어, 화학적 저해 방법은, 효소 처리가 세포외 및 세포내 단백질들 (세포-세포 및 세포-ECM 접합부)을 붕괴시키기 때문에, 세포의 조직 유사 구조 및 세포-세포간 소통을 유지할 수 없다. 따라서, 효소에 의한 단백질 절단은 세포 생존력과 세포 기능을 감소시킨다. 물리적 와해 (즉, 고무 폴리스맨 또는 매질 흡인에 의한 물리적 와해)는 세포-세포 접합부 붕괴 및 배양된 부착성 시트를 세포 응집물로 분해시킨다.
일부 실시형태에서, 세포외 기질은 피브로넥틴, 라미닌 및 콜라겐으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 연접 단백질은 인테그린-β1, 코넥신 43, β-카테닌 및 N-카데린으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 연골원성 세포 시트는 연골형성 분화 세포들로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 연골원성 세포 시트는 필수적으로 연골형성 분화 세포들로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 연골원성 세포 시트 내의 세포들 중 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%는 연골형성 분화 세포가다. 일부 실시형태에서, 연골원성 세포 시트 내의 세포들 중 100%는 연골형성 분화 세포가다.
연골원성 세포 시트를 제조하는데 사용되는 MSC는, 세포 시트의 형성 또는 그의 특성들을 최적화하기 위해, 세포 배양 지지체의 온도 반응성 중합체 상의 배양 용액에 다양한 세포 밀도로 첨가될 수 있다. 예를 들어, MSC에서 사이토카인 발현 수준은 세포 배양 지지체 (예: TRCD)에서 MSC의 초기 세포 밀도를 조절함으로써 최적화할 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포 배양 지지체에서 MSC의 초기 세포 밀도를 증가시키면, 사이토카인 발현 (예컨대, HGF)이 증가된다. 일부 실시형태에서, 세포 배양 지지체에서 MSC의 초기 세포 밀도를 증가시키면, 사이토카인 발현이 감소된다. 일부 실시형태에서, 세포 시트의 제조에 사용되는 세포 배양 지지체에서 MSC의 초기 세포 밀도는 1×103/cm2내지 9×105/cm2이다. 일부 실시형태에서, 세포 배양 지지체에서 MSC의 초기 세포 밀도는 적어도 1×103, 5×103, 1×104, 2×104, 3×104, 4×104, 5×104, 6×104, 7×104, 8×104, 9×104, 1×105, 2×105, 3×105, 4×105, 5×105, 6×105, 7×105, 8×105 또는 9×105 개의 세포/cm2이다. 이러한 값들 중 임의의 한 값을 사용하여 세포 배양 지지체에서 MSC의 초기 세포 밀도 범위를 규정할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 세포 배양 지지체에서의 초기 세포 밀도는 1×103 내지 5×103 개의 세포/cm2, 2×104 내지 1×105 개의 세포/cm2, 4×104 내지 1×105 개의 세포/cm2 또는 1×103 내지 5×104 개의 세포/cm2이다.
또한, 본원에 기재된 연골원성 세포 시트는 숙주 유기체의 표적 조직에 이식된 후 세포외 기질 단백질과 세포 연접 단백질을 계속 발현할 수도 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 상기 세포 시트는 숙주 유기체의 조직에 이식된 후 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 또는 30일간 세포외 기질 단백질 및/또는 세포 연접 단백질을 발현한다. 일부 실시형태에서, 상기 세포 시트는 숙주 유기체의 조직에 이식된 후 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개월간 세포외 기질 단백질 및/또는 세포 연접 단백질을 발현한다. 일부 실시형태에서, 이식 후 상기 세포 시트에서 발현된 세포외 기질 단백질은 피브로넥틴, 라미닌 및 콜라겐으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 이식 후 상기 세포 시트에서 발현된 세포 연접 단백질은 빈쿨린, 인테그린-β1, 코넥신 43, β-카테닌, 인테그린 결합된 키나제 및 N-카데린으로부터 선택된다.
현재의 줄기 세포 치료법은 생검에서 분리된 배양 줄기 세포를 주사용 세포 현탁액으로 사용하는 경우가 많다 (Bayoussef et al., 2012, J Tissue Eng Regen Med, 6(10)). 주입된 세포 현탁액은 통상적으로 질환이 있는 장기나 조직 내에서 생착과 체류가 저조하다 (Devine et al., 2003, Blood, 101(8), 2999-3001). 수확시에 효소적 저해로 인한 줄기 세포 현탁액에서 온전한 ECM과 세포-세포 접합부 (즉, 소통)의 손실은 줄기 세포 기능, 생체 내 생착과 생존력을 손상시키고, 생체 내 치료적 효능을 제한할 수 있다. 이와는 대조적으로, 본원에 기술된 연골원성 세포 시트를 제조하는 방법은, 고유한 세포 기능상의 구조를 보존하여, 이식 후 표적 조직에 대한 세포 시트의 부착을 개선한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 상기 세포 시트는 숙주 유기체의 조직에 이식된 후 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 또는 30일간 해당 숙주 유기체의 표적 조직에 부착되어 있다. 일부 실시형태에서, 상기 세포 시트는 숙주 유기체의 조직에 이식된 후 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6일간 해당 숙주 유기체의 표적 조직에 부착되어 있다.
또한, 본원에 설명된 연골원성 세포 시트는 여러 면에서 현탁 배양과 다르다. 현탁 배양은 ECM 또는 세포-세포 접합부가 없는 단일 세포를 포함하는데, 그 이유는 세포 현탁 배양액의 제조에 통상적으로 사용되는 배양 표면으로부터 세포를 수확하여 현탁시키기 위해서는, 이러한 세포-세포 접합부에서의 이들 세포 부착 단백질들이 (예컨대, 단백질 가수분해 트립신 처리에 의해) 제거되어야 하기 때문이다. 단일 세포 현탁액과는 대조적으로, 본원에 기술된 연골원성 세포 시트는 내인성 세포에서 생성된 ECM과 세포 시트의 형성 동안 생성되는 세포들 간의 온전한 세포-세포 접합부를 모두 함유한다. 세포 시트 형성, 제조 및 취급 중에 유지되는 내인성 ECM과 고유한 세포-세포 접합부는, 숙주 유기체에 이식하는 동안 이들의 표현형 보존, 세포 기능 및 표적 조직 (예: 관절 연골)에 대한 연골원성 세포 시트의 부착을 위한 중요한 특성들의 유지를 용이하게 한다.
III. 시험관 내 연골원성 세포 시트의 제조 방법
특정 양태에서, 본 발명은 a) 중간엽 줄기 세포 (MSC)를 밀집 증식할 때까지 온도 반응성 배양기에서 배양하여 세포 시트를 형성하는 단계; b) 온도를 감소시켜 상기 세포 시트를 분리하고 상기 세포 시트를 수축시켜, 수축된 세포 시트를 형성하는 단계; c) 상기 수축된 세포 시트를 배양 표면과 접촉시키는 단계; 및 d) 상기 배양 표면의 수축된 세포 시트를 연골형성 배지로 처리하고 배양하여 연골원성 세포 시트를 형성하는 단계를 포함하는, 연골원성 세포 시트를 제조하는 방법에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, 상기 수축된 세포 시트는 적어도 1, 2, 3 또는 4주간 배양 표면에서 성장한다. 일부 실시형태에서, 상기 연골형성 배지는 형질전환 성장 인자 베타 (TGFβ) 및 뼈형성 단백질 (BMP)로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 연골형성 배지는 하기 배지 성분들 중 하나 이상을 포함한다: 인슐린-트랜스페린-셀레늄 (ITS-G), 덱사메타손, 소혈청 알부민 (BSA), L-아스코르브산 2-포스페이트, L-프롤린 및 리놀레산.
일부 실시형태에서, MSC는 인간 골수 중간엽 줄기 세포 (hBM-MSC)이다. hUC-MSC를 분리하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며 본원에 기재되어 있다.
세포 시트를 제조하는 일반적인 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 미국 특허 8,642,338호; 8,889,417호; 9,981,064호; 및 9,114,192호에 기술되어 있으며, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
세포 배양 지지체의 기질을 코팅하는데 사용되는 온도 반응성 중합체는 일반적으로 수용액 중 상한 또는 하한 임계 용액 온도가 0℃ 내지 80℃, 예를 들어 10℃ 내지 50℃, 0℃ 내지 50℃ 또는 20℃ 내지 45℃의 범위이다.
상기 온도 반응성 중합체는 단독중합체 또는 공중합체일 수 있다. 대표적인 중합체는, 예를 들어 일본 특허 공보 211865/1990호에 기재되어 있다. 구체적으로, 이들은 예를 들어 (메트)아크릴아미드 화합물 [(메트)아크릴아미드는 아크릴아미드와 메타크릴아미드를 모두 지칭함], N-(또는 N,N-디)알킬-치환된 (메트)아크릴아미드 유도체, 및 비닐 에테르 유도체와 같은 단량체들의 단독중합 또는 공중합에 의해 수득될 수 있다. 공중합체의 경우, 전술한 단량체들과 같은 임의의 2개 이상의 단량체가 사용될 수 있다. 또한, 이들 단량체들은 다른 단량체들과도 공중합될 수 있고, 한 중합체가 다른 중합체에 그래프트될 수 있거나, 2개의 중합체가 공중합될 수 있거나, 또는 중합체와 공중합체의 혼합물도 사용될 수 있다. 필요하다면, 중합체는 이들의 고유한 특성을 손상시키지 않는 범위에서 가교될 수도 있다.
상기 중합체로 코팅되는 기질로는 유리, 개질된 유리, 산화규소, 폴리스티렌, 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리에스테르, 폴리카보네이트 및 세라믹과 같은, 세포 배양에 통상적으로 사용되는 것들을 비롯하여 어떠한 종류들도 가능하다.
지지체를 온도 반응성 중합체로 코팅하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 일본 특허 공보 211865/1990호에 기재되어 있다. 구체적으로, 이러한 코팅은, 기질과 상기 언급한 단량체 또는 중합체에, 예를 들어 전자빔 (EB) 노출, γ-선 조사, UV선 조사, 플라즈마 처리, 코로나 처리 또는 유기 중합 반응을 가하여 달성될 수 있다.
온도 반응성 중합체의 커버리지는 0.4-3.0 ㎍/cm2, 예를 들어 0.7-2.8 ㎍/cm2또는 0.9-2.5 ㎍/cm2 범위일 수 있다. 세포 배양 지지체의 형태는, 예를 들어 접시, 다중 플레이트, 플라스크 또는 세포 삽입체일 수 있다.
배양된 세포들은, 지지체 물질의 온도를 해당 지지체 기질 상의 중합체가 수화되는 온도로 조절한 결과, 상기 세포들이 탈착될 수 있게 함으로써, 세포 배양 지지체로부터 분리하여 회수될 수 있다. 세포 시트와 지지체 사이의 갭에 물줄기를 가하면 부드러운 탈착도 가능하다. 세포 시트의 분리는, 세포들이 배양된 배양액 내에서, 또는 어느 것이든 적절한 다른 등장액들 중에서 영향을 받을 수 있다.
특정 실시형태에서, 상기 온도 반응성 중합체는 폴리(N-이소프로필 아크릴아미드)이다. 폴리(N-이소프로필 아크릴아미드)는 31℃의 물 중에서 임계 용액 온도가 더 낮다. 이는 유리 상태에 있는 경우, 31℃ 이상의 온도의 물에서 탈수를 겪어 중합체 사슬이 응집되어서 탁도를 유발한다. 그와는 반대로, 31℃ 이하의 온도에서는, 중합체 사슬이 수화하여 물에 용해되므로, 중합체에서 세포 시트가 분리된다. 특정 실시형태에서, 상기 중합체는 페트리 접시와 같은 기질의 표면을 덮고 그 위에 고정된다. 따라서, 31℃ 이상의 온도에서는, 기질 표면의 중합체도 탈수되지만, 중합체 사슬이 기판 표면을 덮어 그 위에 고정되기 때문에, 기판 표면은 소수성이 된다. 그와는 반대로, 31℃ 이하의 온도에서는, 기질 표면의 중합체는 수화되지만, 중합체 사슬이 기판 표면을 덮어 그 위에 고정되기 때문에, 기판 표면은 친수성이 된다. 소수성 표면은 세포의 부착과 성장에 적합한 표면인 반면, 친수성 표면은 세포의 부착을 억제하고 배양액을 냉각시키는 것만으로도 세포가 분리된다.
