WO2024024708A1 - 軟骨修復用組成物及びその製造方法 - Google Patents
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- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
Definitions
- the present invention relates to a cartilage repair composition containing a three-dimensional culture of umbilical cord tissue-derived cells as an active ingredient, and a method for producing a cartilage repair composition.
- musculoskeletal diseases such as fractures and skeletal muscle injuries
- stable treatment results can generally be obtained by selecting cast treatment, rehabilitation, surgical treatment, etc. depending on the individual case.
- Cartilage diseases such as those of the knee meniscus and articular cartilage, are a typical example, and one of the contributing factors is poor tissue healing ability.
- MSCs mesenchymal stem cells
- Non-Patent Document 1 describes the use of mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord blood and hyaluronic acid hydrogel in patients with osteoarthritis by transplantation of a pharmaceutical product consisting of a composite material of mesenchymal stem cells and hyaluronic acid hydrogel. Cartilage regeneration at articular cartilage defect sites has been reported.
- Patent Document 1 discloses a composition for treating articular cartilage damage containing umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells.
- there are many hematopoietic stem cells in umbilical cord blood there are only a small amount of mesenchymal stem cells, so it is difficult to stably obtain a homogeneous mesenchymal stem cell population.
- Patent Document 2 describes cartilage regeneration in a cartilage damaged site of a rabbit knee joint by transplantation of a chondrocyte therapeutic agent containing human umbilical cord-derived stem cells, and human umbilical cord-derived stem cells.
- Non-Patent Document 2 reports cartilage repair in a cartilage damaged site of a minipig knee joint by transplanting a mixture of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells and hyaluronic acid.
- Patent Document 2 and Non-Patent Document 2 describe cartilage repair using a three-dimensional culture consisting of umbilical cord tissue-derived cells, and the expression of matrix metalloproteinase (MMP) genes and integrin ⁇ subunit (ITGA) genes with cells derived from other tissues. There is no mention of comparison of expression levels or expression of Oct4 gene and Nanog gene.
- MMP matrix metalloproteinase
- IGA integrin ⁇ subunit
- An object of the present invention is to provide a novel cartilage repair composition containing cells having characteristics suitable for cartilage repair.
- Umbilical cord tissue-derived cells constituting a culture obtained by three-dimensional culture have characteristics of cell proliferation ability and gene expression level that are different from cells constituting a culture obtained by three-dimensional culture of cells derived from other tissues. They discovered this and completed the present invention.
- the present invention consists of the following.
- a composition for cartilage repair containing a three-dimensional culture of cells derived from umbilical cord tissue as an active ingredient. 2. The preceding item, characterized in that the expression level of the matrix metalloprotease gene in the umbilical cord tissue-derived cells constituting the three-dimensional culture is lower than the expression level of each gene in the synovial tissue-derived cells or meniscal-derived cells.
- the composition for cartilage repair according to 1. 3.
- the composition for cartilage repair according to item 1 or 2 wherein the matrix metalloprotease gene is one or more genes selected from the group consisting of MMP1, MMP2, MMP3, MMP9, MMP13, and MT1-MMP. 4.
- the expression level of any one or two genes of ITGA1 and ITGA2 in the umbilical cord tissue-derived cells constituting the three-dimensional culture is compared with the expression level of each gene in synovial tissue-derived cells or meniscus-derived cells. and/or the expression level of any one or two genes of ITGA10 and ITGA11 in the umbilical cord tissue-derived cells constituting the three-dimensional culture is higher than that of each gene in the synovial tissue-derived cells or meniscus-derived cells.
- composition for cartilage repair according to any one of items 1 to 4 above, wherein the three-dimensional culture contains umbilical cord tissue-derived cells cultured in the presence of a scaffold substrate. 6.
- the expression level of any one or two genes of Oct4 and Nanog in the umbilical cord tissue-derived cells is higher than the expression level of each gene in the umbilical cord tissue-derived cells cultured in the absence of the scaffold substrate.
- the cartilage in the composition for cartilage repair includes a meniscus, articular cartilage, intervertebral disc, costal cartilage, tracheal cartilage, bronchial cartilage, nasal cartilage, thyroid cartilage, pubic symphysis, articular disc, epiphyseal plate, auricular cartilage, and external auditory canal cartilage. 7.
- 8. 8 The cartilage repair composition according to any one of items 1 to 7, wherein the umbilical cord tissue-derived cells include undifferentiated cells.
- a method for producing a composition for cartilage repair comprising a step of three-dimensionally culturing umbilical cord tissue-derived cells. 10. 10. The manufacturing method according to item 9, wherein the step of three-dimensionally culturing includes the step of culturing in the presence of a scaffold substrate.
- the umbilical cord tissue-derived cells constituting the culture obtained by the three-dimensional culture of the present invention are more stable than the cells constituting the culture obtained by the three-dimensional culture of synovial tissue-derived cells or meniscal-derived cells.
- the expression level of a protease gene e.g. MMP1 is low, and/or the expression level of a specific integrin ⁇ subunit gene (e.g. ITGA1) is high, and/or the expression level of a specific integrin ⁇ subunit gene (e.g. ITGA10) is high.
- the expression level of genes involved in undifferentiation e.g., Oct4 is low and/or high compared to umbilical cord tissue-derived cells cultured in the absence of a scaffold substrate, and it is highly effective for cartilage repair. Effective compositions are provided.
- Example 1 Evaluation results of MSC differentiation potential.
- A Undifferentiated umbilical cord tissue-derived cells
- B cells differentiated into adipocytes by culture in adipocyte differentiation medium (Oil Red staining)
- C cells differentiated into osteoblasts by culture in osteoblast differentiation medium.
- D Differentiated cells (Alizarin Red staining);
- D Cells differentiated into chondrocytes by culture in a chondrocyte differentiation medium (Alcian Blue staining).
- FIG. 1 Undifferentiated umbilical cord tissue-derived cells
- B cells differentiated into adipocytes by culture in adipocyte differentiation medium (Oil Red staining)
- C cells differentiated into osteoblasts by culture in osteoblast differentiation medium.
- D Differentiated cells (Alizarin Red staining);
- D Cells differentiated into chondrocytes by culture in a chondrocyte differentiation medium (Alcian Blue staining).
- FIG. 3 is a diagram showing the results of comparison of relative DNA amounts of mesenchymal stem cells derived from various tissues at each time point on days 1, 4, 7, 14, and 28 of three-dimensional culture.
- A Comparison of umbilical cord tissue-derived mesenchymal stem cells, synovial tissue-derived mesenchymal stem cells, and meniscal tissue-derived mesenchymal stem cells in three-dimensional culture
- B umbilical cord tissue-derived mesenchymal stem cells in three-dimensional culture, These are the results of a comparison between adipose tissue-derived mesenchymal stem cells and cancellous bone tissue-derived mesenchymal stem cells.
- Example 3 FIG.
- FIG. 4 is a diagram showing the comparison results of gene expression levels of mesenchymal stem cells derived from various tissues on the fourth day of three-dimensional culture.
- A MMP1,
- B MMP2,
- C MMP3,
- D MMP9,
- E MT1-MMP,
- F MMP13,
- G ITGA1,
- H ITGA2,
- I ITGA10,
- J J
- the vertical axis "Relative gene expression” means the relative gene expression level.
- Example 4 Gene expression analysis results of planar culture and three-dimensional culture.
- A Oct4 and (B) Nanog measurement results.
- the vertical axis "Relative expression” means the relative gene expression level.
- Example 5 Example 5
- the present invention relates to a cartilage repair composition containing a three-dimensional culture of umbilical cord tissue-derived cells as an active ingredient. Furthermore, the present invention relates to a method for producing the composition for cartilage repair.
- umbilical cord tissue refers to a tubular tissue that connects a fetus and placenta, and conceptually does not include umbilical cord blood.
- the umbilical cord tissue of the present invention is not particularly limited as long as it is collected from a mammal, and examples include umbilical cord tissue from humans, monkeys, cows, horses, pigs, sheep, dogs, cats, etc., and preferably, Human umbilical cord tissue.
- the umbilical cord tissue-derived cells of the present invention are derived from cells present in the umbilical cord tissue, and are obtained by isolation from the umbilical cord tissue.
- a cell population obtained from umbilical cord tissue is a cell population containing undifferentiated cells, and in this specification, "umbilical cord tissue-derived cells” refers to undifferentiated cells derived from cells present in umbilical cord tissue, unless otherwise specified. refers to Here, undifferentiated cells mean cells that are not terminally differentiated, and include all cells that are in the process of differentiating into terminally differentiated cells.
- the umbilical cord tissue-derived cells of the present invention include all umbilical cord tissue-derived cells that have cartilage repair activity, excluding cells that have terminally differentiated and lost cartilage repair activity, such as umbilical cord tissue-derived stem cells, mesenchymal cells, etc.
- Examples include stem cells, endothelial cells, stromal cells, various progenitor cells contained in umbilical cord interstitial tissue (umbilical cord matrix) (e.g., chondroprogenitor cells, osteoprogenitor cells, preadipocytes, etc.), preferably stem cells, more preferably They are mesenchymal stem cells.
- Umbilical cord tissue-derived mesenchymal stem cells are preferably, but not limited to, positive for CD73, CD90 and/or CD105, negative for CD34 and/or CD45, and chondrocytes, osteoblasts and Cartilage cells that meet at least one of the following criteria: / or cells that have the ability to differentiate into adipocytes, and are more preferably positive for CD73, CD90, and CD105, negative for CD34 and CD45, and are chondrocytes. , are cells that have the ability to differentiate into osteoblasts and adipocytes.
- the umbilical cord tissue-derived cells of the present invention may be autologous cells, allogeneic cells, or known cells, such as human umbilical Wharton jelly-derived mesenchymal stem cells from Vitality, human umbilical vein cells from ScienCell and PromoCell. It may also be an endothelial cell.
- the method for isolating umbilical cord tissue-derived cells from umbilical cord tissue is not particularly limited, and may be a method known per se or a method to be developed in the future. As a method known per se, for example, washing the umbilical cord tissue with a buffer solution. There is a method in which the umbilical cord tissue is cut into small pieces, cultured, and after the appearance of adherent cells that have migrated out of the tissue, it is treated with a type I collagenase-containing medium (Patent Document 2), or after washing the umbilical cord tissue with a buffer and cutting it into small pieces.
- Patent Document 2 a type I collagenase-containing medium
- Non-Patent Document 2 a method in which explants obtained by treatment with a medium containing type I collagenase are cultured in a medium containing fetal bovine serum and antibiotics to obtain cells that have migrated outside the tissue
- Non-Patent Document 2 a method in which cells are isolated from umbilical cord tissue are obtained. Examples include a method in which the vascular tissue and Wharton's jelly are cut into small pieces, and then the cells are dissociated using an automatic tissue dispersion/shredding device or a sieve (Japanese Patent Publication No. 2013-514072).
- One preferred embodiment of the method for isolating umbilical cord tissue-derived cells from umbilical cord tissue is to cut the umbilical cord tissue into small pieces using a scalpel, mixer, and/or homogenizer, etc., and culture the tissue pieces in a medium containing fetal bovine serum or the like. Adherent cells that have migrated out of the tissue during culture can be isolated by filtration, centrifugation, and/or pipetting.
- the umbilical cord tissue is cut into small pieces using a scalpel, mixer, and/or homogenizer, and the tissue pieces are treated in a solution containing a proteolytic enzyme such as a collagenase, for example, by filtration, centrifugation, etc. It can be isolated by machine and/or pipetting.
- Umbilical cord tissue-derived cells isolated from umbilical cord tissue in the present invention can be passaged and maintained by monolayer culture (also referred to as flat culture. The same applies hereinafter).
- monolayer culture also referred to as flat culture.
- cell culture methods are broadly classified into adherent culture and suspension culture, and monolayer culture is one type of adherent culture.
- monolayer culture cells attach to the surface of a substrate such as a culture vessel or bead-like carrier as a scaffold, proliferate two-dimensionally until they completely fill the surface, and form a monolayer.
- a culture vessel subjected to cell adhesion treatment such as a culture flask, a petri dish, a multiwell plate, etc.
- a polystyrene dish for tissue culture can be used.
- multiwell plates can be used.
- three-dimensional culture refers to culturing cells while interacting with the surrounding environment, including, for example, surrounding cells, extracellular matrices, and/or scaffold substrates.
- three-dimensional culture may be culturing cells in the presence of a scaffold substrate.
- the term "three-dimensional culture” refers to a culture obtained by three-dimensional culture of cells.
- the three-dimensional culture comprises cells cultured in the presence of a scaffold substrate and/or a scaffold substrate.
- the term "three-dimensional culture consisting of umbilical cord tissue-derived cells” is not limited to consisting only of umbilical cord tissue-derived cells, but includes umbilical cord tissue-derived cells, preferably umbilical cord tissue-derived cells as the main constituent. It may also contain components other than umbilical cord tissue-derived cells, such as an extracellular matrix, a scaffold base material, and a medium component.
- the three-dimensional culture of the present invention uses a scaffold base material in which cells can be embedded and/or cells can grow and/or proliferate on the surface.
- a collagen sponge when used as a scaffold base material, cells can adhere and migrate between the pores of the collagen sponge's porous structure, and can proliferate three-dimensionally within and/or on the surface of the collagen sponge.
- a collagen gel when used as the scaffold substrate, cells can be embedded within and grow within the collagen gel and/or can grow on the surface of the collagen gel.
- a combination of a collagen sponge and a collagen gel when used as a scaffold substrate, cells can exist together with the collagen gel between the pores of the porous structure of the collagen sponge, and can grow three-dimensionally within and/or on the surface of the collagen sponge. .
- the incubator for three-dimensional culture is not particularly limited, but for example, a culture vessel treated with cell adhesion (such as a culture flask, Petri dish, multiwell plate, etc.) can be used, and specifically, for example, a cell culture plate ( VTC-P96, VIOLAMO) can be used.
- a culture vessel treated with cell adhesion such as a culture flask, Petri dish, multiwell plate, etc.
- a cell culture plate VTC-P96, VIOLAMO
- the scaffold base material used in the three-dimensional culture of the present invention is not particularly limited as long as it is a material that can achieve the effects of the present invention and can be used for cartilage repair, but is preferably a collagen base material containing collagen as a main raw material. be.
- the form of the collagen base material is not particularly limited, and may be, for example, a collagen sponge, a collagen gel, a collagen sheet, a combination thereof, etc., preferably a collagen sponge and/or a collagen gel, and more preferably a collagen sponge. and collagen gel.
- Collagen sponges are porous structures with multiple pore structures.
- the collagen sponge used in the present invention is preferably manufactured by directly freeze-drying a collagen solution without forming collagen fibers, so that the orientation of collagen molecules is not unidirectional but random. Therefore, sufficient strength and operability can be obtained in solution or in vivo.
- the collagen sponge used in the present invention may be a collagen sponge that has been insolubilized using a chemical crosslinking agent.
- the insolubilization treatment increases the physical strength of the collagen sponge and prolongs its survival period within the implanted tissue.
- collagen molecules are cross-linked in a random orientation, increasing the mechanical strength of the collagen sponge in all directions.
- the insolubilization treatment using a chemical crosslinking agent is performed by bringing the entire dried collagen product into contact with the chemical crosslinking agent without changing the shape of the freeze-dried collagen solution (hereinafter also referred to as dried collagen material).
- the chemical crosslinking agent include water-soluble chemical crosslinking agents and vaporizable chemical crosslinking agents.
