KR20110051166A

KR20110051166A - 포유동물의 전구 세포를 인슐린 생성 이자섬 세포로 분화시키는 방법

Info

Publication number: KR20110051166A
Application number: KR1020107027546A
Authority: KR
Inventors: 조셉 찰스 루이즈; 스티븐 마이클 호이나우스키
Original assignee: 베스타 테라퓨틱스 인코포레이티드
Priority date: 2008-05-22
Filing date: 2009-05-21
Publication date: 2011-05-17
Also published as: BRPI0912320A2; AU2009248959A1; CN102282250A; US20170045497A1; TW201000110A; CA2725196A1; US20100136688A1; ES2862623T3; JP2011520470A; RU2010152354A; EP2291514A1; US8877497B2; IL209471A0; US20150056647A1; EP2291514B1; US9605244B2; MX2010012730A; WO2009143353A1

Abstract

본 발명은 전구 세포를 인슐린 생성 이자섬 세포로 분화시키는 방법, 및 상기 세포를 사용하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.

Description

포유동물의 전구 세포를 인슐린 생성 이자섬 세포로 분화시키는 방법{Method of differentiating mammalian progenitor cells into insulin producing pancreatic islet cells}

관련출원의 상호참조

본 출원은 2008년 5월 22일자로 출원된 미국 임시출원 제61/055,341호를 우선권으로 주장하며, 그의 전체내용은 본 원에 참고로 원용된다.

발명의 분야

본 발명은 일반적으로 특정 세포형의 포유동물 전구 세포를 다른 세포형으로 분화시키는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 줄기 세포를 포함한 포유동물의 전구 세포를 인슐린 생성 이자섬 세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다.

진성 당뇨병("당뇨병")은 미국에서 질병율 및 사망율의 주 요인중 하나이다. 당뇨병으로 고통받는 환자는 대사 장애(들)가 있고, 인슐린 생성량이 적어 혈중 당수치가 비정상적으로 높다(즉, 고혈당증).

이자내 랑게르한스섬에서 발견되는 베타 세포("이자섬 β 세포)는 인슐린을 생성한다. I형 및 (보다 적게는) II형 당뇨병에서, 인슐린 생성 부족은 기능성 인슐린-생성 섬 세포 덩이가 불충분한 것에 기인할 수 있다. 바이러스, 약품 및/또는 자가면역 공격 및 세포 파괴가 이러한 세포 손실의 원인이 될 수 있다.

이러한 병의 원인이 알려지면서 손실 또는 손상 세포를 도너 이자 세포로 보충함으로써 당뇨병 개시를 역전 또는 예방하려는 시도가 행해지고 있다. 이러한 부류의 세포-기반 요법은 가능성이 있지만, 연구 및/또는 이식을 목적으로 한 이자 세포, 특히 인간 이자 세포는 양적 및 질적인 면 모두에서 공급 부족에 시달리고 있다.

본 발명은 부분적으로 이자 이외의 조직을 포함하는 임의 조직 유래의 전구 세포를 인슐린-생성 이자 세포에 이르도록 사용하는 것이 가능해 짐으로써 상기 부족한 공급을 증가시키는 방법을 제공한다.

발명의 개요

본 발명은 전구 세포가 인슐린 생성 이자 세포로 분화되기에 충분한 시간동안에, (a) 전구 세포를 2 mmol/L의 소듐 부티레이트를 포함하는 무혈청 유도전 배지에서 배양한 다음; (b) 상기 전구 세포를 녹아웃(knock-out) 대체 혈청을 포함하는 유도 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 전구 세포를 인슐린-생성 이자 세포로 분화시키는 방법을 제공한다. 전구 세포는 간 줄기 세포, 제대 기질 줄기 세포 또는 지방 줄기 세포일 수 있다. 바람직하게, 전구 세포는 인간 조직에서 유래된 것이다. 유도 배지는 약 2%의 녹아웃 대체 혈청을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 구체예는 본 발명에 따라 전구 세포로부터 분화된 이자 β 섬-유사 세포를 화합물과 접촉시키고; 상기 이자 β 섬-유사 세포의 생존성을 측정하는 단계를 포함하며, 이때 상기 화합물의 존재시 생존성이 화합물의 부재시와 비교하여 감소된 것은 화합물이 생체내에서 독성적임을 나타내는, 시험관내에서 화합물의 독성을 평가하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예는 본 발명에 따라 전구 세포로부터 분화된 대사 활성 이자 β 섬-유사 세포를 화합물과 접촉시키고; 상기 이자 β 섬-유사 세포의 대사 활성을 측정하는 단계를 포함하며, 이때 상기 화합물의 존재시 대사 활성이 화합물의 부재시와 비교하여 감소 또는 증가된 것은 화합물이 생체내에서 활성을 가진다는 것을 나타내는, 시험관내에서 화합물의 활성을 평가하는 방법을 제공한다.