중간엽 줄기 세포를 위한 배양액은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 미국 특허 9,803,176호 및 9,782,439호에 기술되어 있고, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다. 일부 실시형태에서, 세포 배양액은 인간 혈소판 용해물 (hPL)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 배양액은 소태아 혈청 (FBS)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 배양액은 아스코르브산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 배양액은 이종성 물질이 없는 배지, 즉 인간으로부터 수득된 생성물을 함유할 수 있지만 인간이 아닌 동물로부터 수득된 생성물은 함유하지 않는 배지이다. 일부 실시형태에서, 상기 배양액은 인간이 아닌 동물로부터 수득된 적어도 하나의 생성물 (예컨대, FBS)을 함유한다. 일부 실시형태에서, 상기 배양액은 인간으로부터 수득된 생성물을 함유하지 않는다. 특정 실시형태에서, 상기 배양액은 둘베코의 변형된 이글 배지 (DMEM) (Life Technologies, 미국 캘리포니아주), 인간 혈소판 용해물 (hPL, iBiologics, 미국 피닉스주), Glutamax (Life Technologies), MEM 비필수 아미노산 용액 (NEAA) (Life Technologies) 및 항생제, 예컨대 페니실린 스트렙토마이신 중 하나 이상을 포함한다.
MSC (예: hBM-MSC)는 세포 배양 지지체의 기질 표면에 코팅된 온도 반응성 중합체 상에서 배양액 중의 세포를 배양하기 전에 1회 이상의 계대 배양 (즉, 계대접종)을 거칠 수 있다. 일부 실시형태에서, MSC (예: hBM-MSC)는 세포 배양 지지체의 기질 표면에 코팅된 온도 반응성 중합체 상에서 배양액 중의 세포를 배양하기 전에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15회의 계대배양을 거친다. 상기 수치들 중 임의의 수치를 사용하여 계대 배양 횟수 범위를 규정할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, MSC (예: hBM-MSC)는 온도 반응성 중합체 상에서 세포를 배양하기 전에 2 내지 10, 4 내지 8 또는 1 내지 12회의 계대배양을 거친다. 일부 실시형태에서, 계대배양의 횟수는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15회 미만이다. 일부 실시형태에서, 계대배양의 횟수는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15회이다.
연골원성 세포 시트는 용도에 따라서 다양한 크기 범위로 제조될 수 있다. 일부 실시형태에서, 연골원성 세포 시트의 직경은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20 cm이다. 이러한 수치들 중 임의의 수치를 사용하여 연골원성 세포 시트의 크기 범위를 규정할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 연골원성 세포 시트의 직경은 1 내지 20 cm, 1 내지 10 cm 또는 2 내지 10 cm이다. 일부 실시형태에서, 연골원성 세포 시트의 면적은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 또는 300 cm2이다. 이러한 수치들 중 임의의 수치를 사용하여 연골원성 세포 시트의 크기 범위를 규정할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 연골원성 세포 시트의 면적은 1 내지 100 cm2, 3 내지 70 cm2, 또는 1 내지 300 cm2이다. 본원에 기술된 방법은 연골원성 세포 시트의 표면적이 그 두께보다 훨씬 더 큰 연골원성 세포 시트를 생성하게 된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 연골원성 세포 시트의 표면적 대 그의 두께 비는 적어도 10:1, 100:1, 1000:1 또는 10,000:1이다. 본원에 기재된 연골원성 세포 시트는 1층 이상의 밀집 증식된 연골형성 분화 세포, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10층의 연골형성 분화 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 연골원성 세포 시트는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10층 미만의 연골형성 분화 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 연골원성 세포 시트는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10층의 연골형성 분화 세포를 포함한다.
IV. 연골원성 세포 시트의 사용 방법
일부 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 연골원성 세포 시트를 대상체의 조직에 적용하는 단계를 포함하는, 상기 연골원성 세포 시트의 이식을 필요로 하는 대상체에게 상기 연골원성 세포 시트를 이식하는 방법에 관한 것이다.
일부 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 연골원성 세포 시트를 대상체의 연골에 적용함으로써, 대상체의 연골 조직을 복구하는 단계를 포함하는, 연골 조직의 복구를 필요로 하는 대상체의 연골 조직을 복구하는 방법에 관한 것이다. 본원에 기재된 방법들의 일부 실시형태에서, 연골은 관절 연골이다.
일부 실시형태에서, 대상체는 국소 연골 결함, 예컨대 국소 관절 연골 결함이 있다. 본원에서 사용된 "국소 연골 결함"이라는 용어는 명확한 영역에 한정되어 있는 연골 손상을 의미한다. 일부 실시형태에서, 대상체는 증상을 보이는 연골 결함, 예컨대 증상을 보이는 관절 연골 결함이 있다. 일부 실시형태에서, 상기 증상을 보이는 연골 결함은 급성 또는 반복적 외상에 의해 유발된다. 일부 실시형태에서, 대상체는 퇴행성 관절 질환 (예: 골관절염)이 있거나, 퇴행성 관절 질환 (예: 골관절염)이 발병할 위험이 있다.
일부 양태에서, 본 발명은 관절 질환의 치료 또는 예방이 필요한 대상체에서 관절 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 본원에 기재된 바와 같은 연골원성 세포 시트를 대상체의 관절에 적용하여 대상체의 관절 질환을 치료 또는 예방하는 단계를 포함하는 것인, 방법에 관한 것이다. 본원에 사용된 "치료하다", "치료하는" 및 "치료"라는 용어들은 모두 관절 질환과 관련된 적어도 하나의 측정가능한 물리적 매개변수의 개선 또는 역전을 지칭하려는 것이다. 또한, "치료하다", "치료하는" 및 "치료"라는 용어들은 관절 질환의 진행을 예방하거나, 또는 적어도 이를 늦추는 것을 의미할 수도 있다. 한 실시형태에서, "치료하다", "치료하는" 및 "치료"라고 하면, 관절 질환, 장애 또는 병태와 관련된 통증의 감소 또는 완전한 경감을 지칭한다. 또 다른 실시형태에서, "치료하다", "치료하는" 및 "치료"라고 하면, 관절 염증의 감소를 지칭한다. 또 다른 실시형태에서, "치료하다", "치료하는" 및 "치료"라고 하면, 관절의 연골, 예컨대 활막성 관절의 관절 연골의 연골 분해를 억제하거나 감소시키는 것을 지칭한다. 그리고 또 다른 실시형태에서, "치료하다", "치료하는" 및 "치료"라고 하면, 관절 질환과 관련된 하나 이상의 증상, 예컨대 관절 통증, 관절 부종, 관절 경직, 염증, 관절 움직임의 어려움, 운동 범위 감소의 완화를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 대상체는 본원에 기재된 연골원성 세포 시트를 해당 대상체에 첫 적용하는 시점에 관절 질환이 있다. 일부 실시형태에서, 연골원성 세포 시트를, 예를 들어 관절 질환 (예: 골관절염)이 발생하기 전에 대상체에 적용하여 관절 질환의 발생을 방지한다.
일부 실시형태에서, 상기 관절은 활막성 관절 및 연골 관절로부터 선택된다. "활막성 관절"이라는 용어는 포유동물의 신체에서 가장 흔하고 가동성이 있는 유형의 관절을 의미한다. 활막성 관절에는 경첩 관절 (예: 팔꿈치 및 무릎), 회전 관절 (예: 목의 상단부에 있는 고리뼈와 축뼈), 절구공이 (ball and socket) 관절 (예: 고관절), 안장 관절 (예: 엄지의 손목손허리 관절), 과상 관절 (예: 손목, 손허리손가락 관절, 발허리발가락 관절) 및 활주 관절 (예: 손목의 손목뼈사이 관절)이 포함된다. 활막성 관절의 비제한적 예로는 무릎, 손목, 어깨, 엉덩이, 팔꿈치, 후관절, 손목-손바닥뼈, 및 발목뼈/발허리뼈 관절을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. "연골성 관절"은 복장뼈 몸통 자루 관절 (복장뼈)과 같은 연골 및 추간판과 같은 부분가동 관절로 전체적으로 연결된 관절이다. 특정 실시형태에서, 상기 관절 질환은 활막성 관절에 영향을 미친다. 다른 실시형태에서, 상기 관절 질환은 연골성 관절에 영향을 미친다.
일부 실시형태에서, 상기 관절 질환은 퇴행성 관절 질환, 예를 들어 골관절염이다. 본원에 사용된 바와 같이, "골관절염"은 활막성 관절에서 발생하는 관절염의 형태를 지칭한다. 이는 일반적으로 만성 질환이며, 관절을 형성하기 위해 함께 모인 뼈 끝에 있는 관절 연골로 알려진 보호 연골이 마모 및/또는 분해되는 경우에 발병한다. "관절 연골"은 관절의 뼈 끝 부분에 있는 조직을 가리키며, 움직일 때 관절의 뼈 사이에 마찰이 없이 접촉할 수 있게 해준다. 관절 연골은 콜라겐과 프로테오글리칸의 2가지 주요 구성요소로 구성된다. 활막성 관절의 연골 파괴는, 다수의 요인들, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 프로테아제, 노화, 과체중 및 연골 형성의 유전적 결함으로 인해 발생할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 관절 질환은 관절 염증, 골관절염, 류마티스 관절염 및 슬개골 연골연화증으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 양태에서, 본 발명은 급성 또는 반복적 외상으로 유발된, 증상을 보이는 연골 결함이 있는 대상체의 골관절염을 예방하는 방법으로서, 본원에 기재된 연골원성 세포 시트를 상기 결함이 있는 연골에 적용하여 상기 대상체의 골관절염을 예방하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, 연골원성 세포 시트가 사용되는 조직은 연골, 예컨대 관절 연골이다. 일부 실시형태에서, 연골원성 세포 시트가 사용되는 조직은 뼈, 예컨대 연골하골이다.
본원에 기재된 연골원성 세포 시트의 한 가지 장점은, 사용된 세포 시트의 세포외 기질이 해당 세포 시트를 대상체의 연골 조직에 결합시키는 천연 접착제로서 작용하여, 세포 시트를 조직에 부착시키기 위한 봉합이나 바느질이 필요하지 않다는 점이다. 지지체 막 또는 기타 장치들을 사용하여 연골원성 세포 시트를 대상체의 연골 조직으로 이동시킨 다음, 시트 이동 후에 이들을 제거할 수 있다. 상기 지지체는, 예를 들어 폴리(비닐리덴 디플루오라이드) (PVDF), 셀룰로스 아세테이트, 셀룰로스 에스테르, 플라스틱 및 금속일 수 있다. 상기 연골원성 세포 시트는 표적 조직에 쉽게 부착되어, 단시간에 표적 조직에 직접 부착된 후 봉합 없이도 스스로 안정화된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 상기 연골원성 세포 시트는 조직과 접촉한 후 5, 10, 15, 20, 25, 또는 30분 이내에 표적 조직에 부착된다. 연골형성 시트가 일단 관절 조직에 부착되면, 상기 지지체 막을 제거할 수 있다.
특정 실시형태에서, 세포 시트 내의 연골형성 분화 세포는 대상체에 대해 동종이계성인데, 즉 대상체와 동일한 종의 다른 개체로부터 분리되어, 하나 이상의 유전자좌에서의 유전자들이 동일하지 않다. 보고된 특정 사례에서, MSC에서 유래된 세포 시트는 인간과 동물 모델에서 동종이계성 거부 반응을 회피하는 것으로 보인다 (Jiang et al., 2005, Blood, 105(10), 4120-4126). 따라서, 본원에 기술된 연골원성 세포 시트는 규격 제품으로서 동종이계성 세포 요법에 사용될 수 있다. 다른 실시형태에서, 세포 시트의 연골형성 분화 세포는 해당 연골원성 세포 시트가 사용되는 대상체에 대해 동종이계성이다. 일부 실시형태에서, 상기 대상체는 인간이다.
동종이계성 세포의 공급원은 숙주 환자의 동종이계성 조직에서 표준 면역학적 능력 하에 의미있는 치료를 이끌어낼 수 있어야 한다. 여기에는 신뢰할 수 있는 세포 호밍 (cell homing) 및 관심대상 치료 조직 부위에서 충분한 기간 동안 부분 용량 생착 또는 유지가 포함된다 (Leor et al., 2000, Circulation, 102(19 Suppl 3), III 56-6). 현재 추정치는, 줄기 세포 현탁액을 피험자에게 투여하는 경우, 허혈성 손상 이후에 손상된 심근층에 주사된 줄기 세포의 3% 미만이 주사후 3일째 유지되는 것으로 보고 있다 (Devine et al., 2003, Blood, 101(8), 2999-3001). 게다가, 표적 조직에 생착되는 세포 현탁액으로부터 투여된 대부분의 세포들은 첫 수주 이내에 사멸할 것이다 (Reinecke & Murry, 2002, J Mol Cell Cardiol, 34(3), 251-253). 그에 반해, 본원에 기재된 연골원성 세포 시트는 이식 후 3일째에 숙주 조직에 높은 분획 보유율로 안정적으로 생착된다. 따라서, 본원에 기술된 연골원성 세포 시트는 주사 또는 투여된 중간엽 줄기 세포 현탁액에 비해 뚜렷한 장점을 제공한다.