- the insolubilization treatment using a water-soluble chemical crosslinking agent can be performed by immersing the dried collagen in the water-soluble crosslinking agent.
- Insolubilization treatment using a vaporizable chemical crosslinking agent can be performed by placing the dried collagen and the chemical crosslinking agent (for example, a formalin solution) in a sealed container.
- Preferred chemical crosslinkers are water-soluble chemical crosslinkers.
- the collagen sponge used in the present invention preferably has a uniform pore structure.
- the average diameter of the pores is in the range of 1 ⁇ m or more and less than 300 ⁇ m, preferably in the range of 5 ⁇ m or more and 200 ⁇ m or less.
- the standard deviation of the diameter of the pores of the collagen sponge is preferably 20 ⁇ m or less, more preferably 15 ⁇ m or less, and still more preferably 7 ⁇ m or less.
- the value obtained by dividing the value of the standard deviation of pore diameter by the average diameter of pores is preferably 0.7 or less. , more preferably 0.6 or less.
- the average diameter and standard deviation of the pores can be calculated by randomly selecting a plurality of pores (for example, 100) from the surface of the collagen sponge, measuring the major axis of the pore, and using this major axis as the diameter of the pore. can.
- the collagen sponge used in the present invention preferably has a small average pore diameter, a dense pore structure, and is uniform compared to conventional collagen sponges, so it has high tensile strength in any direction. Obtainable. Note that if the average diameter is 1 ⁇ m or less, cells cannot infiltrate, and the properties required for cartilage treatment cannot be obtained.
- the collagen sponge used in the present invention may be a freeze-dried product of an acidic collagen solution.
- Acidic collagen solution is an acidic solution in which collagen is dissolved in a solvent.
- the preferred pH is 1 or more and 4.5 or less, more preferably 2 or more and 4 or less, and even more preferably 2.5 or more and 3.5 or less.
- the acidic collagen solution may contain additives.
- the additive does not promote collagen fibrillation, for example.
- the entire solution is uniform, the collagen molecules are uniformly dispersed, and no collagen fibrils are formed.
- the lyophilized product of acidic collagen solution is obtained by freeze-drying the acidic collagen solution, has a uniform pore structure, has more uniform compressive strength and tensile strength, and is strong against tension from any direction. It is resistant to compression from any direction. In the freeze-dried product, no collagen fibers are formed, and the orientation of collagen molecules is not unidirectional but random.
- One embodiment of the collagen sponge used in the present invention is a collagen sponge in which a porous structure with a pore structure is obtained by freeze-drying a collagen solution that has been subjected to agitation and defoaming treatment, and is insolubilized using a chemical crosslinking agent.
- a collagen sponge can be manufactured by the manufacturing method described in International Publication No. 2018/123814, and for example, Atelocollagen Sponge (MIGHTY, KKN-CSM-50) manufactured by Koken Co., Ltd. can be mentioned.
- the collagen used as a material for the collagen base material used in the present invention includes insoluble collagen collected from living tissues, such as tendon collagen derived from Achilles tendon, collagen derived from the skin, soluble collagen, and solubilized collagen, such as enzyme-solubilized collagen ( Atelocollagen), alkali-soluble collagen, acid-soluble collagen, salt-soluble collagen, etc. can be used, but atelocollagen is particularly desirable.
- enzyme-solubilized collagen Atelocollagen
- alkali-soluble collagen alkali-soluble collagen
- acid-soluble collagen acid-soluble collagen
- salt-soluble collagen etc.
- There is no particular restriction on the animal species from which the collagen is derived and there is no problem as long as the collagen has a denaturation temperature that does not cause thermal denaturation during culture.
- collagen used as a material for the collagen sponge of the present invention may be chemically modified in its constituent amino acid side chains. Specifically, collagen that has been subjected to acylation such as acetylation, succinylation, and phthalation, alkylation such as methylation and ethylation, and esterification may be mentioned.
- composition for cartilage repair of the present invention containing the collagen sponge described above can be used for cartilage treatment, and is suitable for being implanted in a living body as a reinforcing or filling material for cartilage tissue.
- the collagen sponge has the same tensile strength and compressive strength (stress) as the cartilage tissue to be implanted, and has uniform structure and strength, reducing the mechanical burden on the surrounding tissue. and maintain the pore structure for cell infiltration.
- the method of treating a joint using the composition for cartilage repair of the present invention containing the above collagen sponge is not particularly limited, but one example will be described below.
- make small holes for example, 2 to 3 places
- insert a trocar into the joint fill the joint and the trocar with physiological saline
- pass the endoscope through the trocar and directly insert the trocar into the joint.
- a suture is passed through a reinforcing material or a filling material containing the cartilage repair composition of the present invention and soaked in physiological saline.
- the sutures of the prosthetic material are pulled to transport the prosthetic material through the trocar and into the joint.
- a replacement material is implanted in the damaged area of the cartilage tissue of the joint and sewn in with sutures.
- the trocar and endoscope are removed from the joint, and the hole in the skin is closed.
- composition for cartilage repair of the present invention containing the above-mentioned collagen sponge has high biocompatibility and is unlikely to cause an antigen-antibody reaction during transplantation. It is also degraded by phagocytes and disappears over a certain period of time.
- the filling material is decomposed over time, and tissue is rebuilt in parallel with the decomposition.
- Cells infiltrated into the collagen sponge secrete in vitro matrix and regenerate tissue. Even after collagen sponge decomposition, cells and secreted matrix remain, resulting in tissue regeneration.
- the collagen sponge used in the present invention is particularly suitable for use as a reinforcing material for the meniscus.
- the meniscus is a tissue sandwiched between the articular cartilage of the femur and tibia, and strong force is applied from above and below, and its shape changes depending on the force. If a replacement material made of collagen sponge is simply press-fitted into the defective part of the meniscus, it will fall off, so suturing is required.
- the collagen sponge used in the present invention can maintain its tensile strength even when exposed to body fluids and water, and will not tear and fall off from the part where the suture thread is passed even if it is sutured to the defect. It has physical strength that can withstand suturing to tissue.
- the collagen sponge can be used as a filling material in meniscal reconstruction treatment (suturing or filling). Since the collagen sponge has excellent compressive strength, surrounding cells can infiltrate without crushing the internal pore structure, and when it is transplanted into the meniscus, it does not place a load (physical stimulation) on the surrounding tissue. Nor.
- the composition for cartilage repair of the present invention containing the collagen sponge described above is particularly preferably used as a filling material to compensate for total removal, total loss, subtotal removal, and partial loss of the inner edge of the meniscus.
- the filling material for the inner edge needs to have a maximum length of 30 mm.
- the collagen sponge used in the present invention even if it is 30 mm in length, it is highly biocompatible, has a uniform pore structure, compressive strength, and has a tensile strength that can be sutured. It is.
- the collagen sponge used in the present invention can be used in arthroscopic surgery. It has the strength to withstand suturing even when impregnated with water such as blood, body fluids, and physiological saline.
- the collagen sponge used in the present invention can be used in arthroscopic surgery by passing a suture through the collagen sponge soaked with physiological saline and pulling the suture through the trocar. It can be sutured to the tissue in this state.
- the composition for cartilage repair of the present invention containing the above-mentioned collagen sponge is particularly suitable for treating meniscus among cartilage tissues. Therefore, it is important that the shape of the collagen sponge has a thickness (height) of 1 mm or more and 10 mm or less, preferably 3 mm or more and 5 mm or less.
- the collagen sponge has a length of 1 mm or more and 50 mm or less, preferably 5 mm or more and 30 mm or less, and a width of 1 mm or more and 50 mm or less, preferably 5 mm or more and 30 mm or less.
- the shape of the collagen sponge used in the present invention can be cut and processed according to the size of each tissue defect, so there is no need to join multiple prosthetic materials together.
- the meniscus When used to compensate for total removal, total loss, subtotal removal, or partial loss of the meniscus, it is preferably disc-shaped or semilunar-shaped.
- the collagen sponge When used for meniscal regeneration treatment, it is thought that the meniscus can be restored to its original size, thereby reducing the possibility of knee osteoarthritis.
- the composition for cartilage repair of the present invention can be produced by a production method that includes a step of three-dimensionally culturing umbilical cord tissue-derived cells.
- the culture period of the three-dimensional culture is not particularly limited as long as it is within a period in which the umbilical cord tissue-derived cells can maintain undifferentiated state, but for example, immediately after the start of culture - 8 weeks, 1 day - 8 weeks, immediately after the start of culture - 6 weeks. , 1 day to 6 weeks, immediately after the start of culture to 5 weeks, or 1 day to 5 weeks, preferably immediately after culture to 28 days, preferably 1 day to 28 days, preferably 2 days to 28 days, preferably 3 days.
- the step of three-dimensionally culturing the umbilical cord tissue-derived cells includes the step of culturing the umbilical cord tissue-derived cells in the presence of a scaffold substrate.
- the step of culturing umbilical cord tissue-derived cells in the presence of a scaffold substrate is as follows. Umbilical cord tissue-derived cells are suspended in a growth medium such as DMEM containing 10% FBS and penicillin/streptomycin to prepare a cell suspension. Umbilical cord tissue-derived cells contained in the cell suspension are seeded onto a scaffold base material.
- the cell density is not particularly limited as long as cells can proliferate, but for example, 1.0 ⁇ 10 2 to 1.0 ⁇ 10 5 cells, preferably 5.0 ⁇ 10 2 to 2.0 ⁇ 10 4 cells, per 1 mm 3 of the scaffold substrate.
- the cells can be seeded at a density of more preferably 1.0 ⁇ 10 3 to 1.5 ⁇ 10 4 cells, particularly preferably 1.5 ⁇ 10 3 to 8.5 ⁇ 10 3 cells.
- the seeded cells are cultured at 37 ⁇ 1° C., 5% CO 2 and under static conditions for one day or more.
- the medium is replaced once every 1 to 5 days, preferably once every 2 to 3 days.
- Collagen gel may be mixed with the cell suspension.
- the collagen gel is mixed at a final concentration of 0.001 to 50%, preferably 0.01 to 10%, more preferably 0.05 to 5%, particularly preferably 0.1 to 1%, and most preferably 0.5%.
- the method for producing a composition for cartilage repair of the present invention includes a step of subculturing umbilical cord tissue-derived cells, preferably a step of subculturing umbilical cord tissue-derived cells to the 2nd to 5th generation, and a step of subculturing umbilical cord tissue-derived cells to 3rd generation. It can be further included before the step of culturing.
- the medium that can be used for maintaining and culturing umbilical cord tissue-derived cells is not particularly limited as long as it is capable of cultivating umbilical cord tissue-derived cells, but the main medium includes, for example, Dulbecco's modified Eagle's medium as a raw material, and preferably contains a main component. It can be used by appropriately containing serum such as fetal bovine serum and antibiotics such as penicillin and streptomycin.
- the medium component for example, the medium component described in Sci Rep. 2021 Jan 19;11(1):1757. can be used.
- the split ratio of umbilical cord tissue-derived cells can be 1:2 to 1:5.
- the medium can be replaced once every 1 to 7 days, preferably once every 2 to 3 days.
- the method for producing a composition for cartilage repair of the present invention includes a step of culturing in the presence of a scaffold substrate, a step of culturing umbilical cord tissue-derived cells in three dimensions, and/or a step of subculturing umbilical cord tissue-derived cells. It may also include a step of creating and storing the master cell before or after.
- Umbilical cord tissue-derived cells constituting the three-dimensional culture contained in the composition for cartilage repair of the present invention have at least one of the following characteristics.
- (1) Cell proliferation ability in three-dimensional culture is higher than cells constituting a culture obtained by three-dimensional culture of synovial tissue-derived cells and/or meniscus-derived cells. If undifferentiated cells with the ability to differentiate into chondrocytes have a high proliferation ability, chondrocyte repair will be promoted, which is considered to be advantageous for cartilage repair, and particularly advantageous for meniscal repair, which requires high strength. It will be done.
- the expression level of one or more selected matrix protease genes is low.
- Matrix protease is known as an extracellular matrix degrading enzyme, and if its expression level is low, the decomposition of cartilage tissue is suppressed, which is advantageous for cartilage repair, and is particularly advantageous for meniscal repair, which requires high strength. it is conceivable that.
- the amino acid sequence encoded by the MMP1 gene is disclosed, for example, in NCBI Reference Sequence: NP_002412.1, and the mRNA sequence is disclosed, for example, in NCBI Reference Sequence: NM_002421.4.
- the amino acid sequence encoded by the MMP2 gene is disclosed, for example, in NCBI Reference Sequence: NP_004521.1, and the mRNA sequence is disclosed, for example, in NCBI Reference Sequence: NM_004530.6.
- the amino acid sequence encoded by the MMP3 gene is disclosed, for example, in NCBI Reference Sequence: NP_002413.1, and the mRNA sequence is disclosed, for example, in NCBI Reference Sequence: NM_002422.5.
- the amino acid sequence encoded by the MMP9 gene is disclosed, for example, in NCBI Reference Sequence: NP_004985.2, and the mRNA sequence is disclosed, for example, in NCBI Reference Sequence: NM_004994.3.
- the amino acid sequence encoded by the MMP13 gene is disclosed, for example, in NCBI Reference Sequence: NP_002418.1, and the mRNA sequence is disclosed, for example, in NCBI Reference Sequence: NM_002427.4.
- the amino acid sequence encoded by the MT1-MMP gene is disclosed, for example, in NCBI Reference Sequence: NP_004986.1, and the mRNA sequence is disclosed, for example, in NCBI Reference Sequence: NM_004995.4.
- Integrin ⁇ subunits of ITGA1 and ITGA2 compared to cells constituting the culture obtained by three-dimensional culture of synovial tissue-derived cells and/or meniscal-derived cells. Gene expression level is high.
- Integrin ⁇ subunit is known to constitute integrins that, together with integrin ⁇ 1 subunit, are involved in cell adhesion and signal transduction through the cell surface.
- ITGA1 and ITGA2 are known to be involved in collagen binding, and when their expression levels are high, the binding between cells and extracellular matrix is enhanced, which is advantageous for cartilage repair. It is believed to be particularly advantageous for meniscal repair, which requires high strength.
- the amino acid sequence encoded by the ITGA1 gene is disclosed, for example, in NCBI Reference Sequence: NP_852478.1, and the mRNA sequence is disclosed, for example, in NCBI Reference Sequence: NM_181501.2.
- the amino acid sequence encoded by the ITGA2 gene is disclosed, for example, in NCBI Reference Sequence: NP_002194.2, and the mRNA sequence is disclosed, for example, in NCBI Reference Sequence: NM_002203.4.
- the amino acid sequence encoded by the ITGA10 gene is disclosed, for example, in NCBI Reference Sequence: NP_003628.2, and the mRNA sequence is disclosed, for example, in NCBI Reference Sequence: NM_003637.5.
- the amino acid sequence encoded by the ITGA11 gene is disclosed, for example, in NCBI Reference Sequence: NP_001004439.1, and the mRNA sequence is disclosed, for example, in NCBI Reference Sequence: NM_001004439.2.
- Oct4 and Nanog are known as genes involved in promoting self-renewal ability and maintaining undifferentiated state, and their high expression levels are thought to be advantageous for cartilage repair.
- the amino acid sequence encoded by the Oct4 gene is disclosed, for example, in NCBI Reference Sequence: NP_002692.2, and the mRNA sequence is disclosed, for example, in NCBI Reference Sequence: NM_002701.6.
