JP2001502905A

JP2001502905A - ホウォートンゼリーから分離した細胞を用いた軟骨組織の形成

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Publication number: JP2001502905A
Application number: JP10519528A
Authority: JP
Inventors: パルチノ，アンソニー，エフ．; ノートン，ブライアン，エイ．; ローマン，ジュリアサン
Original assignee: アドバンストティシューサイエンシズ，インコーポレーテッド
Priority date: 1996-10-23
Filing date: 1997-10-23
Publication date: 2001-03-06
Also published as: US5919702A; KR20000052709A; AU4988897A; EP0939803A1; AU731827B2; CA2269121A1; NZ335531A; WO1998017791A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、臍帯、特にホウォートンゼリー(Wharton's jelly)から、軟骨を作る軟骨細胞をもたらす前軟骨細胞を単離し、それらを使用することに関する。単離された前軟骨細胞、またはそれから生じる軟骨細胞は、培養下に有糸分裂で増やして、治療用の新しい軟骨組織を形成させるために使用できる。前軟骨細胞または軟骨細胞の「バンク」が凍結保存され、必要に応じてそれらを融解して、新しい軟骨組織を形成させるために使用できる。

Description

【発明の詳細な説明】ホウォートンゼリーから分離した細胞を用いた軟骨組織の形成 1. 序本発明は、軟骨組織を作るための組成物および方法に関する。さらに特定すると、本発明は、ホウォートンゼリー(Wharton’s jelly)(その細胞は軟骨組織を形成する軟骨細胞を生じさせる)のような臍帯源から前軟骨細胞(prechondrocyte )を分離する方法に関する。分離された前軟骨細胞、またはそれから生じる軟骨細胞は、培養下で有糸分裂的に増やして、さまざまな治療用途を有する軟骨組織を形成させることができる。本発明の前軟骨細胞、またはそれから生じる軟骨細胞は細胞の「バンク」を形成させるために低温保存および凍結保存し、必要に応じてこれらの細胞を融解し、新たな軟骨組織の形成に使用することができる。これはヒトの軟骨組織を形成させるために用いるとき特に有利である。本発明は、ホウォートンゼリーからの前軟骨細胞の分離、それらの有糸分裂的増殖、三次元枠組みへの接種、前記枠組み上での軟骨組織へのそれらの誘導について記載する実施例により実証される。 2. 発明の背景 2.1. 置換軟骨組織の用途リウマチや変形性関節炎のような疾患または外傷により引き起された軟骨の損傷は、重大な身体的変形や衰弱を招くことがある。ヒト関節軟骨が老化するとその純圧縮および引張特性が変化する。膝関節軟骨の表面部分は30代まで引張強度の増加を示すが、その後は関節表面においてII型コラーゲンに対する検出可能な損傷がおこり、引張強度は加齢とともに顕著に減少する。軟骨の深部でも、コラーゲン含量の低下は示さないものの、加齢につれて引張強度が徐々に低下する。これらの観察は、老化とともに物理的な、それ故構造的な軟骨組織の変化が発生し、それが十分に進行すると軟骨が外傷的損傷を受けやすくなることを示している。変形性関節炎の軟骨においてはII型コラーゲンが過度に損傷し、コラーゲンフィブリルのけん縮が起こる。リウマチ様関節炎では多形性白血球から放出されたプロテアーゼとフリーラジカルの両者の作用により関節表面に見られる損傷の多くが発生する(Tikuら，1990，J．Immunol．145:690-696)。軟骨細胞による軟骨マトリックス分解とプロテアーゼの誘導はおそらく主としてインターロイキン -1(IL-1)または腫瘍壊死因子-α(TNF-α)によるものである(Tyler，1985，Bioch em．J．225:493-507)。したがって、置換用軟骨組織の供給源は軟骨の減少または外傷の多くの症例において有用であろう。 2.2．軟骨の減少に対する現在の治療法軟骨の減少に対する現在の治療は補綴物質による置換であり、例えば、美容的修復のためのシリコーンや、関節細工のための金属合金等である。しかし、補綴装具を入れると通常は下部組織および骨の損失を伴い、もとの軟骨組織で可能であった完全な機能は回復しない。永久的な外来部品の存在に関連した長期の重大な症状としては、感染、糜爛、不安定等がある。骨細胞を付着させた手術用スチールと共に滅菌骨または骨粉を最終的に移植して使用しても、細胞支持体の非分解性のために殆どの場合成功を収めていない。米国特許第4,609,551号には、in vitroおよび／またはin vivoで軟骨形成反応を刺激することができる可溶性骨タンパク質に、少なくとも３日間、in vitroで繊維芽細胞を接触させることが開示されている。活性化された繊維芽細胞を、次いで生物分解性マトリックスと合わせることにより、または関節内注射もしくは同種移植片および補綴装具への付着により、体内に導入する。この方法の欠点は、軟骨形成が短期間の培養では発生せず、軟骨合成のために移植部位の接触させた繊維芽細胞に過度に依存することになることである。あるいはまた、軟骨細胞を分離し、in vitroで有糸分裂的に増やし、損傷部位に直接投与してin vivoで新しい軟骨組織を形成させるか、または培養してin vi troで新しい軟骨組織を形成させた後に組織の損傷部位に移植された。例えば、G randeに付与された1989年７月11日発行の米国特許第4,846,835号には、三次元コラーゲンマトリックス上に自己由来軟骨細胞を接種し、その後関節軟骨損傷部位にin vivoで挿入し、縫合骨膜組織弁を用いて適所に固定することが開示されている。Vacantiらに付与された1991年８月20日発行の米国特許第5,041,138号には、後で移植するための三次元生物分解性マトリックス上に軟骨細胞を接種することにより軟骨性構造体をin vitroで増殖させるか、または、フリーの軟骨細胞をin vitroで増殖させた後に損傷部位に直接投与することが記載されている。 2.3．軟骨形成細胞の供給源軟骨細胞は通常の成熟軟骨組織から得ることができる。例えば、上記のGrande に付与された米国特許第4,846,835号とVacantiらに付与された米国特許第5,041, 138号はいずれも、関節の軟骨をコラゲナーゼ溶液中で消化し、続いて移植に先立ってin vitro培養培地中で軟骨細胞を有糸分裂的に増殖させることを開示している。有糸分裂で増えた軟骨細胞の集団が得られたら、それらの細胞を同一の被験者（親細胞を最初に採取した個体）に移植（自家移植）するか、または異なる被験者に移植（異種移植）する。さらに、異種移植は同一種の関係のあるまたは関係のない個体から得られた軟骨細胞を利用したり（同種間移植）、異なる種から得られた軟骨細胞を利用してもよい（異種間移植）。あるいはまた、軟骨細胞は同種間または異種間でありうる樹立された長期細胞系からも得られる。自家移植には、軟骨細胞または前軟骨細胞を患者から採取し、その後効果的な移植片を得るのに十分な数または密度にまで有糸分裂的に増殖させることが必要である。しかし、有効な細胞数または密度へと十分に増殖させるのに時間がかかるため自己由来培養物の有効利用は阻まれている。なぜなら、一部の軟骨修復は直ちに、または外傷の発生後短期間のうちに行う必要があるからである。別の制限は細胞の有糸分裂能にある。細胞が増殖できる回数は限られており、治療のために得られる最終的な細胞量が制限されてしまう。さらに、体にひどくこたえる重症の関節障害が患者の軟骨組織全体の分解を引き起こす場合は、軟骨細胞の培養を開始するために利用できる非罹患軟骨組織がほとんど存在しない可能性がある。異種培養物の使用は、新たに形成された移植軟骨組織の免疫反応や拒絶反応の可能性を含めて、それ自体の起こりうる問題を抱えている。その上、異種移植は組織や細胞系中に存在する病原体を被験者に伝播する危険がある。間葉細胞は軟骨形成細胞の別の供給源であり得る。間葉細胞は一般的に多能性の細胞であるとされ、多数回分裂して最終的に骨格組織（軟骨、骨、腱、靱帯、骨髄間質および結合組織を含む）を生じさせる子孫細胞をもたらす。定義によると、これらの間葉細胞は一般的に一定数の有糸分裂（これに限らないが）に左右されないと考えられている(Caplan，1991，J．Orthopaed．Res．9:641-650)。Ca planに付与された、1993年３月30日および1993年７月13日発行のそれぞれ米国特許第5,197,985号および同第5,226,914号には、ヒト骨髄由来の間葉細胞を分離し、培養下で増やし、それらを活性化させて骨または、上記特許によれば、軟骨に分化させることが記載されている。同様に、Caplanに付与された1996年１月23日発行の米国特許第5,486,359号には、ヒト間葉幹細胞およびこれらの細胞に対するモノクローナル抗体が記載されている。この場合も、それらが種々の組織型に分化するように細胞を培養すると述べられている。しかしながら、Caplanの上記特許には骨形成が示されているにすぎないことに注目されたい。事実、かかる細胞が軟骨細胞を得るために利用できること、または軟骨組織が開示された方法で作られることを示すデータは皆無である。さらに、もし間葉細胞が自己由来でなければ、それらの使用は上で述べたような免疫拒絶反応や病原体の伝播といった起こりうる問題を解決することができない。さらに、Caplanの上記特許は軟骨形成能がある細胞の供給源としての臍帯のホウォートンゼリーを開示していない。かくして、免疫反応を起こす危険がなく、また、病原体を伝播する恐れのない軟骨細胞の容易に入手できる供給源から、疾病または外傷の治療に使用するための新しい軟骨組織を作りだす方法は有益だろう。 2.4．軟骨形成における成長因子およびホルモンの役割成長因子は、細胞代謝に対するパラクリンまたはオートクリン作用を有し、後述するように、軟骨細胞の分裂、マトリックス合成、および分解を遅延させ、あるいは促進することができる。 2.4.1．トランスフォーミング増殖因子-β トランスフォーミング増殖因子-β(TGF-β)は、多くの細胞型の増殖と分化を制御する関連した２量体タンパク質の増殖ファミリーを指す(Barnardら，1990， Biochem．Biophys．Acta．1032:79-87;Massague，1990，Annu．Rev．Cell．Biol ．6:597-619;Roberts and Sporn，1990，pp．419-472 M.B．Sporn and A.B．and Roberts(eds.)，Peptide Growth Factors and Their Receptors I,Springer-Ve rlag，Berlin)。このファミリーのメンバーとしては、TGFβ-1(Derynckら，1985 ，Nature 316:701-705;Mosesら，1981，Cancer Res．41:2842-2848;Robertsら， 1981，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 78，5339-5343;Sharplesら，1987，DNA 6:2 39-244)、TGF-β2(DeMartinら，1987，EMBO J．6:3676-3677;Hanksら，1988，Pr oc．Natl．Acad．Sci．USA 85，79-82;Ikedaら，1987，Biochemistry 26，2406- 2410;Madisenら，1988，DNA 7，1-8;Marquardtら，1987，Biol．Chem．262:1212 7-12131，Seyedinら，1987，J.Biol．Chem．262:1946-1949)、TGF-β3(Derynck ら，1988，EMBO J．7:3737-3743;Jakowlewら，1988，Endocrinol．2，747-755) 、TGF-β4(Jakowlewら，1988，Mol．Endocrinol．2:1064-1069)、TGF-β5(Konda iahら，1990，J．Biol．Chem．265:1089-1093)、より遠縁のミュラー管抑制物質 (Cateら，1986，Cell．45:685-698)、インヒビン(Masonら，1985，Nature 318:6 59-663)、骨形態形成タンパク質(Wozneyら，1988，Science 242:1528-1534)およびOP-1(Ozkaynakら，1990，EMBO J．9:2085-2093)が含まれる。新たに発見されたメンバーとしては、OP-2(Ozkaynakら，1992，J．Biol．Chem．267:25220-2522 7)、GDF-1(Lee，1990，Mol．Endocrinnol．4:1034-1040)、GDF-3およびGDF-9(Mc Pherron and Lee，1993，J．Biol．Chem．268:3444-3449)およびNodal(Zhouら， 1993，Nature 361:543-546)がある。 TGF-βは、最初にその細胞増殖効果について特性付けされた。これはラット腎繊維芽細胞の足場非依存的増殖を刺激し(Robertsら，1981，前掲)、またサル腎細胞の増殖を抑制した(Tuckerら，1984，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 81:6757- 6761)。その後、TGF-βは種々の生物学的活性を有することが示されており、例えば、これは骨形成を促進し(Noda and Camilliere，1989，Endocrinol．124: 2991-2995;Joyceら，1990，J．Cell．Biol．110:2195-2207;Marcelliら，1990， J．Bone Mineral Res．5:1087-1096;Beckら，1991，J．Bone Minaral Res．6:96 1;Mackie and Trechsel，1990，J．Cell．Biol．110，2195-2207)、軟骨特異的巨大分子の生成へとラット筋細胞を誘導し(Seyedinら，1984，J．Biol．Chem．2 61:5693-5695;Seyedinら，1986，J．Biol．Chem．261:5693-5695;およびSeyedin ら，1987，J．Biol．Chem．262:1946-1949)、初期造血前駆細胞(Goeyら，1989， J．Immunol．143:877-880)、Ｔ細胞(Kehrlら，1986，J．Exp．Med．163:1037-10 50)、Ｂ細胞(Kasidら，1988，J．Immunol．141．690-698)、マウス表皮細胞(Pie tenpolら，1990，Cell 61:777-785;Coffeyら，1988，Cancer Res．48:1596-1602 )およびいくつかのヒト癌細胞系(Robertsら，1985，Proc．Natl．Acad．Sci．US A 82:119-123;Ranchalisら，1987，Biophys．Res．Commun．148:783-789)の増殖を抑制する。またTGF-βはコラーゲンとフィブロネクチンの合成と分泌を増加させ(Ignotz and Massague，1986，J．Biol．