본 발명의 그밖의 다른 구체예는 본 발명에 따라 제대 기질 세포로부터 분화된 이자 β 섬-유사 세포 집단을 치료를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하여, 상기 치료를 필요로 하는 개체의 이자에서 β 섬 세포의 손실 또는 결핍을 치료하는 방법을 제공한다. 환자는 당뇨병으로 진단받았을 수 있다.

본 발명의 그밖의 또 다른 구체예는 본 발명의 이자 β 섬-유사 세포 패널과 인슐린 생성 및/또는 유전자 발현을 측정하기 위한 적어도 하나의 시약을 포함하는 약물 스크리닝 키트를 제공한다. 일 구체예로, 키트는 전구세포-유래 이자 β 섬-유사 세포를 배양하기 위한 적어도 하나의 배지를 포함한다.

도 1은 본 발명에 따라 이자 β 섬-유사 세포로 분화된 인간 간 줄기 세포로부터 얻은 cDNA의 PCR 분석 결과를 제공한다. 레인 1(Pdx), 레인 2(인슐린), 레인 3(글루카곤), 레인 4(소마토스타틴), 레인 5(glut2), 레인 6(GADPH, 대조군).
도 2는 본 발명에 따라 이자 β 섬-유사 세포로 분화된 인간 UCM 세포로부터 생성된 인슐린이 면역조직학적으로 염색된 것을 나타낸다. 갈색(암)으로 염색된 부분은 인슐린 존재를 나타낸다. (10배 확대율).
도 3은 본 발명에 따라 이자 β 섬-유사 세포로 분화된 인간 UCM 세포에서 얻은 cDNA의 PCR 분석 결과를 제공한다. 좌측에서 우측으로 방향으로 레인 1 - Pdx-1; 레인 2 - 글루카곤; 레인 3 - 인슐린; 레인 4 - glut 2; 레인 5 - 소마토스타틴; 레인 6 - GAPDH (대조군).
도 4는 본 발명에 따라 이자 β 섬-유사 세포로 분화된 인간 UCM 세포에 의해 배지에 분비된 인슐린의 양(5 일)을 나타내는 그래프이다. NSB: 비특이적 결합(대조군).

발명의 상세한 설명

본 발명은 이자 또는 이자 이외의 조직 유래 전구 세포를 인슐린-생성 이자 세포로 분화시키는 방법을 제공한다. 지방 전구 세포, 간 전구 세포 및 제대 기질 전구 세포를 비롯한 임의 조직의 전구 세포가 본 발명의 교시를 이용함으로써 인슐린-생성 이자 세포로 분화되도록 유도될 수 있다.

용어 "전구" 세포는 보다 "성숙한" 세포로 분화될 수 있는 능력을 가지는 임의의 세포를 정의하기 위해 본 원에서 개괄적으로 사용된다. 따라서, 용어 "분화"는 단일 세포형/계통내에서 세포의 "성숙"(예를 들면, 간 줄기 세포가 간모세포로 성숙) 뿐 아니라 세포가 하나의 세포형/계통에서 다른 세포형/계통으로(예를 들면, 간세포에서 이자 세포로) "전환"하는 것도 의미하는 것이다.

일례를 들면, 본 원에서 사용된 용어 "간 전구세포"는 완전 성숙된(즉, 분화된) 간세포 또는 담낭 세포가 아닌 임의의 세포를 정의하기 위해 개괄적으로 사용된다. 따라서, "간 전구세포"는 간 줄기 세포 및 그의 미숙 자손 모두를 망라한다. "자손"은 자기 복제 간 줄기 세포, 간모세포, 이로부터 유래된 양능성 전구세포 및 특정 세포형(예를 들면, 수임 담낭 세포의 전구세포 또는 간세포)으로 분화되도록 위탁된 전구세포를 모두 망라한다. 본 발명에 따르면, 간 전구세포는 또한 이자 세포로 분화될 수도 있다.

본 원에서 전구세포에 대한 설명 및 실시예는 전부는 아니지만 거의 대부분 인간-유래 세포 집단(성인 및 태아 둘 다의)과 관련될 것이나, 본 원의 교시가 인간으로만 한정되는 것은 아니다. 실제로, 당업자들은 본 원의 교시가 포유동물, 일반적으로는 예를 들면, 마우스, 래트, 개 등에서 유래하는 전구세포의 분리 및 분화에도 적용될 수 있다는 것을 예상할 수 있다. 따라서, 본 발명의 영역은 임의의 모든 포유동물의 전구세포를 포함하도록 의도된다.