- the amino acid sequence encoded by the Nanog gene is disclosed, for example, in NCBI Reference Sequence: NP_079141.2, and the mRNA sequence is disclosed, for example, in NCBI Reference Sequence: NM_024865.4.
- the amino acid sequences and mRNA sequences shown in the NCBI Reference Sequence numbers listed above are examples and are not limited thereto.
- the composition for cartilage repair of the present invention is used for repairing bone tissue by autograft, syngeneic transplant, allograft, or xenograft.
- Application methods include, for example, parenteral administration, local administration, etc., and more preferably, embedding, filling, injection, or coating into damaged or defective cartilage tissue can be employed.
- the composition for cartilage repair of the present invention can be widely used for the repair of cartilage tissues, such as cartilage reconstruction base materials, cell preparations for treating cartilage damage, cartilage grafts, autologous cultured cartilage, artificial cartilage, artificial cartilage, etc. It may be used in combination with known cartilage treatment for joints, artificial meniscus, etc.
- cartilage damage is not particularly limited, and includes, for example, meniscal damage, traumatic cartilage defect, osteochondritis dissecans, osteoarthritis, rheumatoid arthritis, anterior cruciate ligament damage, patellar dislocation, and intrafemoral Including condyle osteonecrosis.
- the composition for cartilage repair of the present invention is not only applicable to conventional cartilage treatments, but also can be used for cartilage treatments that will be developed in the future, particularly meniscal regeneration treatments and intervertebral disc regeneration treatments.
- the cartilage to which the composition for cartilage repair of the present invention is applied is not particularly limited, but includes, for example, meniscus, articular cartilage, intervertebral disc, costal cartilage, tracheal cartilage, bronchial cartilage, nasal cartilage, thyroid cartilage, pubic symphysis, joint Examples include discs, epiphyseal plates, auricular cartilage, external auditory canal cartilage, epiglottis cartilage, laryngeal cartilage, and labrum.
- the cartilage to which the composition for cartilage repair of the present invention is applied is preferably a meniscus or an intervertebral disc, particularly Preferably it is a meniscus.
- the subject to whom the composition for cartilage repair of the present invention is administered is usually a mammal.
- mammals include, but are not limited to, rodents such as mice, rats, hamsters, and guinea pigs; experimental animals such as rabbits; livestock such as pigs, cows, goats, horses, sheep, and mink; dogs, cats, etc. pets, humans, primates such as monkeys, cynomolgus monkeys, rhesus monkeys, marmosets, orangutans, and chimpanzees, and more preferably humans.
- the cartilage repair composition of the present invention includes an effective amount of a three-dimensional culture of umbilical cord tissue-derived cells.
- "effective amount” means an amount effective to prevent and/or treat cartilage damage. Such an effective amount is appropriately adjusted depending on the severity of cartilage damage, the patient, and other medical factors.
- the composition for cartilage repair of the present invention may contain, for example, 1,000 to 100,000 cells/mm 3 , 1,000 to 10,000 cells/mm 3 , or 50,000 to 100,000 cells/mm 3 , preferably 5,000 cells/mm 3 . ⁇ 70,000 pieces/mm 3 , more preferably 10,000 ⁇ 50,000 pieces/mm 3 .
- the composition for cartilage repair of the present invention may contain other components as necessary in addition to the three-dimensional culture made of umbilical cord tissue-derived cells.
- pharmaceutically acceptable carriers and excipients can be included.
- examples include the basic medium, physiological saline, buffer solution, etc. used for preparing the composition for cartilage repair, as well as dextrose, hyaluronic acid, polyethylene glycol, polyvinyl alcohol, carboxymethyl cellulose, and combinations thereof. may be included in the composition for cartilage repair of the present invention.
- Example 1 Isolation and passage of human umbilical cord tissue-derived mesenchymal stem cells This example describes isolation, maintenance, and passage of human umbilical cord tissue-derived mesenchymal stem cells used in subsequent examples.
- Human umbilical cord tissue-derived mesenchymal stem cells were isolated using umbilical cord tissues derived from patients (6 people) who provided consent and approval from the Ethics Committee of Osaka University, a national university corporation.
- the human umbilical cord tissue-derived mesenchymal stem cells used in this example were obtained by (1) a cell dispersion method using an enzyme (protease), and (2) physically cutting. The cells were isolated using two explant techniques: culturing tissue and obtaining cells. Cells isolated by the cell dispersion method were used in the test whose results are shown in FIG. 2B, and cells isolated by the explant method were used in the test whose results are shown in FIG. 2A and FIG. 3. The cell dispersion method is based on a previous report (Kanamoto T et al., Scientific Reports 2021).
- Collagenase (Animal Origin Free)-B LS004145 (Funakoshi/Worthington Biochemical Corporation) or STEMxyme2 STZ2 (Funakoshi/Worthington Biochemical Corporation) was used.
- MSCs mesenchymal stem cells
- Relative expression of MSC markers was evaluated by overlaying the histogram of isotype control (anti-IgG antibody). The results are shown in Figure 1. As shown in Figures 1A to E, the percentage of CD73(+), CD90(+), and CD105(+) cells was high, and there were almost no CD34(+) and CD45(+) cells. Therefore, the human umbilical cord tissue-derived cells of this example are positive for CD73, CD90, and CD105 and negative for CD34 and CD45 (CD73+/CD90+/CD105+/CD34-/CD45-), indicating that they have the characteristics of MSC. This was confirmed from the expression profile of surface markers.
- the ability to differentiate into adipocytes, osteoblasts, and chondrocytes was determined using the PromoCell (trademark) differentiation kit for the 3rd passage cultured human umbilical cord tissue-derived cells according to the protocol of the kit. evaluated.
- PromoCell trademark
- For evaluation of adipocyte differentiation potential cells were cultured in adipocyte differentiation medium for 13 days, stained with Oil Red, and observed under a light microscope.
- For evaluation of differentiation potential into osteoblasts cells were cultured in osteoblast differentiation medium for 13 days, stained with Alizarin Red, and observed under a light microscope.
- For evaluation of differentiation potential into chondrocytes cells were cultured in chondrocyte differentiation medium for 13 days, stained with Alcian Blue, and observed under a light microscope.
- Human synovial tissue-derived mesenchymal stem cells used in this comparative example were isolated from aseptically collected synovial tissue using the cell dispersion method in the same manner as in Example 1 above, and were incubated for 2 to 5 passages. The cells after passage were used for three-dimensional culture.
- the human meniscal tissue-derived mesenchymal stem cells used in this comparative example were isolated from aseptically collected meniscal tissue using the cell dispersion method in the same manner as in Example 1 above, and were incubated for 2 to 5 passages. The cells after passage were used for three-dimensional culture.
- the human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells used in this comparative example were isolated from aseptically collected adipose tissue using the explant method in the same manner as in Example 1 above, and after 2 to 5 passages. Cells were used in the examples below.
- Human cancellous bone tissue-derived mesenchymal stem cells used in this comparative example were isolated from cancellous bone tissue aseptically collected using the explant method in the same manner as in Example 1 above, and were cultured for 2 to 5 passages. The latter cells were used for three-dimensional culture.
- Example 2 Three-dimensional culture of mesenchymal stem cells derived from various tissues such as umbilical cord tissue-derived mesenchymal stem cells
- various tissues isolated, maintained, and subcultured in Example 1 and Comparative Examples 1 to 4 Three-dimensional culture of derived mesenchymal stem cells was performed.
- atelocollagen sponge (MIGHTY, KKN-CSM-50, Kouken) with a diameter of 5 mm and a thickness of 3 mm was used as a scaffold substrate for three-dimensional culture.
- Atelocollagen is mainly composed of type I collagen derived from bovine dermis, and this sponge has communicating pores of 30 to 200 ⁇ m and can withstand compressive loads of up to 40 kPa. Cell seeding onto the atelocollagen sponge was carried out in two ways: with and without atelocollagen gel.
- Mesenchymal stem cells derived from various tissues isolated, maintained, and passaged in Example 1 and Comparative Examples 1 to 4 were suspended in a growth medium (DMEM containing 10% FBS and penicillin/streptomycin), and an equal amount of 1% atelocollagen was added.
- a cell suspension containing 0.5% collagen gel was prepared by mixing with gel (Koken). Place one atelocollagen sponge in each well of a 96-well cell culture plate (VTC-P96, VIOLAMO), and carefully drop 50 to 70 ⁇ L/well of the prepared cell suspension (1 ⁇ 10 5 to 5 ⁇ 10 5 cells/well), soaked.
- Three-dimensional culture A 96-well plate seeded with various cells was left standing at 37°C and 5% CO 2 using a CO 2 incubator (MCO-230/170AICUVH, PHC), and culture was continued for 28 days. . The medium was replaced once every 2 to 3 days.
- Example 3 Measurement of relative DNA amount of three-dimensionally cultured mesenchymal stem cells derived from various tissues
- the relative DNA amount of each three-dimensionally cultured cell was measured.
- three-dimensional cultures containing mesenchymal stem cells derived from various tissues and atelocollagen sponges were collected at 1, 4, 7, 14, and 28 days after cell seeding on atelocollagen sponges, and PureLink DNA was extracted using the TM Genomic DNA Purification Kit (Thermo Fisher Scientific) according to the manufacturer's instructions. DNA concentration was determined fluorometrically using a QubitTM 4.0 Fluorometer (Thermo Fisher Scientific). Results were expressed as mean values and standard errors (SD).
- Umbilical cord tissue-derived mesenchymal stem cells have the same or higher relative DNA content than other tissue-derived mesenchymal stem cells at each time point of 1, 4, 7, 14, and 28 days of three-dimensional culture, They showed equivalent or higher cell proliferation ability (Fig. 3A, B). As shown in Figure 3A, in comparison with synovial tissue-derived mesenchymal stem cells, which are conventionally used for cell therapy of joint tissues, umbilical cord tissue-derived mesenchymal stem cells were cultured for 4, 7, 14, and 28 days. showed a high cell proliferation ability, and showed a significantly high cell proliferation ability after 28 days of culture (****: p ⁇ 0.001).
- mesenchymal stem cells derived from umbilical cord tissue have a higher cell proliferation ability in three-dimensional culture than mesenchymal stem cells derived from other tissues such as synovial tissue, and the high cell proliferation ability is at least It continued for 4 weeks.
- Example 4 Gene expression analysis of three-dimensionally cultured mesenchymal stem cells derived from various tissues
- various gene expression levels were measured for each three-dimensionally cultured cell.
- various tissue-derived mesenchymal stem cells were three-dimensionally cultured, and three-dimensional cultures containing various tissue-derived mesenchymal stem cells and atelocollagen sponges were collected 4 days after cell seeding on the atelocollagen sponge. Measured by quantitative PCR. Extraction of total RNA was performed using Trizol (Invitrogen) and PureLink TM RNA Purification Kit (Thermo Fisher Scientific), and reverse transcription to cDNA was performed using High-Capacity RNA-to-cDNA kit (Thermo Fisher Scientific). went.
- Quantitative PCR was performed using PowerSYBRTM Green Master Mix and QuantiStudio 7 Pro Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific). The sequences used for the primers are shown in Table 1. Target gene expression was normalized to the expression of the reference gene glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH). Results were expressed as mean values and standard errors (SD). Regarding statistical treatment, single comparisons were performed using Student's t test, and multiple comparisons were performed using one-way analysis of variance (ANOVA) and post hoc Tukey-Cramer test. Statistical analysis was performed using Excel Statistics (Social Information Service Co., Ltd.).
- umbilical cord tissue-derived MSCs showed different gene expression compared to MSCs derived from other tissues.
- integrin ⁇ subunits ⁇ 1 and ⁇ 2 types were highly expressed, while matrix metalloprotease family genes tended to be poorly expressed.
- umbilical cord tissue-derived mesenchymal stem cells have lower gene expression of MMP1, MMP2, MMP3, MMP9, MT1-MMP, MMP13, ITGA10, and ITGA11 (Fig. 4A to F, Figures 4I and 4J), and ITGA1 and ITGA2 gene expression was high (Fig. 4G and 4H).
- Example 5 Gene expression analysis of planarly cultured cells and three-dimensionally cultured cells
- two-dimensionally cultured umbilical cord tissue-derived mesenchymal stem cells and three-dimensionally cultured umbilical cord tissue-derived mesenchymal stem cells The expression levels of undifferentiated marker genes were measured.
- atelocollagen sponge using atelocollagen gel
- SD standard errors
- Umbilical cord tissue-derived MSCs during three-dimensional culture had higher gene expression levels of Oct4 and Nanog, genes involved in undifferentiation, compared to those during flat culture ( Figures 5A and B).
- the umbilical cord tissue-derived cells constituting the three-dimensional culture contained in the cartilage repair composition of the present invention have a high cell proliferation ability in three-dimensional culture, have characteristics suitable for cartilage repair, and can be used in autologous or allogeneic regenerative medicine. Available.
- the cartilage repair composition of the present invention can be widely used in the repair of cartilage tissue, and can be used, for example, in artificial cartilage, artificial joints, artificial menisci, grafts, cell preparations, injections, cartilage replacement materials, and the like.
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Abstract
軟骨修復に適した特徴を有する細胞を含む新規な軟骨修復用組成物及びその作製方法を提供することを課題とする。 臍帯組織由来細胞に着目し、臍帯組織由来細胞の三次元培養を行った。三次元培養により得られた培養物を構成する臍帯組織由来細胞は、他組織由来細胞の三次元培養により得られた培養物を構成する細胞とは異なる細胞増殖能及び遺伝子発現量の特徴を有することを見出した。本発明の三次元培養により得られた培養物を構成する臍帯組織由来細胞は、軟骨修復に適した特徴を有し、軟骨修復に有効な組成物を提供できる。
Description
本発明は、臍帯組織由来細胞からなる三次元培養物を有効成分として含む軟骨修復用組成物、及び軟骨修復用組成物の製造方法に関する。
本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願特願2022-118591号優先権を請求する。
本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願特願2022-118591号優先権を請求する。
骨折や骨格筋損傷などの運動器疾患に対しては、ギプス治療やリハビリテーション・手術治療などを個別のケースに応じて選択することで、安定した治療成績が得られることが一般的である。一方、最善とされる治療を行っても、機能障害の残存やその後の再発・増悪のリスクが高い疾患が存在する。膝半月板や関節軟骨に代表される軟骨疾患はその代表であり、組織治癒力に乏しいことがその要因として挙げられる。
組織治癒を促進する手法としては、細胞・細胞外マトリックス（足場）・成長因子の供給が中心となる。関節組織の細胞治療の分野においては、滑膜組織由来の間葉系幹細胞（mesenchymal stem cell: MSC）を使用した報告が多い。滑膜をはじめとする間葉組織は、採取するために数回の手術を必要とし、患者への負担が大きい。
臍帯血や臍帯組織は、分娩時の副産物として採取可能であるため、一般的な間葉組織よりも容易かつ非侵襲的に採取できるという利点がある。臍帯血由来の間葉系幹細胞を用いた軟骨再生について、非特許文献１には、ヒト臍帯血由来間葉系幹細胞とヒアルロン酸ヒドロゲルとの複合材料からなる医薬品の移植による変形性関節症患者の関節軟骨欠損部位における軟骨再生が報告されている。特許文献１には、臍帯血由来間葉系幹細胞を含む関節軟骨損傷治療用組成物について開示がある。しかしながら、臍帯血には、造血幹細胞が多く存在するが、間葉系幹細胞は少量しか存在しないため、均質な間葉系幹細胞の細胞集団を安定的に得ることが困難である。
一方、臍帯組織には、間葉系幹細胞が多く存在する。臍帯組織由来の間葉系幹細胞は、その抗炎症・免疫抑制能を活用した臨床研究が行われている一方で、組織修復能を期待した再生治療に関しては、他の組織（骨髄・脂肪・関節組織）由来の間葉系幹細胞と比較して報告が少ない。臍帯組織由来の間葉系幹細胞を用いた軟骨再生について、特許文献２には、ヒト臍帯由来幹細胞を含む軟骨細胞治療剤の移植によるウサギ膝関節の軟骨損傷部位における軟骨再生、並びにヒト臍帯由来幹細胞とヒアルロン酸誘導体及びコラーゲンとの三次元培養について開示がある。非特許文献２には、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞とヒアルロン酸との混合物の移植によるミニブタ膝関節の軟骨損傷部位における軟骨修復が報告されている。しかしながら、特許文献２及び非特許文献２は、臍帯組織由来細胞からなる三次元培養物による軟骨修復、並びに他組織由来細胞とのマトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）遺伝子及びインテグリンαサブユニット（ITGA）遺伝子の発現量の比較やOct4遺伝子及びNanog遺伝子の発現については一切言及されていない。
Stem Cells Transl Med. 2017 Feb; 6(2):613-621.