Chem．261:4337-4345;Centrellaら， 1987，J．Biol．Chem．262:2869-2874;Malemudら，1991，J．Cell Physio．149: 152-159;Galeraら，1992，J．Cell Physio．153:596-606;Phillipsら，1994，So c．Inv．Derm．103-2:228-232)、切開傷の回復を促進し(Mustoeら，1987，Scien ce 237:1333-1335)、マウス乳房移植物中でカゼイン合成を抑制し(Robinsonら， 1993，J．Cell．Biol．120:245-251)、ラット肝上皮細胞においてDNA合成とpRb のリン酸化を抑制し(Whitson and Itakura，1992，J．Cell．Biochem．48:305-3 15)、BFGF結合プロテオグリカンの産生を刺激し(Nugent and Edelman，1992，J ．Biol．Chem．267:21256-21264)、EGFレセプターのリン酸化と偏平上皮癌細胞の増殖を調節し(Goldkorn and Mendelsohn，1992，Cell Growth and Differenti ation)、子宮上皮細胞(Rotelloら，1991，Proc．Natl，Acad．Sci．USA 88:3412 -3415)、培養肝細胞および退化肝臓(Oberhammerら，1992，Proc．Natl．Acad．S ci．USA 89:5408-5412)においてアポトーシスに至らせる。また好中球の内皮への付着を抑制することで再灌流障害からの心臓保護を媒介し(Leferら，1990，Sc ience 249,61-64;Leferら，1993，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90:1018-1022) 、マウスの実験的な自己免疫疾患からの防御を与える(Kuruvillaら，1991，Proc．Natl． Acad．Sci．USA 88:2918-2921)。筋細胞および軟骨細胞における軟骨特異的巨大分子の産生を誘導するTGF-βの能力についての前記報告とは対照的に、TGF-βが繊維芽細胞増殖因子と相乗的に作用して、ニワトリ胸骨軟骨細胞によるII型コラーゲンの合成を抑制すること(H ortonら，1989，J．Cell Physio．141:8-15)およびTGF-βがラット軟骨細胞での II型コラーゲンの産生を抑制すること(Rosenら，1988，J．Cell Physio．134:33 7-346)が見出されている。実際にTGF-βは、in vitroおよびin vivoにおいて殆どの正常細胞型の増殖の標準的インヒビターとして出現し、非常に多様な生物学的活性を示す(Alexandrow and Moses，1995，Cancer Res．55:1452-1457)。 TGF-β1はヒトおよびブタ血小板から(Assoianら，1983，J．Biol．Chem．258: 7155-7160)から精製されており、組換え体TGF-β1が現在では入手可能である(Ge ntryら，1988，Mol．Cell．Biol．7:3418-3427)。 2.4.2．インスリン様増殖因子ＩおよびII インスリン単独では、コラーゲンマトリックスの合成を刺激するうえでインスリン様増殖因子(IGF-I)よりもずっと活性が低い。しかしインスリンは、低濃度の血清(1%)の存在下においてプロテオグリカン合成を増強する。以前にはソマトメジンｃと呼ばれていたIGF-Iは、in vitroにおいてコラーゲンおよびプロテオグリカン合成の強力な誘導物質である(Lindahlら，1987，J．Endocrinol．115:2 63-271;Markowerら，1989，Cell．Biol．Int．Rep．13:259-270)。インスリン様増殖因子II(IGF-II)は、DNAおよびRNA合成を刺激し、胎児細胞のクローン増殖を刺激するうえでIGF-Iよりも強力であり、一方IGF-Iは成人軟骨細胞に対してはより効果が高い。IGF-IIは、プロテオグリカン合成を刺激するものの、インスリンと同様にIGF-Iよりもずっと効果が低い(McQuillanら，1986，Bio chem．J．240:423-430)。 2.4.3．成長ホルモン成長ホルモン(GH)を非経口投与することにより、in vivoにおいて局所的な成長板の発生を刺激することができる。下垂体切除により成長板の軟骨細胞におけるIGF-Iが消失し、このことは合成が停止することを示している。一方、GHにより全身的あるいは局所的に処置すると、IGF-Iが出現する。GHのin vitroにおける細胞増殖に対する直接の刺激効果についての報告(Maroら，1989，Endocrinol ．125:1239-1445)はそれが効果を有していなかったとする報告(Burchら，1985， J．Clin．Endocrinol．Motab．60:747-750)と矛盾している。 2.4.4．その他の増殖因子上皮増殖因子(EGF)のみでは軟骨細胞の増殖に対して何の効果も示さない。インスリンと共存すると、EGFは相乗的にプロテオグリカン合成を刺激し、軟骨細胞の増殖を誘導する(Osbornら，1989，J．Orthop．Res．7:35-42)。塩基性繊維芽細胞増殖因子(bFGF)は、胎児関節軟骨においてプロテオグリカン合成を抑制するが(Hamermanら，1986，J．Cell．Physiol．127:317-322)、成人関節軟骨においてはIGF-Iと付加的に機能し、プロテオグリカン合成を刺激するようである(Os born，K.D.,ら，1989，J．Orthop．Res．7:35-42)。血小板由来増殖因子(PDGF) もプロテオグリカン合成を増強する(Prinsら，1982，Arthritis Rheum．25:1228 -1238)。ある種の骨誘導タンパク質(BMP)は軟骨形成を剌激し、軟骨の生産を促進する(Inadaら，1996，Biochem．and Biophys．Res．Comm．222(2):317-322;Ha ttersleyら，1995，J．Bone and Mineral Res．10(1):PS163)。 3. 発明の概要本発明は、in vitroまたはin vivoにおける軟骨組織の作製方法に関わり、この方法は種々の目的に使用できる。本発明によれば、軟骨細胞前駆細胞すなわち「前軟骨細胞」を臍帯源、最も好ましくはホウォートンゼリー(Wharton'sjelly) から分離し、培養して軟骨組織を形成しうる軟骨細胞を生じさせる。本発明は、前軟骨細胞がin vitro培養技術によりホウォートンゼリーから分離できるという発見に一部基づくものである。本発明の一実施形態においては、ホウォートンゼリーから分離された前軟骨細胞の集団をin vitroで有糸分裂により増やして培養し、治療用の軟骨組織を形成しうる軟骨細胞を生じさせる。本発明の別の実施形態においては、ホウォートンゼリーから分離された前軟骨細胞および／またはそれらから分化した軟骨細胞、すなわち本発明の細胞、を「バンク」として低温保存および凍結保存し、必要に応じてこれらの細胞を融解し、軟骨組織の形成に使用することができる。例えば、ホウォートンゼリーを被験者の誕生直後に被験者の臍帯から採取する。本発明の細胞（採取された細胞またはそれから得られた細胞）は、被験者の生涯にわたって何年間も「バンク」に凍結保存することができる。必要に応じて細胞をバンクから取り出して融解させ、その融解細胞を用いて、軟骨の修復、置換または増強、ならびに骨、腱、靱帯などの他の間葉組織の修復、置換または増強のために、一生にわたりいつでも新しい組織を作ることができる。ホウォートンゼリーから分離された細胞の「胎児」性の結果、移植された本発明の細胞またはそれらから生じる軟骨組織の免疫拒絶反応は最小限に抑えられる。したがって、本発明の別の実施形態において、かかる細胞はそれを必要としている任意の被験者に使用するための「普遍的ドナー細胞」として有用である。本発明の別の実施形態では、細胞をヒドロゲル溶液中に懸濁して、それらを患者に注入または移植することができる。あるいはまた、最初に細胞をヒドロゲルに接種し、培養した後に移植してもよい。移植に先立って細胞が有糸分裂により増殖するようにヒドロゲル中で培養することが好ましい。本発明のさらに別の実施形態では、本発明の細胞から新しい軟骨組織を作り、当技術分野で知られたまたは今後開発される修復、置換または増強技術を用いて、患者の軟骨組織を修復し、置換しまたは増強するために使用する。例えば、本発明の細胞を、前軟骨細胞または軟骨細胞により橋かけされ得る間隙、開口または細孔を有する生物適合性の非生存物質から構成された三次元枠組みまたはスカホールド（足場）に接種する。適切なin vitro培養条件下では、接種された細胞が三次元枠組みを実質的におおい、細胞外マトリックスを分泌して新しい生存軟骨組織を形成し、これを体内に移植する。あるいはまた、本発明の細胞を三次元枠組みに接種して、直ちに被験者の部位に移植する。接種された細胞は体内で新しい軟骨組織を形成しはじめるさらに他の実施形態においては、本発明の細胞を接種する三次元枠組みが１種以上の生理活性薬、または抗炎症剤、増殖因子、免疫抑制剤などから選択される他の化合物をさらに含むか、または前記物質によりコーティングされる。本発明のさらなる実施形態においては、本発明の細胞を三次元枠組み上に接種して増殖させ、断続的な圧力変化が可能な容器または軟骨組織構築物のin vitro 作製用に特別に設計されたバイオリアクターシステム（このバイオリアクターは増殖中のチャンバー内の加圧および対流による軟骨細胞への栄養素の十分な供給を可能にする）に入れる。さらなる実施形態では、本発明の細胞を体内の部位に、例えば注射により三次元枠組みに付着させずに、直接投与して、その部位に新たな軟骨組織を形成させる。本発明のさらなる実施形態においては、本発明の細胞により作られた新しい軟骨組織から細胞外マトリックスを抽出し、軟骨の修復もしくは置換に有用な、または例えば美容目的のために顔や他の身体部分の強化に有用な製剤へとさらに加工する。本発明のさらなる実施形態では、本発明の細胞を、外因的に供給される増殖因子、例えばTGF-βまたはBMP-2、BMP-12、BMP-13などのBMPを用いて、軟骨を形成するように刺激する。本発明のさらに別の実施形態では、作られる軟骨の量を増加させるか、または例えば移植片に関係した拒絶反応や炎症の危険性を少なくすることで移植の成功率を高めるような、特定のタイプの増殖因子、ペプチド、タンパク質もしくは他の分子を産生するように、またはその産生を増加させるように、本発明の細胞を遺伝子操作する。 4. 図面の簡単な説明図1Aは、細胞接種した三次元枠組み上にin vitro形成された新しい軟骨組織である。本発明の細胞をPGAフェルト枠組み上に接種し、完全培地（RPMI 1640、10 % FBS、5% ES、抗生物質、抗真菌薬を含み、ヒドロコルチゾンを含まず）でTGF- β1なしで４週間培養した。倍率4X。視野の定規はミリメーター目盛りである。図1Bは、細胞接種した三次元枠組み上にin vitro形成された新しい軟骨組織である。本発明の細胞をPGAフェルト枠組みに接種し、続いて、完全培地(RPMI 164 0、10% FBS、5% ES、抗生物質、抗真菌薬を含み、ヒドロコルチゾンを含まず）で72時間、その後TGF-β1（10ng/mL）を含有する培地で72時間、そして最後に、更に３週間、TGF-β1なしの完全培地で培養した。倍率4X。視野の定規はミリメーター目盛りである。この軟骨は図1Aのそれより大きく、密度が高い。図1Cは、細胞接種した三次元枠組み上にin vitro形成された新しい軟骨組織である。本発明の細胞をPGAフェルト枠組みに接種し、続いて、完全培地（RPMI 16 40、10% FBS、5% ES、抗生物質、抗真菌薬を含み、ヒドロコルチゾンを含まず）で72時間、その後TGF-β1（10ng/mL）を含有する培地で72時間培養した。その後、該細胞構築物をTGF-β1なしの完全培地で72時間培養した。その後、TGF-β1（ 10ng/mL）を添加して、更に72時間培養した。最後に、該細胞構築物を更に2.5週間、TGF-β1なしの完全培地で培養した。倍率4X。視野の定規はミリメーター目盛りである。この軟骨は図1Aのそれより大きく、密度が高い。図2Aは、図1Bに記載の通り培養した新しい軟骨組織のヘマトキシリン−エオシン染色した切片（4μｍ）である。組織は広いマトリックス沈積を示すが、硝子軟骨（hyaline cartilage）の特徴である小腔（lacunae）は存在しない。倍率10 0X。図2Bは、図1Cに記載の通り培養した新しい軟骨組織のヘマトキシリン−エオシン染色した切片（4μｍ）である。組織は広いマトリックス沈積を示すが、硝子軟骨の特徴である小腔は存在しない。倍率100X。図3Aは、図1Bに記載の通り培養した新しい軟骨組織のサフロニンO（safronin O）染色切片（7〜8μｍ）である。倍率100X。図3Bは、図1Bに記載の通り培養した新しい軟骨組織のトリクロム（trichrome ）染色切片（7〜8μｍ）である。倍率100X。図4Aは、図1Bに記載の通り培養した新しい軟骨組織の免疫染色切片（4μｍ）である。切片を正常血清（アイソタイプ対照）で処理した。染色はイムノペルオキシダーゼ反応を用いて発色させた。倍率100X。図4Bは、図1Bに記載の通り培養した新しい軟骨組織の免疫染色切片（4μｍ）である。切片をヒトＩ型に対する抗体で処理した。染色はイムノペルオキシダーゼ反応を用いて発色させ、Ｉ型コラーゲンに対して陽性染色をもたらした。倍率 100X。図4Cは、図1Bに記載の通り培養した新しい軟骨組織の免疫染色切片（4μｍ）である。切片をヒトII型に対する抗体で処理した。染色はイムノペルオキシダーゼ反応を用いて発色させ、II型コラーゲンに対して陽性染色をもたらした。倍率 100X。図4Dは、図1Cに記載の通り培養した新しい軟骨組織の免疫染色切片（4μｍ）である。切片をヒトＩ型コラーゲンに対する抗体で処理した。染色はイムノペルオキシダーゼ反応を用いて発色させ、Ｉ型コラーゲンに対して陽性染色をもたらした。倍率100X。図4Eは、図1Cに記載の通り培養した新しい軟骨組織の免疫染色切片（4μｍ）である。切片をヒトII型コラーゲンに対する抗体で処理した。染色はイムノペルオキシダーゼ反応を用いて発色させ、II型コラーゲンに対して陽性染色をもたらした。倍率100X。図５は、新しい軟骨組織構築物の染色強度の総括である。培養は上記の図1A（ TGF-β1なし、すなわち、無処理）、1B（TGF-β1ｘ1）、及び1C（TGF-β1ｘ2）の通り実施した。強度は0〜+4の目盛りを付した。サフロニンO（SAF）及びトリクロム（TRICH）染色による構築物の染色は、関節軟骨組織切片の染色（陽性対照、+4）と比較した。Ｉ型またはII型コラーゲンに対する抗体による構築物の免疫染色とその後のイムノペルオキシダーゼ反応は、アイソタイプ対照血清（陰性対照、0）による染色と比較した。図6Aは、新しい軟骨組織構築物の縦方向切片の面積（μｍ²）である。3週間培養は、全3週間にわたり培養した上記の図1A（TGF-β1なし）、1B（TGF-β1x1）及び1C（TGF-β1x2）に記載の通り実施した。図中の6週間培養は、上記の通り実施したが、更に3週間追加してTGF-β1なしの完全培地で培養を続けた。面積は、計算機処理面積計により測定した。このデータは、図1A〜Cに示したものを定量表示する。最大漸増がほぼ3週間にわたり観察された。