간 전구 세포

상기 언급된 각 간 전구 세포(예를 들면, "줄기 세포", "간모세포" 또는 "간세포") 집단은 그의 각 크기 및/또는 각 집단 고유 마커의 특정 배열로 식별될 수 있다. 이하 표 1을 참조바란다.

	간 줄기 세포	간모세포	성인 간세포 (성인 담낭 세포)
크기 (μM)	7-9	10-12	17-25
EpCAM	+++	++	-- (++)
AFP	---	+++	-- (--)
알부민	+	++	+++ (--)
CK19	+++	++	-- (++)
클라우딘 3	+++	-	- (+)
텔로머라제	+++	+++	++ (n.t.)
소닉(Sonic) 및 인디안 헤지호그 (Indian Hedgehog)	+++	++	-- (--)
I-CAM1	---	+++	++ (+)
N-CAM	+++	---	-- (--)
MDR3	-	-	-- (+++)
P450-3A4	---	---	+++ (--)

EpCAM=상피 세포 부착 분자; CK19= 사이토케라틴 19, 담낭 특이적 사이토케라틴; I-CAM=세포간 부착 분자; NCAM=뉴론 세포 부착 분자; MDR3=다중약물 내성 유전자 아이소형 3(담즙 운반 관련)

P450-C3A4=시토크롬 P450 3A4; 클라우딘 3=폐쇄막 단백질(아이소형 3).

간 줄기 세포(HSC)는 태아 및 신생아 간의 관판(또한 한계판으로도 불림) 및 소아 및 성인 간의 헤링관에서 발견되고, 텔로머라제 발현으로 자기 복제가 입증되었으며, 이식시 성숙 간세포를 형성할 수 있는 다능성 세포이다. 이러한 세포로는 EpCAM+, NCAM+, ALB+, CK8/18+, CK19+, CD133/1+가 있으며, 시험된 모든 조혈 마커(예를 들면, CD34, CD38, CD45, CD14), 중간엽 세포 마커(CD146, VEGFr, CD31) 및 P450s 또는 알파-태아 단백질 발현에 음성적이다. HSC는 간모세포 및 수임 (단능성) 담낭 전구세포를 생성하는 것으로 밝혀졌다.

간모세포(HB)는 태아 및 신생아 간의 실질 도처에서 헤링관 말단에 결박된 작은 세포 무리 또는 단일 세포로서 발견되는 다능성 세포이다. HB는 HSC로부터 유래된다. HB는 HSC 상에 존재하지만 중요한 특징은 없는 많은 항원을 공유한다. 예를 들어, HB는 NCAM 보다는 ICAM1을 발현하며, 알파-태아 단백질 및 태아의 P450s 형을 상당량 발현한다. 이들 HB는 단능성 전구세포, 수임 간세포 및 담낭 전구세포를 생성한다.

간 수임 전구세포는 간세포 및 담낭 계통의 단능성 전구세포이다. 그의 항원 프로필은 HB의 것과 겹친다; 담낭 수임 전구세포는 CK19를 발현하지만 AFP 또는 ALB를 발현하지 않는 반면에, 간세포 수임 전구세포는 AFP 및 ALB를 발현하지만 CK19를 발현하지 않는다. 수임 담낭 전구세포는 간 줄기 세포 및 또한 간모세포로부터 직접 유래된다.

중간엽 세포(MC)는 간질(중간엽 줄기 세포), 내피(혈관모세포), 별 세포(별 세포 전구체) 및 각종 조혈 세포(조혈 줄기 세포)를 비롯하여, 상이한 많은 중간엽 세포형에서 다양한 계통 단계의 세포를 포함한다(성숙 세포 및 괄호안에 그의 전구체로 기술됨).

간 전구 세포의 분리

본 발명에 따라 시험관내에서 분리 및 분화하기에 적합한 간 전구세포는 임의의 특정 방법으로 분리 또는 분화된 것에 한정되지 않는다. 일례로, 간 전구세포의 분리 및 확인 방법이 예를 들어 전체내용이 본 원에 참고로 원용되는 미국 특허 제6,069,005호; 및 미국 특허출원 제09/487,318호; 10/135,700호; 10/387,547호 및 11/560,049호에 기술되었다.