Tzu Chi Med J. 2019 Jan-Mar; 31(1): 11-19.
軟骨組織では、軟骨細胞が細胞外マトリックスを介して三次元的に存在する。分化能を有する細胞の三次元培養により、より生体内に近い状態で再生医療に適用できる。本発明は、軟骨修復に適した特徴を有する細胞を含む新規な軟骨修復用組成物を提供することを課題とする。
本発明者らは上記課題を解決するために臍帯組織由来細胞に着目し、鋭意研究を重ね臍帯組織由来細胞の三次元培養を行った。三次元培養により得られた培養物を構成する臍帯組織由来細胞は、他組織由来細胞の三次元培養により得られた培養物を構成する細胞とは異なる細胞増殖能及び遺伝子発現量の特徴を有することを見出し、本発明を完成した。
即ち本発明は、以下よりなる。
１．臍帯組織由来細胞からなる三次元培養物を有効成分として含む軟骨修復用組成物。
２．前記三次元培養物を構成する臍帯組織由来細胞におけるマトリックスメタロプロテアーゼ遺伝子の発現量が、滑膜組織由来細胞又は半月板由来細胞における各遺伝子の発現量と比較して低いことを特徴とする、前項１に記載の軟骨修復用組成物。
３．前記マトリックスメタロプロテアーゼ遺伝子が、MMP1、MMP2、MMP3、MMP9、MMP13及びMT1-MMPからなる群より選択される１種又は複数種の遺伝子である、前項１又は２に記載の軟骨修復用組成物。
４．前記三次元培養物を構成する臍帯組織由来細胞におけるITGA1及びITGA2のいずれか1種又は2種の遺伝子の発現量が、滑膜組織由来細胞又は半月板由来細胞における各遺伝子の発現量と比較して高く、並びに／あるいは
前記三次元培養物を構成する臍帯組織由来細胞におけるITGA10及びITGA11のいずれか1種又は2種の遺伝子の発現量が、滑膜組織由来細胞又は半月板由来細胞における各遺伝子の発現量と比較して低いことを特徴とする、前項１～３のいずれかに記載の軟骨修復用組成物。
５．前記三次元培養物が、足場基材存在下で培養された臍帯組織由来細胞を含む、前項１～４のいずれかに記載の軟骨修復用組成物。
６．前記臍帯組織由来細胞におけるOct4及びNanogのいずれか1種又は2種の遺伝子の発現量が、足場基材非存在下で培養された臍帯組織由来細胞における各遺伝子の発現量と比較して高いことを特徴とする、前項１～５のいずれかに記載の軟骨修復用組成物。
７．前記軟骨修復用組成物における軟骨が、半月板、関節軟骨、椎間板、肋軟骨、気管軟骨、気管支軟骨、鼻軟骨、甲状軟骨、恥骨結合、関節円板、骨端板、耳介軟骨、外耳道軟骨、咽頭蓋軟骨、喉頭軟骨及び関節唇からなる群から選択されるいずれか１種又は複数種の軟骨である、前項１～６のいずれかに記載の軟骨修復用組成物。
８．前記臍帯組織由来細胞が、未分化細胞を含む、前項１～７のいずれかに記載の軟骨修復用組成物。
９．臍帯組織由来細胞を三次元培養する工程を含む、軟骨修復用組成物の製造方法。
１０．前記三次元培養する工程が、足場基材存在下で培養する工程を含む、前項９に記載の製造方法。
１．臍帯組織由来細胞からなる三次元培養物を有効成分として含む軟骨修復用組成物。
２．前記三次元培養物を構成する臍帯組織由来細胞におけるマトリックスメタロプロテアーゼ遺伝子の発現量が、滑膜組織由来細胞又は半月板由来細胞における各遺伝子の発現量と比較して低いことを特徴とする、前項１に記載の軟骨修復用組成物。
３．前記マトリックスメタロプロテアーゼ遺伝子が、MMP1、MMP2、MMP3、MMP9、MMP13及びMT1-MMPからなる群より選択される１種又は複数種の遺伝子である、前項１又は２に記載の軟骨修復用組成物。
４．前記三次元培養物を構成する臍帯組織由来細胞におけるITGA1及びITGA2のいずれか1種又は2種の遺伝子の発現量が、滑膜組織由来細胞又は半月板由来細胞における各遺伝子の発現量と比較して高く、並びに／あるいは
前記三次元培養物を構成する臍帯組織由来細胞におけるITGA10及びITGA11のいずれか1種又は2種の遺伝子の発現量が、滑膜組織由来細胞又は半月板由来細胞における各遺伝子の発現量と比較して低いことを特徴とする、前項１～３のいずれかに記載の軟骨修復用組成物。
５．前記三次元培養物が、足場基材存在下で培養された臍帯組織由来細胞を含む、前項１～４のいずれかに記載の軟骨修復用組成物。
６．前記臍帯組織由来細胞におけるOct4及びNanogのいずれか1種又は2種の遺伝子の発現量が、足場基材非存在下で培養された臍帯組織由来細胞における各遺伝子の発現量と比較して高いことを特徴とする、前項１～５のいずれかに記載の軟骨修復用組成物。
７．前記軟骨修復用組成物における軟骨が、半月板、関節軟骨、椎間板、肋軟骨、気管軟骨、気管支軟骨、鼻軟骨、甲状軟骨、恥骨結合、関節円板、骨端板、耳介軟骨、外耳道軟骨、咽頭蓋軟骨、喉頭軟骨及び関節唇からなる群から選択されるいずれか１種又は複数種の軟骨である、前項１～６のいずれかに記載の軟骨修復用組成物。
８．前記臍帯組織由来細胞が、未分化細胞を含む、前項１～７のいずれかに記載の軟骨修復用組成物。
９．臍帯組織由来細胞を三次元培養する工程を含む、軟骨修復用組成物の製造方法。
１０．前記三次元培養する工程が、足場基材存在下で培養する工程を含む、前項９に記載の製造方法。
本発明の三次元培養により得られた培養物を構成する臍帯組織由来細胞は、滑膜組織由来細胞又は半月板由来細胞の三次元培養により得られた培養物を構成する細胞と比較してマトリックスプロテアーゼ遺伝子（例えばMMP1）の発現量が低く、及び／又は特定のインテグリンαサブユニット遺伝子（例えばITGA1）の発現量が高く、及び／又は特定のインテグリンαサブユニット遺伝子（例えばITGA10）の発現量が低く、及び／又は、足場基材非存在下で培養された臍帯組織由来細胞と比較して未分化性に関与する遺伝子（例えばOct4）の遺伝子の発現量が高い性質を有し、軟骨修復に有効な組成物が提供される。
本発明は、臍帯組織由来細胞からなる三次元培養物を有効成分として含む軟骨修復用組成物に関する。さらに当該軟骨修復用組成物の製造方法に関する。
本明細書において「臍帯組織」とは、胎児と胎盤を繋ぐ管状組織であり、臍帯血は概念上包含しないものとする。本発明の臍帯組織は、哺乳類から採取された臍帯組織であれば特に限定されないが、例えば、ヒト、サル、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、イヌ又はネコ等の臍帯組織が挙げられ、好ましくは、ヒトの臍帯組織である。
（臍帯組織由来細胞）
本発明の臍帯組織由来細胞は、臍帯組織に存在する細胞に由来し、臍帯組織から単離して得られる。臍帯組織から得られる細胞集団は、未分化細胞を含む細胞集団であり、本明細書において「臍帯組織由来細胞」とは、特に断りのない限り、臍帯組織に存在する細胞に由来する未分化細胞を指す。ここで、未分化細胞とは、最終分化していない細胞を意味し、最終分化細胞へ分化する過程にある全ての細胞を包含する。本発明の臍帯組織由来細胞は、終末分化して軟骨修復活性を失った細胞を除く、軟骨修復活性を有する全ての臍帯組織由来の細胞を包含し、例えば、臍帯組織由来の幹細胞、間葉系幹細胞、内皮細胞、間質細胞、臍帯間質組織（臍帯マトリックス）に含まれる各種前駆細胞（例えば軟骨前駆細胞、骨前駆細胞、脂肪前駆細胞等）等が挙げられ、好ましくは幹細胞、より好ましくは間葉系幹細胞である。臍帯組織由来間葉系幹細胞は、特に限定されないが、好ましくは、CD73、CD90及び／又はCD105が陽性であること、CD34及び／又はCD45が陰性であること、並びに、軟骨細胞、骨芽細胞及び／又は脂肪細胞への分化能を有する細胞であることのうち少なくとも１つを満たし、より好ましくは、CD73、CD90及びCD105が陽性であり、かつ、CD34及びCD45が陰性であり、かつ、軟骨細胞、骨芽細胞及び脂肪細胞への分化能を有する細胞である。本発明の臍帯組織由来細胞は、自家細胞でも他家細胞でもよく、公知の細胞でもよく、例えば、Vitality社のヒト臍帯ホウォートンゼリー由来間葉系幹細胞や、ScienCell社及びPromoCell社のヒト臍帯静脈内皮細胞であってもよい。
本発明の臍帯組織由来細胞は、臍帯組織に存在する細胞に由来し、臍帯組織から単離して得られる。臍帯組織から得られる細胞集団は、未分化細胞を含む細胞集団であり、本明細書において「臍帯組織由来細胞」とは、特に断りのない限り、臍帯組織に存在する細胞に由来する未分化細胞を指す。ここで、未分化細胞とは、最終分化していない細胞を意味し、最終分化細胞へ分化する過程にある全ての細胞を包含する。本発明の臍帯組織由来細胞は、終末分化して軟骨修復活性を失った細胞を除く、軟骨修復活性を有する全ての臍帯組織由来の細胞を包含し、例えば、臍帯組織由来の幹細胞、間葉系幹細胞、内皮細胞、間質細胞、臍帯間質組織（臍帯マトリックス）に含まれる各種前駆細胞（例えば軟骨前駆細胞、骨前駆細胞、脂肪前駆細胞等）等が挙げられ、好ましくは幹細胞、より好ましくは間葉系幹細胞である。臍帯組織由来間葉系幹細胞は、特に限定されないが、好ましくは、CD73、CD90及び／又はCD105が陽性であること、CD34及び／又はCD45が陰性であること、並びに、軟骨細胞、骨芽細胞及び／又は脂肪細胞への分化能を有する細胞であることのうち少なくとも１つを満たし、より好ましくは、CD73、CD90及びCD105が陽性であり、かつ、CD34及びCD45が陰性であり、かつ、軟骨細胞、骨芽細胞及び脂肪細胞への分化能を有する細胞である。本発明の臍帯組織由来細胞は、自家細胞でも他家細胞でもよく、公知の細胞でもよく、例えば、Vitality社のヒト臍帯ホウォートンゼリー由来間葉系幹細胞や、ScienCell社及びPromoCell社のヒト臍帯静脈内皮細胞であってもよい。
臍帯組織から臍帯組織由来細胞を単離する方法は、特に制限されず、自体公知の方法又は今後開発される方法であってもよく、自体公知の方法としては、例えば臍帯組織を緩衝液で洗浄し、小片に切断後、培養し、組織外に遊走した付着細胞が出現後に、Ｉ型コラゲナーゼ含有培地で処理する方法（特許文献２）や、臍帯組織を緩衝液で洗浄し、小片に切断後、Ｉ型コラゲナーゼ含有培地で処理して得た外植片をウシ胎児血清及び抗生物質含有培地で培養し、組織外に遊走した細胞を得る方法（非特許文献２）や、臍帯組織から分離した血管組織及びホウォートンゼリーを小片に切断後、自動組織分散・破砕装置や篩で細胞を解離させる方法（特表２０１３－５１４０７２号公報）が挙げられる。臍帯組織から臍帯組織由来細胞を単離する方法の好ましい一態様として、メス、ミキサー及び／又はホモジェナイザー等を用いて臍帯組織を小片化し、組織片をウシ胎児血清等を含む培地で培養し、培養により組織外に遊走した付着細胞をろ過、遠心機及び／又はピペッティング等により単離することができる。別の好ましい一態様として、メス、ミキサー及び／又はホモジェナイザー等を用いて臍帯組織を小片化し、組織片を例えばコラーゲン分解酵素等のタンパク質分解酵素を含む液中で処理し、例えばろ過、遠心機及び／又はピペッティング等により単離することができる。
本発明において臍帯組織から単離された臍帯組織由来細胞は、単層培養（平面培養とも称される。以下同じ。）により継代及び維持することができる。一般的に、細胞培養法は接着培養と浮遊培養に大別され、単層培養は接着培養の一つである。単層培養では、培養器やビーズ状担体等の基材の表面を足場として細胞が付着し、表面を埋めつくすまで二次元的に増殖し、単層を形成する。本発明の平面培養の培養器としては、例えば細胞接着処理された培養器であって、例えば培養フラスコ、シャーレ、マルチウェルプレート等を使用することができ、具体的には例えば組織培養用ポリスチレンディッシュ又はマルチウェルプレートを使用することができる。
本明細書において「三次元培養」とは、細胞を、例えば周囲の細胞、細胞外マトリックス及び／又は足場基材等を含む周囲の環境と相互作用させながら培養することをいう。一態様において、三次元培養は、細胞を足場基材存在下で培養することであり得る。本明細書において「三次元培養物」とは、細胞の三次元培養により得られた培養物をいう。一態様において、三次元培養物は、足場基材存在下で培養された細胞及び／又は足場基材を含む。本明細書において「臍帯組織由来細胞からなる三次元培養物」とは、臍帯組織由来細胞のみからなることに限定されず、臍帯組織由来細胞を含み、好ましくは臍帯組織由来細胞を主要な構成要素として含み、臍帯組織由来細胞以外の成分、例えば細胞外マトリックス、足場基材、培地成分等を含んでもよい。本発明の三次元培養は、培養器とは別に、細胞を内部に包埋すること、及び／又は細胞が表面で生育及び／若しくは増殖することが可能な足場基材を用いる。例えば、コラーゲンスポンジを足場基材とする場合、細胞はコラーゲンスポンジの多孔質構造のポア間で接着及び遊走でき、コラーゲンスポンジ内部及び／又は表面上で三次元的に増殖できる。例えば、コラーゲンゲルを足場基材とする場合、細胞はコラーゲンゲル中に埋め込まれてその内部で増殖でき、及び／又はコラーゲンゲル表面上で増殖できる。例えば、コラーゲンスポンジ及びコラーゲンゲルの組み合わせを足場基材とする場合、細胞はコラーゲンゲルと共にコラーゲンスポンジの多孔質構造のポア間に存在でき、コラーゲンスポンジ内部及び／又は表面上で三次元的に増殖できる。三次元培養の培養器としては、特に限定されないが、例えば細胞接着処理された培養器（例えば培養フラスコ、シャーレ、マルチウェルプレート等）を使用することができ、具体的には例えば細胞培養プレート（VTC-P96、VIOLAMO社）を使用することができる。
（足場基材）
本発明の三次元培養で用いられる足場基材は、本発明の効果が得られ、軟骨修復の用途に使用できる素材であれば特に限定されないが、好ましくはコラーゲンを主原料として含むコラーゲン基材である。コラーゲン基材の形態は、特に限定されないが、例えば、コラーゲンスポンジ、コラーゲンゲル、コラーゲンシート、これらの組み合わせ等であってもよく、好ましくはコラーゲンスポンジ及び／又はコラーゲンゲルであり、より好ましくはコラーゲンスポンジ及びコラーゲンゲルの組み合わせである。
本発明の三次元培養で用いられる足場基材は、本発明の効果が得られ、軟骨修復の用途に使用できる素材であれば特に限定されないが、好ましくはコラーゲンを主原料として含むコラーゲン基材である。コラーゲン基材の形態は、特に限定されないが、例えば、コラーゲンスポンジ、コラーゲンゲル、コラーゲンシート、これらの組み合わせ等であってもよく、好ましくはコラーゲンスポンジ及び／又はコラーゲンゲルであり、より好ましくはコラーゲンスポンジ及びコラーゲンゲルの組み合わせである。
（コラーゲンスポンジ）
コラーゲンスポンジは、複数のポア構造を有する多孔質構造体である。本発明で用いられるコラーゲンスポンジは、好ましくは、コラーゲン線維を形成していない状態のコラーゲン溶液を直接凍結乾燥処理することにより製造されることにより、コラーゲン分子の配向が一方向ではなく、ランダムであることから、溶液中又は生体内において、十分な強度、操作性を得ることができる。
コラーゲンスポンジは、複数のポア構造を有する多孔質構造体である。本発明で用いられるコラーゲンスポンジは、好ましくは、コラーゲン線維を形成していない状態のコラーゲン溶液を直接凍結乾燥処理することにより製造されることにより、コラーゲン分子の配向が一方向ではなく、ランダムであることから、溶液中又は生体内において、十分な強度、操作性を得ることができる。