図6Bは、培養3週間後の新しい軟骨組織構築物の縦方向切片の面積（μｍ²）である。培養物は、次の増殖因子で処理するか又は処理しなかった：下垂体抽出物（PE、10μｇ/mL）、この場合は本発明の細胞をPGAフェルト枠組みに接種し、続いて完全培地（RPMI 1640、10% FBS、5% ES、抗生物質、抗真菌薬を含み、ヒドロコルチゾンを含まず）で72時間、その後PE（10μｇ/mL）を含有する培地で72 時間、そして最後にPEなしの完全培地で更に3週間インキュベーションした；TGF -β1＋表皮成長因子（EGF、100ng/mL）、表皮成長因子をTGF-β1と共に添加したことを除いて図1B記載の様式で添加した；TGF-β1＋インスリン様増殖因子（IGF 、100ng/mL）、インスリン様増殖因子をTGF-β1と共に添加したことを除いて図1 B記載の様式で添加した。面積は、計算機処理面積計により測定した。これらのデータは、他の因子がコラーゲン組織の増殖に影響を与えることを示す。 5. 発明の詳細な説明本発明は、軟骨の疾患もしくは傷害の治療、または追加の軟骨を提供することによる構造体の増強に使用するための（ａ）臍帯のホウォートンゼリーから前軟骨細胞を単離する方法；（ｂ）単離した前軟骨細胞及び／またはそれから分化した軟骨細胞の集団（本明細書では以後、本発明の細胞と集合的に呼ぶ）を有糸分裂により増殖する方法；及び（ｃ）有糸分裂により増殖した本発明の細胞の集団を新しい軟骨組織の形成を可能とするかまたは誘導する条件下で培養する方法に関わる新しい軟骨組織形成のための組成物と方法に関する。本発明はまた、限定されるものでないが、有糸分裂的にまたは他の方法で増殖した本発明の細胞；それから生じた新しい軟骨組織；それから抽出された細胞外マトリックス；及び三次元軟骨／枠組み構築物を含めて、前記方法の産物に関する。本発明はまた、軟骨をin vivo修復、置換または増強するか、新しい軟骨組織または生理活性薬を産生するか、または潜在的治療薬または化粧品の細胞毒性を試験するために有用な三次元軟骨培養物をin vitro形成するためのこれらの細胞、構築物及び組織の使用に関する。ホウォートンゼリーから単離した前軟骨細胞並びにそれから分化した軟骨細胞は、疾患または外傷で失った軟骨を修復または置換するための新しい軟骨組織を作るために使うことができる。更に、本発明の細胞は低温保存及び凍結貯蔵が可能であり、従って、細胞の「バンク」を確立して、いつでも患者の生涯中に疾患または外傷で失われた軟骨を置換するための新しい軟骨組織の形成に使うことができる。本発明は更に、それを必要とする患者において使用するための軟骨組織を生じる「普遍的ドナー細胞」としての、バンク中のまたはその他の本発明の細胞の使用を含むものである。本明細書で使われる用語「前軟骨細胞（pre-chondrocyte）」は、(1)多能性つまり系列に拘束されていない（lineage-uncommitted）、典型的には当業界で「幹細胞」と呼ばれる前駆細胞で、その系を再生するかまたは軟骨細胞に分化するであろう子孫細胞を産生する無制限な数の有糸分裂の潜在能力を有する細胞； (2)幹細胞の有糸分裂から生じた、系列に拘束されている子孫細胞で、最終的に軟骨細胞に分化する細胞を意味する。幹細胞とは異なり、系列に拘束された子孫細胞は一般的に他の子孫細胞を産生する無制限な数の有糸分裂能力はないと考えられるが、その代わり、最終的に軟骨細胞に分化する。本明細書で使われる用語「軟骨細胞」は、(1)前軟骨細胞から分化した細胞；または(2)親軟骨細胞の有糸分裂から生じた細胞；または：(3)単独でまたは一つ以上の他の細胞との組合せで軟骨組織を形成する及び／または含む、細胞外マトリックス（「ECM」）を分泌する能力のあるホウォートンゼリーのごとき臍帯源に由来する細胞を意味する。本明細書で使われる用語「本発明の細胞」は、(1)ホウォートンゼリーのごとき臍帯源から単離された前軟骨細胞；(2)軟骨細胞；または(3)前述の前軟骨細胞及び軟骨細胞の混合集団を意味する。本明細書で使われる用語「軟骨組織」は当分野で一般的に認識されている用語であり、ECM中に埋め込まれた細胞を含む特殊タイプの高密度結合組織をいう（例えば、Cormack，1987，Ham's Histology，9th Ed.，J.B．Lippincott Co.，pp ．266-272を参照）。軟骨の生化学的組成はタイプにより異なる。しかし、軟骨の一般組成は、コラーゲン、プロテオグリカン及び水からなる濃厚ECMにより囲まれた軟骨細胞を含む。軟骨のいくつかのタイプが当分野で認識されており、例えば、硝子軟骨、関節軟骨、肋軟骨、繊維軟骨、半月板軟骨、弾性軟骨、耳介軟骨、及び黄色軟骨を含む。どのタイプの軟骨の形成も本発明の範囲内に含まれるものである。本発明は、主にヒト用の新しい軟骨組織を作製するための組成物と方法に関する。しかし、本発明はまた、必要があればウマ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタなどを含むどの動物の使用のためであっても、新しい軟骨組織を作製するために実施することができる。かかる動物の治療は、本発明の範囲内に入るものである。本発明は、単に説明のためにであるが、次の区分に分けられる：(i)ホウォートンゼリーからの前軟骨細胞の単離；(ii)軟骨細胞の分化及び新しい軟骨組織の作製；(iii)前軟骨細胞及び／または軟骨細胞の「バンク」の確立；(iv)前軟骨細胞及び軟骨細胞のin vivo使用；(v)三次元軟骨培養物のin vitro確立；(vi)新しい軟骨組織の使用；及び(vii)遺伝子操作された軟骨。 5.1．ホウォートンゼリーからの前軟骨細胞の単離本発明の前軟骨細胞は、膿帯源、好ましくはホウォートンゼリーから単離される。ホウォートンゼリーは、臍帯中に見出されるゼラチン状物質であり、一般的にルーズな粘液性結合組織とみなされており、しばしば繊維芽細胞、コラーゲン繊維及び主にヒアルロン酸から構成された無定形基質からなると記述されている（Takechiら，1993，Placenta 14:235-45）。ホウォートンゼリーの組成及び構成について様々な研究が行われている（Gill and Jarjoura，1993，J．Rep．Med ．38:611-614;Meyerら，1983，Biochim．Biophys．Acta 755:376-387）。一つの報告が、ホウォートンゼリーからの「繊維芽細胞様」細胞の単離とin vitro培養を記述している（McElreaveyら，1991，Biochem．Soc．Trans．636th Meeting D ublin 19:29S）。本発明による前軟骨細胞の単離と培養のためのホウォートンゼリーを採取するには、臍帯は満期または早期妊娠のいずれかの終結と同時に取得される。例えば、限定するものではないが、臍帯、またはその切片は誕生地から研究室に、例えばダルベッコ修飾イーグル培地（DMEM）のごとき培地を容れたフラスコ、ビーカーまたは培養皿のごとき滅菌容器に入れて運ばれる。臍帯は、好ましくは、ホウォートンゼリーの採取前及び採取中、滅菌条件下に維持して取り扱い、更に、例えば70%エタノール溶液で臍帯の簡単な表面処理をして表面滅菌し、その後、滅菌蒸留水ですすぎ洗いするのがよい。臍帯は、ホウォートンゼリーの抽出前にほぼ3〜5℃で凍結せずに3時間まで、短時間保存することができる。ホウォートンゼリーは、当分野で公知の適切な方法により滅菌条件下で臍帯から採取される。例えば、臍帯をメスで横方向に、例えばほぼ1インチ切片に切断し、それぞれの切片を、表面血液をゆるやかな攪拌で切片から除去するに十分な量のCaCl₂（0.1g/l）及びMgCl₂・6H₂O（0.1g/l）を含むリン酸緩衝溶液（PBS）を容れた50ml遠心管のごとき滅菌容器に移す。その後、切片を取り出して滅菌した表面に置き、切片の外層または「ケーシング（casing）」を臍帯の縦軸に沿って切開する。ホウォートンゼリーは典型的には臍帯の3つの血管の間に位置する。血管とケーシングを例えば、滅菌鉗子及び解剖鋏で切り取り、ホウォートンゼリーを採集して、100mmTC処理ペトリ皿のごとき滅菌容器に納める。その後、ホウォートンゼリーを培養のために、例えば2 〜3mm³の更に小さい切片に刻む。ホウォートンゼリーを、その中に含まれる前軟骨細胞を増殖させるために適切な条件下の培地中でin vitroインキュベートする。本発明の前軟骨細胞を単離するために、例えば、限定されるものでないが、DMEM、McCoys 5A培地（Gibco）、イーグル基本培地、CMRL培地、Glasgow最小必須培地、Ham's F-12培地、Iscove' s修飾Dulbecco's培地、Lievovitz's L-15培地、及びRPMI 1640などのごとき、どの適切なタイプの培地でも使うことができる。培地は、例えば、ウシ胎児血清（ FBS）、ウマ血清（ES）、ヒト血清（HS）を含む一つ以上の成分、及び微生物汚染を抑制するために、例えば、ペニシリンG、ストレプトマイシン硫酸塩、アンホテリシンB、ゲンタマイシン、及びニスタチン、単独または組合せなどのごとき一つ以上の抗生物質及び／または抗真菌薬を補給することができる。最も適切な培地、培地調製、及び細胞培養技術を選択する方法は当分野では公知であり、本明細書に参考として組み込まれるDoyleら，(編)，1995，Cell & Ti ssue Culture:Laboratory Procedures ，John Wiley & Sons，Chichester；及びH o and Wang(編)，1991，Animal Cell Bioreactors，Butterworth-Heinemann，Bo stonを含む様々な文献に記載されている。ホウォートンゼリーを十分な時間、例えば、ほぼ10〜12日間培養した後、外植組織中に存在する前軟骨細胞は、該組織からの移動（migration）または細胞分裂、または両方の結果として、該組織から増殖して出てくる傾向がある。その後、これらの前軟骨細胞を、最初に使ったのと同じかまたは異なるタイプの、前軟骨細胞集団の有糸分裂増殖が可能な、新鮮な培地を容れた別の培養容器に移すことができる。あるいはまた、ホウォートンゼリー中に存在する異なる細胞型をサブ集団に分画化し、そのサブ集団から前軟骨細胞を単離することができる。これは細胞分離のための標準技術を使って実施することが可能で、限定されるものではないが、ホウォートンゼリーをその成分細胞に解離する酵素処理、その後のクローニング及び形態学的または生化学的マーカー、所望でない細胞の選択的破壊（ネガティブ選択）、例えばダイズ凝集素（soybean agglutinin）を用いた混合集団中の細胞凝集能の差に基づく分離、凍結−融解操作、混合集団中の細胞の接着性の差に基づく分離、濾過、通常の遠心法またはゾーン遠心法、遠心エルトリエーション（向流遠心）、ユニット重力分離（unit gravity separation）、向流分配、電気泳動、及び蛍光活性化セルソーティング（FACS）を使う特定の細胞型の選別を含む。クローン選択及び細胞分離技術を概観するためには、本明細書に参考として組み込まれるFreshney，1994，Culture of Animal Cells;A Manual of Basic Technique ，3d Ed.，Wiley-Liss，Inc.，New Yorkを参照のこと。前軟骨細胞を培養するための好ましい実施形態では、ホウォートンゼリーをほぼ2〜3mm³の切片に切断し、ペトリ皿の底にガラススライドを容れたTC処理ペトリ皿中に置く。その後、該組織切片を他のガラススライドで覆い、例えば、10% FBS、5% ES、及びペニシリンG（100μｇ/ml）、ストレプトマイシン硫酸塩（100 μｇ/ml）、アンホテリシン（250μｇ/ml）、ゲンタマイシン（10μｇ/ml）を含む抗微生物化合物を含有するRPMI 1640のごとき完全培地中、pH7.4〜7.6で培養する。該組織は好ましくは37℃、5% CO₂で、10〜12日間インキュベートする。培地は必要に応じて、注意深く培地を培養皿から例えばピペットで吸引し、新鮮な培地を補充することにより、変える。インキュベーションは上記の通り十分な数または密度、例えば、完全コンフルエンスでなくほぼ70%コンフルエンスの細胞が培養皿内及びスライド表面に蓄積するまで続ける。元の外植組織切片を取り除き、残りの細胞を標準技術を使ってトリプシン処理を施す。トリプシン処理後、該細胞を採集し、新鮮な培地に移し換えて上記の通りインキュベーションする。培地は、トリプシン処理後少なくとも24時間に1回変えて浮遊細胞を除去する。培養物中に残留する細胞は前軟骨細胞と考えられる。前軟骨細胞が単離されたら、該集団を有糸分裂により増殖させる。前軟骨細胞は、ほぼ3〜6.5ｘ10⁴/cm³の密度に到達するか、または、例えば、培養皿の表面上で規定されたコンフルエンシー％に到達したとき、新鮮な培地に移し換えまたは「継代」すべきである。前軟骨細胞のインキュベーション中に、細胞は培養容器の壁に付着することがあり、そこで細胞は増殖を続けてコンフルエントな単層を形成することがある。培養容器のコンフルエントな単層の存在は培養中の細胞増殖を「停止」しがちであるので、この現象は、例えば、該細胞の一部を新鮮な培地の入っている新しい培養容器に移し換えることにより、回避するか最小化すべきである。コンフルエントな単層の除去または該細胞の一部を新しい容器の新鮮な培地への移し換えは通常、細胞の増殖活性を回復するであろう。ほぼ25%コンフルエンシーを越える前軟骨細胞単層を有する培養容器では、かかる除去または移し換えを行うべきである。あるいはまた、液体培養では、細胞の容器壁付着を防止するために、例えば、軌道振盪機で攪拌することができる。好ましい実施形態では、軟骨組織は、継代数の少ない前軟骨細胞を使い作製される。例えば、2〜4継代は、細胞が分化して軟骨組織を作る能力を保存するのに最適な継代数であると思われる。しかし本発明は、いったん前軟骨細胞が培養物中に確立されれば、軟骨を作製しうる軟骨細胞の前駆細胞として機能するそれらの能力は、例えば、細胞培養物が適切な密度またはコンフルエンシー％に達した時の新鮮な培地への規則的な継代により、または適切な増殖因子での処理により、または培地または培養プロトコルの変更により、または以上のいくつかの組み合わせにより、維持可能であることを意図する。本発明によれば、前軟骨細胞は、患者自身の臍帯から採集したホウォートンゼリーから得ることができる。また、治療の必要な患者が胎児または幼児の両親の一人である場合、前軟骨細胞を、発育中の胎児または新生児に結合した臍帯から得られたホウォートンゼリーから取得することは有利であり得る。代わりにあるいはまた、ホウォートンゼリーから単離した細胞の「胎児」性の故に、本発明の細胞及び／またはそれから形成される新しい軟骨組織の免疫拒絶反応は最小化されているだろう。その結果、かかる細胞は、それを必要とする患者に使用する新しい軟骨組織を作るための「普遍的ドナー細胞」として有用である。 5.2. 軟骨細胞の分化及び軟骨組織の形成いったん確立されたら、前軟骨細胞の培養物は、新しい軟骨組織を作る能力のある軟骨細胞の作製に使うことができる。前軟骨細胞の軟骨細胞への分化とその後のそれからの軟骨組織の形成は、例えば、アスコルベートを含むかまたは含まないBMP-13のごときBMPまたはTGF-βなどの特定の外因性増殖因子の培地への添加により開始させることができる。また、前軟骨細胞は遺伝子操作によって、例えば、軟骨細胞への成功した及び／または向上した分化及び／または移植前後の軟骨形成の代謝回転のために、TG F-β（例えば、TGF-β₁）のごとき特定タイプの増殖因子並びにTIMPまたはメタロプロテイナーゼの組織阻害剤に対する遺伝子を発現させることができる。