하나 이상의 연골원성 세포 시트를 본원에 기재된 방법에서 대상체의 연골 조직에 사용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 연골원성 세포 시트를 대상체의 연골 조직 (예: 관절 연골 조직)에 사용할 수 있다. 이러한 수치들 중 임의의 수치를 사용하여 대상체의 연골 조직에 사용되는 연골원성 세포 시트수의 범위를 규정할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 2-4, 3-5 또는 1-10개의 연골원성 세포 시트를 대상체의 연골 조직 (예: 관절 연골 조직)에 사용한다.
실시예
실시예 1
재료 및 방법
세포 배양
계대수 2에서 Lonza로부터 구입한 계대수 4의 인간 골수 유래 중간엽 줄기 세포 (hBM-MSC)를 10% 소태아 혈청 (FBS, Thermo Fisher Scientific, 미국 매사추세츠주), 1% 페니실린 스트렙토마이신 (PS, Life Technologies) 및 5 ng/mL의 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF, PeproTech, 미국 뉴저지주)가 보충된 둘베코의 변형된 이글 배지 (DMEM, Life Technologies, 미국 캘리포니아주)를 함유하는 성장 배지 중에 3,000 개의 세포/cm2로 플레이팅한 뒤, 37℃, 5% CO2의 가습 환경에서 항온배양하였다. 1일 및 5일째에 배지를 교체하고, 90% 밀집 증식될 때까지 세포들을 약 7일간 배양하였다. 세포들을 0.05% 트립신-EDTA (Gibco, 미국 뉴저지주)를 사용하여 계대접종한 후, 상기 세포 현탁액을 혈구계수기를 사용하여 계수하였다.
세포 시트와 펠릿 제조 및 연골형성 세포 분화
펠릿 배양을 위해 15 mL 에펜도르프 튜브에서 2.5 x 105개의 세포로 20% FBS 성장 배지 중에서 계대수 5의 hBM-MSC를 분취하여, 단층 배양을 위해 1 ㎛ 공극의 6-웰 세포 배양 삽입체에 씨딩하고, 세포 시트 배양을 위해 35 mm UpCell 접시 (Nunc, Thermo Fisher Scientific, 덴마크)에 씨딩하였다 (씨딩은 모두 6.7×104 개의 세포/cm2). 펠릿 제조를 위해, 튜브들을 500×g에서 10분간 회전시켰다. 캡을 느슨하게 풀고, 세포들을 37℃, 5% CO2에서 3일간 항온배양하여 펠릿을 형성하였다. 세포 시트 제조를 위해, 세포들을 5일간 배양하였다. 5일째에, 세포 시트들을 20℃에서 1시간 동안 방치한 후, 겸자를 사용하여 분리하였다. 세포 시트를 재도말하기 위해, 1 ㎛의 공극 세포 배양 삽입체 (Falcon, 미국 네브래스카주)를 세포 시트 재도말 전에 밤새 FBS로 컨디셔닝하였다. 삽입체를 1×PBS (Gibco)로 2회 세척하고 표준 항온배양기에 보관하였다. 분리된 세포 시트들을 OHP 필름 (Apollo, 미국 뉴욕주)을 사용하여 상기 컨디셔닝된 세포 배양 삽입체로 옮겨 삽입체 웰과 기저 접촉되도록 하였다. 세포 시트들을 37℃, 5% CO2에서 1시간 동안 20 μL의 성장 배지에서 항온배양하였다. 1시간 후에, 새로운 세포 성장 배지를 상기 시트에 첨가하고, 세포 부착을 위해 이들을 37℃, 5% CO2에서 3일간 항온배양하였다. 3일간의 항온배양 단계 후, 연골형성 샘플을 연골형성 배지로 유도하고, 대조군 샘플을 세포 성장 배지에 보관한 후, 모든 샘플들을 저산소 항온배양기 (37℃, 5% CO2, 5% O2)로 옮겼다. 연골형성 배지는 10 ng/mL의 형질전환 성장 인자 베타-3 (TGFβ3, Thermo Fisher Scientific), 200 ng/mL의 뼈형성 단백질-6 (BMP6, PeproTech), 1% 인슐린-트랜스페린-셀레늄 (ITS-G, Thermo Fisher Scientific), 1% PS (Life Technologies), 1% 비필수 아미노산 (NEAA, Thermo Fisher Scientific), 100 nM 덱사메타손 (MP Biomedicals, 미국 오하이오주), 1.25 mg/ml의 소혈청 알부민 (BSA, Sigma-Aldrich, 미국 미주리주), 50 ㎍/mL의 L-아스코르브산 2-포스페이트 (Sigma-Aldrich), 40 ㎍/mL의 L-프롤린 (Sigma-Aldrich) 및 5.35 ㎍/mL의 리놀레산 (Sigma-Aldrich)이 보충된 둘베코의 변형된 이글 배지 (DMEM, Life Technologies)를 포함하였다. 연골형성 및 대조군 샘플의 경우, 배지는 분화 기간 (0일~4주) 동안 주 2회 교체하였다.
조직학적 분석
4% 파라포름알데하이드 (PFA, Thermo Scientific)로 15분간 고정한 후, 파라핀으로 매립하였다. 매립된 샘플들을 4 ㎛로 박편을 만들어 알시안 블루와 사프라닌-O로 염색하였다. 알시안 블루는 연골의 글리코사미노글리칸과 같은 산성 다당류를 염색하는데 사용되는 다가의 염기성 염료이다. 사프라닌-O는 관절 연골의 구성성분들 (예: 프로테오글리칸, 연골세포 및 II형 콜라겐)을 다양한 색조의 적색으로 염색하는 염기성 염료이다. 초기 연골형성을 감지하기 위해, 샘플들을 알시안 블루 (EMD Millipore, 미국 매사추세츠주)로 10분간 염색하였다. 성숙한 연골형성을 감지하기 위해, 표준 방법에 따라 사프라닌-O 염색을 수행하였다. 간략히 설명하면, 샘플들을 바이게르트의 철 헤마톡실린 (Wiegert's Iron Hematoxylin) (Sigma-Aldrich)으로 4분, 0.5 g/L의 패스트 그린 (Sigma-Aldrich)으로 5분, 0.1% 사프라닌-O (Sigma-Aldrich)로 8분간 염색하였다. 모든 샘플들은 밤새 건조시킨 후, AmScope 소프트웨어를 사용하여 BX 41 광시야 현미경으로 이미지를 촬영하였다. 사프라닌-O로 염색된 슬라이드들을 사용하여 세포 시트 두께와 핵 밀도를 계산하였다. 각 세포 시트 슬라이드에 대해, 세포 시트의 길이를 따라 3장의 사진을 촬영하였다. AmScope 소프트웨어에 내장된 측정 도구를 사용하여, 시트의 꼭대기에서 기저부 가장자리까지 사진당 5번의 측정이 이루어졌으며, 이러한 측정들은 시트를 따라 고르게 간격을 벌려두고 하였다. 핵 계수는 시트당 동일한 3장의 사진을 사용하여 수행하였다. AmScope 소프트웨어에 내장된 측정 도구를 사용하여, 500 ㎛ 길이의 세포 시트를 이미지 안에 표시하였다. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 표시된 박편 내에서 핵수를 계수하였다. 세포 시트 직경과 부피 계산을 위해서, ImageJ 소프트웨어를 사용하여 해당 시트들의 육안으로 본 이미지를 분석하였다. 그룹당 4개의 세포 시트에 대해 5번의 직경 측정이 이루어졌으며, 언급된 사프라닌-O 샘플의 두께 측정을 이용하였다. 모든 측정치들은 각 샘플 그룹에 대해 평균을 내었다.
면역조직화학 분석
단면 IHC 분석을 위해, 샘플들을 4% PFA로 삽입체 막에 15분간 고정하고 파라핀으로 매립하였다. 매립된 샘플들을 4 ㎛ 박편으로 만들어, 성숙한 연골형성을 감지하기 위해 II형 콜라겐에 대해 염색하고, 비대성을 감지하기 위해 MMP13에 대해 염색하며, 부착 분자들을 감지하기 위해 피브로넥틴과 라미닌에 대해 염색하였다. 간략히 설명하면, 항원 복원은 50X 저(Low) pH 표적 복원 용액 (Dako, Agilent Technologies, 미국 캘리포니아주)의 1:50 희석액과 함께 압력솥에서 저압으로, II형 콜라겐 샘플의 경우 106-110℃에서 15분간 항온배양하였고, MMP13, 피브로넥틴 및 라미닌 샘플의 경우 프로테이나아제 K (Dako, Agilent Technologies)와 함께 실온에서 6분간 항온배양하였다. 피브로넥틴과 라미닌 샘플을 0.1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich)으로 실온에서 10분간 투과시켰다. 모든 샘플들에 대해 10% 정상 염소 혈청 (Vector Laboratories, 미국 캘리포니아주)을 사용하여 비특이적 결합을 실온에서 30분간 차단시켰다. 이후, II형 콜라겐, MMP13, 피브로넥틴 및 라미닌 샘플을 각각 항-II형 콜라겐 1차 항체 (Thermo Fisher Scientific)의 1:200 희석액, 항-MMP13 1차 항체 (Abcam, 영국 캠브리지)의 1:200 희석액, 항피브로넥틴 1차 항체 (Abcam)의 1:100 희석액 또는 항라미닌 1차 항체 (Abcam)의 1:100 희석액 중에서 4℃로 밤새 항온배양하였다. 샘플들을 1×PBS로 세척하고 염소 항-래빗 488 2차 항체 (Thermo Fisher Scientific)의 1:200 희석액에서 커버를 씌워 실온으로 2시간 동안 항온배양하였다. 2시간 후, 샘플들을 1×PBS로 세척하고 DAPI 함유 봉입재 (Invitrogen, 미국 매사추세츠주)로 봉입하였다. Zeiss Axio 광시야 현미경과 ZEN 소프트웨어로 샘플들을 시각화하였다. 세포골격 배열을 확인하기 위해, 팔로이딘 (F-액틴) 염색을 수행하였다. 간략히 설명하면, 샘플들을 0.1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich)을 사용하여 15분간 투과시키고 1×PBS로 세척하였다. 다음으로, 샘플들을 팔로이딘 알렉사플루오르 488 (Life Technologies)과 함께 실온에서 커버를 씌워 30분간 항온배양하였다. 이후, 샘플들을 1×PBS로 세척하고 DAPI 용액 (2 방울/mL, Life Technologies)과 함께 실온에서 5분간 항온배양하였다. 샘플들을 1×PBS로 세척한 후 봉입을 준비하였다. 샘플들을 공초점 현미경 (Nikon A1 - NIS Elements AR 소프트웨어)을 사용하여 이미지를 촬영화였다. ImageJ를 사용하여 이미지들을 분석하여 준비하였다.
RT-PCR 분석
막자 모터 믹서를 가지고 1 mL TRIzol/샘플 (Ambion, Life Technologies, 미국 캘리포니아주)을 사용하여 샘플들의 RNA를 추출하였다. 제조사의 지침에 따라 PureLink RNA 미니 키트 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific)로 총 RNA를 분리하였다. cDNA 합성을 위해, 모든 샘플들을 동시에 합성하였다. cDNA를 합성하기 전에, Nanodrop으로 RNA를 정량하고, 모든 cDNA 샘플들은 1 ㎍의 RNA/샘플로 준비하였다. 순도 (A260/A280)가 1.8보다 큰 모든 샘플들을 계속 수행하기에 충분히 순수한 것으로 간주하였다. cDNA 합성은 제조사의 지침에 따라 고성능 cDNA 역전사효소 키트 (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, 미국 매사추세츠주)를 사용하여 수행하였다. RT-PCR 분석은 Applied Biosystems Step OnePuls 장비를 사용하여 TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific)를 가지고 수행하였다. 유전자 발현 수준을 하기 유전자들에 대해 분석하였다: 1) 하우스키핑 유전자로서 글리세르알데하이드 3-인산 탈수소효소 (GAPDH, Hs99999905_m1), 2) SRY-박스 9 (Sox9, Hs01001343_g1), 3) II형 콜라겐 알파 1 사슬 (Col II, Hs002640051_m1), 4) 아그레칸 (ACAN, Hs00153936_m1), 5) X형 콜라겐 알파 1 사슬 (ColX, Hs00166657_m1), 6) 알칼리성 포스파타아제 (ALPL, Hs01029144_m1), 7) 기질 금속단백질분해효소 13 (MMP13, Hs00942584_m1), 11) β-카테닌 (Hs00355049_m1), 12) 뼈형성 단백질 2 (BMP2, Hs00154192_m1), 13) 연골 올리고머 기질 단백질 (COMP, Hs00164359_m1). 모든 프라이머들은 Applied Biosystems에서 제조하였다. 상대적 유전자 발현은 정량을 위한 비교 CT 방법으로 계산하였다. 유전자 발현은 GAPDH 발현 수준으로 정규화하였다. 연골형성 세포 분화의 경우, 발현 수준은 단층 3주 대조군을 기준으로 하고, 시간 비교 분화 발현 수준은 시간 0 단층 대조군을 기준으로 한다.