本発明で用いられるコラーゲンスポンジは、化学架橋剤により不溶化処理されているコラーゲンスポンジであり得る。不溶化処理により、コラーゲンスポンジの物理的な強度が高められ、移植した組織内での残存期間が延長する。不溶化処理を行うことにより、コラーゲン分子がランダムな配向で架橋され、コラーゲンスポンジのすべての方向における力学的強度が高められる。
化学架橋剤による不溶化処理は、コラーゲン溶液の凍結乾燥体（以下、コラーゲン乾燥物ともいう。）の形状を崩すことなく、コラーゲン乾燥物全体と化学架橋剤とを接触させることにより行う。化学架橋剤としては、水溶性化学架橋剤や気化可能な化学架橋剤等が挙げられる。水溶性化学架橋剤による不溶化処理は、水溶性架橋化剤にコラーゲン乾燥物を浸漬することにより行うことができる。気化可能な化学架橋剤による不溶化処理は、密閉した容器にコラーゲン乾燥物と化学架橋剤（例えば、ホルマリン溶液）を入れることにより行うことができる。好ましい化学架橋剤は、水溶性化学架橋剤である。
本発明で用いられるコラーゲンスポンジは、好ましくは一様なポア構造を有する。ポアの平均直径は、１μｍ以上３００μｍ未満の範囲、好ましくは５μｍ以上２００μｍ以下の範囲である。また、該コラーゲンスポンジのポアの直径の標準偏差は、好ましくは２０μｍ以下、より好ましくは１５μｍ以下、さらに好ましくは７μｍ以下である。本発明のコラーゲンスポンジにおいて、ポアの直径の標準偏差の値を、ポアの平均直径で除した値（ポアの直径の標準偏差の値／ポアの平均直径）は、好ましくは０．７以下であり、より好ましくは０．６以下である。なおポアの平均直径と標準偏差は、コラーゲンスポンジの表面から無作為に複数個（例えば１００個）のポアを選択し、ポアの長径を測定し、この長径をポアの直径として、算出することができる。本発明で用いられるコラーゲンスポンジは、従来のコラーゲンスポンジと比較して、好ましくはポアの平均直径が小さく、密なポア構造を有し、一様であることから、どの方向においても高い引張強度を得ることができる。尚、平均直径が１μｍ以下では細胞が浸潤できないため、軟骨治療にて求められる性質が得られない。
本発明で用いられるコラーゲンスポンジは、酸性コラーゲン溶液の凍結乾燥体であり得る。酸性コラーゲン溶液は、コラーゲンが溶媒に溶解されている酸性の溶液である。好ましいｐＨはｐＨ１以上ｐＨ４．５以下であり、より好ましくは、ｐＨ２以上４以下であり、さらに好ましくはｐＨ２．５以上３．５以下である。酸性コラーゲン溶液には、添加剤を含有してもよい。添加剤は、例えばコラーゲンの線維化を促進しないものが好適である。酸性コラーゲン溶液は、液全体が均一であり、コラーゲン分子の分散状態が均一の状態となり、コラーゲン原線維が形成されていない。酸性コラーゲン溶液の凍結乾燥体は、酸性コラーゲン溶液を凍結乾燥させた物であり、均一なポア構造を有し、より均一な圧縮強度及び引張強度を有し、どの方向からの引張にも強く、どの方向からの圧縮にも強い性質を有する。該凍結乾燥体は、コラーゲン線維は形成されておらず、コラーゲン分子の配向は一方向ではなく、ランダムである。
本発明で用いられるコラーゲンスポンジの一態様は、撹拌脱泡処理されたコラーゲン溶液を凍結乾燥したポア構造を有する多孔質構造体に、化学架橋剤による不溶化処理が加えられたコラーゲンスポンジである。このようなコラーゲンスポンジは、国際公開第２０１８／１２３８１４号に記載の製造方法により製造でき、例えば高研社製のアテロコラーゲンスポンジ（MIGHTY、KKN-CSM-50）を挙げることができる。
本発明で用いられるコラーゲン基材の材料として用いられるコラーゲンは、生体組織より採取された不溶性コラーゲン、例えばアキレス腱由来のテンドンコラーゲン、皮膚由来のコラーゲン、可溶性コラーゲン、可溶化コラーゲン、例えば酵素可溶化コラーゲン（アテロコラーゲン）、アルカリ可溶化コラーゲン、酸可溶性コラーゲン、塩可溶性コラーゲン等を用いることができるが、特にアテロコラーゲンが望ましい。コラーゲンが由来する動物種にも特に制限はなく、培養時にコラーゲンが熱変性を起こすことのない変性温度を持つコラーゲンであれば問題はない。具体的にはウシ、ブタ等哺乳動物由来、ニワトリ等の鳥類由来、マグロ、イズミダイ等の魚類由来等を用いることができる。またリコンビナントコラーゲンも用いることができる。本発明のコラーゲンスポンジの材料として用いられるコラーゲンは、コラーゲンの構成アミノ酸側鎖が化学修飾されていてもよい。具体的にはアセチル化、サクシニル化、フタール化等のアシル化、メチル化、エチル化等のアルキル化、エステル化等されたコラーゲンが挙げられる。
上記のコラーゲンスポンジを含む本発明の軟骨修復用組成物は、軟骨治療に用いることができ、軟骨組織の補強材又は補填材として生体に埋植されるのに適している。培養する際には、生体の軟骨組織が受ける負荷と類似の負荷を加えながら培養することも可能である。該コラーゲンスポンジは、埋植する軟骨組織と同等の引張強度と圧縮強度（応力）を有し、構造及び強度にむらがないものであることから、埋植周辺組織への力学的な負担を軽減でき、かつ、細胞が浸潤するためのポア構造を維持することができるものである。
上記のコラーゲンスポンジを含む本発明の軟骨修復用組成物を用いて関節の治療を行う方法は特に限定されないが、一例を以下に説明する。まず治療を要する関節の周囲の皮膚面に小さな穴（例えば２～３箇所）を開け、関節にトラカールを挿入し、関節とトラカール内を生理食塩水で満たし、トラカール内に内視鏡を通して、直接手術部位にアクセスする。本発明の軟骨修復用組成物を含む補強材又は補填材に縫合糸を通して生理食塩水に浸す。補填材を生理食塩水に浸漬した状態で、補填材の縫合糸を引っ張ってトラカール内を通して補填材を関節内に運ぶ。関節の軟骨組織の損傷部位に補填材を埋植し、縫合糸で縫いつける。その後、関節からトラカール、内視鏡を抜き、皮膚面の穴を閉じる。
上記のコラーゲンスポンジを含む本発明の軟骨修復用組成物は、生体適合性が高く、移植時に抗原抗体反応を起こしにくい。また、貪食細胞などにより分解されて一定期間で消失する。軟骨の欠損部、特に半月板欠損部に補填することで周囲の細胞が浸潤し、継時的に補填材が分解され、分解と並行して組織が再建される補填材である。コラーゲンスポンジ中に浸潤した細胞は、生体外マトリクスを分泌し組織を再生する。コラーゲンスポンジ分解後も細胞と分泌されたマトリクスが残り、組織が再生した状態となる。
本発明で用いられるコラーゲンスポンジは、特に半月板の補強材として用いるのに適している。半月板は大腿骨と脛骨の関節軟骨に挟まれた組織であり、上下から強い力が加わり、力に応じて形状が変化する。半月板の欠損部に、コラーゲンスポンジからなる補填材をプレスフィットするだけでは脱落してしまうため、縫合が必要となる。本発明で用いられるコラーゲンスポンジは、体液や水分に曝されても、引張強度を維持することができ、欠損部に縫合しても縫合糸を通した部分から千切れて脱落しないものであり、組織への縫合に耐えうる物理的強度を有するものである。すなわち、該コラーゲンスポンジは、半月板を再建する治療（縫合術又は補填術）にて補填材として使用できるものである。該コラーゲンスポンジは、圧縮強度も優れていることから、内部のポア構造がつぶれずに、周囲の細胞が浸潤でき、半月板に移植した際に周囲の組織に負荷（物理的刺激）を掛けることもない。
上記のコラーゲンスポンジを含む本発明の軟骨修復用組成物は、特に、半月板内縁部の全摘・全欠損・亜全摘・部分欠損を補填するための補填材として使用することが好ましい。内縁部の補填材としては、最大で長さ３０ｍｍの大きさが必要である。本発明で用いられるコラーゲンスポンジによれば、長さ３０ｍｍの大きさであっても、生体適合性が高く、均一のポア構造かつ圧縮強度があり、縫合できる引張強度のものを提供することが可能である。本発明で用いられるコラーゲンスポンジは、関節鏡視下手術に使用できるものである。血液、体液、生理食塩水などの水分を含浸させても、縫合に耐えうる強度を持つ。本発明で用いられるコラーゲンスポンジは、関節鏡視下手術において、生理食塩水を浸潤させたコラーゲンスポンジに縫合糸を通し、縫合糸を引っ張ってトラカールの中を通すことができ、生理食塩水に浸漬した状態で組織に縫合することができる。
上記のコラーゲンスポンジを含む本発明の軟骨修復用組成物は、軟骨組織のうち特に半月板の治療に適している。従ってコラーゲンスポンジの形状は、厚さ（高さ）が１ｍｍ以上１０ｍｍ以下、好ましくは３ｍｍ以上５ｍｍ以下であることが重要である。好ましくはコラーゲンスポンジの形状は、長さが１ｍｍ以上５０ｍｍ以下、好ましくは５ｍｍ以上３０ｍｍ以下であり、幅が１ｍｍ以上５０ｍｍ以下、好ましくは５ｍｍ以上３０ｍｍ以下である。また本発明で用いられるコラーゲンスポンジの形状は、各組織の欠損のサイズに併せて切断・加工できることから、複数の補填材をつなぎ合わせるといった作業が生じない。半月板の全摘・全欠損・亜全摘・部分欠損の補填に用いる場合は、円盤状、もしくは半月状であることが好ましい。当該コラーゲンスポンジを半月板の再生治療に用いた場合は、元通りの半月板のサイズに修復することができると考えられることから、変形性膝関節症になる可能性を低くおさえることができる。
（軟骨修復用組成物の製造方法）
本発明の軟骨修復用組成物は、臍帯組織由来細胞を三次元培養する工程を含む製造方法により製造することができる。三次元培養の培養期間は、臍帯組織由来細胞が未分化性を維持し得る期間内であれば特に限定されないが、例えば培養開始直後～８週間、１日～８週間、培養開始直後～６週間、１日～６週間、培養開始直後～５週間、又は１日～５週間でよく、好ましくは培養直後～２８日、好ましくは１日～２８日、好ましくは２日～２８日、好ましくは３日～２８日、好ましくは４日～２８日、好ましくは５日～２８日、好ましくは６日～２８日、好ましくは７日～２８日、好ましくは１４日～２８日、より好ましくは培養直後～１４日、より好ましくは１日～１４日、より好ましくは２日～１４日、より好ましくは３日～１４日、より好ましくは４日～１４日、より好ましくは１日～７日、より好ましくは２日～７日、より好ましくは３日～７日、より好ましくは４日～７日、より好ましくは培養直後～４日、より好ましくは１日～４日、より好ましくは２日～４日、より好ましくは３日～４日、より好ましくは４日である。本発明の好ましい一態様において、臍帯組織由来細胞を三次元培養する工程は、臍帯組織由来細胞を足場基材存在下で培養する工程を含む。
本発明の軟骨修復用組成物は、臍帯組織由来細胞を三次元培養する工程を含む製造方法により製造することができる。三次元培養の培養期間は、臍帯組織由来細胞が未分化性を維持し得る期間内であれば特に限定されないが、例えば培養開始直後～８週間、１日～８週間、培養開始直後～６週間、１日～６週間、培養開始直後～５週間、又は１日～５週間でよく、好ましくは培養直後～２８日、好ましくは１日～２８日、好ましくは２日～２８日、好ましくは３日～２８日、好ましくは４日～２８日、好ましくは５日～２８日、好ましくは６日～２８日、好ましくは７日～２８日、好ましくは１４日～２８日、より好ましくは培養直後～１４日、より好ましくは１日～１４日、より好ましくは２日～１４日、より好ましくは３日～１４日、より好ましくは４日～１４日、より好ましくは１日～７日、より好ましくは２日～７日、より好ましくは３日～７日、より好ましくは４日～７日、より好ましくは培養直後～４日、より好ましくは１日～４日、より好ましくは２日～４日、より好ましくは３日～４日、より好ましくは４日である。本発明の好ましい一態様において、臍帯組織由来細胞を三次元培養する工程は、臍帯組織由来細胞を足場基材存在下で培養する工程を含む。
（足場基材存在下で培養する工程）
本発明の一態様において、臍帯組織由来細胞を足場基材存在下で培養する工程は、以下の通りである。臍帯組織由来細胞を、10%FBS及びペニシリン・ストレプトマイシン含有DMEM等の増殖培地に懸濁し、細胞懸濁液を調製する。前記細胞懸濁液に含まれる臍帯組織由来細胞を足場基材に播種する。細胞密度は、細胞が増殖可能であれば特に限定されないが、足場基材1 mm3あたり、例えば、1.0×102～1.0×105個、好ましくは5.0×102～2.0×104個、より好ましくは1.0×103～1.5×104個、特に好ましくは1.5×103～8.5×103個の細胞密度となるように播種することができる。播種した細胞を37±1℃、5％CO2、静置条件下で１日以上培養する。培地は1～5日に一度、好ましくは2～3日に一度交換する。細胞懸濁液にはコラーゲンゲルを混合してもよい。コラーゲンゲルを混合する場合、終濃度0.001～50%、好ましくは0.01～10%、より好ましくは0.05～5%、特に好ましくは0.1～1%、最も好ましくは0.5%のコラーゲンゲルを混合する。
本発明の一態様において、臍帯組織由来細胞を足場基材存在下で培養する工程は、以下の通りである。臍帯組織由来細胞を、10%FBS及びペニシリン・ストレプトマイシン含有DMEM等の増殖培地に懸濁し、細胞懸濁液を調製する。前記細胞懸濁液に含まれる臍帯組織由来細胞を足場基材に播種する。細胞密度は、細胞が増殖可能であれば特に限定されないが、足場基材1 mm3あたり、例えば、1.0×102～1.0×105個、好ましくは5.0×102～2.0×104個、より好ましくは1.0×103～1.5×104個、特に好ましくは1.5×103～8.5×103個の細胞密度となるように播種することができる。播種した細胞を37±1℃、5％CO2、静置条件下で１日以上培養する。培地は1～5日に一度、好ましくは2～3日に一度交換する。細胞懸濁液にはコラーゲンゲルを混合してもよい。コラーゲンゲルを混合する場合、終濃度0.001～50%、好ましくは0.01～10%、より好ましくは0.05～5%、特に好ましくは0.1～1%、最も好ましくは0.5%のコラーゲンゲルを混合する。
本発明の軟骨修復用組成物の製造方法は、臍帯組織由来細胞を継代培養する工程、好ましくは、臍帯組織由来細胞を2～5代目まで継代培養する工程を、臍帯組織由来細胞を三次元培養する工程より前に更に含むことができる。臍帯組織由来細胞の維持・培養において使用可能な培地は、臍帯組織由来細胞を培養可能であればよく特に限定されないが、主要な培地として、例えばダルベッコ改変イーグル培地を原料として含み、好ましくは主成分とし、ウシ胎児血清等の血清、ペニシリン及びストレプトマイシン等の抗生物質を適宜含ませて使用することができる。培地成分として、例えば、Sci Rep. 2021 Jan 19;11(1):1757.に記載の培地成分を使用することができる。
臍帯組織由来細胞の継代比率（split ratio）は1：2～1：5とすることができる。培地は1～7日に一度、好ましくは2～3日に一度交換することができる。
本発明の軟骨修復用組成物の製造方法は、足場基材存在下で培養する工程臍帯組織由来細胞を三次元培養する工程より前に、及び／又は、臍帯組織由来細胞を継代培養する工程より前若しくは後に、マスターセルを作製及び保存する工程を含んでもよい。