本発明は更に、軟骨細胞の培養物、並びに前軟骨細胞と軟骨細胞の両方を含む混合培養物の確立と維持を意図する。前軟骨細胞と同じように、いったん軟骨細胞の培養物または前軟骨細胞と軟骨細胞の混合培養物が確立されたら、該細胞集団は、軟骨形成なしの細胞増殖に導く条件下、例えばTGF-βまたは他の増殖因子を欠く培地で、細胞密度を目安として新鮮な培地への継代により、有糸分裂によりin vitro増殖させる。前軟骨細胞の培養物と同じ様に、軟骨細胞の培養物及び前軟骨細胞と軟骨細胞の混合培養物は、十分な細胞密度に到達すれば新鮮な培地に移し換えるべきである。かくして、例えば、細胞の一部を新しい培養容器へそして新鮮な培地に移し換えることにより、細胞単層の形成を防止または最小化すべきである。かかる除去または移し換えは、細胞単層がほぼ25%コンフルエンシーを越えれば、どの培養容器でも行われるべきである。これとは別に、該培養系を攪拌して細胞の付着を防止することができる。５．３．細胞バンクの確立本発明の細胞が上記のように培養物中で確立されたら、それらは、規則的な移送を必要とする細胞の連続in vitro培養物、または好ましくは低温保存されている細胞のいずれかを含む細胞「バンク」に維持または保存され得る。本発明の細胞の低温保存は、Doyleら，1995，上記同様に記載された方法などの公知の方法によって行われ得る。例えば、限定するものではないが、細胞を、「凍結培地」、例えば15〜20％のＦＢＳおよび10％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）をさらに含み、５〜10％のグリセロールを含むかまたは含まない培地などに、例えば約４〜10×10⁶細胞／mlの密度で懸濁し得る。細胞を、ガラス製またはプラスチック製アンプル（Nunc）に分配し、次いで密封してプログラマブルフリーザーの冷凍庫に移す。凍結の最適速度は、経験的に決定され得る。例えば、融解熱を通して−１℃／分の温度で変化させる凍結プログラムが用いられ得る。アンプルが−180℃に到達したら、それらを液体窒素貯蔵区域に移す。低温保存細胞は、何年もの間保存することができるが、生存能力の維持のために少なくとも５年毎に検査するべきである。本発明の低温保存細胞は細胞のバンクを構成し、その一部は解凍によって「回収」することができ、次いで必要に応じて新しい軟骨組織の産生に用いることができる。解凍は、一般的に、例えば、アンプルを液体窒素から37℃の水浴に移すことによって急速に行うべきである。解凍されたアンプルの中身は、ただちに、無菌条件下で、10％のＦＢＳおよび５％のＥＳでコンディショニングされたＲＰＭＩ１６４０などの適当な培地を含む培養容器に移すべきである。培地中の細胞は、細胞ができるだけ早く培地をコンディショニングすることによって誘導期の遅延を防ぐことができるように、約３〜６×10⁵細胞／mlの初期密度に調整されるのが望ましい。培養中、例えば、倒立顕微鏡を用いて細胞を毎日調べることによって細胞増殖を検出し得るものであり、細胞が適当な密度に到達したらすぐに継代培養する。必要に応じて本発明の細胞はバンクから回収され得るものであり、そして、例えば、下記のような三次元軟骨培養のようにin vitroで、または、例えば、新しい軟骨組織が必要な部位に細胞を直接投与することによってin vivoで、新しい軟骨組織を産生させるために使用され得るものである。上記のように、本発明の細胞は、その細胞が当初被験者の臍帯から単離されている場合、その被験者における使用のための新しい軟骨組織を産生させるために用いられ得るものである（自己）。一方、本発明の細胞は、任意の被験者における使用のための新しい軟骨組織を産生させるために普遍的ドナー細胞として用いられ得るものである(異種) 。５．４．前軟骨細胞および軟骨細胞のin vivo使用本発明の細胞は、病気または外傷から生ずる軟骨組織の修復または置換を必要とする被験者を治療するため、または顔面もしくはその他の身体の特徴を増強させるなどの美容的作用を与えるために使用され得る。治療は、新しい軟骨組織を産生させるための本発明の細胞の使用、ならびに現在当技術分野で公知の任意の方法または将来開発されるであろう任意の方法にしたがって産生される軟骨組織の使用を必要とし得るものである。例えば、本発明の細胞は、それらがin vivo で新しい軟骨組織を産生するように、組織損傷の部位に直接移植、注射、または投与され得る。非限定的な実施形態においては、本発明の細胞を含む製剤は、新軟骨組織の産生が望まれている部位への直接注射用に調製される。例えば、限定するものではないが、本発明の細胞は注射用のヒドロゲル溶液に懸濁され得る。一方、細胞を含有するヒドロゲル溶液は、移植前にそのヒドロゲル溶液内に分散された細胞を有するマトリックスを形成させるために、例えば、鋳型中で硬化させ得るものである。あるいは、マトリックスが硬化したら、細胞が移植前に有糸分裂的に増大するように、細胞構成体(cell formations)が培養され得る。ヒドロゲルは、共有結合、イオン結合、または水素結合によって架橋されることにより水分子を閉じ込めてゲルを形成する三次元開放格子(open-lattice)構造を作り出す有機ポリマー（天然または合成）である。ヒドロゲルの形成に用いることができる材料としては、例えば、イオン的に架橋される、アルギネートおよびその塩などの多糖類、ポリホスファジン(polyphosphazines)、ならびにポリアクリル酸エステル、または、それぞれ温度もしくはpHで架橋される、Pluronics（商標名）もしくはT etronics（商標名）のようなブロックポリマー、ポリエチレンオキシド−ポリプロピレングリコールブロックコポリマーが挙げられる。一般的に、これらのポリマーは、水、緩衝塩溶液、もしくは水性アルコール溶液のような水性溶液に少なくとも部分的に可溶性であり、荷電側鎖基またはその１価のイオン性塩を有する。カチオンと反応し得る酸性側鎖基を有するポリマーとしては、例えば、ポリ（ホスファゼン）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、アクリル酸とメタクリル酸のコポリマー、ポリ（酢酸ビニル）、およびスルホン化ポリスチレンなどのスルホン化ポリマーが挙げられる。また、アクリル酸またはメタクリル酸とビニルエーテルモノマーまたはポリマーとの反応によって生成した酸性側鎖基を有するコポリマーも使用することができる。酸性基としては、例えば、カルボン酸基、スルホン酸基、ハロゲン化（好ましくはフッ素化）アルコール基、フェノール性ＯＨ基、および酸性ＯＨ基が挙げられる。アニオンと反応し得る塩基性側鎖基を有するポリマーとしては、例えば、ポリ（ビニルアミン）、ポリ（ビニルピリジン）、ポリ（ビニルイミダゾール）、およびいくつかのイミノ置換ポリホスファゼンが挙げられる。また、このポリマーのアンモニウム塩または第四級塩も主鎖窒素またはペンダントイミノ基から形成され得る。塩基性側鎖基としては、例えば、アミノ基およびイミノ基が挙げられる。アルギネートは、水中で室温にて２価のカチオンによりイオン的に架橋されてヒドロゲルマトリックスを形成することができる。これらの穏やかな条件により、例えばLimの米国特許第4,352,883号に記載されているように、アルギネートはハイブリドーマ細胞被包に対して最も一般的に使用されるポリマーである。Lim プロセスにおいては、被包される生物材料を含有する水性溶液を水溶性ポリマーの溶液に懸濁し、懸濁液を液滴にして多価カチオンに接触させることによってばらばらのマイクロカプセル状に構成させ、次いでマイクロカプセルの表面をポリアミノ酸で架橋して被包材料のまわりに半透膜を形成させる。ポリホスファゼンは、単結合と二重結合が交互に存在することによって分離された窒素およびリンからなる主鎖を有するポリマーである。各リン原子は、２つの側鎖（「Ｒ」）に共有結合されている。ポリホスファゼンの繰り返し単位は、一般構造（ｌ-）：（式中、ｎは整数である。）を有する。架橋に適したポリホスファゼンは、酸性であり、２価または３価のカチオンによる塩橋形成能のある大多数の側鎖基を有する。好ましい酸性側鎖基としては、例えば、カルボン酸基およびスルホン酸基が挙げられる。加水分解に対して安定なポリホスファゼンは、Ca²⁺またはAl³⁺のような２価または３価カチオンによって架橋されるカルボン酸側鎖基を有するモノマーから形成される。イミダゾール、アミノ酸エステル、またはグリセロール側鎖基を有するモノマーの混合による加水分解によつて分解するポリマーが合成され得る。例えば、ポリアニオン性ポリ［ビス（カルボキシラトフェノキシ）］ホスファゼン（ＰＣＰＰ）が合成され得るものであり、これは、水性媒体中、室温以下にて溶解多価カチオンにより架橋してヒドロゲルマトリックスを形成する。生物侵食性ポリホスファゼンは、少なくとも２つの異なる種類の側鎖、多価カチオンと塩橋を形成する能力のある酸性側鎖基、およびin vivo条件下で加水分解する側鎖基、例えばイミダゾール基、アミノ酸エステル、グリセロールおよびグルコシルを有する。生物侵食性または生物分解性という用語は、本明細書で用いられる場合、所望の用途（通常in vivo治療）において許容できる期間内、約2 5℃〜38℃の温度を有するpH６〜８の生理学的溶液に曝してから約５年未満、最も好ましくは約１年未満の内に溶解または分解するポリマーを意味する。側鎖の加水分解によりポリマーの侵食が生じる。加水分解性側鎖としては、例えば、その基がアミノ架橋によってリン原子に結合されている非置換および置換イミダゾールおよびアミノ酸エステルが挙げられる（両方のＲ基がこの様式で結合しているポリホスファゼンポリマーは、ポリアミノホスファゼンとして公知である）。ポリイミダゾールホスファゼンに関し、ポリホスファゼン主鎖上の「Ｒ」基のいくつかはイミダゾール環であり、環窒素原子によって主鎖のリンに結合している。その他の「Ｒ」基は、Allcockら，Macromolecule 10:824-830(1977)の科学論文に示されたメチルフェノキシ基またはその他の基のような、加水分解に関係しない有機残基であり得る。ヒドロゲル材料の合成方法、ならびにかかるヒドロゲルの調製方法は、当技術分野で公知である。そのような細胞製剤は、さらに、当技術分野で公知の１以上の種類のコラーゲンおよび／または増殖因子および薬物のような選択された細胞外マトリックス成分などの１以上のその他の成分を含み得る。細胞製剤に有効に配合され得る増殖因子としては、限定するものではないが、ＴＧＦ−βファミリーのメンバー、ＩＧＦ−Ｉおよび−II、成長ホルモン、ＢＰＭ−１３のようなＢＰＭなどの当技術分野で公知であるか、将来同定される１以上の組織増殖因子が挙げられる。一方、本発明の細胞は、ＢＰＭ−１３またはＴＧＦ−βのような増殖因子を発現および産生するように遺伝子操作され得る。本発明の細胞の遺伝子操作についての詳細を下記に示す。細胞製剤に有効に配合され得る薬物としては、抗炎症化合物ならびに局所麻酔薬が挙げられる。限定するものではないが、下記：（１）適切な pHおよび等張性を付与するための緩衝液；（２）滑剤；（３）例えば、アルギネート、寒天、植物ゴムなどの投与部位およびその付近に細胞を維持するための粘性材料；ならびに（４）投与部位に、例えば、軟骨組織の形成もしくはその物理化学的特性の増大または修飾、または細胞の生存能力のサポート、または炎症もしくは拒絶の抑制のような所望の効果をもたらし得るその他の細胞型のいずれかのようなその他の成分も製剤に含有せしめることができる。細胞がその部位から離れるのを防ぐために、細胞を適当な創傷被膜によって被覆してもよい。そのような創傷被膜は、当業者には公知である。一方、本発明の細胞を、三次元枠組みまたは足場上に接種し、すぐにin vivo 移植することができ、接種された細胞は枠組みの表面で増殖し、被験者の細胞とともにin vivoで置換軟骨組織を形成する。三次元枠組みの使用についての詳細は下記に示す。そのような枠組みは、軟骨形成を刺激し、さもなければ本発明の実施を増大もしくは向上させる上記の１以上の増殖因子、薬物またはその他の成分とともに移植され得る。５．５．三次元軟骨培養物のin vitro確立本発明の細胞を用いることによって新しい軟骨組織をin vitroで産生させることができ、次いでそれを被験者の軟骨組織の修復、置換または増強が必要な部位に移植し、植え込み、さもなければ挿入することができる。非限定的実施形態においては、本発明の細胞を用いることによって三次元組織構築物をin vitroで産生させ、次いでそれをin vivo移植する。三次元組織構築物の産生の例としては、Naughtonらの1990年10月16日に発行された米国特許第4, 963,489号（これは参照により本明細書に含まれるものである）を参照されたい。例えば、本発明の細胞を三次元枠組みまたは足場上に接種または「種まき」し、in vitroで増殖または成長させることによってin vivo移植できる生存軟骨組織を形成することができる。本発明の細胞は、半集密的または集密的になるまで培養容器内で自由に増殖させ、培養物から持ち上げ、そして三次元枠組み上に接種することができる。Naug htonら，1987，J．Med．18:219-250を参照されたい（これは参照により本明細書に含まれるものである）。三次元枠組みに細胞を高濃度、例えば約10⁶〜５×10⁷ 細胞／mlで接種することにより、三次元支持体が比較的短い時間で確立される三次元枠組みは、（ａ）細胞をそれに接着させ（または細胞をそれに接着させるように修飾することができ）；および（ｂ）細胞を１層以上に増殖させる、任意の材料および／または形状のものであり得る。限定するものではないが、ナイロン（ポリアミド）、ダクロン（ポリエステル）、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリレート、ポリビニル化合物（例えば、ポリ塩化ビニル）、ポリカーボネート（ＰＶＣ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ、テフロン）、サーマノックス（ＴＰＸ）、ニトロセルロース、綿、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、コラーゲン（スポンジ、編組、または織糸などの状態のもの）、ガット縫合糸、セルロース、ゼラチン、または、例えば、種々のポリヒドロキシアルカノエートなどのその他の天然生物分解性材料もしくは合成材料などの、多くの種々の材料をマトリックスの形成に用いることができる。これらの材料のいずれかをメッシュに編むことによって、例えば、三次元枠組みまたは足場を形成することができる。好ましい実施形態によれば、枠組みはフェルトであり、これは生物吸収性材料製、例えば、ＰＧＡ、ＰＬＡ、ポリグルコネート（ＰＬＧＡ）またはヒアルロン酸製のマルチフィラメント糸から作ることができる。糸を、クリンプ加工、切断、カーディングおよびニードリングからなる標準布加工技術を用いてフェルトにする。さらに好ましい実施形態によれば、フェルトは完全培地に予備浸漬され、フェルトの多孔度は80〜98％の範囲であり、フェルトの密度は30〜60mg／ccの範囲であり、フェルトの厚さは１〜７mmの範囲である。さらに、三次元枠組みは、耳の外部の形状のような有用な形状、または修復、置換もしくは増強されるその他の身体の特定の構造に成形され得る。ナイロン、ポリスチレンなどの一定の材料は、細胞付着に対して不十分な基質である。