분화 후 조작과 재부착
구조적 변화를 가늠하는 이식 가능성을 보기 위해, 3주간 연골형성 세포 분화된 수축 시트를 메스를 사용하여 반으로 절단하였다. 각 시트의 반을 즉시 4% PFA에 15분간 고정하고 파라핀으로 매립하였다. 각 시트의 나머지 반을 새로운 FBS로 코팅된 35 mm 조직 배양 플라스틱 접시에 다시 도말하였다. 상기 세포 시트를 옮기기 위해, 이를 세포 배양 삽입체 막으로부터 살짝 밀어내어 겸자를 이용하여 수동으로 새 접시로 옮겼다. 시트들을 2차 표면에 놓은 후, 소량의 연골형성 배지에서 1시간 동안 항온배양하여 부착시켰다. 1시간 후, 새로운 연골형성 배지를 첨가하고, 세포 시트들을 저산소 항온배양기로 옮겼다. 3일간의 배양 기간 동안 매일 시트 가장자리의 세포들에 대하여 명시야 이미지를 촬영하였다. 3일 후, 세포 시트의 절반을 4% PFA 중에서 15분간 고정시키고 파라핀으로 매립하였다.
표적 조직 부위에 대한 이식 가능성을 보기 위해, 3주간 연골형성 세포 분화된 수축 시트를 메스를 사용하여 4분의 1로 절단하였다. 각 시트의 4분의 1을 즉시 4% PFA에 15분간 고정하고 파라핀으로 매립하였다. 각 시트의 나머지 4분의 1 조각들은 신선한 생체외 인간 관절 연골 조각들 (약 2 cm2)의 꼭대기 쪽에 이식하였다. 과정을 진행하는 동안, 인간 관절 연골 샘플들을 인간 엉덩이 관절 연골에서 채취하였다. 3일간의 공동 배양 후, 연골 샘플 상의 세포 시트들을 4% PFA 중에서 3일간 고정시키고 파라핀으로 매립하였다.
통계 분석
모든 통계 분석은 n=4의 데이터 세트에 대해 수행하였다. 모든 정량 수치들은 평균 및 표준 편차로 나타내었다. 통계적 유의성은 양측, 대응표본 스튜던트 T-검정을 사용하여 계산하였다. 유의성은 *p<0.05및 **p<0.01로 정의하였다.
결과
hBM-MSC의 연골형성 가능성
연골형성 배지 및 저산소 조건에서 3주 후, 펠릿 배양물로서 hBM-MSC는 예상한 양성 연골형성 특성을 나타냈다 (도 2). 3주간 분화된 펠릿들은 모든 연골형성 염색 (알시안 블루 (도 2D), 사프라닌-O (도 2E), II형 콜라겐 (도 2F))에 대해 양성이었다. 3주 대조군 펠릿들은 모든 연골형성 염색에 대해 음성이었다 (도 2A-C). RT-PCR을 사용한 유전자 분석을 통해, 연골형성 마커 (Sox9 (도 2G), II형 콜라겐 (도 2H), 아그레칸 (도 2I))의 발현이 3주 대조군 펠릿들에 비해 3주간 분화된 펠릿들에서 유의하게 증가되었음을 알 수 있었다. 상기 데이터는 hBM-MSC의 연골형성 가능성을 뒷받침하는 것이다.
hBM-MSC 세포 시트의 내생적 분리후 수축
세포 시트들은 온도 반응성 배양 접시에서 분리된 후 자발적 수축을 거치게 된다. 내생적 분리 후 수축은, 수축된 세포 시트 (도 1B,D)의 크기와 구조를 비수축 조건 (도 1A,C)에 비해 현저히 변화시킨다. 수축된 세포 시트들은 비수축 시트에 비해 직경이 29.2% 감소하고 (도 1E), 구조체의 두께가 883% 증가한다 (도 1F).
수축 시트로서 hBM-MSC의 연골형성 가능성 증가
3주간의 연골형성 세포 분화는 결과적으로 세포 시트의 양성적 연골형성을 유도하였다 (도 11). 수축되지 않은 세포 시트들은, 수축되지 않은 3주 대조군 시트 (도 11)와 비교하였을 때, 알시안 블루 (도 11), 사프라닌-O (도 11) 및 II형 콜라겐 (도 11)에 대해서 약간의 양성적인 연골형성 염색을 나타냈다보였다. 양성적인 알시안 블루 염색은 해당 샘플의 산성 점액질 함량과 상관관계가 있는 더 진한 청색으로 나타난다. 사프라닌-O는 GAG 함량에 대하여 양성 황산화 프로테오글리칸을 진한 적색으로 염색시키고, 다른 모든 ECM을 청색으로 대비염색시킨다. II형 콜라겐은 적색 형광 (유사)으로 표시되고, 핵은 DAPI (청색)로 대비염색된다. 상기 수축된 시트들은, 3주의 수축 대조군 (도 11) 및 연골형성 비수축 시트들과 비교하였을 때, 모든 연골형성 마커들 (알시안 블루 (도 11), 사프라닌-O (도 11), II형 콜라겐 (도 11))에 대해 짙게 염색되었다. 상기 분화된 수축 시트들도 성숙한 유리질 연골과 관련이 있는 골소강 형태를 나타내었다. 모든 연골형성 마커들 (Sox9 (도 11Q), Col II (도 11S), 아그레칸 (도 11R))에 대한 유전자 발현은, 3주간의 분화 후 비수축 시트들에 비해 수축된 시트들에서 크게 증가하였다. 게다가, 수축 시트들은, 두께가 비수축 시트들에서 23배 증가했던 것에 반해, 3주간의 분화 후 30배의 두께 증가를 나타내었다 (도 11). 분화 후 이러한 두께의 증가는, 수축 또는 비수축 시트 내의 세포수를 크게 변화시키지 않는데 (도 11), 이는 연골형성 수축 세포 시트의 두께 증가가 연골형성과 관련된 ECM 침착에 의해 유도됨을 시사하는 것이다.
연골형성 세포 분화를 위한 세포골격 구조 변화
세포골격 배열은 팔로이딘 (f-액틴) 형광 염색으로 관찰되었으며, 핵은 DAPI에 의해 확인되었다 (도 10 및 11). 0일째에, 비수축 시트들은 MSC의 표준 단층 배양과 관련이 있는 신장되고 정렬된 세포골격 구조를 나타낸다 (도 10 및 11). 그에 반해, 분리 후 수축하게 둔 세포 시트들은 0일째에 보다 무작위적인 교차된 섬유 구조를 나타냈다 (도 10 및 11). 3주간의 분화 후, 3주 분화된 수축 시트 세포들 중 대다수의 세포들은 성숙한 연골세포와 관련이 있는 응축된 둥근 세포골격 구조를 나타낸다 (도 10 및 11). 비수축 시트의 일부 세포들은 이러한 둥근 세포골격 구조를 나타내지만; 3주간 분화된 비수축 시트의 대다수의 세포들은 보다 가변적인 MSC 유사 구조를 가진다 (도 10 및 11). 이러한 세포골격 변화 이외에도, 수축된 시트들은 비수축 시트들 (도 10 및 11)과 비교하였을 때, 세포-세포 상호작용 (β-카테닌 (도 10 및 11)) 및 연골형성의 유도 및 개시 (BMP2 (도 10 및 11), COMP (도 10 및 11))와 연관이 있는 ECM 구성성분들에서의 현저한 증가를 나타내었다.
시간의 경과에 따른 세포 시트의 연골형성 세포 분화
시간이 경과함에 따른 수축된 세포 시트와 펠릿의 연골형성 세포 분화는, 연골형성과 매우 유사한 진행 과정을 나타내며, 수축된 세포 시트에서 황산화 GAG 축적이 조금 더 일찍 시작되는 것으로 보인다 (도 12). 펠릿 배양물과 수축된 시트는 모두 0일째에 사프라닌-O 염색에 대해 음성이다 (도 12). 1주간 분화에 의해, 수축된 세포 시트들 (도 12)은 샘플 전체에 걸쳐 펠릿 배양물 (도 12)에 비해서 더 넓은 사프라닌-O 염색을 나타내지만, 염색은 두 양 샘플 모두에서 매우 희미하다. 상기 사프라닌-O 염색과 함께, 수축된 시트들은 펠릿 배양물과 비교하였을 때, 연골형성의 유도 및 개시 (BMP2 (도 12), COMP (도 12))와 관련된 ECM 성분들에 있어서 현저한 증가를 나타내었다. 3주간 분화에 의해, 수축된 세포 시트들 (도 12)과 펠릿들 (도 12)은 모두 사프라닌-O에 대하여 짙게 염색되었고, 골소강 형태를 나타내었다. 유전자 분석은, 수축된 시트와 펠릿의 4주간의 분화 동안에 연골형성 마커 (Sox9 (도 12) 및 II형 콜라겐 (도 12)) 발현에 대해서 유사한 경향을 보여주고 있다. 수축된 시트와 펠릿 모두에 있어서 Sox9 발현은 초기 연골형성 동안에 증가한 후, 샘플들이 계속 분화함에 따라 감소한다. 연골형성 마커 발현은 분화 도중의 어느 시점에서든 수축된 시트와 펠릿 사이에서 크게 다르지 않다.
수축된 세포 시트의 비대 개시 지연
수축된 시트는 표준 펠릿 배양물과 비교하였을 때 비대 특성의 개시가 지연되었음을 알 수 있다 (도 12). 비대 마커인 MMP13에 대한 면역조직화학 염색은 0일째의 펠릿과 수축 시트에서 음성이다 (도 12). 펠릿 배양물에서의 MMP13 염색은 2주까지는 음성이거나 낮게 유지되지만 (도 12), 3주 및 4주 샘플들에서는 모두 높게 발현된다 (도 12). MMP13 염색은 3주까지는 수축된 시트 샘플들에서 음성이거나 낮고 (도 12), 4주 샘플에서만 양성이다 (도 12). X형 콜라겐 유전자 발현은 수축된 시트와 펠릿 모두의 경우에서 연골형성 세포 분화과정 동안에 증가한다 (도 12). X형 콜라겐의 발현은 3주 및 4주 분화에서 모두 수축된 시트에서보다 펠릿 배양에서 현저하게 높다. 모든 샘플에서, MMP13 유전자 발현은 초기 연골형성 동안에는 낮고, 분화 후기 단계 동안 증가하기 시작한다 (도 12). MMP13 발현의 증가는 수축된 시트 배양의 경우 (3주에서 4주 사이)에서보다 펠릿 배양에서 더 일찍 (2주에서 3주 사이) 발생한다. 3주차 분화에서 MMP13의 발현은 수축된 세포 시트에 비해 펠릿에서 현저히 더 높다.
분화 후 수축된 세포 시트는 구조적 특성을 손상시키기 않으면서 조작하여 2차 생물체 표면으로 옮길 수 있다.
3주간 분화되었던 수축된 세포 시트들은 조작하여 새로운 접시에 옮겨서 3일 동안 강하게 부착시킬 수 있었다 (도 13). FBS로 코팅된 접시에서 3일간의 2차 배양 후, 세포 시트들을 수거하여 고정시키고 사프라닌-O로 염색하였다. 상기 염색을 통해서, 이동 후 세포 시트의 구조와 함량에는 뚜렷한 영향이 없는 것을 알 수 있었다 (도 13). 그에 반해, 2차 배양접시에 옮겨진 펠릿 배양물은 사프라닌-O 염색이 감소하고 펠릿 형태에서 약간의 변화를 나타냈다 (도 13). 3일간의 2차 배양 후, 수축된 시트들은 세포 시트의 기저면에 국한된 라미닌 세포 부착 염색을 유지하였던 반면 (도 13), 펠릿의 라미닌 염색은 해당 펠릿 주변부 부근에 국한되어 있고 세포 시트 배양물에 비해 경계면 표면에서 더 약하다 (도 13). 2차 배양 동안, 펠릿 배양물 (도 13)에서의 최소 세포 이동과 지연된 진행과 비교하였을 때, 분화된 수축 시트 (도 13)를 이동시킨 후 빠르게는 24시간 후에 세포 시트의 가장자리에서 세포 이동을 볼 수 있었는데, 이는 펠릿 배양물보다 수축된 시트에서 표면에 대한 더 강한 접착력과 세포들의 더 강한 생존력이 있음을 의미하는 것이다.
분화 후 세포 시트는 3일 동안 신선한 생체외 연골 표면에 강하게 부착된다 (도 14). 라미닌 세포 부착 염색은 시트와 연골 표면 사이의 계면에서 가장 강한데 (도 14), 이는 세포 시트와 표적 조직 사이의 강한 부착 및 상호작용이 있음을 의미하는 것이다.