간 줄기 세포 및 간모세포는 특징적인 항원 프로필을 지니며, 전술한 프로토콜로 분리될 수 있다. 예를 들어, 간 줄기 세포 및 간모세포는 다수의 항원(예를 들면, 사이토케라틴 8, 18, 및 19, 알부민, CD133/1, 및 상피 세포 부착 분자("EpCAM")를 공유하며, 조혈 마커(예를 들면, 글리코포린 A, CD34, CD38, CD45, CD14) 및 중간엽 세포 마커(예를 들면, CD146, CD31, VEGFr 또는 KDR)에 음성적이다.

다른 한편으로, 간 줄기 세포 및 간모세포는 크기(줄기 세포는 7 내지 9 ㎛이고; 간모세포는 10 내지 12 ㎛임), 배양물의 형태(줄기 세포는 형태학적으로 균일한 밀집 콜로니를 형성하는 반면, 간모세포는 전용 채널인 추정 소관이 산재된 줄모양의 구조를 형성함), 특정 항원의 발현 패턴 차이(EpCAM은 간 줄기 세포를 통해 발현되나, 간모세포내 세포 표면에 국한됨), 또는 항원 프로필 차이(N-CAM은 간 줄기 세포에 존재하나, 알파-태아 단백질(AFP) 및 ICAM1은 간모세포에 의해 발현됨)에 의해 서로 구별될 수 있다.

일 구체예에 있어서, 일차 간 줄기 세포는 상술된 방법에 의해 인간의 간으로부터 수득된다. 요약하여 나타내면, 전간 간세포의 단일 세포 현탁액을 얻고, 조직 배양 플라스틱상에 단독으로, 또는 콜라겐 및 라미닌을 포함하는 세포외 단백질의 기질상에 플레이팅하였다. 이어, 세포를 혈청을 포함하는 배지에서 현탁 세포가 플레이트에 부착하는데 필요한 시간(보통 1 내지 2일) 동안 배양하였다.

그 다음에, 혈청-함유 배지를 제거하고, 혈청이 없는 "히로시 쿠보타 (Hiroshi Kubota) 배지"(HK)로 교체한 다음, 특이적 성장 인자를 보충하였다. 보다 구체적으로, HK는 구리를 함유하지 않고 칼슘 함량이 낮으며(< 0.5 mM) 인슐린(5 ㎍/ml), 트랜스페린/fe (5 ㎍/ml), 고밀도 지질단백질(10 ㎍/ml), 셀레늄(10-10 M), 아연(10-12 M) 및 정제 알부민에 결합된 유리 지방산 혼합물 7.6 μE가 보충된 무혈청 기초 배지(예를 들면, RPMI 1640)이다. 이와 같은 배지의 제조방법에 대한 상세한 설명은 다른 곳, 예를 들면 그의 내용이 본 원에 참고로 원용되는 문헌[Kubota H, Reid LM, Proceedings of National Academy of Sciences (USA) 2000;97:12132-12137]에서 공개되었다.

이들 조건하에서 간 줄기 세포 콜로니가 플레이트상에 5 내지 14 일간에 걸쳐 비교적 신속히 형성된다.

제대 기질 전구 세포

제대 기질(UCM) 전구 세포는 당업계에 공지된 임의의 기술을 이용하여, 예컨대 전체내용이 본 원에 참고로 원용되는 미국 특허 제5,919,702호; 및 미국 특허 출원 공개 제20040136967호 및 20080019949호에 기재되어 있는 바와 같이 분리될 수 있다. UCM 세포(워튼 젤리 세포로도 알려져 있음)는 제대를 가지고 있는 거의 모든 동물에서 발견될 수 있으며, 그안에서 수집한 워튼 젤리로부터 얻을 수 있다. "태아" 세포는 세포 및/또는 이로부터 분화된 인슐린-생성 이자 세포의 임의의 면역 거부를 최소화할 수 있는 특성을 가지기 때문에, 발생 태아 또는 신생아의 제대에서 얻은 워튼 젤리로부터 UCM 줄기 세포를 수득하는 것이 유리할 수 있다. 따라서, 이러한 세포는 이를 필요로 하는 임의의 대상에 사용하기 위해 이자섬 세포 또는 베타-유사 세포를 생성하기 위한 "유비쿼터스 도너(ubiquitous donor) 세포"로서 유용할 수 있다.