これらの材料が三次元枠組みとして使用される場合、それらのマトリックスへの付着を増大させるために、本発明の細胞の接種前にマトリックスを前処理することが望ましい。例えば、本発明の細胞の接種前に、ナイロンマトリックスを0.1Ｍの酢酸で処理し、ポリリシン、ＰＢＳ、および／またはコラーゲン中でインキュベートすることによってナイロンを被覆することができる。ポリスチレンは硫酸を用いて簡単に処理することができる。培養物を長期間維持したり、低温保存する場合、ナイロン、ダクロン、ポリスチレン、ポリアクリレート、ポリビニル、テフロン、綿などの非分解性材料が好ましくあり得る。本発明にしたがって使用することができる都合のよいナイロンメッシュは、Nitexであり、ナイロン濾過メッシュは210μｍの平均孔径を有し、90μｍの平均ナイロン繊維直径を有する（＃3-210/36 Tetko社、ニューヨーク）。さらに、１以上のタンパク質（例えば、コラーゲン、弾性繊維、細網繊維）、糖タンパク質、グリコサミノグリカン（例えば、ヘパリン硫酸、コンドロイチン -4-硫酸、コンドロイチン-6-硫酸、デルマタン硫酸、ケラチン硫酸など）、細胞マトリックス、および／または、限定するものではないが、特に、ゼラチン、アルギネート、寒天、アガロース、植物ゴムなどのその他の材料で枠組みをコーティングすることなどによって、三次元枠組みの外面を修飾して細胞の付着または増殖および軟骨組織の分化を改良し得る。本発明の細胞は、枠組み上に接種される。軟骨についてin vivoで見られる細胞微小環境を培養物中に再現することは重要であるので、本発明の細胞をin viv o移植またはin vitro使用前に増殖させる程度は変動し得る。さらに、細胞の接種前、接種中、または接種後に培地にＴＧＦ−βなどの増殖因子をアスコルビン酸塩とともに加えて、軟骨細胞分化および軟骨細胞による軟骨形成を誘発することができる。培養物中に維持されるＴＧＦ−βの濃度を監視し、調節することによって増殖を最適化することができる。一方、本発明の細胞は、ＢＰＭ−１３またはＴＧＦ−βのような増殖因子を発現および産生するように遺伝子操作され得る。例えば、ＴＧＦ−βの遺伝子またはコード配列は、培養物中のＴＧＦ−βの濃度を制御することができるように、調節プロモーターと作動可能なように連結して配置される。本発明の細胞は、植え込みに都合のよいその他の遺伝子産物、例えば、抗炎症因子、例えば、抗ＧＭ −ＣＳＦ、抗ＴＮＦ、抗ＩＬ−１、抗ＩＬ−２などを産生するように遺伝子操作され得る。一方、細胞は、炎症を促進する天然遺伝子産物、例えばＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２などの発現を「ノックアウト」するか、拒絶の危険を低下させるためにＭＨＣの発現を「ノックアウト」するように遺伝子操作され得る。さらに、細胞は、遺伝子治療に使用するために、患者の遺伝子活性のレベルを調節して軟骨移植の成果を手助けし、改良するように遺伝子操作され得る。次いで、遺伝子操作された細胞をスクリーニングして、１）リウマチ様疾患またはin vivo炎症反応の症状の改善をもたらし、および／または２）免疫監視および拒絶を免れる細胞系を選択し得る。本発明の細胞に加えて、三次元枠組みに形成された新しい軟骨組織の増殖を向上させ、またはその１以上の特性を変更するように、その他の細胞を三次元枠組みに添加することができる。そのような細胞としては、限定するものではないが、特に、繊維芽細胞、内皮細胞、血管周囲細胞、マクロファージ、単球、血漿細胞、マスト細胞、脂肪細胞などが挙げられ得る。三次元枠組みは、細胞の増殖およびその上での軟骨組織の産生が増大し、または移植の拒絶の危険が低減されるように修飾され得る。したがって、限定するものではないが、抗炎症薬、免疫抑制薬、増殖因子などの１以上の生物学的に活性な化合物を、局所的な徐放性のために枠組みに添加することができる。そのような徐放性製剤としては、例えば、生物学的に活性な化合物および生物適合性のポリマー、例えばポリ（乳酸）、ポリ（乳酸-コ-グリコール酸）、メチルセルロース、ヒアルロン酸、コラーゲンなどを含む複合物が挙げられる。薬剤送達ビヒクルにおける分解性ポリマーの構造、選択および使用は、A．Dombら，1992，Polym ers for Advanced Technologies 3:279-292などのいくつかの刊行物に概説されている。医薬製剤におけるポリマーの選択および使用についてのさらなる手引きは、Drug and the Pharmaceutical Sciences，M．Dekker，ニューヨークのM．Ch asinおよびR．Langer（編），1990，“Biodegradable Polymers as Drug Delive ry Systems，Vol．45によるテキストに見出すことができる。これらの刊行物は参照により本明細書に含まれるものである。さらに別の実施形態においては、本発明の細胞を、「バイオリアクター(biore actor)」において三次元培養系とともに使用して、細胞を培養し、天然軟骨組織が典型的に経験する環境条件下で組織を得ることによって天然ヒト軟骨組織の重要な生化学的特性、物理的特性および構造特性を有する軟骨組織構築物を産生し得るものである。したがって、三次元培養系は間欠的および周期的加圧下に維持され得るものであり、本発明の細胞は対流によって栄養分が十分に供給され得るものである。約２〜５mm厚の置換軟骨組織構築物全体にわたる本発明の細胞への十分な栄養分供給を維持することは、構築物の見掛け密度が増大するのでかなり重要である。圧力は、微孔質三次元軟骨構築物を通過する液体の流れを促進するので、栄養分の供給、および構築物に埋封された細胞からの廃棄物の除去が改善される。バイオリアクターとしては、限定するものではないが、「ピストン方式」硬質プラスチックバイオリアクター；ベローズ；「浮動盤」を有する軟質プラスチックバッグ；および「ロールピン」を有する軟質プラスチックバッグなどいくつかのデザインが挙げられ得る。三次元枠組み上に本発明の細胞を接種した後、枠組み上の細胞を適当な培地中でインキュベートする。ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、Fisher's、Iscove's、Mc Coy'sなどの多くの市販の培地が使用に適するものであり得る。その他の有用な培地は、経験に基づいて処方され得る。そのような培地には、ＦＢＳ、ＥＳ、ＨＳなどの１以上のその他の成分、および特に上記のような抗生物質、抗真菌物質などの１以上の抗菌化合物が補給され得る。三次元枠組みは、インキュベーション中、増殖活性を最大にするために培地中に懸濁されているか、または浮かべられていることが重要である。さらに、使用済み培地を除去し、解離細胞を減らし、新鮮培地を加えるために周期的に培養物に「栄養分供給(fed)」をするべきである。ＴＧＦ−βが存在する場合、その濃度はこれらの工程中に調節され得る。約10ng／mlの濃度のＴＧＦ−βが望ましいことが多い。軟骨細胞培養においては、プロリン、非必須アミノ酸、およびアスコルビン酸塩（約50μｇ/ml）も培養物中に含まれ得る。これらの手順は、バイオリアクターを用いて行う場合に非常に容易になる。このバイオリアクターは、本発明の細胞を接種した三次元枠組みを収容する密閉系である。バイオリアクターは、不純物混入の可能性を低減するものであり、対流によつて三次元構築物全体の細胞への十分な栄養分供給を維持する環境条件を作り出すために間欠的且つ周期的加圧下に培養物を維持するものである。インキュベーション中、本発明の細胞は、一般的に、線状に増殖し、三次元枠組みの開口部または孔の内部および全体に増殖し始める前にその三次元枠組みを包囲してコロニーを形成する。枠組みの孔は、本発明の細胞をそれらの孔全体に広げさせるのに適当な大きさであるべきである。メッシュ型の枠組みを用いる場合、約150μｍ〜約220μｍの範囲の孔が十分に機能するということがわかった。しかしながら、枠組みの三次元構造および複雑さに依存して、その他の孔径が同様に十分に機能し得る。実際、本発明の細胞を拡大させ、長期間複製および増殖を続けさせる任意の形状または構造は、本発明にしたがって機能するであろう。細胞が付着した三次元枠組みのインキュベーション中、増殖細胞がマトリックスから解離され得る。これらの解離細胞は培養容器の壁にこびりつき得るものであり、増殖し続けて集密的単層を形成し得る。このことは、例えば、栄養分供給中に解離細胞を除去したり、または三次元枠組みを新たな培養容器に移したりすることによって防止するか、または最小にするべきである。上記のように、容器内の集密的単層の存在は、三次元枠組みおよび／または培養物中の細胞の増殖を「遮断する」傾向がある。通常、集密的単層を除去したり、または枠組みを新たな容器中の新鮮培地に移すことによって、三次元培養系の増殖活性が回復するであろう。そのような除去または移送は、集密性が25％を超えている細胞単層を有する培養容器においてなされるべきである。一方、培養容器を、例えば、オービタル振盪機(orbital shaker)で攪拌することによって解離細胞がこびりつくのを防ぐことができ、あるいは周期的に培養物に栄養分補給する代わりに、新鮮培地が対流によって培養系全体に連続的に流れるようにその培養系をセットアップすることができる。流量を調節することにより、三次元培養物内の増殖を最大にし、且つ枠組みから解離した細胞を洗い流して除去することができ、その結果、細胞は容器の壁にこびりつかず、集密的に増殖しない。いずれの場合においても、解離細胞は将来使用するために回収され、低温保存され得る。５．６．新しい軟骨組織の使用本発明の細胞および軟骨組織は、種々の用途に用いることができる。これらの用途としては、限定するものではないが、非付着状態の細胞、もしくは例えば上記のような三次元枠組みに付着したような細胞の植え込みもしくは移植；または本発明の細胞によって産生された新しい軟骨組織から調製された細胞外マトリックスの注射が挙げられる。そのような細胞、組織および細胞外マトリックスは、病気または外傷によって損傷した軟骨組織、もしくは正常に発達することができなかった軟骨組織の修復、置換または増強、または美容目的に役立ち得る。さらに、本発明の細胞または軟骨組織は、いくつか挙げるとすると：（１）化合物、アレルゲン、増殖／調節因子、薬学的化合物などの有効性および／または細胞傷害性についてin vitroでスクリーニングするため；（２）一定の病気の機構を解明するため；（３）薬物および／または増殖因子が作動する機構を研究するため；（４）患者の癌を診断および監視するため；（５）遺伝子治療のため；および（６）生物学的に活性な産物を産生させるために用いることができる。５．６．１．in vivo 植え込み本発明にしたがって産生された軟骨組織は、損傷した軟骨組織もしくは破壊された軟骨組織を修復または置換したり、現存する軟骨組織を増強したり、新組織または変更組織を導入したり、人工的補てつ物を改良したり、あるいは生物学的組織または構造をつなぎ合わせるために用いることができる。例えば、限定するものではないが、本発明の特定の実施形態としては、（ｉ）三次元培養物中で増殖した置換軟骨組織構築物で被覆された人工股関節部；（ii）軟骨組織構築物による膝再建；（iii）関節軟骨の再建および／または置換が必要なその他の関節の補てつ物；ならびに（iv）軟骨組織構築物による美容再建が挙げられる。例えば、膝、股関節部、肘、足関節部、上腕関節窩関節などのいくつかの関節における関節軟骨の関節内障の評価は、関節鏡検査技術によって可能になった。関節鏡手術はますます普及し、且つ成功するようになってきており、例えば、直径３〜４mmの非常に小さな切断道具を膝に使用することができる。関節鏡によって得られた視野に手術器具を入れる三角測量(triangulation)は多数の入口(port als of entry)を要し；一方、切断道具は関節鏡内の溝に通すことができ、この場合関節内にただ一つの開口部が必要である（Jackson，R.W.，1983，J．Bone J oint Surg.［AM］65:416）。関節鏡手術によって傷ついた部分または変質した部分の選択的除去後の軟骨移植は高い成功率で用いられ得る。軟骨組織構築物は、種々の型の関節のための主な再建手術に用いることもできる。詳細手順は、Resn ick，D.,およびNiwayama，G.,(編)，1988，Diagnosis of Bone and Joint Disor ders ，第２版，W.B.Sanders社に記載されている。これは参照により本明細書に含まれるものである。移植細胞および／または軟骨組織を修復部位に固定することができる場合、損傷した軟骨の修復または置換の成功率を高めることができる。移植後の関節の運動によって新しい細胞および軟骨組織が生じ、順行固定化技術が用いられない場合、その部位から追い出されるようになる。生物適合性組織由来のパッチ（部位の上に置くことができる）；生物吸収性縫合糸またはその他の留め具、例えばピン、ステープル、タックス、ねじおよび固定具(anchor)；非吸収性固定装置、例えば縫合糸、ピン、ねじおよび固定具；接着材；ならびに締り嵌め幾何学の使用などの種々の方法を用いることにより、新たな細胞および／または軟骨組織を一定の場所に固定することができる。５．６．２．細胞外マトリックスの治療上の使用本発明の細胞または該細胞から産生された生存軟骨組織を移植する代わりとして、軟骨修復、置換または増強が必要な被験者は、それらの細胞または組織によって産生された細胞外マトリックス（「ＥＣＭ」）の投与から利益を得ることができる。したがって、例えば、上記のような三次元培養系を用いることなどによって所望の量のＥＣＭが枠組み上に分泌されるように本発明の細胞を用いてin v itroで新たな軟骨組織を産生させた後、新組識を含む細胞が除去され、ＥＣＭがさらなる使用、例えば注射可能な調製物としての使用のために加工される。したがって、新軟骨組織を含む細胞は殺され、任意の細胞崩壊物は枠組みから除去され得る。このプロセスはいくつかの異なる方法で行われ得る。例えば、生存軟骨組織を低温保存することなく液体窒素中でフラッシュ凍結することができ、あるいは軟骨組織を、細胞が浸透圧に応答して破裂するように無菌蒸留水中に浸漬することができる。細胞が殺されたら、細胞膜を破壊し、細胞崩壊物をＥＤＴＡ、ＣＨＡＰＳまたは両性イオン性界面活性剤のような穏やかな界面活性剤を用いたすすぎによる処理によって除去することができる。穏やかな界面活性剤によるすすぎを用いることの利点は、それが膜結合タンパク質（これはしばしば高度に抗原性である）を可溶化することである。一方、軟骨組織を、細胞膜を破壊し、細胞内容物を除去する試薬を用いて酵素的に消化し、および／または抽出することができる。かかる酵素としては、例えば、限定するものではないが、ヌクレアーゼ（例えば、デオキシリボヌクレアーゼおよびリボヌクレアーゼ）、ホスホリパーゼおよびリパーゼが挙げられる。界面活性剤としては、例えば、TRITON X-100、オクチルフェノキシポリエトキシ− エタノール（RohmおよびHaas）、BRIJ-35、ポリエトキシエタノールラウリルエーテル（Atlas Chemical社）、TWEEN 20、ポリエトキシエタノールソルビタンモノラウレート（RohmおよびHaas）、LUBROL-PX、またはポリエチレンラウリルエーテル（RohmおよびHaas）などの非イオン性界面活性剤；ならびに、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、硫酸化高級脂肪族アルコール、スルホン化アルカンおよび分枝鎖または非分枝鎖の７〜22炭素原子を含むスルホン化アルキルアレンなどのイオン性界面活性剤が挙げられる。