실시예 2
관절 연골 국소 결함 치유 요법에 사용되는 여러가지 줄기 세포들은 시험관 내 펠릿 배양을 이용하였을 때 연골형성 잠재력을 나타내지만; 이러한 잠재력은 세포들이 생체재료 스캐폴드에 씨딩되는 경우에는 거의 유지되지 않는다. 세포 시트 조직 공학은 스캐폴드 필요조건을 요구하지 않으며 배양물로부터 직접적인 세포 이식을 가능케한다. 연골 치료를 위한 인간 MSC 시트를 개발하기 위해서는, 시트 형태로 세포의 연골형성 능력을 유지하는 것이 중요하다.
본 연구는 세포 시트 기술을 사용하여 시험관 내에서 MSC로부터 바로 사용할 수 있는 유리질과 같은 연골 구조체를 제조하는 것을 목표로 한다. 본 연구는 추가로, 세포 시트가 유리질 같은 표현형으로 연골형성 세포 분화한 후에 이식 능력을 유지하여, 해당 구조체의 구조적 또는 연골형성 특성을 손상시키지 않으면서 자발적인 부착 및 표적 조직 부위와의 상호작용을 가능하게 함을 입증하고 있다 (도 9). 본 연구는, 이식된 세포들이 재생 치료를 위해 생체 내에서 유리질 연골을 확립하는 시간을 줄일 수 있는, 사전 분화시킨 유리질 같은 세포 시트 구조체의 개발에 대해 기술하고 있다.
1. 재료 및 방법
1.1. 세포 배양
계대수 2의 Lonza로부터 구입한 hBM-MSC를 10% 소태아 혈청 (FBS) (Thermo Fisher Scientific, 미국 매사추세츠주), 1% 페니실린 스트렙토마이신 (PS) (Gibco, 미국 뉴욕주) 및 5 ng/mL의 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF) (PeproTech, 미국 뉴저지주)가 보충된 고글루코스 (4.5 g/L) 둘베코의 변형된 이글 배지 (HG-DMEM) (Life Technologies, 미국 캘리포니아주)를 함유하는 성장 배지 중에 3,000 개의 세포/cm2로 플레이팅한 뒤, 가습 환경 (37℃, 5% CO2)에서 항온배양하였다. 1일 및 5일째에 배지를 교체하고, 90% 밀집 증식될 때까지 세포들을 약 7일간 배양하였다. 세포들을 0.05% 트립신-EDTA (Gibco)를 사용하여 계대접종한 후, 상기 세포 현탁액을 혈구계수기를 사용하여 계수하였다. 세포를 증식시키고 계대수 3 및 4로 보관하여 계대수 5의 실험에 사용하였다.
1.2. 세포 시트와 펠릿 제조 및 연골형성 세포 분화
계대수 5의 hBM-MSC를 펠릿 배양을 위한 15 mL의 원뿔형 튜브에서 2.5 x 105개의 세포로 20% FBS 성장 배지 중에 분취하고, 단층 배양을 위한 1.0 ㎛ 직경의 공극의 6-웰 세포 배양 삽입체 (Falcon, 미국 네브래스카주) 및 세포 시트 배양을 위한 35 mm 직경의 UpCell 접시 (CellSeed, 일본 도쿄)에 6.7 x 104개의 세포/cm2로 씨딩하였다. 펠릿 제조를 위해, 원뿔형 튜브들을 500 xg에서 10분간 원심분리하였다. 캡을 느슨하게 풀고, 세포들을 표준 항온배양기 (37℃, 5% CO2)에서 3일간 항온배양하여 펠릿을 형성하였다. 세포 시트 제조를 위해, 세포들을 5일간 배양하였다. 5일째에, 세포 시트들을 20℃로 옮겨 1시간 동안 방치한 후, 겸자를 사용하여 분리하였다. 세포 시트를 재도말하기 위해, 1.0 ㎛의 공극의 6-웰 세포 배양 삽입체를 세포 시트 재도말 전에 밤새 FBS로 컨디셔닝하였다. 시트를 옮기기 전에 삽입체들을 1 x 인산염 완충 식염수 (PBS) (Gibco)로 2회 세척하였다. 분리된 세포 시트들을 오버헤드 프로젝터 폴리에스테르 필름 (Apollo, 미국 뉴욕주)을 사용하여 상기 컨디셔닝된 세포 배양 삽입체로 옮겨, 삽입체 웰 배양 표면과 기저 접촉되도록 한 후, 표준 배양기에서 20 μL의 성장 배지 중에서 1시간 동안 항온배양하였다. 1시간 후, 신선한 세포 성장 배지를 상기 시트들에 첨가하고, 이들을 추가로 3일간 항온배양하여 시트 부착을 담보하고 펠릿 배양물 항온배양 기간과 유사하게 하였다. 3일간의 항온배양 단계 후, 연골형성 샘플을 연골형성 배지로 유도하고, 대조군 샘플을 10% FBS 세포 성장 배지에 보관한 후, 모든 샘플들을 저산소 항온배양기 (37℃, 5% CO2, 5% O2)로 옮겼다. 연골형성 배지는 10 ng/mL의 형질전환 성장 인자 베타-3 (TGFβ3) (Thermo Fisher Scientific), 200 ng/mL의 뼈형성 단백질-6 (BMP6) (PeproTech), 1% 인슐린-트랜스페린-셀레늄 (ITS-G) (Thermo Fisher Scientific), 1% PS (Life Technologies), 1% 비필수 아미노산 (NEAA) (Thermo Fisher Scientific), 100 nM의 덱사메타손 (MP Biomedicals, 미국 오하이오주), 1.25 mg/ml의 소혈청 알부민 (BSA) (Sigma-Aldrich, 미국 미주리주), 50 ㎍/mL의 L-아스코르브산 2-포스페이트 (Sigma-Aldrich), 40 ㎍/mL의 L-프롤린 (Sigma-Aldrich) 및 5.35 ㎍/mL의 리놀레산 (Sigma-Aldrich)이 보충된 HG-DMEM을 포함하였다. 연골형성 및 대조군 샘플의 경우, 배지는 분화 기간 (0일~3주) 동안 주 2회 교체하였다.
1.3. 조직학적 분석
4% 파라포름알데하이드 (PFA) (Thermo Scientific)로 15분간 고정한 후, 샘플들을 파라핀으로 매립하였다. 매립된 샘플들은 4 ㎛로 박편으로 만들었다. 세포 형태를 확인하기 위해, 표준 방법에 따라 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색을 수행하였다. 간략히 설명하면, 샘플들을 메이어의 헤마톡실린 (Mayer's Hematoxylin) (Sigma-Aldrich)으로 4분간 염색하고, 에오신 (Thermo Scientific)으로 4분간 염색하였다. 성숙한 연골형성을 감지하기 위해, 표준 방법에 따라 사프라닌-O 염색을 수행하였다. 간략히 설명하면, 샘플들을 바이게르트의 철 헤마톡실린 (Wiegert's Iron Hematoxylin) (Sigma-Aldrich)으로 4분, 0.5 g/L의 패스트 그린 (Sigma-Aldrich)으로 5분, 0.1% 사프라닌-O (Sigma-Aldrich)로 8분간 염색하였다. 모든 샘플들은 밤새 건조시킨 후, AmScope 소프트웨어 (미국)를 사용하여 BX 41 광시야 현미경 (Olympus, 일본) 으로 이미지를 촬영하였다. 사프라닌-O로 염색된 슬라이드 단면 박편들을 사용하여 세포 시트 두께와 핵 밀도를 계산하였다. 각 세포 시트 슬라이드에 대해, 세포 시트의 길이를 따라 3장의 사진을 촬영하였다. AmScope 소프트웨어에 내장된 측정 도구를 사용하여, 시트의 꼭대기에서 기저부 가장자리까지 사진당 5번의 측정이 이루어졌으며, 이러한 측정들은 시트를 따라 고르게 간격을 벌려두고 하였다. 핵 계수는 시트당 동일한 3장의 사진을 사용하여 수행하였다. AmScope 소프트웨어에 내장된 측정 도구를 사용하여, 500 ㎛ 길이의 세포 시트를 표시하였다. ImageJ 소프트웨어 (NIH, 미국)를 사용하여 표시된 박편 내에서 핵수를 계수하였다. 세포 시트 직경 계산을 위해서, ImageJ 소프트웨어를 사용하여 해당 시트들의 육안으로 본 이미지를 분석하였다. 그룹당 4개의 세포 시트에 대해 5번의 직경 측정을 수행하였다. 모든 측정치들은 각 샘플 그룹에 대해 평균을 내었다.
1.4. 면역조직화학 분석
단면 IHC 분석을 위해, 샘플들을 4% PFA로 삽입체 막에 15분간 고정하고 파라핀으로 매립하였다. 매립된 샘플들을 4 ㎛ 박편으로 만들어, 성숙한 연골형성을 감지하기 위해 I형 및 II형 콜라겐에 대해 염색하고, 비대성을 감지하기 위해 MMP13에 대해 염색하며, 부착 분자들을 감지하기 위해 라미닌에 대해 염색하였다. 간략히 설명하면, 항원 복원은 50X 저(Low) pH 표적 복원 용액 (Dako, Agilent Technologies, 미국 캘리포니아주)의 1:50 희석액과 함께 압력솥에서 저압으로, II형 콜라겐 샘플의 경우 106-110℃에서 15분간 항온배양하였고, I형 콜라겐, MMP13 및 라미닌 샘플의 경우 프로테이나아제 K (Dako, Agilent Technologies)와 함께 실온에서 6분간 항온배양하였다. 라미닌 샘플을 0.1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich)으로 실온에서 10분간 투과시켰다. II형 콜라겐, MMP13 및 라미닌 샘플들의 경우에는 10% 정상 염소 혈청 (Vector Laboratories, 미국 캘리포니아주) 및 I형 콜라겐 샘플들의 경우에는 5% 정상 당나귀 혈청 (Abcam)을 사용하여 실온에서 30분간 비특이적 결합을 차단시켰다. 이후, II형 콜라겐, I형 콜라겐, MMP13 및 라미닌 샘플들을 각각 항-II형 콜라겐 1차 항체 (Thermo Fisher Scientific)의 1:200 희석액, 항-I형 콜라겐 1차 항체 (Thermo Fisher Scientific)의 1:200 희석액, 항-MMP13 1차 항체 (Abcam)의 1:100 희석액 또는 항-라미닌 1차 항체 (Abcam)의 1:100 희석액 중에서 4℃로 밤새 항온배양하였다. 샘플들을 1×PBS로 세척하고 II형 콜라겐, MMP13 및 라미닌 샘플들의 경우에는 염소 항-래빗 488 2차 항체 (Thermo Fisher Scientific)의 1:200 희석액, 또는 I형 콜라겐 샘플들의 경우에는 염소 항-당나귀 594 2차 항체 (Thermo Fisher Scientific)의 1:200 희석액 중에서 커버를 씌워 실온으로 2시간 동안 항온배양하였다. 2시간 후, 샘플들을 1×PBS로 세척하고 DAPI 함유 봉입재 (Invitrogen, 미국 매사추세츠주)로 봉입하였다. Zeiss Axio 광시야 현미경과 ZEN 소프트웨어로 샘플들을 시각화하였다. AmScope 소프트웨어를 사용하여 BX 41 광시야 현미경으로 샘플들을 시각화하였다. 세포골격 배열을 확인하기 위해, 팔로이딘 (F-액틴) 염색을 수행하였다. 간략히 설명하면, 샘플들을 0.1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich)을 사용하여 15분간 투과시키고 1×PBS로 세척하였다. 다음으로, 샘플들을 팔로이딘 알렉사플루오르 488 (Life Technologies)과 함께 실온에서 커버를 씌워 30분간 항온배양하였다. 이후, 샘플들을 1×PBS로 세척하고 DAPI 용액 (2 방울/mL, Life Technologies)과 함께 실온에서 5분간 항온배양하였다. 그런 다음, 샘플들을 1×PBS로 세척하여 봉입을 준비하였다. 샘플들을 공초점 현미경 (Nikon A1 - NIS Elements AR 소프트웨어)을 사용하여 이미지를 촬영화였다. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 이미지를 준비하였다.