전 UCM 세포를 제대에서 분리하고, 분화 없이 UCM 세포 성장을 자극하는 인자를 함유하고, 배양시 UCM 줄기 세포가 기질 표면에 선택적으로 부착되도록 할 수 있는 배지에 가한다. 검체-배지 혼합물을 배양하고, 부착되지 않은 물질을 기질 표면으로부터 제거한다. 본 발명의 UCM 세포를 분리하는 데에 임의의 적절한 종류의 배양 배지를 사용할 수 있으며, 배양 배지에 예를 들어, 혈청을 비롯한 하나 이상의 성분이 첨가될 수 있다.

충분한 시간, 예를 들면, 약 10 내지 12 일동안 세포 배양 후, 체외이식 조직에 존재하는 UCM 유래 줄기 세포는 그로부터의 이동 또는 세포 분열에 의해, 또는 이 둘 다에 의한 결과로 조직에서 사라질 것이다. 그 다음에, 이들 UCM 유래 줄기 세포를 제거하여 초기에 사용한 것과 동일하거나 상이한 종류의 신선한 배지를 함유하는 배양 용기를 분리할 수 있으며, 이 경우 UCM 유래 줄기 세포 집단은 유사분열적으로 확장될 수 있다.

UCM 유래 줄기 세포를 배양하기 위한 일 구체예에 있어서, 제대 조직 부분을 저부에 유리 슬라이드를 구비한 조직 배양 디시에 놓고, 듈베코 MEM + 20% FBS; 또는 10% FBS, 5% 배아 줄기 세포 한정 FBS 및 항미생물 화합물을 함유하는 RPMI 1640에서 배양하였다. 조직은 바람직하게는 37 내지 39 ℃ 및 5% CO₂에서 10 내지 12 일간 배양된다.

다른 구체예에 있어서, 완전 절개하여 혈액을 제거한 제대를 효소적으로(예를 들면, 40 U/mL 히알우로니다제 및 0.4 mg/mL 콜라게나제 용액으로) 및 기계적으로(예를 들면, 막자로 40 메쉬 스크린) 분해시켰다. 이렇게 얻은 단일 세포 현탁액을 58% 저 글루코스 DMEM, 40% MCDB201(Sigma, St. Louis, Mo.), 1x 인슐린-트랜스페린-셀레늄-A(Invitrogen, Carlsbad, Calif.), 0.15 mg/mL 알부맥스(AlbuMAX) I(Invitrogen, Carlsbad, Calif.), 1 nM 덱사메타손, 100 uM 아스코르브산 2-포스페이트, 100 U 페니실린, 1000 U 스트렙토마이신, 2% FBS, 10 ng/mL EGF 및 10 ng/mL 혈소판-유래 성장 인자 BB(PDGF-BB)를 함유하는 한정 배지(DM)에 현탁시켰다. 이어서, 세포를 시딩하고, DM에서 확장시켰다.

본 발명은 배양시 줄기 세포가 확립되기만 하면, 예를 들어 세포 배양물이 적절한 밀도 또는 컨플루언시(confluency) 비율에 도달하도록 신선 배지의 계대를 조절하거나, 적절한 성장 인자로 처리하거나, 배양 배지 또는 배양 프로토콜을 변경시키거나, 또는 이들을 일부 조합시킴으로써 성숙 세포 또는 세포주용 전구세포로 제공될 능력이 유지될 수 있다고 판단하고 있다.

지방 줄기 세포

지방 조직으로부터 지방 줄기 세포(ASC)의 유래방법이 전체내용이 본 원에 참고로 원용되는 미국 특허 제6153432호, 6391297호, 6429013호, 6555374호, 6841150호, 7001746호 및 7033587호에 기재되어 있다. 요약하여 나타내면, 일례로, 조직을 입수하여 분별원심법에 적용하고, 배양하여 확장시킨다. 전형적으로, 1 g의 조직은 배양 24 시간내에 50,000 내지 100,000개의 줄기 세포를 생성한다. 확장 배지는 바람직하게는 60% DMEM(저 글루코스) 및 10% 소태아 혈청(FBS); 5 ㎍/ml 인슐린, 5 ㎍/ml 트랜스페린 및 5 ng/ml 셀레늄; 10^-9 M 덱사메타손; 10 ng/ml 표피 성장 인자 (EGF); 10^-4M 아스코르브산 2-포스페이트; 100 U/ml 페니실린; 및 100 U/ml 스트렙토마이신이 보충된 40% MCDB-201을 포함한다. 이론에 얽매이지 않거나, 결부시킴이 없이, 배지에 EGF를 첨가하게 되면 ASC가 후에 인슐린-생성 섬 세포로 분화하는 능력이 향상될 것으로 판단된다. 아스코르브산 2-포스페이트는 ASC에 유사 효과를 가질 수 있다.