ＥＣＭの回収は、新しい軟骨組織が生分解性または非生分解性の三次元枠組み上に形成されたか否かに依存して、種々の方法で行うことができる。例えば、枠組みが非生分解性である場合、枠組みを音波処理、高圧水噴射、機械的スクラッピング、または界面活性剤もしくは酵素による穏やかな処理、または上記のいずれかの組み合わせにかけることによってＥＣＭを除去することができる。枠組みが生分解性である場合、例えば、枠組みを溶液中で分解させるか、溶解することによってＥＣＭを回収することができる。一方、生分解性枠組みがＥＣＭとともに注射され得る材料から構成される場合、枠組みとＥＣＭは、その後の注射のためにまとめて加工処理することができる。あるいはまた、ＥＣＭは、非生分解性枠組みからのＥＣＭの回収についての上記した方法のいずれかによって生分解性枠組みから除去することができる。回収プロセスは全て、本発明の軟骨細胞によって産生されたＥＣＭを変性しないように設計されるのが好ましい。ＥＣＭを回収したら、さらにそれは加工処理され得る。したがって、ＥＣＭは、当技術分野で周知の技術を用いて、例えば音波処理によって、手術針を通過することができるような微粒子にホモジナイズされ得る。ＥＣＭの成分は所望によりガンマ線照射によって架橋することができる。好ましくは、ＥＣＭを0.25〜２ M radで照射することによって、ＥＣＭを滅菌および架橋することができる。グルタルアルデヒドのような毒性の作用物質を用いる化学架橋が可能であるが、一般的には好ましくない。ＥＣＭ中に存在する種々の型のコラーゲンのようなタンパク質の量および／または割合は、本発明の細胞によって産生されたＥＣＭを１以上のその他の細胞型によって分泌されたＥＣＭと混合することによって調節され得る。さらに、タンパク質、増殖因子および／または薬物のような生物学的活性物質をＥＣＭ調製物に含有せしめることができる。具体的な生物学的活性物質としては、ＴＧＦ−β などのような、注射部位の治癒および組織修復を促進する組織増殖因子が挙げられる。被験者に投与するためのＥＣＭの処方は、典型的には、調製物のイオン強度を等張（すなわち、約0.1〜0.2）および生理学的pH（すなわち、約pH6.8〜7.5）に調節することを含む。さらに、リドカイン（通常、約0.3重量％の濃度）などの局所麻酔薬を加えて注射の際の局所的な痛みを低減することができる。さらに、ＥＣＭ製剤は、薬学的に許容できる担体を含み得る。水、緩衝水、0.4％食塩水、0.3％グリシンなどの種々の水性担体が用いられ得る。また、ＥＣＭ製剤は、保存剤、タンパク質安定剤などの、医薬製剤の保存寿命を延ばすのに役立つ追加の成分を含み得る。ＥＣＭ製剤は、無菌であり、粒子物を含まないのが好ましい（注射可能な状態であるためである）。ＥＣＭ製剤は、通常の周知の滅菌技術によって滅菌され得る。ＥＣＭ製剤は、おおよその生理学的条件が必要な場合には、pH調節剤、緩衝剤、毒性調節剤など(例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなど)の薬学的に許容できる補助物質を含み得る。ＥＣＭ製剤は、皮下投与などの種々の形式の投与に適合し得る。被験者に投与可能な組成物および被験者への投与に必要な調節剤を調製するための実際の方法は、当業者には公知であるか明白であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Science ，第17版，Mack Publishing Company，Easton，Pa(1985)により詳細に記載されている。これは参照により本明細書に援用する。また、ＥＣＭ製剤は、身体が許容できる液体滑剤も含み得る。そのような滑剤は、一般的に、注射部位におけるＥＣＭの注射可能性、貫入可能性(intrudabili ty)および分散性を向上させ、組成物の粘性を変更することによってスパイキング(spiking)の量を減少させるために用いられる。スパイキングは、組成物が組織へ注入されず、注射器から滲み出してしまう原因となり得るものである。滑剤の例としては、グリセロール、グリコーゲン、マルトースなどが挙げられる。また、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、およびスクシニル化コラーゲンなどの非繊維性コラーゲンのような有機ポリマーを基材とする材料も滑剤として作用し得る。次いで、最終的なＥＣＭ製剤は、組織欠損部位または増強が望まれている部位にマトリックスを正確に配置するために、注射器またはその他の注射器具内に入れられ得る。皮膚増強用の製剤の場合、「注射可能な」という用語は、製剤が、正常な条件下、正常な圧力下で実質的なスパイキングなしに25という低ゲージの注射器から投与され得ることを意味するものである。この正確な配置のためには、27ゲージ（200μ I.D.）くらい細いか、30ゲージ（150μ I.D.）くらい細い針が望ましい。そのような針を通って押し出され得る最大粒径は、少なくとも下記：粒子最大径、粒子アスペクト比（長さ：幅）、粒子剛性、粒子の表面荒さ、および粒子：粒子接着に影響を及ぼす関連因子、懸濁液の粘弾性特性、ならびに針を通過する流量の複合的な関数である。上記の注射可能なＥＣＭの調製方法は、好ましくは、滅菌材料を用いる滅菌条件下で行われる。薬学的に許容できる担体中の加工処理されたＥＣＭは、軟組織を増強し、または先天的異常、後天的欠損または美容欠損を修復もしくは矯正するために皮内または皮下注射することができる。そのような症状の例としては、片側顔面小体症、頬部および頬骨形成不全、片側乳房形成不全、漏斗胸、胸筋無発育（Poland's異常）および口蓋裂修復または粘膜下口蓋裂（咽頭後方移植のようなもの）に従属的な口蓋帆咽頭機能不全のような先天的異常；陥没瘢痕、皮下萎縮（例えば、円板状エリトマトーデスに従属的なもの）、角化症病変(keratot ic lesions)、非凝集眼(unucleated eye)における眼球陥没（上溝症候群）、顔のアクネくぼみ、皮下萎縮による線状硬皮症、鞍鼻奇形、ロンベルグ病および片側声帯麻痺のような後天的欠損（外傷後、手術後、感染後）；ならびに眉間のしわ線、深い鼻唇しわ、周口地図状ひだ、くぼんだ頬および乳房発育不全のような美容欠損が挙げられる。また、薬学的に許容できる担体中の加工処理されたECＭを、身体括約筋を画定する組織などの内部組織に注入することによってかかる組織を増強することもできる。５．６．３．in vitro での化合物の有効性および細胞毒性のスクリーニング本発明の細胞および軟骨組織は、薬剤、増殖／調節因子、抗炎症剤などの有効性および細胞毒性について広範な種類の化合物をスクリーニングするためにin v itroで使用され得る。この目的のために、本発明の細胞、または上記の組織培養物をin vitroで維持し、試験される化合物に曝す。細胞毒性化合物の活性は、培養物中の細胞を傷つける、または殺すというその能力によって測定することができる。これは、生体染色技術によって容易に評価され得る。増殖／調節因子の効果は、in vitroで生細胞の数を分析することによって、例えば、全細胞数および分化細胞数によって評価され得る。これは、型特異的細胞抗原を規定する抗体を用いる免疫細胞化学的技術の使用などの、標準細胞学的および／または組織学的技術を用いて行われ得る。懸濁培養物中または上記のような三次元系での本発明の細胞における種々の薬物の効果が評価され得る。本発明の細胞および軟骨組織は、生理学的または病理学的症状の研究用のモデル系として使用され得る。例えば、固定された関節は、いくつかの点で比較的早期に傷つく。軟骨細胞の代謝活性は、プロテオグリカンの損失として影響されるように見え、水含量の増大がすぐに観察される。軟骨の正常な白色のきらきら光る外観は、曇った青みをおびた色に変化し、軟骨の太さは低減する。しかしながら、栄養分欠乏によるこの変化の量対ストレス依存性代謝ホメオスタシスの混乱による量はまだ明確ではない。本発明の細胞および軟骨組織は、例えば、間欠的加圧などの異なる身体的条件下での、軟骨構築物内外への栄養媒体のポンプ作用によって、軟骨の栄養要求量を測定するために用いられ得る。これは、特に、弱体化軟骨を外傷損傷しやすくする、例えば膝の関節軟骨の引張力の年齢または損傷に関連した減少についての根源的な原因を研究することにおいて有用であり得る。また、本発明の細胞および軟骨組織は、サイトカインおよびその他の前炎症媒介物、例えばＩＬ−１、ＴＮＦおよびプロスタグラジン（これらはリウマチ疾患の結果として滑液に放出される）の作用の機構を研究することにも用いられ得る。したがって、患者自身の関節液をin vitroで試験することによって、本発明の細胞の増殖におけるこれらの化合物の作用を研究することができるであろう。さらに、細胞毒性剤および／または薬剤を、特定の患者に対して最も効き目のあるもの、例えば軟骨の吸収を低減しまたは妨げるものや、関節軟骨のバランスのとれた増殖を増大させるものなどのについてスクリーニングすることができる。次いでin vitroで効き目があることが判明した作用物質を用いることによって、患者を治療学的に処置することができるであろう。５．７．遺伝子操作された軟骨細胞および軟骨本発明の細胞および軟骨組織は、移植の成果を補助または改良するため、および／または遺伝子治療に使用するための遺伝子および遺伝子産物in vivo導入用のビヒクルを提供し得る。下記の記載は、本発明の細胞またはその細胞から産生された組織のいずれかの遺伝子操作に関するものである。目的の遺伝子産物を発現する細胞、またはその細胞からin vitroで産生された軟骨組織は、その遺伝子産物が欠乏している被験者に移植することができる。例えば、種々の型のリウマチ様疾患または関節疾患の症状を予防または改善することが可能な産物、例えば炎症反応の予防に関係するものなどを発現する遺伝子は、病気状態下で過小発現するか(under-expressed)、またはダウンレギュレートされ得る。あるいはまた、遺伝子産物の活性が減少することによって、リウマチ様疾患または関節疾患に関連した病理学的症状のいくつかまたは全てが現われ得る。いずれにしても、活性遺伝子産物のレベルは遺伝子治療によって(すなわち、本発明の細胞を活性遺伝子産物を産生するように遺伝子操作し、遺伝子操作された細胞またはその細胞から作られた組織を移植が必要な被験者に移植することによって)増大され得る。一つの実施形態においては、本発明の細胞は、移植の失敗の危険またはリウマチ様疾患もしくは炎症反応による軟骨組織のさらなる変性を低減するのに役立つ抗炎症遺伝子産物を発現するように遺伝子操作される。例えば、本発明の細胞は、１以上の抗炎症遺伝子産物、例えば、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、またはその他の炎症サイトカインを中和する抗体のイディオタイプに対応するペプチドまたはポリペプチドなどを発現するように遺伝子操作され得る。ＩＬ−１は、プロテオグリカンならびにII型、IX型およびXI型コラーゲンの合成を減少させることが示されている（ Tylerら，1985，Biochem．J．227:869-878；Tylerら，1988，Coll．Relat．Res ．82:393-405;Goldringら，1988，J．Clin．Invest．82:2026-2037;およびLefeb vreら，1990，Biophys．Acta．1052:366-372）。また、ＴＮＦも、プロテオグリカンおよびII型コラーゲンの合成を阻害するが、ＩＬ−１よりもかなりその能力が小さい（Yaron，I.ら，1989，Arthritis Rheum．32:173-180;Ikebe，T.ら1988 ，J．Immunol．140:827-831;およびSaklatvala，J.，1986，Nature 322:547-5 49）。あるいはまた、本発明の細胞は、軟骨産生を刺激するのに役立つ遺伝子産物、例えばＢＭＰ−１３またはＴＧＦ−βなどを産生するように遺伝子操作され得る。また、例えば、本発明の細胞は、宿主による移植片の拒絶を予防するヒト補体調節タンパク質をコードする遺伝子を発現するように操作され得る。例えば、McCurryら，1995，Nature Medicine 1:423-427を参照されたい。本発明の細胞を遺伝子操作するのに有用であり得る方法は、当技術分野では周知である。例えば、目的の遺伝子を含む組換えＤＮＡ構築物またはベクターを構築し、それを用いて本発明の１以上の細胞を形質転換またはトランスフェクトし得る。目的の遺伝子を有しており、該遺伝子を発現する能力のあるそのような形質転換またはトランスフェクトされた細胞が選択され、培養されてコロニー的に増大する。目的の遺伝子を含むＤＮＡ構築物を調製する方法、細胞を形質転換またはトランスフェクトする方法、および目的の遺伝子を有する細胞を選択し、該遺伝子を発現させる方法は、当技術分野では周知である。例えば、Maniatisら， 1989，Molecular Cloning ，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laborat ory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.；Ausubelら，1989，Current Protocols in Molecular Biology ，Greene Publishing Associates & Wiley Interscience ，N.Y.；およびSambrookら，1989，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第２版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.に記載された技術を参照されたい。さらに、Seldonら，1987，Science 236:714-71 8によって記載されたトランス核(transkaryotic)移植技術が有用であり得る。これらの刊行物は全て参照により本明細書に援用する。本発明の細胞は、限定するものではないが、組込みウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクターもしくはアデノ関連ウイルスベクター、または非組込み複製ベクター、例えば、パピローマウイルスベクター、ＳＶ４０ベクター、アデノウイルスベクター；または複製−欠損ウイルスベクターなどの種々のベクターのいずれかを用いて操作され得る。ＤＮＡを細胞に導入するその他の方法としては、リポソームの使用、エレクトロポレーション、パーティクルガン、または直接ＤＮＡ注入が挙げられる。宿主細胞は、好ましくは、特に、プロモーターまたはエンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、および選択可能なマーカーのような１以上の適切な発現調節エレメントによって調節された、すなわちそれらと作動可能なように連結されたＤＮＡで形質転換またはトランスフェクトされる。外来ＤＮＡの導入後、操作された細胞は富化培地中で増殖させることができ、次いで選択培地に切り換えることができる。外来ＤＮＡにおける選択可能なマーカーは選択に対する耐性を付与し、細胞に、例えば、プラスミド上の外来ＤＮＡを、その染色体内に安定に組み込ませ、増殖させてフォーカスを形成させ、次いでクローニングされて細胞系に拡大させ得るものである。この方法は、遺伝子産物を発現する細胞系を操作するのに都合よく用いられ得る。