1.5. 실시간 정량적 PCR 분석
막자 모터 믹서를 가지고 1 mL TRIzol/샘플 (Ambion, Life Technologies, 미국 캘리포니아주)을 사용하여 샘플들의 RNA를 추출하였다. 제조사의 지침에 따라 PureLink RNA 미니 키트 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific)로 총 RNA를 분리하였다. cDNA 합성을 위해, 모든 비교용 샘플들을 동시에 합성하였다. cDNA를 합성하기 전에, Nanodrop 분광광도계 (Thermo Scientific, 미국)로 RNA를 정량하고, 모든 cDNA 샘플들은 1 ㎍의 RNA/샘플로 준비하였다. 순도 (A260/A280)가 1.8보다 큰 모든 샘플들을 사용하기에 충분히 순수한 것으로 간주하였다. cDNA 합성은 제조사의 지침에 따라 고성능 cDNA 역전사효소 키트 (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, 미국 매사추세츠주)를 사용하여 수행하였다. RT-PCR 분석은 Applied Biosystems Step OnePlus 장비를 사용하여 TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific)를 가지고 수행하였다. 유전자 발현 수준을 하기 유전자들에 대해 분석하였다: 1) 하우스키핑 유전자로서 글리세르알데하이드 3-인산 탈수소효소 (GAPDH, Hs99999905_m1), 2) β-액틴 (Hs99999903_m1), 3) β-카테닌 (Hs00355049_m1), 4) 뼈형성 단백질 2 (BMP2, Hs00154192_m1), 5) 연골 올리고머 기질 단백질 (COMP, Hs00164359_m1), 6) SRY-박스 9 (SOX9, Hs01001343_g1), 7) 아그레칸 (ACAN, Hs00153936_m1), 8) II형 콜라겐 알파 1 사슬 (COL2A1, Hs00264051_m1), 9) I형 콜라겐 알파 1 사슬 (COL1A1, Hs00164004_m1), 10) X형 콜라겐 알파 1 사슬 (COLX, Hs00166657_m1), 11) 기질 금속단백질분해효소 13 (MMP13, Hs00942584_m1). 모든 프라이머들은 Applied Biosystems에서 제조하였다. 상대적 유전자 발현은 정량을 위한 비교 CT 방법으로 계산하였다. 유전자 발현은 GAPDH 발현 수준으로 정규화하였다. 세포골격 분석 및 시간 비교 분화의 경우, 발현 수준은 0일 2D 단층 대조군을 기준으로 하고, 연골형성 세포 분화의 경우, 발현 수준은 2D 단층 3주 대조군을 기준으로 한다.
1.6. 분화 후 조작과 재부착
분화 후 구조적 변화와 조작 및 부착 능력을 평가하기 위해, 3주간 연골형성 세포 분화된 수축 hBM-MSC 시트를 메스를 사용하여 반으로 절단하였다. 각 시트의 반을 즉시 4% PFA에 15분간 고정하고 파라핀으로 매립하였다. 각 시트의 나머지 반을 FBS로 코팅된 35 mm 조직 배양 플라스틱 접시에 다시 도말하였다. 상기 세포 시트를 옮기기 위해, 세포 시트의 절반을 세포 배양 삽입체 막으로부터 살짝 밀어내어 겸자를 이용하여 수동으로 FBS 코팅된 새 배양 접시로 옮겼다. 시트들을 2차 표면에 놓은 후, 연골형성 배지에서 1시간 동안 항온배양하여 부착시켰다. 1시간 후, 신선한 연골형성 배지를 첨가하고, 세포 시트들을 추가의 배양을 위해 저산소 항온배양기로 옮겼다. Zeiss Axio 명시야 현미경과 ZEN 소프트웨어를 사용하여 3일의 배양 기간 동안 0~72시간 사이의 시트 가장자리에서 세포들의 명시야 이미지들을 캡처하였다. 3일 후, 세포 시트의 절반을 4% PFA 중에서 15분간 고정시키고 파라핀으로 매립하였다. 비교를 위해, 3주차 연골형성 세포 분화된 펠릿들을 FBS 코팅된 35 mm 조직 배양 플라스틱 접시에 다시 도말하였다. 펠릿들을 부드럽게 피펫팅하여 수동으로 새로운 배양 표면으로 옮겼다. 펠릿들을 2차 표면에 놓은 후, 소량의 연골형성 배지에서 1시간 동안 항온배양하여 부착시켰다. 1시간 후, 신선한 연골형성 배지를 첨가하고, 펠릿들을 저산소 항온배양기로 옮겨서 추가로 6시간 동안 배양하였다. 구조체 부착 효율은, 이동된 시트 또는 펠릿의 총수에 대한 상기 추가의 6시간 배양 후 부착된 시트 또는 펠릿들의 비율로서 정량하였다 (n = 6).
1.7. 분화 후 이식 가능성
목표 연골 조직에 대한 이식 가능성을 알아보기 위해, 3주차 연골형성 세포 분화된 수축 시트를 메스를 사용하여 4분의 1로 절단하였다. 각 시트의 4분의 1을 즉시 4% PFA에 15분간 고정하고 파라핀으로 매립하였다. 각 시트의 나머지 4분의 1 조각들은 통상적인 고관절 관절경 검사 절차 도중에 인간 고관절 연골에서 버려진 개인정보를 제거한 조직으로 수거된 신선한 (수거 당일) 생체 외 인간 관절 연골 조각들 (약 2 cm2)의 꼭대기 측에 이식하였다. 저산소 항온배양기에서 3일간의 공동 배양 후, 연골 샘플 상의 세포 시트들을 4% PFA 중에서 3일간 고정시키고 파라핀으로 매립하였다.
1.8. 통계 분석
모든 통계 분석은 n ≥ 4의 생물학적 반복 실험군의 데이터 세트에 대해 수행하였다. 모든 정량 수치들은 평균 ± 표준 편차로 나타내었다. 통계적 유의성은 데이터의 정규 분포를 가정하는 양측 대응표본 스튜던트 t-검정을 사용하여 평가하였다. 이 통계 분석을 위한 충분한 정규 분포는 데이터의 왜도가 ≥-0.8 및 ≤+0.8인 것으로 정의하였다. 통계적 유의성은 p≥0.05, *p<0.05및 **p<0.01을 유의하지 않음 (ns)으로 정의하였다.
2. 결과
2.1. hBM-MSC 시트의 자발적 분리 후 수축
배양된 인간 골수 유래 중간엽 줄기 세포 (hBM-MSC) 시트들은 온도 반응성 배양 접시에서 분리된 후 자발적으로 수축되었다 (도 15). 자발적인 분리 후 수축은, 2D 단층 세포 배양 조건과 비교하였을 때, 생성된 3D 수축된 세포 시트의 크기와 구조를 상당히 변형시켰다 (도 15). 2D 단층 세포 배양 조건에 비해서, 분리 후 세포 시트 수축 후의 hBM-MSC 시트들은 직경의 상당한 감소 (3.5배 감소, p = 1.77E-5)(도 15)와 두께 증가 (7배 증가, p = 3.63E-6)(도 15)를 나타내었다.
2.2. 연골형성 가능성에 대한 시트 세포골격 변화
배양된 hBM-MSC 시트 세포골격 배열은 팔로이딘 (F-액틴) 형광 염색으로 관찰하였으며, 핵은 DAPI로 확인하였다 (도 10a,b). 0일째에, 2D 배양물 내의 세포들은 MSC의 표준 부착 배양과 관련이 있는 신장되고 정렬된 세포골격 구조를 나타냈다 (도 10A). 그에 반해, 분리 후 수축시킨 수거된 hBM-MSC 세포 시트들은 더 원형의 핵을 갖는 보다 무작위적인 교차된 섬유 구조를 나타냈다 (도 10B). 이러한 세포골격 변화는, 수축된 3D 시트와 2D 단층 배양물 간의 상대적인 β-액틴 유전자 발현 (도 10C)을 기초로, 유의미한 것으로 확인되었다 (p = 0.0194). 이러한 세포골격 변화 이외에도, 수축된 3D 시트들은, 연골형성 유도 전의 2D 단층 배양물과 비교하였을 때, 세포-세포 상호작용의 β-카테닌 (p = .00865),및 연골형성유발 신호전달 분자인 BMP2 (p = .0000457)와 COMP (p = .000947)에서 상당한 증가를 나타냈다 (도 10D-F) .
2.3. 3D 수축 시트로 hBM-MSC의 연골형성 가능성 증가
연골형성 가능성이 있는 것으로 익히 알려진 MSC 공급원으로 hBM-MSC를 선택하였고, 이는 표준 3D 펠릿 배양물에서도 확인되었다 (도 2 참조). 3D 수축 세포 시트로서 수확한 hBM-MSC의 3주 연골형성 세포 분화 결과, 양성 유리질 유사 연골형성이 유도되었다 (도 11). 대조군 샘플이 아닌 3주 분화된 샘플에서 양성 사프라닌-O 및 II형 콜라겐 염색이 확인되었다 (도 11a-d, g-j). 사프라닌-O는 황산화 프로테오글리칸을 적색으로 염색시키고 (적색의 강도는 GAG 함량에 비례함), 패스트 그린은 다른 ECM 단백질들을 청색으로 대비염색시킨다. II형 콜라겐은 적색 형광 (유사 적색 면역염색)으로 표시되고, 핵은 DAPI (청색)로 대비염색된다. 단층 2D hBM-MSC 배양물은, 3주 분화 후 사프라닌-O (도 11G) 및 II형 콜라겐 (도 11I)에 대해 약간의 양성 연골형성 염색을 나타냈다. 3주 분화 후의 3D 수축 시트들은, 연골형성 2D 배양물 (도 11G,I)과 비교하였을 때, 모든 연골형성 마커들 (사프라닌-O (도 11H) 및 II형 콜라겐 (도 11J))에 대해서 더 짙게 염색되었다. 상기 분화된 3D 수축 시트들도 성숙한 유리질 연골과 관련이 있는 골소강 구조를 생성하였다 (도 11H). 3주간의 분화 후, 3주 분화된 수축 시트들의 대부분의 세포들은 성숙한 연골세포와 관련이 있는 응축된 둥근 세포골격 구조를 나타냈다 (도 11N). 2D 단층 배양물의 일부 세포들도 이러한 둥근 세포골격 구조를 나타냈으나; 3주 분화된 단층에서의 대다수의 세포들은 보다 다양한 방추형 또는 섬유아세포 형태를 나타냈다 (도 11M). 모든 연골형성 마커들의 유전자 발현은, 3주간의 분화 후 2D 세포 배양물과 비교하였을 때, 3D 수축된 세포 시트에서 유의하게 증가하였다 (SOX9 (도 11Q) (p = 0.0044),ACAN(도 11R) (p = 0.0242)및 COL2A1 (도 11S) (p = 0.0126)).또한, 3D 수축된 세포 시트들은, 3주간의 분화 후 2D 배양물 (도 11K)과 비교하였을 때, I형 콜라겐 에 대하여 II형 콜라겐이 상당히 더 높은 비율로 발현되었으며 (도 11T) (p = 0.0107),I형 콜라겐 (도 11L)의 경우 최소한으로 염색되었다. 게다가, 3D 수축 시트들은 3주간의 분화 후 두께가 30배 증가했는데, 이는 2D 세포 배양물 두께의 23배 증가 (도 11O) (p = 4.26E-6)보다 훨씬 더 큰 것이다. 분화 후 두께에서의 이러한 증가는, 3D 수축 세포 시트 또는 2D 세포 배양물 내에서 세포수를 크게 변화시키지 않았는데 (도 11P) (p = 0.422(3D);0.997(2D)),이는 연골원성 세포 시트의 두께 증가가 연골형성으로 유도된 ECM 침착의 결과임을 시사하는 것이다.
2.4. 시간의 경과에 따른 세포 시트의 연골형성 세포 분화
시간이 경과함에 따른 3D 수축 세포 시트와 펠릿의 연골형성 세포 분화는, 연골형성과 매우 유사한 진행 과정을 나타내며, 3D 수축 hBM-MSC 시트에서 황산화 GAG 축적이 조금 더 일찍 시작되고, 비대 및 섬유연골 표현형의 발생이 지연되는 것으로 보인다 (도 12). 펠릿 배양물과 3D 시트는 모두 0일째에 사프라닌-O 염색에 대해 음성이었다 (도 12A,E). 1주간 분화 후, 3D 수축된 세포 시트들 (도 12F)은 샘플 전체에 걸쳐 펠릿 배양물 (도 12B)에 비해서 더 넓은 사프라닌-O 염색을 나타내지만, 염색은 양 샘플 모두에서 매우 희미하였다. 3주 분화에 의해, 3D 세포 시트 (도 12H)와 펠릿 배양물 (도 12D) 모두 사프라닌-O (도 12H,D)와 II형 콜라겐 (도 12Q)에 대해 강하게 염색되었던 한편, 골소강 구조도 나타내었다. 유전자 분석을 통해, 수축 시트 및 펠릿에 대한 3주간의 분화 동안 연골형성 마커 발현 (SOX9, COL2A1, ACAN)에서 유사한 경향이 있음을 알 수 있었다 (도 12S). 연골형성 마커 발현은 분화 도중의 어느 시점에서든 3D 시트와 펠릿 사이에서 크게 다르지 않았다 (Sox 9: p = 0.435 (0일째), 0.754 (1W), 0.189 (2W), 0.222 (3W); COL2A1: p = 0.169(0일째), 0.158 (1W), 0.265 (2W), 0.131 (3W); ACAN: p = 0.773(0일째), 0.681 (1W), 0.213 (2W), 0.724 (3W)).