전구 세포의 인슐린-생성 이자 세포로의 분화

본 원에 사용된 용어 "이자섬 β-유사" 세포 또는 "인슐린-생성 이자섬" 세포는 이자섬 β 세포의 지표인 적어도 2개의 마커를 발현하는 세포를 가리킨다. 예시적인 이자섬 β 세포 마커에는 이자 십이지장 호메오박스-1(PDX-1), 인슐린, 소마토스타틴, 글루코스 전달체-2(glut2), 글리코겐, 아밀라제 및 뉴로제닌 3(Ngn3)의 발현을 들 수 있으나, 이들에만 한정되지는 않는다. 추가의 예시적인 마커로는 구형상과 같은 형태학적 특성이 포함된다. 또 다른 예시적인 마커로는 인슐린 생성과 같은 특성이 포함된다. 따라서, 특정 구체예에 있어서, 이자섬 β-유사 세포는 인슐린 생성과 같은 더 성숙한 이자섬 β 세포 기능을 발현한다.

특정 구체예에 있어서, 본 발명의 간세포-유사 세포는 본 원에 기술된 바와 같은 간세포 마커를 2 이상으로 발현한다. 다른 구체예에 있어서, 이자섬 β-유사 세포는 본 원에 기술된 바와 같은 이자섬 β 세포 마커를 3 이상으로 발현한다. 특정 구체예에 있어서, 본 발명의 이자섬 β-유사 세포는 본 원에 기술된 바와 같은 간세포 마커를 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상으로 발현한다. 당업자들이라면 알고 있는 바와 같이, 본 발명의 이자섬 β-유사 세포는 또한 다른 공지 마커 또는 기능을 발현할 수도 있다.

일 구체예에 있어서, 전구 세포는 하기 방법을 이용하여 분화된다: 유도전, 전구 세포를 0.5 내지 10 g/L의 저(바람직하게는, 1 g/L) 글루코스 DMEM, MCDB201 pH 7.4, 1x 인슐린-트랜스페린-셀레늄(ITS, Invitrogen), 0.1 내지 5 mg/mL(바람직하게는, 0.15 mg/mL)의 알부민(예를 들면, 알부맥스, Invitrogen), 0.5 내지 5 nM(바람직하게는, 1 nM)의 덱사메타손, 25 내지 250 μM(바람직하게는, 100 μM)의 아스코르브산-2-포스페이트, 5 내지 50 ng/mL(바람직하게는, 10 ng/mL)의 EGF, 5 내지 50 ng/mL(바람직하게는, 10 ng/mL)의 PDGF, 1 내지 5%(바람직하게는, 2%)의 FBS 및 페니실린/스트렙토마이신(Pen/Strep)을 함유하는 한정 배지에서 조직 배양 플레이트에 부착하기에 충분한 시간동안 배양한다. 이어서, 전구 세포를 무혈청 이스코브 변형 듈베코(Iscove's Modified Dulbecco) 배지(IMDM), 1 내지 5 mM(바람직하게는, 2 mM)의 소듐 부티레이트 및 Pen/Strep를 함유하는 유도전 배지에서 약 24 시간동안 배양한다. 그 다음에, 세포를 3 내지 36 시간, 바람직하게는 약 24 시간 이상동안 IMDM, 1 내지 5%(바람직하게는, 2%)의 녹아웃 대체 혈청 (KSR, Gibco) 및 Pen/Strep를 함유하는 분화 배지에서 배양한다.

소듐 부티레이트는 다수 유전자의 발현을 조절하는 강력한 히스톤 탈아세틸라제 저해제(HDACI)이다. 본 발명에 적합한 다른 HDACI로는 페닐 부티레이트, 레티노산, 발프론산, APHA 화합물 8, 아피시딘, (-)-데푸데신, 스크립타이드, 시르티놀 및 트리코스타틴이 있다.

다른 구체예에 있어서, 전구 세포는 하기 방법을 이용하여 분화된다: 유도전, 전구 세포를 저(1 g/L) 글루코스 DMEM, MCDB201 pH 7.4, 1x 인슐린-트랜스페린-셀레늄(ITS, Invitrogen), 0.15 g/mL 알부맥스(Invitrogen), 1 nM 덱사메타손, 100 μM 아스코르브산-2-포스페이트, 10 ng/mL EGF, 10 ng/mL PDGF, 2% FBS 및 페니실린/스트렙토마이신(Pen/Strep)을 함유하는 한정 배지에서 조직 배양 플레이트에 부착하기에 충분한 시간동안 배양한다. 이어서, 전구 세포를 "저" 1 g/L 글루코스-DMEM, 5 내지 25 mM(바람직하게는, 10 mM)의 니코틴아미드, 0.5 내지 5 mM(바람직하게는, 1 mM)의 β-머캅토에탄올, 2% FBS, 및 Pen/Strep를 함유하는 유도전 배지에서 약 24 시간동안 배양한다. 그 다음에, 세포를 무혈청 1 g/L 글루코스-DMEM, 10 mmol/L 니코틴아미드, 1 mmol/L β-머캅토에탄올 및 Pen/Strep를 함유하는 분화 배지에서 10 시간 이상 배양한다.