任意のプロモーターを用いることにより挿入遺伝子の発現を誘導し得る。例えば、ウイルスプロモーターとしては、限定するものではないが、ＣＭＶプロモーター／エンハンサー、ＳＶ４０、パピローマウイルス、エプスタイン・バーウイルス、エラスチン遺伝子プロモータおよびβ−グロビンが挙げられる。好ましくは、対象である遺伝子の発現を調節するのに用いられる調節エレメントは、産物がin vivoで必要な場合にのみ合成されるように、遺伝子の発現を調節することが可能であるべきである。一過性発現が望ましい場合、好ましくは、構成的プロモーターが非組込みおよび／または複製−欠損ベクターに用いられる。一方、誘導プロモーターを用いることによって必要に応じて挿入遺伝子の発現を誘導することができる。誘導プロモーターとしては、限定するものではないが、メタロチオネインおよび熱ショックタンパク質と関連したものが挙げられる。これまでに記載され、使用され得る組織特異性を示す転写調節領域としては、例えば、限定するものではないが、エラスターゼＩ遺伝子調節領域（これは膵小胞体細胞において活性である）（Switら，1984，Cell 38:639-646;Ornitzら，19 86，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50:399-409;MacDonald,1987,Hepatol ogy 7:425-515）；インスリン遺伝子調節領域（これは膵β細胞において活性である）（Hanahan,1985,Nature 315:115-122）；免疫グロブリン遺伝子調節領域（これはリンパ系細胞において活性である）（Grosschedlら，1984，Cell 3S:64 7-658;Adamsら，1985，Nature 318:533-538;Alexanderら，1987，Mol.Cell.Biol .7:1436-1444）；ミエリン塩基性タンパク質遺伝子調節領域（これは脳の寡突起神経膠細胞において活性である）（Readheadら，1987，Cell 48: 703-712）；ミオシンＬ鎖-2遺伝子調節領域（これは骨格筋において活性である）（Shani，1985，Nature 314:283-286）；および性腺刺激放出ホルモン遺伝子調節領域（これは視床下部において活性である）（Masonら，1986，Science234: 1372-1378）が挙げられる。本発明の細胞は、移植部位における炎症または拒絶を促進する因子の発現を「ノックアウト」するように遺伝子操作され得る。標的遺伝子の発現レベルまたは標的遺伝子産物の活性レベルを低下させるための負のモジュレーション技術を下記に示す。「負のモジュレーション」は、本明細書で用いられる場合、モジュレーション処理が無い場合の標的遺伝子産物のレベルおよび／または活性に対して標的遺伝子産物のレベルおよび／または活性を低下させることを意味するものである。軟骨細胞に天然の遺伝子の発現は、例えば、相同的組換え技術を用いて遺伝子を完全に不活性化することによって発現を阻害すること（通常、「ノックアウト」という）などを含むいくつかの技術を用いて低減またはノックアウトすることができる。通常、タンパク質の重要な領域をコードするエキソン（またはその領域に対するエキソン5'）は、陽性の選択可能なマーカー、例えばneoによって分断されており、標的遺伝子からの正常なＭＲＮＡの産生を妨げることによって遺伝子を不活性化させる。また、遺伝子は、遺伝子の一部に欠失を作ったり、遺伝子全体を欠失させることによっても不活性化され得る。ゲノム内に遠く離れて存在し、標的遺伝子に対して相同性のある二つの領域を有する構築物を用いることによって、これら２つの領域の間に介在する配列を欠失させることができる（Mombaertsら，1991，Proc．Nat．Acad．Sci．U.S.A．88:3084-3087）。また、標的遺伝子の発現を阻害するアンチセンスおよびリボザイム分子も、標的遺伝子の活性レベルを低下させるために本発明にしたがって用いることができる。例えば、主要組織適合遺伝子複合体（ＨＬＡ）の発現を阻害するアンチセンスＲＮＡ分子は、免疫応答に関して最も多用途であることが示されている。さらに、三重らせん分子を標的遺伝子活性のレベルの低減に利用することができる。これらの技術は、L.G．Davisら（編），1994，Basic Methods in Molecular Bio logy ，第２版，Appleton & Lange，Norwalk，Conn.に詳細に記載されている。これは参照により本明細書に含まれる。前述の技術のいずれかを用いることにより、本発明の細胞においてＩＬ−１の発現をノックアウトして、移植された軟骨の吸収の危険または本発明の細胞による炎症媒介物の産生を低下させることができる。同様に、ＭＨＣクラスII分子の発現を、移植された組織の拒絶の危険を低減するためにノックアウトすることができる。本発明の細胞を遺伝子操作したら、それらを患者に直接移植して、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、またはその他の炎症サイトカインについての中和抗体のイディオタイプに対応するペプチドまたはポリペプチドなどの抗炎症遺伝子産物を産生させることによってリウマチ様疾患または関節疾患の症状を改善させることができる。ＩＬ−１は、軟骨吸収および軟骨細胞による炎症伝達物質の産生の潜在的な刺激物質である（Campbellら，1991，J．Immun．14 7:1238-1246）。一方、遺伝子操作された細胞を用いて新しい軟骨組織をin vitr oで産生することもでき、次いでその組織は上記のように被験者に移植される。遺伝子治療における本発明の組成物および方法の使用はいくつかの利点を有する。第一に、培養物は真核細胞を含むので、遺伝子産物は、恐らく、適正に発現され、プロセシングされて活性産物を形成するであろう。第二に、遺伝子治療技術は、一般的に、トランスフェクト細胞の数が実質的に増大して臨床的に重要になり、適切になり、有用になる場合、有用である。したがって、例えば、上記の三次元培養物は、関節疾患の治療に効き目があり得るレベルまでトランスフェクト細胞の数を有糸分裂的に増大させ、遺伝子産物を増幅させる。５．８．生物学的分子の産生さらなる実施形態においては、本発明の細胞をin vitroで培養することにより高収量で生物学的産物を産生させることができる。例えば、そのような細胞は、対象となる特定の生物学的産物（例えば、増殖因子、調節因子、ペプチドホルモンなど）を天然で産生するか、または生物学的産物を産生するように遺伝子操作されており、例えば、上記の三次元培養系を用いてコロニー的に増やすことができる。細胞が生物学的産物を栄養培地に放出する場合、その産物は、標準的な分離技術、例えば、いくつか挙げるとすると、示差(differential)タンパク質沈殿反応、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、電気泳動、ＨＰＬＣなどを用いて使用済み培地またはならし培地から容易に単離することができる。例えば、in vitroで三次元培養物に栄養分供給するための流動法(flo wmethod)を利用するために、「バイオリアクター」が用いられ得る。本質的に、新鮮培地が三次元培養物を通過するとき、生物学的産物は培養物から洗い出され、次いで上記のように流出物から単離され得る。一方、対象となる生物学的産物は細胞内に維持され得るので、その回収には細胞を溶解することが必要であり得る。次いで、生物学的産物を上記の技術の１以上を用いて精製することができる。６．実施例：ホウォートンゼリーからの前軟骨細胞の単離および軟骨組織の誘導６．１．材料および方法臨月で出産した直後に、ヒト臍帯を取得した。ホウォートンゼリーを無菌条件下で臍帯から切り出し、約２〜３ｍｍ³の組織切片に切断し、約50〜100の組織切片を、底部上に無菌ガラススライドを含む100ｍｍのＴＣ−処理ペトリ皿に入れた。ガラススライドを各組識切片の上に置いて、事実上細胞をスライドの間にサンドイッチ状にはさんで、軽くたたいて組織切片とペトリ皿とを十分に接触させた。スライドをどかさずに、組織切片を、20mlの完全培地（すなわち、ＲＰＭＩ１６４０、10％ＦＢＳ、５％ＥＳ、ペニシリンＧ（100μｇ/ml）、ステレプトマイシン硫酸（100μｇ/ml）、アンホテリシンＢ（250μｇ/ml）、ゲンタマイシン（10μｇ/ml））、pH7.4〜7.6で浸した。組織切片を37℃および５％ＣＯ₂でインキュベートし、培地を週２回交換した。 10〜12日後、元の組織切片を除去し、スライドおよびペトリ皿に付着した細胞を標準技術を用いてトリプシン処理した。トリプシン処理後、細胞を回収して、ＴＩ７５フラスコ内の新鮮培地に約0.75〜1.0×10⁶細胞の初期細胞密度で移し、上記のようにしてインキュベートした。トリプシン処理の24時間後に培地を交換して浮遊細胞を除去した。次いで、それぞれ最終細胞密度が３〜6.5×10⁴ 細胞／cm²になるまで、前軟骨細胞に完全培地上を３回通過させた。３回目の通過の終了後、前軟骨細胞を、完全培地および10％ＤＭＳＯを含む「凍結培地」に約４〜10×10⁶細胞／mlの密度で移した。凍結培地を４℃にて細胞を添加する前に入れて、その後、細胞を培地中で数分間４℃に維持して凍結前に平衡化させた。細胞をプラスチックアンプル（Nunc、Naperbille、ＭＤ）に分配して密封し、プログラマブルフリーザー(770 Cryomed)の冷凍庫に移した。凍結プログラムによって、融解熱を通じて−１℃／分の速度で温度を低下させた。次いで、アンプルを液体窒素貯蔵区域に移した。アンプルを液体窒素から37℃の水浴に移すことによって細胞を急速に解凍させた。解凍されたアンプルの中身を、無菌条件下で、ただちに完全培地を含む培養容器に移した。培地中の初期細胞密度は、約３〜６×10⁵細胞／mlに調節した。培養中に入れた後、細胞を倒立顕微鏡を用いて検査して細胞増殖を検出し、細胞が約３〜6.5×10⁴細胞／cm²の密度に到達したら新鮮培地を通過させた。一次培養の開始後、約４回以下の回数通過させて有糸分裂的に増やした後、約４×10⁶細胞を下記のような三次元枠組みに接種した。ＰＧＡ−フェルトを含む三次元枠組みを約13±１μｍの太さのＰＧＡ繊維（Al bany International、Mansfield、ＭＡ）を用いて作製した。ＰＧＡ繊維をアセンブルして直径１cm、厚さ２ｍｍ、密度1.50〜1.64gm／cm³、重さ5.5〜6.5mg（多孔度≒97％）の構築物にした。ＰＧＡフェルト構築物は電子ビームを用いて滅菌した。ＰＧＡフェルト構築物を、10％ＦＢＳおよび５％ＥＳを含むＲＰＭＩ１６４０を含有する完全培地に、そのＰＧＡフェルト構築物をカバーするのに十分な培地を含む滅菌容器に入れて、ＰＧＡフェルト構築物の全切片をピペットを用いて培地で浸すことによって予備浸漬した。ＰＧＡフェルト構築物を培地中で37℃にて２時間インキュベートした。 12ウエル滅菌培養プレート（Corning Glassworks、ニューヨーク）の各ウエルを、ゲル化を生じさせる1.5mlの１％アガロース（FMC Bioproducts、Rockville 、ＭＤ）で被覆し、１ｍｌの完全培地＋アスコルビン酸塩（50μｇ/ml）を各ウエルに加えた。アガロースを用いてフェルトから剥離した細胞を捕獲することによってフェルト上の細胞増殖を阻害する単層の形成を防ぐ。本発明の細胞をアスコルビン酸塩を含む完全培地に約４×10⁷細胞／mlの密度で懸濁した。ＰＧＡフェルト構築物を培地から取り出して、乾燥し、100μｌの細胞懸濁液（４×10⁶細胞／ml）を乾燥ＰＧＡフェルト構築物にピペットで塗布することによって本発明の細胞を接種した。次いで、細胞接種ＰＧＡフェルト構築物を各ウェル内の培地に入れた。細胞接種ＰＧＡフェルト構築物を含む培養プレートをオービタル振盪機（100/rpm）にて37℃で２時間インキュベートし、４mlのアスコルビン酸塩を含む完全培地を加えて、培養プレートを上記のようにして３日間インキュベートした。次いで、細胞接種ＰＧＡ−フェルト構築物を、アガロースを含まないが、アスコルビン酸塩およびＴＧＦ−β１（10ng／ml）含有完全培地を含む６−ウェル培養皿の新ウェルに移し、72時間培養した。次に、細胞接種ＰＧＡフェルト構築物をＴＧＦ−β１非含有完全培地を含むウェルに移し、３日毎に培地を交換しながら３週間培養した。培養期間の終わりに、細胞接種ＰＧＡフェルト構築物を10％中性緩衝化ホルマリンに固定し、パラフィンに埋封し、切断した（４〜６μｍ）。切片を、ヘマトキシリン／エオシン（図２Ａ〜Ｂ）、アルシアンブルー、ルテニウムレッド、サフラニンＯ（図３Ａ）、もしくはトリクローム（図３Ｂ）で染色し、または抗コラーゲンＩもしくはII抗体で標識した後に免疫ペルオキシダーゼで染色した（図４Ａ〜４Ｅ）。６．２．結果３週間のインキュベーション期間の終わりに、ＴＧＦ−β１パルスに曝した細胞接種ＰＧＡフェルト構築物は、硬い、きらきら光る、軟骨組織のコンシステンシーを有する「組織」を産生した（図１Ａおよび１Ｂ）。一方、ＴＧＦ−β１に曝さなかった細胞接種ＰＧＡフェルト構築物も軟骨に特異的な特性を有する「組織」を産生したが、ＴＧＦ−β１処理細胞よりも小さく、密度が低かった（図１Ｃ）。免疫染色により、コラーゲンＩ、コラーゲンII両方の沈着が示された（図４Ａ〜４Ｅ）。上記で引用した全ての特許、特許出願および刊行物は参照により本明細書に含まれるものである。本発明は、本発明の個々の態様の単なる例示として記載された特定の実施形態によって範囲を限定されるものではない。当業者には、本明細書に示され、記載されたもの以外にも、機能的に同等である方法および組成物が前述の記載および添付の図面から自明であろう。そのような変更修正は添付の特許請求の範囲に含まれるものとする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｑ 1/00 Ａ６１Ｐ 17/00 // Ａ６１Ｋ 35/32 19/00 Ａ６１Ｐ 17/00 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ 19/00 Ｃ (72)発明者ノートン，ブライアン，エイ. アメリカ合衆国 92021 カリフォルニア州，エルカヨン，クアイルカンヨンロード 10461 (72)発明者サンローマン，ジュリアアメリカ合衆国 92122 カリフォルニア州，サンディエゴ，アジーストリートナンバー42 6214

Claims