연골형성 발현은 유사했지만, 3D 수축 시트는 표준 펠릿 배양에 비해 비대 및 섬유연골 특성의 발생이 지연되었다. 비대 마커인 MMP13 44,45에 대한 면역조직화학 염색은 0일째의 펠릿 배양물과 3D 시트에서 음성이었다 (도 12I,M). hBM-MSC 펠릿 배양물에서의 MMP13 염색은 2주까지는 음성 또는 최소한으로 나타났으나 (도 12I-K), 3주 샘플들에서는 높게 발현되었다 (도 12L). MMP13 염색은 3주까지는 3D 시트 샘플들에서 음성 또는 최소한으로 나타났다 (도 12M-P). 3주 분화에 의해, 펠릿 배양물은 섬유연골 마커인 I형 콜라겐의 경우에는 강하게 염색되었던 반면에, 3D 수축 시트는 최소한의 I형 콜라겐 양성 염색을 나타내었다 (도 12R). 비대성 X형 콜라겐 유전자 발현은 3D 시트와 펠릿 모두에 대해 연골형성 세포 분화 과정 동안 증가하였으나 (도 12T); X형 콜라겐의 발현은 3주간의 분화 후 3D 시트에서보다 펠릿 배양물에서 상당히 더 높았다 (p = 0.00596). MMP13 유전자 발현은 두 구조체의 초기 연골형성 과정 동안에는 낮았지만, 3주차에 3D 수축 세포 시트와 비교하였을 때, 펠릿에서 유의하게 더 높았다 (도 12T)(p = 0.0114). 연골형성 초기 단계 동안에는 연골형성과 관련이 있지만, 연골형성 세포 분화 후기 단계 동안에 과발현되는 경우에 연골세포 비대와도 관련이 있는 세포-세포 부착 마커인 β-카테닌의 발현은, 유도 당시 3D 세포 시트에서 유의하게 더 높았으나, 그 후에는 hBM-MSC 펠릿 배양물과 비교하였을 때 분화하는 동안 훨씬 더 낮았다 (도 12U) (p = 0.00248(0일); 0.0374 (1W); 0.00591 (2W); 0.0464 (3W)).
2.5. 시트 특성에 영향을 주지 않는 유리질 유사 세포 시트 조작
3주간 분화시킨 3D 수축된 hBM-MSC 시트들은 조작하여 온전한 시트로 새로운 배양 표면으로 옮길 수 있었다 (도 13). FBS 코팅된 표면에서 3일간의 2차 배양 후, 세포 시트를 수확하여 고정시킨 후, 사프라닌-O로 염색하였다. 상기 염색을 통해서, 이동 후 세포 시트의 구조 또는 GAG 조성에는 뚜렷한 변화가 없음을 알 수 있었다 (도 13A,B). 2차 배양 동안, 수확한 분화된 3D 수축 시트들을 이동시킨 후 빠르게는 6시간 후에 세포 시트들의 가장자리에서 세포 이동/증식이 관찰되었는데 (도 13C), 이는 신속하고 자발적인 표면 부착과 세포 생존력을 시사하는 것이다. 3주 분화된 세포 시트들의 경우에서 100% 부착 성공률에 비해서 (6/6 시트가 완전히 부착됨), 신선한 배지를 첨가하여 구조체를 추가로 6시간 동안 배양한 후에, 재도말한 3주 분화된 펠릿들 중 어느 것도 2차 배양 접시에 부착되어 그 상태를 유지할 수 있는 것들은 없었다 (0/6개의 펠릿 부착) (도 13D). 3주 분화된 3D 수축 시트와 펠릿의 면역조직화학 분석을 통해, 부착 분자인 라미닌 염색은 세포 시트 기저면을 따라 강하게 나타났던 반면 (도 13E), 펠릿 배양물의 라미닌 염색은 펠릿 주변부 부근 (경계 표면)에 최소한의 양성 염색을 나타냈다 (도 13F).
2.6. 유리질 유사 세포 시트 이식 가능성
3주 동안 분화된 3D 수축 hBM-MSC 시트들은 신선한 생체 외 인간 관절 연골 조각들에 자발적으로 강력하게 부착될 수 있었다 (도 14). 분화 후 3D hBM-MSC 시트 (도 14A)는 1시간 이내에 새로운 생체외 인간 관절 연골 표면에 강력하게 부착되었고 (도 14B), 계속된 배양에서 적어도 3일간 부착된 상태를 유지하였다. 3일간의 공동 배양 후 사프라닌-O 염색을 통해, 시트와 연골 표면 사이에 기밀한 물리적 접착이 있음을 알 수 있었고, 경계면을 따라서 틈이 거의 없거나 전혀 보이지 않았다 (도 14C). 3일간의 공동 배양 후 라미닌 염색은 시트와 연골 표면 사이의 계면에서 가장 강하게 나타났는데 (도 13E), 이는 세포 시트와 목표 연골 조직 간에 부착이 지속되어 생물학적으로 결합될 수 있음을 뒷받침하는 것이다.
3. 논의
다수의 연구들에서 MSC가 2D 구조보다는 3D 구조에서 연골형성 가능성이 증가하였음을 입증하고 있다. 2D 세포 배양물과 달리, 3D 배양물은 세포들이 연골세포 세포골격 조직과 관련이 있는 둥근 세포 형태를 취하도록 만들어 준다. 수축된 세포 시트들은 세포들이 연골형성 잠재력과 직접적으로 관련이 있는 보다 둥글고 덜 신장된 세포골격 구조를 취하는 이러한 3D 환경을 자발적으로 만든다. 온도 매개형 분리시, 수축된 세포 시트에서 보이는 2D에서 3D 배양물로의 세포골격 재구성 및 전환 (도 1 및 10)은 기질 세포의 텐세그리티 (tensegrity)에서의 변화로 유도될 가능성이 가장 높은데, 이러한 변화로 고정/부착 배양물로부터의 세포 방출이 액틴 필라멘트의 자발적 수축을 가능케 하여 세포 시트 내에서 세포들의 수축을 촉진하게 되는 것이다.
세포 시트 기술은 효소를 수거하거나 내생적 세포-세포 및 세포-ECM 상호작용에 대한 손상 없이 밀집 증식된 시트로서 세포들을 자발적으로 분리시켜, 액틴 필라멘트를 따라 이러한 집합적인 상호작용의 내생적 세포 수축력을 유지하는데, 이것이 시트 수축을 연속하는 단위로서 자극하게 되는 것이다. 상기 분리 후 세포 시트 수축은 3D, 다핵성 두께, 스캐폴드 무함유 세포 시트 구조를 자발적으로 제조하여 (도 1) 세포골격 재구성을 유도한다 (도 10). 또한, 세포골격 구조에서의 이러한 변화들은, 세포 형태와 ECM 구조를 모두 변화시킴으로써 초기 연골형성 응축을 모방하는 역학적 전환 (mechanotransduction)을 자극할 수 있어, 그 결과 연골형성 유도 전에 β-카테닌을 통한 세포-세포 상호작용의 증가와 연골형성유발 신호전달 분자인 BMP2 (세포 응축 조절기) 및 COMP (콜라겐 축적 및 ECM 조립 조절기)의 상향조절을 유도할 수도 있다.
연골형성 유도 전 연골형성유발 신호전달의 구조적 전환과 상향조절의 결과, 연골형성 배지로 유도한 후 연골형성 표현형을 달성하는 3D 수축 세포 시트를 생성하게 된다 (도 11). 건강한 관절 연골은 특히, 유리질 연골형성 표현형, 예컨대 (전단력, 압축력 및 인장력에 대한 저항을 가능하게 하는) II형 콜라겐과 프로테오글리칸이 풍부한 ECM, SOX9와 아그레칸의 발현, I형 콜라겐의 낮은 발현, 골소강 구조의 핵, 및 ECM에 비해 낮은 세포 밀도를 갖는다. 수확된 3D 수축 시트들은 이러한 표준과 분화 후 유리질 유사 표현형에 대한 허용된 벤치마크: ECM 내에 상당한 정도의 II형 콜라겐과 프로테오글리칸 함량, 통상적인 유리질 연골 마커 (SOX9, COL2A1, ACAN)의 높은 발현, 높은 COL2A1/COL1A1 비율을 갖는 I형 콜라겐의 낮은 발현, 및 비교적 낮은 세포 밀도의 골소강 구조의 핵을 갖는 둥근 세포 구조를 성공적으로 달성한다. ECM 조성 (즉, 프로테오글리칸, 아그레칸 및 II형 콜라겐 함량) 이외에도, (3D 수축 시트 분화에서 보이는) ECM 침착도 유리질 연골형성 세포 분화와 관련이 있다. 연골 형성 유도 전 3D 수축 세포 시트 내의 세포골격 재구성은, ECM 조립 및 콜라겐 축적과 직접적으로 관련이 있는 COMP와 BMP2를 상향조절하여, 그 결과 연골형성 유도 후 2D 배양물에서보다 3D 세포 시트에서 훨씬 더 많은 ECM 침착을 유도한다. 배양 표면에서 온도 매개형 분리 시에 자발적인 수축으로 생성된 3D 세포 시트는, 처음에는 세포가 밀집된 구조이지만; 연골형성 과정 동안에 3D 세포 시트 두께를 현저히 증가시키는 ECM 증착은 해당 구조체의 전체 세포 밀도를 감소시킨다. ECM 침착으로 인해 이러한 전체 세포 밀도가 감소한 결과, 천연 유리질 연골 구조와 세포 분포에 더욱 가깝게 일치하는 유리질 유사 조직 구조체가 생성된다.
유리질 유사 표현형으로의 MSC 연골형성 세포 분화의 주된 한계점은, 시험관 내와 생체 내 모두에 있어서 MSC 유래 연골세포의 비대 및 섬유연골을 향한 불가피한 진행이다. 적절한 유리질 유사 연골형성 세포 분화를 위해서 3D 구조가 분명 필요하기는 하지만, 구조체 두께와 세포 밀도가 매질 확산에 영향을 주어, 더 두꺼운 조직에서 낮은 산소 분압 영역을 생성하고 영양소 확산 구배를 증가시킴으로써 연골형성 세포 분화와 비대에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌으므로 구체적인 임계값은 결정되어야 한다. 본 연구에서, 3D 세포 시트는, 시험관 내 대조군 3D 펠릿 배양물과 비교하였을 때, 유사한 연골세포 발생의 진행 과정을 나타냈으나, 비대 특성의 발생은 지연되었다 (도 12). 시험관 내 MSC 유래 연골세포 비대의 유도 기전은 아직은 대체로 알려지진 않았지만, 본 연구에서 관찰된 MSC 시트의 비대 특성의 발생이 지연되었던 것은 해당 시트의 구조적 특성에서 비롯되었을 가능성이 가장 높다. 구체적으로, 본 연구에 사용된 3D 세포 시트들은, 대조군 3D 펠릿 배양물에 비해, 감소된 세포 밀도 때문에 더 얇아서, 구조체 전반에 걸쳐 보다 많고 균일한 배지 확산을 촉진함으로써, 연골형성이 세포 신호전달보다는 주로 배지 보충에 의해 유도될 수 있다. 연골형성 세포 분화 동안 β-카테닌과 같은 세포 신호전달의 지속적인 과발현은, 기준 Wnt 경로의 활성화를 통해 시험관 내에서 연골세포 비대를 유도하는 것과 관련되어 있다. 3D 펠릿 배양물의 더 큰 두께는, 더 높은 세포 밀도와 조합되어, 충분한 영양소 확산을 방해하는데, 이는 상기 세포-세포 상호작용 (즉, β-카테닌 상향조절 (도 12))에 대한 의존도를 증가시켜, 자유 배지에 제대로 노출되지 않은 해당 펠릿들의 핵심에 있는 세포들에게 연골형성 신호를 전파할 수 있다. 이러한 데이터들은 모두, 3D 세포 시트의 구조체 두께와 세포 밀도를 조정하면, 연골형성 과정 동안의 세포 상호작용을 조절하여, 시험관 내에서 MSC 유래 연골세포 비대의 발생을 지연시킬 수 있음을 시사한다. 시험관 내에서 분화하는 동안 비대 또는 섬유연골 표현형으로의 전환을 평가하고 모니터링하는 것이 중요한데, 그 이유는 이러한 표현형들은 안정적인 유리질 유사 조직을 필요로 하는 향후 생체 내 연구에서 장기간의 치료적 유용성을 규정하는데 유해할 것이기 때문이다. 최적의 구조체 두께들과 상기 비대 전환을 유발하는 구체적인 기전을 밝혀내어, MSC 유래 연골세포 비대를 방지하면서 시험관 내에서 유리질 연골을 생성하기 위한 가장 효과적인 시트 제조 매개변수들을 식별하기 위해서는 추가적인 시험관 내 연구가 필요하다.