（三次元培養物を構成する臍帯組織由来細胞の機能、性質）
本発明の軟骨修復用組成物に含まれる三次元培養物を構成する臍帯組織由来細胞は、以下の特徴の少なくとも１つを有する。
（１）滑膜組織由来細胞及び／又は半月板由来細胞の三次元培養により得られた培養物を構成する細胞と比較して、三次元培養における細胞増殖能が高い。軟骨細胞への分化能を有する未分化細胞の増殖能が高ければ、軟骨細胞の修復が促進されるため、軟骨修復に有利であり、高い強度を要する半月板の修復に特に有利であると考えられる。
（２）滑膜組織由来細胞及び／又は半月板由来細胞の三次元培養により得られた培養物を構成する細胞と比較して、MMP1、MMP2、MMP3、MMP9、MMP13及びMT1-MMPからなる群より選択される１種又は複数種のマトリックスプロテアーゼ遺伝子の発現量が低い。マトリックスプロテアーゼは、細胞外マトリックス分解酵素として知られ、その発現量が低ければ、軟骨組織の分解が抑制されるため、軟骨修復に有利であり、高い強度を要する半月板の修復に特に有利であると考えられる。MMP1遺伝子がコードするアミノ酸配列は、例えばNCBI Reference Sequence: NP_002412.1に開示され、mRNA配列は例えばNCBI Reference Sequence: NM_002421.4に開示される。MMP2遺伝子がコードするアミノ酸配列は、例えばNCBI Reference Sequence: NP_004521.1に開示され、mRNA配列は例えばNCBI Reference Sequence: NM_004530.6に開示される。MMP3遺伝子がコードするアミノ酸配列は、例えばNCBI Reference Sequence: NP_002413.1に開示され、mRNA配列は例えばNCBI Reference Sequence: NM_002422.5に開示される。MMP9遺伝子がコードするアミノ酸配列は、例えばNCBI Reference Sequence: NP_004985.2に開示され、mRNA配列は例えばNCBI Reference Sequence: NM_004994.3に開示される。MMP13遺伝子がコードするアミノ酸配列は、例えばNCBI Reference Sequence: NP_002418.1に開示され、mRNA配列は例えばNCBI Reference Sequence: NM_002427.4に開示される。MT1-MMP遺伝子がコードするアミノ酸配列は、例えばNCBI Reference Sequence: NP_004986.1に開示され、mRNA配列は例えばNCBI Reference Sequence: NM_004995.4に開示される。
（３）滑膜組織由来細胞及び／又は半月板由来細胞の三次元培養により得られた培養物を構成する細胞と比較して、ITGA1及びITGA2のいずれか1種又は2種のインテグリンαサブユニット遺伝子の発現量が高い。インテグリンαサブユニットは、インテグリンβ1サブユニットと共に細胞接着及び細胞表面を介したシグナル伝達に関与するインテグリンを構成することで知られる。インテグリンαサブユニットのうち、ITGA1及びITGA2は、コラーゲン結合に関与することが知られ、その発現量が高ければ、細胞と細胞外マトリックスとの結合が増強されるため、軟骨修復に有利であり、高い強度を要する半月板の修復に特に有利であると考えられる。ITGA1遺伝子がコードするアミノ酸配列は、例えばNCBI Reference Sequence: NP_852478.1に開示され、mRNA配列は例えばNCBI Reference Sequence: NM_181501.2に開示される。ITGA2遺伝子がコードするアミノ酸配列は、例えばNCBI Reference Sequence: NP_002194.2に開示され、mRNA配列は例えばNCBI Reference Sequence: NM_002203.4に開示される。
（４）滑膜組織由来細胞及び／又は半月板由来細胞の三次元培養により得られた培養物を構成する細胞と比較して、ITGA10及びITGA11のいずれか1種又は2種のインテグリンαサブユニット遺伝子の発現量が低い。ITGA10遺伝子がコードするアミノ酸配列は、例えばNCBI Reference Sequence: NP_003628.2に開示され、mRNA配列は例えばNCBI Reference Sequence: NM_003637.5に開示される。ITGA11遺伝子がコードするアミノ酸配列は、例えばNCBI Reference Sequence: NP_001004439.1に開示され、mRNA配列は例えばNCBI Reference Sequence: NM_001004439.2に開示される。
（５）足場基材非存在下で培養された臍帯組織由来細胞と比較して、Oct4及びNanogのいずれか1種又は2種の遺伝子の発現量が高い。Oct4及びNanogは、自己複製能の促進や未分化性の維持に関与する遺伝子として知られ、その発現量が高ければ、軟骨修復に有利であると考えられる。Oct4遺伝子がコードするアミノ酸配列は、例えばNCBI Reference Sequence: NP_002692.2に開示され、mRNA配列は例えばNCBI Reference Sequence: NM_002701.6に開示される。Nanog遺伝子がコードするアミノ酸配列は、例えばNCBI Reference Sequence: NP_079141.2に開示され、mRNA配列は例えばNCBI Reference Sequence: NM_024865.4に開示される。
上記列挙したNCBI Reference Sequence番号に示すアミノ酸配列及びmRNA配列は例示であって、これらに限定されるものではない。
本発明の軟骨修復用組成物に含まれる三次元培養物を構成する臍帯組織由来細胞は、以下の特徴の少なくとも１つを有する。
（１）滑膜組織由来細胞及び／又は半月板由来細胞の三次元培養により得られた培養物を構成する細胞と比較して、三次元培養における細胞増殖能が高い。軟骨細胞への分化能を有する未分化細胞の増殖能が高ければ、軟骨細胞の修復が促進されるため、軟骨修復に有利であり、高い強度を要する半月板の修復に特に有利であると考えられる。
（２）滑膜組織由来細胞及び／又は半月板由来細胞の三次元培養により得られた培養物を構成する細胞と比較して、MMP1、MMP2、MMP3、MMP9、MMP13及びMT1-MMPからなる群より選択される１種又は複数種のマトリックスプロテアーゼ遺伝子の発現量が低い。マトリックスプロテアーゼは、細胞外マトリックス分解酵素として知られ、その発現量が低ければ、軟骨組織の分解が抑制されるため、軟骨修復に有利であり、高い強度を要する半月板の修復に特に有利であると考えられる。MMP1遺伝子がコードするアミノ酸配列は、例えばNCBI Reference Sequence: NP_002412.1に開示され、mRNA配列は例えばNCBI Reference Sequence: NM_002421.4に開示される。MMP2遺伝子がコードするアミノ酸配列は、例えばNCBI Reference Sequence: NP_004521.1に開示され、mRNA配列は例えばNCBI Reference Sequence: NM_004530.6に開示される。MMP3遺伝子がコードするアミノ酸配列は、例えばNCBI Reference Sequence: NP_002413.1に開示され、mRNA配列は例えばNCBI Reference Sequence: NM_002422.5に開示される。MMP9遺伝子がコードするアミノ酸配列は、例えばNCBI Reference Sequence: NP_004985.2に開示され、mRNA配列は例えばNCBI Reference Sequence: NM_004994.3に開示される。MMP13遺伝子がコードするアミノ酸配列は、例えばNCBI Reference Sequence: NP_002418.1に開示され、mRNA配列は例えばNCBI Reference Sequence: NM_002427.4に開示される。MT1-MMP遺伝子がコードするアミノ酸配列は、例えばNCBI Reference Sequence: NP_004986.1に開示され、mRNA配列は例えばNCBI Reference Sequence: NM_004995.4に開示される。
（３）滑膜組織由来細胞及び／又は半月板由来細胞の三次元培養により得られた培養物を構成する細胞と比較して、ITGA1及びITGA2のいずれか1種又は2種のインテグリンαサブユニット遺伝子の発現量が高い。インテグリンαサブユニットは、インテグリンβ1サブユニットと共に細胞接着及び細胞表面を介したシグナル伝達に関与するインテグリンを構成することで知られる。インテグリンαサブユニットのうち、ITGA1及びITGA2は、コラーゲン結合に関与することが知られ、その発現量が高ければ、細胞と細胞外マトリックスとの結合が増強されるため、軟骨修復に有利であり、高い強度を要する半月板の修復に特に有利であると考えられる。ITGA1遺伝子がコードするアミノ酸配列は、例えばNCBI Reference Sequence: NP_852478.1に開示され、mRNA配列は例えばNCBI Reference Sequence: NM_181501.2に開示される。ITGA2遺伝子がコードするアミノ酸配列は、例えばNCBI Reference Sequence: NP_002194.2に開示され、mRNA配列は例えばNCBI Reference Sequence: NM_002203.4に開示される。
（４）滑膜組織由来細胞及び／又は半月板由来細胞の三次元培養により得られた培養物を構成する細胞と比較して、ITGA10及びITGA11のいずれか1種又は2種のインテグリンαサブユニット遺伝子の発現量が低い。ITGA10遺伝子がコードするアミノ酸配列は、例えばNCBI Reference Sequence: NP_003628.2に開示され、mRNA配列は例えばNCBI Reference Sequence: NM_003637.5に開示される。ITGA11遺伝子がコードするアミノ酸配列は、例えばNCBI Reference Sequence: NP_001004439.1に開示され、mRNA配列は例えばNCBI Reference Sequence: NM_001004439.2に開示される。
（５）足場基材非存在下で培養された臍帯組織由来細胞と比較して、Oct4及びNanogのいずれか1種又は2種の遺伝子の発現量が高い。Oct4及びNanogは、自己複製能の促進や未分化性の維持に関与する遺伝子として知られ、その発現量が高ければ、軟骨修復に有利であると考えられる。Oct4遺伝子がコードするアミノ酸配列は、例えばNCBI Reference Sequence: NP_002692.2に開示され、mRNA配列は例えばNCBI Reference Sequence: NM_002701.6に開示される。Nanog遺伝子がコードするアミノ酸配列は、例えばNCBI Reference Sequence: NP_079141.2に開示され、mRNA配列は例えばNCBI Reference Sequence: NM_024865.4に開示される。
上記列挙したNCBI Reference Sequence番号に示すアミノ酸配列及びmRNA配列は例示であって、これらに限定されるものではない。
（軟骨修復用組成物の利用、用途）
本発明の軟骨修復用組成物は、自家移植、同系移植、同種移植又は異種移植による骨組織の修復に利用される。適用方法としては、例えば、非経口投与、局所投与等が挙げられ、より好ましくは、損傷を受けた、若しくは欠損した軟骨組織への埋入、填入、注入若しくは塗布を採用することができる。本発明の軟骨修復用組成物は、軟骨組織の修復の用途に広く利用でき、例えば軟骨再建基材、軟骨損傷治療用細胞製剤等に利用でき、軟骨移植片、自家培養軟骨、人工軟骨、人工関節、人工半月板等の公知の軟骨治療と組み合わせて利用してもよい。ここで、軟骨損傷は、特に限定されず、例えば、半月板損傷、外傷性軟骨欠損症、離断性骨軟骨炎、変形性関節症、関節リウマチ、前十字靭帯損傷、膝蓋骨脱臼、大腿骨内顆骨壊死等を含む。本発明の軟骨修復用組成物は、従来行われている軟骨治療に適用されるのみならず、今後開発される軟骨治療、特に半月板再生治療、椎間板再生治療に用いることも可能である。
本発明の軟骨修復用組成物は、自家移植、同系移植、同種移植又は異種移植による骨組織の修復に利用される。適用方法としては、例えば、非経口投与、局所投与等が挙げられ、より好ましくは、損傷を受けた、若しくは欠損した軟骨組織への埋入、填入、注入若しくは塗布を採用することができる。本発明の軟骨修復用組成物は、軟骨組織の修復の用途に広く利用でき、例えば軟骨再建基材、軟骨損傷治療用細胞製剤等に利用でき、軟骨移植片、自家培養軟骨、人工軟骨、人工関節、人工半月板等の公知の軟骨治療と組み合わせて利用してもよい。ここで、軟骨損傷は、特に限定されず、例えば、半月板損傷、外傷性軟骨欠損症、離断性骨軟骨炎、変形性関節症、関節リウマチ、前十字靭帯損傷、膝蓋骨脱臼、大腿骨内顆骨壊死等を含む。本発明の軟骨修復用組成物は、従来行われている軟骨治療に適用されるのみならず、今後開発される軟骨治療、特に半月板再生治療、椎間板再生治療に用いることも可能である。
本発明の軟骨修復用組成物を適用対象となる軟骨は、特に限定されないが、例えば、半月板、関節軟骨、椎間板、肋軟骨、気管軟骨、気管支軟骨、鼻軟骨、甲状軟骨、恥骨結合、関節円板、骨端板、耳介軟骨、外耳道軟骨、咽頭蓋軟骨、喉頭軟骨、関節唇等を挙げることができる。本発明の軟骨修復用組成物に含まれる三次元培養物の足場基材がコラーゲンスポンジを含む場合、本発明の軟骨修復用組成物を適用対象となる軟骨は、半月板、椎間板が好ましく、特に好ましくは半月板である。
本発明の軟骨修復用組成物の投与対象は、通常哺乳動物である。哺乳動物としては、特に限定されないが、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、カニクイザル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジー等の霊長類等を挙げることができ、より好ましくはヒトである。
本発明の軟骨修復用組成物は、有効量の臍帯組織由来細胞からなる三次元培養物を含む。本明細書中で用いられる「有効量」とは、軟骨損傷を予防及び／又は治療するのに効果的な量を意味する。かかる有効量は、軟骨損傷の重症度、患者その他の医学的要因によって適宜調節される。本発明の軟骨修復用組成物は、例えば、臍帯組織由来細胞を1,000～100,000個／mm3、1,000～10,000個／mm3、又は50,000～100,000個／mm3含有してもよく、好ましくは5,000～70,000個／mm3、より好ましくは10,000～50,000個／mm3含有する。
（その他の成分）