전구 세포는 분화동안 세포의 삼차원 배양이 가능하도록 스캐폴드(scaffold) 존재하에서 분화될 수 있다. 스캐폴드 물질은 자연 발생 성분을 포함할 수 있거나, 합성 물질로 구성될 수 있거나, 또는 이 둘다로 이루어질 수 있다. 스캐폴드 물질은 또한 생체적합성일 수 있다. 예시적인 스캐폴드 물질에는 본 원에 기술된 세포외 기질 및 물질이 포함될 수 있다. 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 다른 스캐폴드 물질은 콜라겐(예를 들면, 콜라겐 타입 I, III, IV, V 및 VI), 젤라틴, 알기네이트, 피브로넥틴, 라미닌, 엔탁틴/니도겐, 테나신, 트롬보스폰딘, SPARC, 운둘린, 프로테오글리칸, 글리코사미노글리칸(예를 들면, 히알우로난, 헤파란 설페이트, 콘드로이틴 설페이트, 케라탄 설페이트 및 더마탄 설페이트), 폴리프로필렌, TER 폴리머, 알기네이트-폴리 L-리신, 콘드로이틴 설페이트, 키토산, MATRIGEL(벡톤-딕킨슨(Becton-Dickinson)사) 또는 상업적으로 입수가능한 그밖의 다른 세포외 기질 물질중 어느 하나 또는 이들의 2 이상의 혼합물을 포함하나, 이들에만 한정되지는 않는다.

특정 일 구체예에 있어서, UCM을 간세포-유사 세포로 분화시키는데 사용하기 위한 세포외 기질은 콜라겐 I이다. 콜라겐 코팅 플레이트를 벡톤-딕킨슨사로부터 상업적으로 구입할 수 있다.

전구 세포를 본 원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 배지에서 적어도 하기 2종 마커의 발현에 충분한 시간동안 배양한다: PDX-1, 인슐린, 소마토스타틴, glut2, 글리코겐, 아밀라제 및 Ngn3; 원형과 같은 형태학적 특성 및 인슐린 생성.

특정 일 구체예에 있어서, 전구 세포는 콜라겐 I 기질상에 2% KSR 및 Pen/Strep를 함유하는 IMDM 분화 배지에서 배양함으로써 인슐린-생성 이자섬 세포로 분화된다.

세포는 전형적으로 인슐린 생성과 같은 이자섬 β 세포-유사 기능적 성질을 획득하기에 충분한 시간동안 배양된다. 이와 관련하여, 분화는 당업계에 공지된 기술을 이용하여 인슐린 생성과 같은 기능적 성질을 측정함으로써 평가된다. 인슐린은 이자에서 발견되고 혈액(생체내) 또는 배지(시험관내에서)로 분비되는 β 섬 세포에 의해 단독으로 생성되는 소형 펩티드 호르몬이다. 인슐린 분비를 입증하기 위하여, 분화된 세포를 항-인간 인슐린 항체로 염색할 수 있다. 배지에 분비된 인슐린의 양을 검출 및 정량화하는 데에 표준 ELISA 기술이 또한 이용될 수도 있다.

요약하여 나타내면, 스트립을 마이크로타이터 플레이트상에서 어셈블하고, 각각에 300 μL의 HRP 세척 완충제를 채운 다음, 플레이트를 실온에서 5 분동안 배양한다. 그 다음에, 완충제를 제거하고, 샘플 20 μL를 검출 항체 20 μL를 함유한 웰에 첨가한다. 이어, 플레이트를 오비탈 진탕기(orbital shaker) 상에서 실온으로 1 시간동안 다시 배양한다. 웰 내용물을 따라내고, HRP 세척 완충제로 3회 세척한다. 효소액 100 μL를 각 웰에 첨가하고, 오비탈 진탕기 상에서 실온으로 30 분동안 배양한다. 또 다시, 웰을 HRP 완충제로 5회 세척한다. 이어서, 기질 용액 100 μL를 웰에 가하고, 오비탈 진탕기 상에서 실온으로 10 분동안 배양한다. 전형적으로, 화학 반응으로 인해 청색이 전개된다. "중단 용액" 100 μL로 반응을 종료시킨다. 이 용액은 상업적으로 입수가능하다. 플레이트를 450 nm에서 분석한다.