다양한 분화 플랫폼들이 시험관 내에서 MSC의 유리질 유사 표현형으로의 연골형성 세포 분화를 성공적으로 촉진하였으나; 이러한 분화 생성물들 중 그 어느 것도 인간 용도로 성공적으로 이식된 적은 없었다. 예를 들어, 펠릿 배양물은, 재생된 조직의 부착 능력과 동종성에서의 제약이 있어, 생체 내 치료적 용도보다는 분화 가능성에 대한 시험관 내 유효성 검증에 주로 사용된다. 펠릿 배양물 클러스터는 생체 내 연골 결함을 채우는데 사용되어 왔으며, 해당 펠릿들의 구형 형태의 제약으로 인해 남겨진 빈 공간 (negative space)을 채울 수 있는 일부 능력은 보여준 바 있다. 그러나, 이러한 펠릿 클러스터는 동종성 조직을 생성하지는 않으며, 결함 부위에 이들을 포함하는 추가적인 접착제 또는 지지체 막 없이는 생물체 표면에 강하게 부착하지는 않는다.
세포 시트 기술의 한 가지 특유한 이점은, 내인성 ECM, 세포 상호작용 및 온전한 부착 단백질 (이들 역시 천연 조직들과 상호작용하기 위한 안정적인 세포 배양 환경을 제공함)의 보유를 통해서 스캐폴드 또는 지지 물질 없이도 목표 조직 부위에 세포들을 직접적이고 자발적으로 이식하는 능력이다. 우리의 데이터는, 세포 시트를 분화 후에 이동시켜, 생물체 표면에 부착시킬 수 있음과, 상기 이동이 구조나 연골형성 특성에 영향을 미치지 않는다는 사실을 입증하고 있다 (도 13). 조작 및 이동 후에 시트 연골형성 및 구조적 특성이 유지된다는 사실은, 손상되거나 누락된 유리질 연골을 신속하게 대체하는데 있어 기대되는 부분이다. 또한, 이러한 분화된 세포 시트들은, 신선한 생체외 인간 연골에 강력하게 부착되어, 3일 이내에 천연 연골세포와의 상호작용을 시작할 수 있었다 (도 13). 이러한 내생적 부착 능력은, 분화 후 시트의 기저 표면을 따라 부착 분자들을 유지하기 때문이다 (펠릿 배양물의 주변부에는 풍부하지 않아, 이식 가능성의 불균형을 야기할 수 있음). 표면 부착 분자들의 보유는 연골 결함 부위에서의 세포 시트 생착과 국소화에 도움을 줄 것으로 예상된다. 유리질 유사 세포 시트와 천연 연골 간의 기밀한 물리적 및 생화학적 상호작용은, 숙주 연골로부터의 직접적인 연골형성 신호를 통해 생체 내 시트의 유리질 특성을 유지하는데 도움을 줄 것으로 예상된다. 상기 생체 외 실험은, 다른 모든 결함의 미시적 환경 요인들의 부재 하에서, 세포 시트와 건강한 관절 연골 간에 이상적인 상호작용을 나타낸다. 관절 연골 국소 결함에서 연골형성 세포 분화된 세포 시트에 대한 시트 이식 능력과 치료적 유용성을 완전히 검증하기 위해서는, 장기간의 추적 관찰과 함께 재생 및 면역 반응에 대해 구체적인 초점을 맞춘 생체 내 시험이 필요할 것이다.
본 연구에서, 우리는 1) MSC 시트가 구조적 변형과 세포골격 재구성을 통한 분리 후 자발적인 세포 시트 수축 후에, 스캐폴드 물질 없이도 시험관 내에서 유리질 연골로 연골형성 세포 분화할 수 있고, 2) 이러한 3D MSC 시트가 시험관 내에서 유리질 유사 연골형성 표현형을 유지하면서 비대를 지연시키는 적절한 초기 두께와 세포 밀도를 제공하며, 3) 분화 후, 이러한 3D 세포 시트는 연골 표면에 자발적으로 직접 부착되어, 이들의 구조 및 연골형성 특성을 유지하여 보유된 부착 단백질들을 통해 천연 조직과 상호작용할 수 있음을 입증하였다. 이러한 결과들에 기초하면, 3D MSC 시트는 관절 연골 재생 치료를 위한 동종이계성의 이식가능한 스캐폴드 무함유 유리질 연골 구조체를 개발하기 위한 확실한 플랫폼을 제공한다.
4. 결론
본 연구에 제시된 세포 시트 기반 기술은 시험관 내에서 유리질 유사 특성을 갖는 스캐폴드 무함유 연골 구조체를 제작하기 위한 개선된 전략을 제공한다. 나아가, 유리질 유사 연골세포로 분화된 3D MSC 시트는 구조적 또는 연골형성 특성을 손상시키지 않으면서 연골 조직에 자발적으로 부착하여 이들과 상호작용을 시작한다. MSC를 사용하는 우리의 세포 시트 기반 기술은, 시험관 내에서 이식가능한 유리질 유사 구조체를 생산하는 적응형 플랫폼을 제공하여, 손상된 유리질 관절 연골을 신속하고 직접적으로 대체할 것이다.
실시예 3
실시예 1과 2에 기재된 연골원성 분화 세포 시트의 이식 능력을 국소 연골 결함의 랫트 모델에서 생체 내 평가하였다. 누드 (RNU) 랫트 뒷다리 활차구에 2 mm의 국소 결함을 만들었는데 (도 15A 참조), 여기서 성공적인 결함 생성은 연골하골을 건드리지 않고 (연골하골에서 출혈이 거의 없거나 전혀 보이지 않음) 연골의 전체 두께를 없애게 된다. 3주 연골형성 세포 분화된 유리질 유사 인간 MSC 유래 세포 시트를 결함 생성 시점에 해당 결함부에 이식하였다 (도 15B 참조). 관절이 닫히기 전에, 시트들을 약간 가습된 환경에서 약 30분간 부착되도록 하였다. 이식 2주 후, 무릎 관절을 수거하여 (도 15C) 세포 시트 이식 능력을 평가하였다. 이식 2주 후의 랫트 국소 결함 내의 3주 분화된 인간 세포 시트의 단면 조직학적 분석은 사프라닌-O (도 15D), 헤마톡실린 및 에오신 (도 26E) 및 인간 특이적 비멘틴 면역조직화학 염색 (도 15F)을 이용하여 수행하였다. 양성 사프라닌-O 염색은 이식 부위에서 세포 시트의 양성 유리질 유사 특성이 유지되고 있음을 보여주고 있다 (도 15D). H&E 염색은 숙주 조직과 통합되었음을 나타내고 있다 (도 15E). 비멘틴은 중간엽 유래 세포에서 발현되는 III형 중간체 필라멘트 단백질이기 때문에, 인간 특이적 비멘틴은 이종 숙주 내에서 인간 세포를 특이적으로 식별하는데 사용될 수 있다. 세포 시트 내 이식된 인간 세포는 인간 특이적 비멘틴에 대해 양성인데, 이는 이식 부위에 생착되어 유지되고 있음을 의미한다 (도 15F). 기준자 = 200 ㎛. 종합하면, 이러한 결과들은 연골형성 세포 분화된 유리질 같은 인간 MSC 유래 세포 시트가 연골에 성공적으로 이식되어 유리질 유사 특성을 유지하면서 숙주 조직과 통합될 수 있음을 시사하는 것이다.

Claims (33)

  1. 적어도 2층의 밀집 증식된 (confluent) 연골형성 분화 세포를 포함하는 연골원성 (chondrogenic) 세포 시트로서, 상기 세포 시트가 중간엽 줄기 세포 (MSC)로부터 제조되고, 상기 세포 시트의 기저면 상의 연골형성 분화 세포들이 하나 이상의 부착 분자를 발현하는 것인, 상기 연골원성 세포 시트.
  2. 제1항에 있어서, 상기 MSC가 인간 골수 MSC (hBM-MSC)인 것인, 연골원성 세포 시트.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 세포 시트가 필수적으로 연골형성 분화 세포로 이루어지는 것인, 연골원성 세포 시트.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 세포 시트 중 세포의 적어도 50%가 연골형성 분화 세포인 것인, 연골원성 세포 시트.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 시트가 세포외 기질을 포함하는 것인, 연골원성 세포 시트.
  6. 제5항에 있어서, 상기 세포외 기질이 II형 콜라겐 및 황산화 프로테오글리칸으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 포함하는 것인, 연골원성 세포 시트.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 연골형성 분화 세포가 SOX9, 아그레칸, COL2A1, ACAN, COMP 및 BMP2로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 발현하는 것인, 연골원성 세포 시트.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 시트가 골소강 (lacunae) 구조를 포함하는 것인, 연골원성 세포 시트.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 부착 분자가 피브로넥틴 및 라미닌으로부터 선택되는 것인, 연골원성 세포 시트.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 시트가 연골 표면에 이식된 후 해당 연골 표면에 물리적으로 부착하는 것인, 연골원성 세포 시트.
  11. 연골원성 세포 시트의 제조 방법으로서,
    a) 중간엽 줄기 세포 (MSC)를 밀집 증식할 때까지 온도 반응성 배양기에서 배양하여 세포 시트를 형성하는 단계;
    b) 온도를 감소시켜 상기 세포 시트를 분리하고 상기 세포 시트를 수축시켜, 수축된 세포 시트를 형성하는 단계;
    c) 상기 수축된 세포 시트를 배양 표면과 접촉시키는 단계; 및
    d) 상기 배양 표면의 수축된 세포 시트를 연골형성 배지로 처리하고 배양하여 연골원성 세포 시트를 형성하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 수축된 세포 시트를 배양 표면에서 적어도 3주간 성장시키는 것인, 방법.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 연골형성 배지가 형질전환 성장 인자 베타 (TGFβ) 및 뼈형성 단백질 (BMP)로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 포함하는 것인, 방법.
  14. 제11항에 있어서, 상기 단계 b)의 세포 시트를 하나 이상의 효소로 처리하지 않고 온도 반응성 배양기로부터 분리하는 것인, 방법.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 연골원성 세포 시트.
  16. 연골원성 세포 시트의 이식을 필요로 하는 대상체에게 연골원성 세포 시트를 이식하는 방법으로서, 제1항 내지 제10항 및 제15항 중 어느 한 항의 연골원성 세포 시트를 상기 대상체의 조직에 적용하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 조직이 연골 및 뼈로부터 선택되는 것인, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 연골이 관절 연골인 것인, 방법.
  19. 연골 조직의 복구를 필요로 하는 대상체의 연골 조직을 복구하는 방법으로서, 제1항 내지 제10항 및 제15항 중 어느 한 항의 연골원성 세포 시트를 상기 대상체의 연골에 적용하여 해당 대상체의 연골 조직을 복구하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 연골이 관절 연골인 것인, 방법.
  21. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 국소 연골 결함이 있는 것인, 방법.
  22. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 증상을 보이는 연골 결함이 있는 것인, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 증상을 보이는 연골 결함이 급성 또는 반복적 외상에 의해 유발되는 것인, 방법.
  24. 제16항 내지 제20항, 제22항 및 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 퇴행성 관절 질환이 있는 것인, 방법.
  25. 관절 질환의 치료 또는 예방이 필요한 대상체의 관절 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 제1항 내지 제10항 및 제15항 중 어느 한 항의 연골원성 세포 시트를 상기 대상체의 관절에 적용하여 해당 대상체의 관절 질환을 치료 또는 예방하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 관절이 활막성 관절 및 연골 관절로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 활막성 관절이 무릎 관절, 손목 관절, 어깨 관절, 고관절, 팔꿈치 관절 또는 목 관절인 것인, 방법.
  28. 제25항에 있어서, 상기 관절 질환이 퇴행성 관절 질환인 것인, 방법.
  29. 제25항에 있어서, 상기 관절 질환이 관절 염증, 골관절염, 류마티스 관절염 및 슬개골 연골연화증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  30. 급성 또는 반복적 외상으로 유발된, 증상을 보이는 연골 결함이 있는 대상체의 골관절염을 예방하는 방법으로서, 제1항 내지 제10항 및 제15항 중 어느 한 항의 연골원성 세포 시트를 상기 결함이 있는 연골에 적용하여 상기 대상체의 골관절염을 예방하는 것인, 방법.
  31. 제16항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 인간인 것인, 방법.
  32. 제16항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 시트의 연골형성 분화 세포가 대상체에 대해 동종이계성인 것인, 방법.
  33. 제16항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 시트의 연골형성 분화 세포가 대상체에 대해 자가 유래성인 것인, 방법.
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