本発明の軟骨修復用組成物は、臍帯組織由来細胞からなる三次元培養物の他に必要に応じて、他の成分を含んでもよい。例えば、薬学的に許容可能な担体、賦形剤を含むことができる。具体的には、軟骨修復用組成物作製のために使用した基本培地、生理食塩水、緩衝液等が挙げられ、更にはデキストロース、ヒアルロン酸、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロースやこれらの組み合わせ等を本発明の軟骨修復用組成物に含有させてもよい。
本発明の軟骨修復用組成物は、臍帯組織由来細胞からなる三次元培養物の他に必要に応じて、他の成分を含んでもよい。例えば、薬学的に許容可能な担体、賦形剤を含むことができる。具体的には、軟骨修復用組成物作製のために使用した基本培地、生理食塩水、緩衝液等が挙げられ、更にはデキストロース、ヒアルロン酸、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロースやこれらの組み合わせ等を本発明の軟骨修復用組成物に含有させてもよい。
以下、本発明の理解を深めるために実施例及び比較例を示して本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではないことはいうまでもない。
（実施例１）ヒト臍帯組織由来間葉系幹細胞の単離及び継代
本実施例では以降の実施例で使用するヒト臍帯組織由来間葉系幹細胞の単離及び維持、継代について説明する。
本実施例では以降の実施例で使用するヒト臍帯組織由来間葉系幹細胞の単離及び維持、継代について説明する。
国立大学法人大阪大学における倫理委員会の承認を得、同意を得た患者（６名）由来の臍帯組織を用いてヒト臍帯組織由来間葉系幹細胞を単離した。
１．ヒト臍帯組織由来間葉系幹細胞の単離
本実施例で使用するヒト臍帯組織由来間葉系幹細胞は、（１）酵素（プロテアーゼ）を用いた細胞分散法と、（２）物理的に裁断した組織を培養して細胞を得るexplant法の２つの手法を使用して単離した。細胞分散法で単離した細胞は、図２Bに結果を示す試験で使用され、explant法で単離した細胞は、図２A、及び図３に結果を示す試験で使用された。細胞分散法は既報に準じる（Kanamoto T et al., Scientific Reports 2021）。プロテアーゼとしては、Collagenase (Animal Origin Free)-B LS004145（フナコシ/Worthington Biochemical Corporation）又はSTEMxyme2 STZ2（フナコシ/Worthington Biochemical Corporation）を用いた。
本実施例で使用するヒト臍帯組織由来間葉系幹細胞は、（１）酵素（プロテアーゼ）を用いた細胞分散法と、（２）物理的に裁断した組織を培養して細胞を得るexplant法の２つの手法を使用して単離した。細胞分散法で単離した細胞は、図２Bに結果を示す試験で使用され、explant法で単離した細胞は、図２A、及び図３に結果を示す試験で使用された。細胞分散法は既報に準じる（Kanamoto T et al., Scientific Reports 2021）。プロテアーゼとしては、Collagenase (Animal Origin Free)-B LS004145（フナコシ/Worthington Biochemical Corporation）又はSTEMxyme2 STZ2（フナコシ/Worthington Biochemical Corporation）を用いた。
（１）細胞分散法による細胞単離
無菌的に採取した臍帯組織をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄し、直視下又は実体顕微鏡下にて動静脈組織を除去し、細かくミンチにした後、0.1%プロテアーゼを含んだ1%ペニシリン/ストレプトマイシン（Thermo Fisher Scientific）を加えたダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco Modified Eagle's Medium：DMEM）中で、37℃で3-6時間処理した。100μmフィルターで濾過した後に遠心（1000-3000rpm）することによって、細胞を得た。
無菌的に採取した臍帯組織をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄し、直視下又は実体顕微鏡下にて動静脈組織を除去し、細かくミンチにした後、0.1%プロテアーゼを含んだ1%ペニシリン/ストレプトマイシン（Thermo Fisher Scientific）を加えたダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco Modified Eagle's Medium：DMEM）中で、37℃で3-6時間処理した。100μmフィルターで濾過した後に遠心（1000-3000rpm）することによって、細胞を得た。
（２）explant法による細胞単離
無菌的に採取した臍帯組織をPBSで洗浄し、直視下又は実体顕微鏡下にて動静脈組織を除去し、細かくミンチにした後、培養容器としてTCPSディッシュを用いて、10%FBS及び1%ペニシリン/ストレプトマイシン含有DMEM中で培養し、組織外に遊走した付着細胞を得た。
無菌的に採取した臍帯組織をPBSで洗浄し、直視下又は実体顕微鏡下にて動静脈組織を除去し、細かくミンチにした後、培養容器としてTCPSディッシュを用いて、10%FBS及び1%ペニシリン/ストレプトマイシン含有DMEM中で培養し、組織外に遊走した付着細胞を得た。
２．ヒト臍帯組織由来間葉系幹細胞の維持・継代
単離した細胞は、細胞培養ディッシュ（VTC-D150/100、VIOLAMO社）にて、10%ウシ胎児血清（FBS）（ニチレイバイオサイエンス）及び1%ペニシリン/ストレプトマイシン含有DMEMに懸濁した。CO2インキュベーター（MCO-230/170AICUVH、PHC社）を用いて、37℃、5％CO2の条件で、静置培養し、２～５継代の細胞を後述（実施例２）の三次元培養に使用した。ヒト臍帯組織由来間葉系幹細胞の培地交換は2～3日に1回行った。継代間隔は3～7日、継代比率（split ratio）は1：2～1：5の間で継代用細胞を播種した。2～5継代後の細胞（P2-P5）を後述（実施例２）の三次元培養に使用した。
単離した細胞は、細胞培養ディッシュ（VTC-D150/100、VIOLAMO社）にて、10%ウシ胎児血清（FBS）（ニチレイバイオサイエンス）及び1%ペニシリン/ストレプトマイシン含有DMEMに懸濁した。CO2インキュベーター（MCO-230/170AICUVH、PHC社）を用いて、37℃、5％CO2の条件で、静置培養し、２～５継代の細胞を後述（実施例２）の三次元培養に使用した。ヒト臍帯組織由来間葉系幹細胞の培地交換は2～3日に1回行った。継代間隔は3～7日、継代比率（split ratio）は1：2～1：5の間で継代用細胞を播種した。2～5継代後の細胞（P2-P5）を後述（実施例２）の三次元培養に使用した。
３．間葉系幹細胞（MSC）の同定
本実施例で使用するヒト臍帯組織由来間葉系幹細胞を、（１）細胞表面マーカーの発現プロファイルと、（２）分化能の評価とにより間葉系幹細胞として同定した。
本実施例で使用するヒト臍帯組織由来間葉系幹細胞を、（１）細胞表面マーカーの発現プロファイルと、（２）分化能の評価とにより間葉系幹細胞として同定した。
（１）細胞表面マーカーの発現プロファイル
平面培養中の3継代のヒト臍帯組織由来細胞（P3）を、PE標識抗CD73抗体、APC標識抗CD90抗体、FITC標識抗CD105抗体、APC標識抗CD34抗体、FITC標識抗CD45抗体、PE標識抗IgG抗体、APC標識抗IgG抗体及びFITC標識抗IgG抗体（いずれもBioLegend社）を用いて染色した。染色した細胞をフローサイトメトリー法にてCantoTM II（BD社製）を用いた測定を行った。MSCマーカー（CD73、CD90、CD105、CD34、CD45）の相対的発現について、アイソタイプコントロール（抗IgG抗体）のヒストグラムと重ねて表示して評価した。結果を図１に示す。図１A～Eに示すように、CD73(+)、CD90(+)、CD105(+)の細胞の割合が高く、CD34(+)、CD45(+)の細胞はほとんど無かった。よって、本実施例のヒト臍帯組織由来細胞は、CD73、CD90及びCD105について陽性かつCD34及びCD45について陰性（CD73+/CD90+/CD105+/CD34-/CD45-）であり、MSCの特徴を有することを細胞表面マーカーの発現プロファイルから確認した。
平面培養中の3継代のヒト臍帯組織由来細胞（P3）を、PE標識抗CD73抗体、APC標識抗CD90抗体、FITC標識抗CD105抗体、APC標識抗CD34抗体、FITC標識抗CD45抗体、PE標識抗IgG抗体、APC標識抗IgG抗体及びFITC標識抗IgG抗体（いずれもBioLegend社）を用いて染色した。染色した細胞をフローサイトメトリー法にてCantoTM II（BD社製）を用いた測定を行った。MSCマーカー（CD73、CD90、CD105、CD34、CD45）の相対的発現について、アイソタイプコントロール（抗IgG抗体）のヒストグラムと重ねて表示して評価した。結果を図１に示す。図１A～Eに示すように、CD73(+)、CD90(+)、CD105(+)の細胞の割合が高く、CD34(+)、CD45(+)の細胞はほとんど無かった。よって、本実施例のヒト臍帯組織由来細胞は、CD73、CD90及びCD105について陽性かつCD34及びCD45について陰性（CD73+/CD90+/CD105+/CD34-/CD45-）であり、MSCの特徴を有することを細胞表面マーカーの発現プロファイルから確認した。
（２）分化能の評価
平面培養3継代目のヒト臍帯組織由来細胞について、PromoCell（商標）の分化キットを使用し、キットのプロトコルに従って、脂肪細胞、骨芽細胞及び軟骨細胞への分化能を評価した。脂肪細胞への分化能評価については、脂肪細胞分化培地で13日培養後、Oil Redで染色し、光学顕微鏡下で観察した。骨芽細胞への分化能評価については、骨芽細胞分化培地で13日培養後、Alizarin Redで染色し、光学顕微鏡下で観察した。軟骨細胞への分化能評価については、軟骨細胞分化培地で13日培養後、Alcian Blueで染色し、光学顕微鏡下で観察した。結果を図２に示す。図２B～Dに示すように、本実施例のヒト臍帯組織由来細胞は、脂肪細胞、骨芽細胞及び軟骨細胞への分化能を有し、MSCの特徴である多分化能を有することを確認した。
平面培養3継代目のヒト臍帯組織由来細胞について、PromoCell（商標）の分化キットを使用し、キットのプロトコルに従って、脂肪細胞、骨芽細胞及び軟骨細胞への分化能を評価した。脂肪細胞への分化能評価については、脂肪細胞分化培地で13日培養後、Oil Redで染色し、光学顕微鏡下で観察した。骨芽細胞への分化能評価については、骨芽細胞分化培地で13日培養後、Alizarin Redで染色し、光学顕微鏡下で観察した。軟骨細胞への分化能評価については、軟骨細胞分化培地で13日培養後、Alcian Blueで染色し、光学顕微鏡下で観察した。結果を図２に示す。図２B～Dに示すように、本実施例のヒト臍帯組織由来細胞は、脂肪細胞、骨芽細胞及び軟骨細胞への分化能を有し、MSCの特徴である多分化能を有することを確認した。
（比較例１）ヒト滑膜組織由来間葉系幹細胞の単離及び継代
国立大学法人大阪大学における倫理委員会の承認を得、同意を得た患者（６名）由来の滑膜組織を用いてヒト滑膜組織由来間葉系幹細胞を単離した。
国立大学法人大阪大学における倫理委員会の承認を得、同意を得た患者（６名）由来の滑膜組織を用いてヒト滑膜組織由来間葉系幹細胞を単離した。
本比較例で使用するヒト滑膜組織由来間葉系幹細胞は、細胞分散法を使用して、上記の実施例１と同様に、無菌的に採取した滑膜組織から単離し、2～5継代後の細胞を三次元培養に使用した。
（比較例２）ヒト半月板組織由来間葉系幹細胞の単離及び継代
国立大学法人大阪大学における倫理委員会の承認を得、同意を得た患者（５名）由来の半月板組織を用いてヒト半月板組織由来間葉系幹細胞を単離した。
国立大学法人大阪大学における倫理委員会の承認を得、同意を得た患者（５名）由来の半月板組織を用いてヒト半月板組織由来間葉系幹細胞を単離した。
本比較例で使用するヒト半月板組織由来間葉系幹細胞は、細胞分散法を使用して、上記の実施例１と同様に、無菌的に採取した半月板組織から単離し、2～5継代後の細胞を三次元培養に使用した。
（比較例３）ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞の単離及び継代
国立大学法人大阪大学における倫理委員会の承認を得、同意を得た患者（１名）由来の脂肪組織を用いてヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞を単離した。
国立大学法人大阪大学における倫理委員会の承認を得、同意を得た患者（１名）由来の脂肪組織を用いてヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞を単離した。
本比較例で使用するヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞は、explant法を使用して、上記の実施例１と同様に、無菌的に採取した脂肪組織から単離し、2～5継代後の細胞を下記の実施例に使用した。
（比較例４）ヒト海綿骨組織由来間葉系幹細胞の単離及び継代
国立大学法人大阪大学における倫理委員会の承認を得、同意を得た患者（１名）由来の海綿骨組織を用いてヒト海綿骨組織由来間葉系幹細胞を単離した。
国立大学法人大阪大学における倫理委員会の承認を得、同意を得た患者（１名）由来の海綿骨組織を用いてヒト海綿骨組織由来間葉系幹細胞を単離した。
本比較例で使用するヒト海綿骨組織由来間葉系幹細胞は、explant法を使用して、上記の実施例１と同様に、無菌的に採取した海綿骨組織から単離し、2～5継代後の細胞を三次元培養に使用した。
（実施例２）臍帯組織由来間葉系幹細胞等の各組織由来間葉系幹細胞の三次元培養
本実施例では、実施例１及び比較例１～４で単離、維持・継代した各種組織由来の間葉系幹細胞の三次元培養を行った。
本実施例では、実施例１及び比較例１～４で単離、維持・継代した各種組織由来の間葉系幹細胞の三次元培養を行った。
１．アテロコラーゲンスポンジへの細胞播種
三次元培養の足場基材として、直径5 mm、厚さ3 mmのアテロコラーゲンスポンジ（MIGHTY、KKN-CSM-50、高研）を使用した。アテロコラーゲンは、主にウシ真皮由来のI型コラーゲンから構成され、このスポンジは、30～200μmの連通孔を持ち、最大40 kPaの圧縮荷重に耐えることができる。アテロコラーゲンスポンジへの細胞播種は、アテロコラーゲンゲルを使用する場合及び不使用の場合の2つの方法で行った。実施例１及び比較例１～４で単離、維持・継代した各種組織由来の間葉系幹細胞を増殖培地（10%FBS及びペニシリン・ストレプトマイシン含有DMEM）に懸濁し、等量の1％アテロコラーゲンゲル（高研）と混合して、0.5%コラーゲンゲル含有細胞懸濁液を作製した。アテロコラーゲンスポンジを９６ウェルの細胞培養プレート（VTC-P96、VIOLAMO社）の各ウェルに1個ずつ入れ、作製した細胞懸濁液を50～70μL/ウェル注意深く滴下し（1×105～5×105個細胞/ウェル）、浸漬させた。