【特許請求の範囲】 1．軟骨組織を作る能力がある細胞へと分化できる、臍帯のホウォートンゼリー由来の前軟骨細胞を含んでなる、単離された前軟骨細胞集団。 2．軟骨組織を作る能力がある、臍帯のホウォートンゼリー由来の前軟骨細胞と軟骨細胞の組合せを含んでなる、単離された細胞集団。 3．前軟骨細胞が系列に拘束されていない前駆細胞である、請求項１または２に記載の前軟骨細胞。 4．前軟骨細胞が系列に拘束されている細胞である、請求項１または２に記載の前軟骨細胞。 5．軟骨組織を作る能力がある、臍帯のホウォートンゼリー由来の軟骨細胞を含んでなる、単離された軟骨細胞集団。 6．軟骨細胞が細胞外マトリックスを分泌することができる、請求項５に記載の軟骨細胞。 7．前記細胞が生物分解性、生物適合性のヒドロゲル溶液中に存在する、請求項１または２に記載の細胞。 8．ヒドロゲルがアルギネートまたはその塩を含む、請求項７に記載の細胞。 9．臍帯のホウォートンゼリーから前軟骨細胞を単離する方法であって、臍帯からホウォートンゼリーを集め、前軟骨細胞増殖用の培地中でホウォートンゼリーをin vitro培養し、そこから増殖性の前軟骨細胞を単離する、ことを含んでなる方法。 10．臍帯のホウォートンゼリーから軟骨細胞を単離する方法であって、臍帯からホウォートンゼリーを集め、前軟骨細胞の増殖用の培地中でホウォートンゼリーをin vitro培養し、そこから増殖性の前軟骨細胞を単離し、前軟骨細胞を培養して、それらが軟骨組織を作る能力がある軟骨細胞を生じるように誘導し、軟骨細胞を単離する、ことを含んでなる方法。 11．組織同等物が形成されるように請求項１または２に記載の細胞を体内に移植することを含んでなる、請求項１または２に記載の細胞のin vivo移植または植込み方法。 12．請求項１に記載の前軟骨細胞、および有効量の増殖因子を含有して前軟骨細胞を有糸分裂により増殖させる培地、を含んでなる前軟骨細胞培養物。 13．請求項２に記載の前軟骨細胞と軟骨細胞の組合せ、および有効量の増殖因子を含有して前記細胞を有糸分裂により増殖させる培地、を含んでなる細胞培養物。 14．前軟骨細胞が系列に拘束されていない前駆細胞である、請求項12または13に記載の前軟骨細胞培養物。 15．前軟骨細胞が系列に拘束された細胞である、請求項12または13に記載の前軟骨細胞培養物。 16．請求項５に記載の軟骨細胞、および有効量の増殖因子を含有して前記軟骨細胞を有糸分裂により増殖させる培地、を含んでなる軟骨細胞培養物。 17．軟骨細胞が細胞外マトリックスを分泌することができる、請求項16に記載の軟骨細胞培養物。 18．前軟骨細胞が有糸分裂で増殖するように臍帯のホウォートンゼリー由来の前軟骨細胞を培養することを含んでなる、前軟骨細胞培養物の培養方法。 19．軟骨組織を作る能力がある軟骨細胞を生じるように前軟骨細胞をさらに誘導する、請求項18に記載の方法。 20．軟骨細胞が細胞外マトリックスを分泌する、請求項19に記載の方法。 21．軟骨細胞が有糸分裂で増殖するように臍帯のホウォートンゼリー由来の軟骨細胞を培養することを含んでなる、軟骨細胞培養物の培養方法。 22．軟骨組織を作るように軟骨細胞をさらに誘導する、請求項21に記載の方法。 23．軟骨細胞が細胞外マトリックスを分泌する、請求項21に記載の方法。 24．前軟骨細胞と軟骨細胞が有糸分裂で増殖するように臍帯のホウォートンゼリー由来の前軟骨細胞と軟骨細胞の組合せを培養することを含んでなる、細胞培養物の培養方法。 25．軟骨組織を作る能力がある軟骨細胞へと分化するように前軟骨細胞をさらに誘導する、請求項24に記載の方法。 26．軟骨細胞が細胞外マトリックスを分泌する、請求項24に記載の方法。 27．組織同等物が形成されるように請求項１または２に記載の細胞を体内に移植することを含んでなる、請求項１または２に記載の細胞のin vivo移植または植込み方法。 28．請求項12、13または16に記載の細胞培養物に薬剤が及ぼす効果を調べる方法であって、 (a)前記細胞培養物を薬剤に接触させ、そして (b)薬剤が培養物中の臍帯のホウォートンゼリー由来の細胞に及ぼす効果を確認する、ことを含んでなる方法。 29．臍帯のホウォートンゼリーから前軟骨細胞を単離し、前記細胞をin vitroで培養することを含む方法により得られるヒト前軟骨細胞培養物。 30．臍帯のホウォートンゼリーから前軟骨細胞を単離し、前記細胞をin vivoで培養することを含む方法により得られるヒト前軟骨細胞培養物。 31．臍帯のホウォートンゼリーから前軟骨細胞を単離し、有効量の増殖因子を含有する培地中で前記細胞を培養して、軟骨細胞へと分化するように前軟骨細胞を誘導し、それから分化した軟骨細胞を培養することを含む方法により得られるヒト軟骨細胞培養物。 32．軟骨細胞が細胞外マトリックスを分泌する、請求項31に記載の軟骨細胞培養物。 33．in vitroで作製された軟骨組織であって、前記生存軟骨組織は臍帯のホウォートンゼリー由来の間質細胞および間質細胞から天然に分泌された結合組織タンパク質を含んでなり、間質細胞と結合組織タンパク質が間質細胞により橋かけされた間隙を有する三次元構造体へと形成された生物適合性の非生存物質から構成された枠組みに付着しかつそれを実質的におおっている、軟骨組織。 34．間質細胞が前軟骨細胞、軟骨細胞またはそれらの組合せである、請求項33に記載の軟骨組織。 35．枠組みがエチレンオキシドで処理されている、請求項33に記載の軟骨組織。 36．枠組みが電子ビームで処理されている、請求項33に記載の軟骨組織。 37．枠組みが生物分解性の物質で構成されている、請求項33に記載の軟骨組織。 38．生物分解性の物質がポリグリコール酸、綿、ガット縫合糸、セルロース、ゼラチン、コラーゲンまたはポリヒドロキシアルカノエートである、請求項37に記載の軟骨組織。 39．ポリグリコール酸がフェルトの形をしている、請求項38に記載の軟骨組織。 40．枠組みが非生物分解性の物質で構成されている、請求項33に記載の軟骨組織。 41．非生物分解性の物質がポリアミド、ポリエステル、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリレート、ポリビニル、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン、またはニトロセルロース化合物である、請求項40に記載の軟骨組織。 42．枠組みがメッシュである、請求項33に記載の軟骨組織。 43．間質細胞が臍帯のホウォートンゼリー由来の前軟骨細胞、臍帯のホウォートンゼリー由来の軟骨細胞、繊維芽細胞、繊維芽細胞様細胞、筋細胞、臍帯細胞または臍帯血由来の骨髄細胞を含む、請求項33に記載の軟骨組織。 44．発現エレメントの制御下にある外来遺伝子でトランスフェクトされた間質細胞をさらに含む、請求項33に記載の軟骨組織。 45．軟骨組織のin vitro培養方法であって、有効量の増殖因子を含有する培地中の三次元枠組み上に接種した臍帯のホウォートンゼリー由来の間質細胞を培養し、その結果として、間質細胞および間質細胞から天然に分泌された結合組織タンパク質が、間質細胞により橋かけされた間隙を有する三次元構造体へと形成された生物適合性の非生存物質から構成された枠組みに付着しかつそれを実質的におおうことにより、三次元構築物に形作られることを含んでなる方法。 46．間質細胞が前軟骨細胞、軟骨細胞またはそれらの組合せである、請求項45に記載の方法。 47．間質細胞が臍帯のホウォートンゼリー由来の前軟骨細胞、臍帯のホウォートンゼリー由来の軟骨細胞、繊維芽細胞、繊維芽細胞様細胞、内皮細胞、周皮細胞、マクロファージ、単球、白血球、形質細胞、マスト細胞、脂肪細胞、臍帯細胞、および臍帯血由来の骨髄細胞の組合せである、請求項45に記載の方法。 48．間質細胞が発現エレメントの制御下にある外来遺伝子でトランスフェクトされている、請求項46に記載の方法。 49．枠組みが生物分解性の物質で構成されている、請求項45に記載の方法。 50．生物分解性の物質がポリグリコール酸、綿、ガット縫合糸、セルロース、ゼラチン、コラーゲンまたはポリヒドロキシアルカノエートである、請求項49に記載の方法。 51．ポリグリコール酸がフェルトの形をしている、請求項50に記載の方法。 52．ポリグリコール酸がエチレンオキシドで処理される、請求項50に記載の方法。 53．ポリグリコール酸が電子ビームで処理される、請求項50に記載の方法。 54．枠組みが非生物分解性の物質で構成されている、請求項45に記載の方法。 55．非生物分解性の物質がポリアミド、ポリエステル、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリレート、ポリビニル、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン、またはニトロセルロース化合物である、請求項54に記載の方法。 56．枠組みがメッシュである、請求項45に記載の方法。 57．増殖因子がTGF-βを含む、請求項45に記載の方法。 58．培地が有効量のアスコルベートをさらに含む、請求項45に記載の方法。 59．培地が静止条件下に保持される、請求項45に記載の方法。 60．培地が対流による動的状態で周期的加圧下に保持される、請求項45に記載の方法。 61．in vitroで作製された生存間質組織を体内に移植することを含んでなる、請求項33に記載の軟骨組織のin vivo移植または植込み方法であって、前記生存軟骨組織が臍帯のホウォートンゼリー由来の間質細胞および間質細胞から天然に分泌された結合組織タンパク質を含んでなり、間質細胞と結合組織タンパク質が間質細胞により橋かけされた間隙を有する三次元構造体へと形成された生物適合性の非生存物質から構成された枠組みに付着しかつそれを実質的におおって組織同等物を形成している、上記方法。 62．請求項33に記載の軟骨組織に薬剤が及ぼす効果を調べる方法であって、 (a)三次元軟骨組織細胞培養物を薬剤にさらし、ただし、前記三次元細胞培養物はin vitroで作製された生存間質組織上で増殖させた臍帯のホウォートンゼリー由来の細胞を含み、前記生存間質組織は間質細胞により橋かけされた間隙を有する三次元構造体へと形成された生物適合性の非生存物質から構成された枠組みに付着しかつそれを実質的におおっている間質細胞と間質細胞から天然に分泌された結合組織タンパク質を含んでなり、 (b)薬剤が培養物中の臍帯のホウォートンゼリー由来の細胞に及ぼす効果を確認する、ことを含んでなる方法。 63．遺伝子操作された軟骨組織において生物学的産物を生産する方法であって、 (a)発現エレメントの制御下にある外来遺伝子でトランスフェクトされた臍帯のホウォートンゼリー由来の間質細胞を培養して外来遺伝子産物を培養物中に発現させ、ただし、トランスフェクトされた間質細胞および間質細胞から天然に分泌された結合組織タンパク質が間質細胞により橋かけされた間隙を有する三次元構造体へと形成された生物適合性の非生存物質から構成された枠組みに付着しかつそれを実質的におおっており、 (b)前記培養物から外来遺伝子産物を単離する、ことを含んでなる方法。 64．三次元細胞培養物において生物学的産物を生産する方法であって、 (a)発現エレメントの制御下にある外来遺伝子でトランスフェクトされた臍帯のホウォートンゼリー由来の間質細胞を含む遺伝子操作された軟骨組織に接種された実質細胞を培養して外来遺伝子産物を培養物中に発現させ、ただし、トランスフェクトされた間質細胞および間質細胞から天然に分泌された結合組織タンパク質が間質細胞により橋かけされた間隙を有する三次元構造体へと形成された生物適合性の非生存物質から構成された枠組みに付着しかつそれを実質的におおっており、 (b)前記培養物から外来遺伝子産物を単離する、ことを含んでなる方法。 65．間質細胞が前軟骨細胞、軟骨細胞またはそれらの組合せである、請求項61、 62、63または64に記載の方法。 66．(a)十分量の増殖因子を含有する培地でホウォートンゼリー由来の前軟骨細胞を培養して、軟骨細胞へと分化するように前軟骨細胞を誘導し、 (b)三次元枠組みに軟骨細胞および軟骨細胞から天然に分泌された結合組織タンパク質を接種し、三次元枠組みが生存細胞により集落化されて、軟骨細胞により橋かけされた間隙を有する三次元構造体を形成するようにする、ことを含んでなる方法により作製された軟骨組織。 67．軟骨組織を修復、置換または増強する方法であって、かかる治療を必要とする患者に、臍帯のホウォートンゼリー由来の軟骨組織形成性細胞の製剤を注入または移植することを含んでなる方法。 68．軟骨組織形成性細胞が軟骨細胞である、請求項67に記載の方法。 69．軟骨組織形成性細胞が前軟骨細胞である、請求項67に記載の方法。 70．軟骨組織形成性細胞が軟骨細胞と前軟骨細胞の組合せである、請求項67に記載の方法。 71．前記製剤が細胞増殖因子を含む、請求項67に記載の方法。 72．前記製剤が抗炎症性化合物を含む、請求項67に記載の方法。 73．体内に移植する直前に、前記製剤の細胞をまず三次元枠組みに接種する、請求項68、69または70に記載の方法。 74．前記製剤の細胞を最初に三次元枠組みに接種して生存間質組織をin vitroで形成させ、前記生存間質組織が間質細胞により橋かけされた間隙を有する三次元構造体へと形成された生物適合性の非生存物質から構成された枠組みに付着しかつそれを実質的におおっている、臍帯のホウォートンゼリー由来の間質細胞および前記間質細胞から天然に分泌された結合組織タンパク質を含んでなる、請求項68、69または70に記載の方法。 75．臍帯のホウォートンゼリー由来の細胞の集団を含んでなる細胞バンク。 76．前記細胞が前軟骨細胞である、請求項75に記載の細胞バンク。 77．前記細胞が軟骨細胞である、請求項75に記載の細胞バンク。 78．前記細胞が臍帯のホウォートンゼリー由来の前軟骨細胞とそれから分化した軟骨細胞との組合せである、請求項75に記載の細胞バンク。 79．低温保存される、請求項76、77または78に記載の細胞。 80．in vitroで培養物中に連続的に継代される、請求項76、77または78に記載の細胞。 81．臍帯のホウォートンゼリー由来の前軟骨細胞を低温保存することを含む方法により得られる前軟骨細胞のバンクであって、融解して培養したとき、軟骨細胞へと分化するように前軟骨細胞を誘導することができる、前軟骨細胞のバンク。 82．臍帯のホウォートンゼリー由来の軟骨細胞を低温保存することを含む方法により得られる軟骨細胞のバンクであって、融解して培養したとき、軟骨組織を作ることができる、軟骨細胞のバンク。。 83．臍帯のホウォートンゼリーから前軟骨細胞と軟骨細胞を単離し、前記単離した細胞を低温保存することを含む方法により得られる前軟骨細胞と軟骨細胞のバンクであって、融解して培養したとき、軟骨組織を作る能力を保持している、前軟骨細胞と軟骨細胞のバンク。 84．臍帯のホウォートンゼリーから軟骨組織を生じるように誘導し得る細胞を単離し、前記細胞がそれらの形態を保持するようにin vitroで前記細胞を培養することを含む方法により得られる細胞のバンク。 85．単離された細胞が軟骨細胞である、請求項84に記載の細胞のバンク。 86．単離された細胞が前軟骨細胞である、請求項84に記載の細胞のバンク。 87．単離された細胞が軟骨細胞と前軟骨細胞の組合せである、請求項84に記載の細胞のバンク。 88．臍帯のホウォートンゼリー由来の軟骨組織形成性細胞から分泌された細胞外マトリックス。 89．臍帯のホウォートンゼリー由来の軟骨細胞を含む軟骨組織から細胞外マトリックスを分離する方法であって、 (a)ホウォートンゼリー由来の前記細胞をin vitroで培養して、細胞外マトリックスを分泌するように前記細胞を誘導し、 (b)培養物中の前記細胞から分泌された細胞外マトリックスを分離する、ことを含んでなる方法。 90．軟骨細胞が前軟骨細胞の培養物から得られ、前軟骨細胞を臍帯のホウォートンゼリーから得て、有糸分裂で増やして軟骨細胞を生じるようにin vitroで培養する、請求項89に記載の細胞外マトリックス。 91．臍帯のホウォートンゼリーから、細胞外マトリックスを分泌するように誘導することができる細胞を単離し、前記細胞をin vitroで培養して細胞外マトリックスを分泌するように誘導し、培養物中の前記細胞から分泌された細胞外マトリックスを分離する方法により得られる細胞外マトリックス。 92．単離された細胞が前軟骨細胞である、請求項91に記載の細胞外マトリックス。 93．軟骨組織を修復、置換または増強する方法であって、かかる治療を必要とする患者に、請求項88、89または91に記載の細胞外マトリックスを含む製剤を注入または移植することを含んでなる方法。