三次元培養の足場基材として、直径5 mm、厚さ3 mmのアテロコラーゲンスポンジ（MIGHTY、KKN-CSM-50、高研）を使用した。アテロコラーゲンは、主にウシ真皮由来のI型コラーゲンから構成され、このスポンジは、30～200μmの連通孔を持ち、最大40 kPaの圧縮荷重に耐えることができる。アテロコラーゲンスポンジへの細胞播種は、アテロコラーゲンゲルを使用する場合及び不使用の場合の2つの方法で行った。実施例１及び比較例１～４で単離、維持・継代した各種組織由来の間葉系幹細胞を増殖培地（10%FBS及びペニシリン・ストレプトマイシン含有DMEM）に懸濁し、等量の1％アテロコラーゲンゲル（高研）と混合して、0.5%コラーゲンゲル含有細胞懸濁液を作製した。アテロコラーゲンスポンジを９６ウェルの細胞培養プレート（VTC-P96、VIOLAMO社）の各ウェルに1個ずつ入れ、作製した細胞懸濁液を50～70μL/ウェル注意深く滴下し（1×105～5×105個細胞/ウェル）、浸漬させた。
２．三次元培養
各種細胞を播種した９６ウェルプレートをCO2インキュベーター（MCO-230/170AICUVH、PHC社）を用いて、37℃、5％CO2の条件下で静置し、28日間培養を継続した。2～3日に1回培地交換を行った。
各種細胞を播種した９６ウェルプレートをCO2インキュベーター（MCO-230/170AICUVH、PHC社）を用いて、37℃、5％CO2の条件下で静置し、28日間培養を継続した。2～3日に1回培地交換を行った。
（実施例３）三次元培養された各種組織由来間葉系幹細胞の相対的DNA量測定
本実施例では、三次元培養された各細胞について相対的DNA量を測定した。実施例２の三次元培養において、アテロコラーゲンスポンジへの細胞播種後1、4、7、14、28日時点の各種組織由来間葉系幹細胞及びアテロコラーゲンスポンジを含む三次元培養物をそれぞれ採取し、PureLinkTM Genomic DNA Purification Kit（Thermo Fisher Scientific）を用いて製造者の指示に従いDNAを抽出した。DNA濃度は、Qubit（商標）4.0 Fluorometer（Thermo Fisher Scientific）を用いて蛍光測定で求めた。結果は平均値及び標準誤差（SD）で示した。統計処理に関しては、スチューデントのt検定を使用して単一比較を実施し、一元配置分散分析（ANOVA）と事後テューキー・クラマー検定を使用して多重比較を実施した。統計解析はエクセル統計（株式会社社会情報サービス）を用いた。
本実施例では、三次元培養された各細胞について相対的DNA量を測定した。実施例２の三次元培養において、アテロコラーゲンスポンジへの細胞播種後1、4、7、14、28日時点の各種組織由来間葉系幹細胞及びアテロコラーゲンスポンジを含む三次元培養物をそれぞれ採取し、PureLinkTM Genomic DNA Purification Kit（Thermo Fisher Scientific）を用いて製造者の指示に従いDNAを抽出した。DNA濃度は、Qubit（商標）4.0 Fluorometer（Thermo Fisher Scientific）を用いて蛍光測定で求めた。結果は平均値及び標準誤差（SD）で示した。統計処理に関しては、スチューデントのt検定を使用して単一比較を実施し、一元配置分散分析（ANOVA）と事後テューキー・クラマー検定を使用して多重比較を実施した。統計解析はエクセル統計（株式会社社会情報サービス）を用いた。
臍帯組織由来間葉系幹細胞は、三次元培養の1、4、7、14、28日の各時点において、他組織由来間葉系幹細胞と比較して、相対的DNA量が同等以上であり、同等又は高い細胞増殖能を示した（図３A、B）。図３Aに示すように、関節組織の細胞治療に従来用いられることが多い滑膜組織由来間葉系幹細胞との比較では、臍帯組織由来間葉系幹細胞は、培養4、7、14、28日において高い細胞増殖能を示し、培養28日において有意に高い細胞増殖能を示した（****：p<0.001）。また、図３Aに示すように、半月板組織由来間葉系幹細胞と比較しても培養4、7、14、28日において高い細胞増殖能を示し、培養7、14、28日において有意に高い細胞増殖能を示した（*：p<0.05、**：p<0.01、****：p<0.001）。また、図３Bに示すように、脂肪組織由来間葉系幹細胞及び海綿骨組織由来間葉系幹細胞と比較して培養１、4、7、14日において同等又は高い細胞増殖能を示した。このことから臍帯組織由来間葉系幹細胞は、滑膜組織をはじめとする他組織由来間葉系幹細胞と比較して三次元培養における細胞増殖能が高く、高い細胞増殖能は、培養初期から少なくとも4週間継続した。
（実施例４）三次元培養された各種組織由来間葉系幹細胞の遺伝子発現解析
本実施例では、三次元培養された各細胞について各種遺伝子発現量を測定した。実施例２と同様に各種組織由来間葉系幹細胞を三次元培養し、アテロコラーゲンスポンジへの細胞播種後4日時点の各種組織由来間葉系幹細胞及びアテロコラーゲンスポンジを含む三次元培養物を採取し、定量的PCRにより測定した。Total RNAの抽出は、Trizol（Invitrogen）とPureLinkTM RNA Purification Kit（Thermo Fisher Scientific）を用いて行い、cDNAへの逆転写は、High-Capacity RNA-to-cDNA kit（Thermo Fisher Scientific）を用いて行った。定量的PCRは、PowerSYBR（商標） Green Master MixとQuantiStudio 7 Pro Real-Time PCR System（Thermo Fisher Scientific）を用いて行った。プライマーに使用した配列は、表１の通りである。標的遺伝子の発現は、参照遺伝子であるグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）の発現に対して正規化した。結果は平均値及び標準誤差（SD）で示した。統計処理に関しては、スチューデントのt検定を使用して単一比較を実施し、一元配置分散分析（ANOVA）と事後テューキー・クラマー検定を使用して多重比較を実施した。統計解析はエクセル統計（株式会社社会情報サービス）を用いた。
本実施例では、三次元培養された各細胞について各種遺伝子発現量を測定した。実施例２と同様に各種組織由来間葉系幹細胞を三次元培養し、アテロコラーゲンスポンジへの細胞播種後4日時点の各種組織由来間葉系幹細胞及びアテロコラーゲンスポンジを含む三次元培養物を採取し、定量的PCRにより測定した。Total RNAの抽出は、Trizol（Invitrogen）とPureLinkTM RNA Purification Kit（Thermo Fisher Scientific）を用いて行い、cDNAへの逆転写は、High-Capacity RNA-to-cDNA kit（Thermo Fisher Scientific）を用いて行った。定量的PCRは、PowerSYBR（商標） Green Master MixとQuantiStudio 7 Pro Real-Time PCR System（Thermo Fisher Scientific）を用いて行った。プライマーに使用した配列は、表１の通りである。標的遺伝子の発現は、参照遺伝子であるグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）の発現に対して正規化した。結果は平均値及び標準誤差（SD）で示した。統計処理に関しては、スチューデントのt検定を使用して単一比較を実施し、一元配置分散分析（ANOVA）と事後テューキー・クラマー検定を使用して多重比較を実施した。統計解析はエクセル統計（株式会社社会情報サービス）を用いた。
コラーゲンスポンジを足場基材とした三次元培養において、臍帯組織由来MSCは、他組織由来MSCと比較して、異なる遺伝子発現を示した。インテグリンαサブユニットではα1及びα2タイプの発現が高く、マトリックスメタロプロテアーゼファミリー遺伝子の発現は低い傾向であった。より詳しくは、滑膜組織由来間葉系幹細胞との比較では、臍帯組織由来間葉系幹細胞は、MMP1、MMP2、MMP3、MMP9、MT1-MMP、MMP13、ITGA10及びITGA11の遺伝子発現が低く（図４A～F、図４I及び図４J）、ITGA1及びITGA2の遺伝子発現が高かった（図４G及び図４H）。また、半月板組織由来間葉系幹細胞と比較しても、MMP1、MMP2、MMP3、MMP9、MT1-MMP、MMP13、ITGA10及びITGA11の遺伝子発現が低い若しくは共に陰性であり（図４A～F、図４I及び図４J）、ITGA1及びITGA2の遺伝子発現が高かった（図４G及び図４H）。
（実施例５）平面培養された細胞と三次元培養された細胞の遺伝子発現解析
本実施例では、平面培養された臍帯組織由来間葉系幹細胞と三次元培養された臍帯組織由来間葉系幹細胞の未分化マーカー遺伝子の発現量を測定した。実施例１と同様の方法により継代培養された増殖期の平面培養時点、及び実施例２と同様の方法によるアテロコラーゲンスポンジ（アテロコラーゲンゲル使用）への細胞播種後4日目の三次元培養時点の細胞を採取し、定量的PCRにより測定した。Total RNAの抽出は、Trizol（Invitrogen）とPureLinkTM RNA Purification kit（Thermo Fisher Scientific）を用いて行い、cDNAへの逆転写は、High-Capacity RNA-to-cDNA kit（Thermo Fisher Scientific）を用いて行った。定量的PCRは、Power SYBR（商標）Green Master MixとQuantiStudio 7 Pro Real-Time PCR System（Thermo Fisher Scientific）を用いて行った。プライマーに使用した配列は、表２の通りである。標的遺伝子の発現は、参照遺伝子であるグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）の発現に対して正規化した。結果は平均値及び標準誤差（SD）で示した。統計処理に関しては、スチューデントのt検定を使用して単一比較を実施し、一元配置分散分析（ANOVA）と事後テューキー・クラマー検定を使用して多重比較を実施した。統計解析はエクセル統計（株式会社社会情報サービス）を用いた。
本実施例では、平面培養された臍帯組織由来間葉系幹細胞と三次元培養された臍帯組織由来間葉系幹細胞の未分化マーカー遺伝子の発現量を測定した。実施例１と同様の方法により継代培養された増殖期の平面培養時点、及び実施例２と同様の方法によるアテロコラーゲンスポンジ（アテロコラーゲンゲル使用）への細胞播種後4日目の三次元培養時点の細胞を採取し、定量的PCRにより測定した。Total RNAの抽出は、Trizol（Invitrogen）とPureLinkTM RNA Purification kit（Thermo Fisher Scientific）を用いて行い、cDNAへの逆転写は、High-Capacity RNA-to-cDNA kit（Thermo Fisher Scientific）を用いて行った。定量的PCRは、Power SYBR（商標）Green Master MixとQuantiStudio 7 Pro Real-Time PCR System（Thermo Fisher Scientific）を用いて行った。プライマーに使用した配列は、表２の通りである。標的遺伝子の発現は、参照遺伝子であるグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）の発現に対して正規化した。結果は平均値及び標準誤差（SD）で示した。統計処理に関しては、スチューデントのt検定を使用して単一比較を実施し、一元配置分散分析（ANOVA）と事後テューキー・クラマー検定を使用して多重比較を実施した。統計解析はエクセル統計（株式会社社会情報サービス）を用いた。
三次元培養時の臍帯組織由来MSCは、平面培養時と比較して、未分化性に関与する遺伝子であるOct4及びNanogの遺伝子発現量が高かった（図５A及びB）。
本発明の軟骨修復組成物に含まれる三次元培養物を構成する臍帯組織由来細胞は、三次元培養における細胞増殖能が高く、軟骨修復に適した特徴を有し、自家又は他家再生医療において利用できる。本発明の軟骨修復組成物は、軟骨組織の修復の用途に広く利用でき、例えば人工軟骨、人工関節、人工半月板、移植片、細胞製剤、注射剤、軟骨補填材等に利用できる。
Claims (10)
- 臍帯組織由来細胞からなる三次元培養物を有効成分として含む軟骨修復用組成物。
- 前記三次元培養物を構成する臍帯組織由来細胞におけるマトリックスメタロプロテアーゼ遺伝子の発現量が、滑膜組織由来細胞又は半月板由来細胞における各遺伝子の発現量と比較して低いことを特徴とする、請求項１に記載の軟骨修復用組成物。
- 前記マトリックスメタロプロテアーゼ遺伝子が、MMP1、MMP2、MMP3、MMP9、MMP13及びMT1-MMPからなる群より選択される１種又は複数種の遺伝子である、請求項２に記載の軟骨修復用組成物。
- 前記三次元培養物を構成する臍帯組織由来細胞におけるITGA1及びITGA2のいずれか1種又は2種の遺伝子の発現量が、滑膜組織由来細胞又は半月板由来細胞における各遺伝子の発現量と比較して高く、並びに／あるいは
前記三次元培養物を構成する臍帯組織由来細胞におけるITGA10及びITGA11のいずれか1種又は2種の遺伝子の発現量が、滑膜組織由来細胞又は半月板由来細胞における各遺伝子の発現量と比較して低いことを特徴とする、請求項１～３のいずれかに記載の軟骨修復用組成物。 - 前記三次元培養物が、足場基材存在下で培養された臍帯組織由来細胞を含む、請求項４に記載の軟骨修復用組成物。
- 前記臍帯組織由来細胞におけるOct4及びNanogのいずれか1種又は2種の遺伝子の発現量が、足場基材非存在下で培養された臍帯組織由来細胞における各遺伝子の発現量と比較して高いことを特徴とする、請求項５に記載の軟骨修復用組成物。
- 前記軟骨修復用組成物における軟骨が、半月板、関節軟骨、椎間板、肋軟骨、気管軟骨、気管支軟骨、鼻軟骨、甲状軟骨、恥骨結合、関節円板、骨端板、耳介軟骨、外耳道軟骨、咽頭蓋軟骨、喉頭軟骨及び関節唇からなる群から選択されるいずれか１種又は複数種の軟骨である、請求項１に記載の軟骨修復用組成物。
- 前記臍帯組織由来細胞が、未分化細胞を含む、請求項１に記載の軟骨修復用組成物。
- 臍帯組織由来細胞を三次元培養する工程を含む、軟骨修復用組成物の製造方法。
- 前記三次元培養する工程が、足場基材存在下で培養する工程を含む、請求項９に記載の製造方法。
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