면역조직화학을 다음과 같이 수행한다: 세포를 메탄올 또는 파라포름알데하이드에서 2 분간 고정시킨 다음, PBS로 세척한다. 3% 과산화수소를 첨가하고, 60 분동안 배양한다. 용액 세척시, PBS/5% 블로토(blotto)/0.3% 트윈(Tween)에서 1:500으로 희석된 일차 항체를 적용하고, 60 분동안 배양한다. 다시, 세포를 PBS로 3회 세척하여 용액을 제거하고, PBS/5% 블로토/0.3% 트윈에서 1:400으로 희석된 이차 항체를 60 분동안 적용한다.

당업자들이 본 발명의 내용을 숙지하면 알 수 있는 바와 같이, 세포 형태 및 이자 β 섬 세포 마커의 발현을 결정하는데 PCR, RT-PCR, 정량적 PCR과 같은 유전자 발현 분석, 면역조직화학, 면역형광 분석 등을 포함하는 단백질 발현 분석을 예로 들 수 있으나 이들에만 한정되지는 않는 당업계에 공지된 임의의 각종 기술이 이용될 수 있다. 이러한 기술은 당업계에 공지되었으며, 본 원에서 더 이상 상세히 설명하지는 않겠다.

본 발명의 세포 분화는 유세포분석 방법, 면역조직화학, 면역형광 분석, 동소 하이브리드화 및/또는 조직학 또는 세포 생물학 기술을 예로 들 수 있으나 이들에만 한정되지는 않는 다양한 기술로 검출될 수 있다. 본 발명에 따르면, 30% 초과, 바람직하게는 약 50% 초과, 보다 바람직하게는 약 75% 초과, 및 가장 바람직하게는 약 90%를 초과한 전구 세포가 인슐린 생성 이자섬 세포로 분화될 수 있다.

인슐린-생성 이자 세포의 사용방법

본 발명의 분화된 이자 β 섬-유사 세포는 또한 유전적 배경이 다양한 개체 유래의 상이한 여러 기원(예를 들면, 제대, 간) 및 심지어는 상이한 동물 기원으로부터 유래된 이자 β 섬-유사 세포 패널로서 제공될 수도 있다. 예를 들어, UMC-유래 이자 β 섬-유사 세포 패널은 약물-대사 효소 및 약물 전달체를 코딩하는 유전자에서 다형상을 가지는 것으로 밝혀진 개체의 UMC 기원으로부터 유래된 유래 이자 β 섬-유사 세포를 포함할 수 있다. 본 발명의 패널은 예를 들면, 인슐린 발현 검출용 시약과 약물 스크리닝용 시약, 예를 들어, 본 원에 기술된 바와 같은 임의의 배양 배지를 포함한 시약을 포함하는 약물 스크리닝 키트의 일부로서 제공될 수 있다.

일 구체예에 있어서, 본 발명의 이자 β 섬-유사 세포는 유전적으로 변형될 수 있다. 이러한 구체예에 따라, 본 발명의 이자 β 섬-유사 세포는 트랜스진(transgene)을 갖는 핵산을 포함하는 유전자 전달 벡터에 노출되고, 그에 따라 세포내에서 트랜스진이 발현하도록 하기에 적절한 조건하에서 핵산이 세포로 도입된다. 트랜스진은 일반적으로 적절한 프로모터와 작동가능하게 연결된 코딩 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트이다. 코딩 폴리뉴클레오티드는 단백질을 코딩할 수 있거나, 안티센스 RNA, siRNA 또는 리보자임과 같은 생물학적 활성 RNA를 코딩할 수 있다.

따라서, 코딩 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 독소 또는 감염성 인자에 내성을 부여하는 유전자, 호르몬(예: 펩티드 성장 호르몬, 호르몬 방출 인자, 성 호르몬, 부신피질자극 호르몬, 인터페론, 인터류킨 및 림포카인과 같은 사이토카인), 세포 표면-결합 세포내 신호전달 부분, 예컨대 세포-부착 분자 및 호르몬 수용체, 및 주어진 계통의 분화 촉진 인자, 또는 서열이 알려진 임의의 다른 트랜스진을 코딩할 수 있다.

이하에 설명되는 바와 같이, 본 발명의 전구 세포로부터 분화된 인슐린-생성 이자섬 세포는 약물 스크리닝, 약물 상호작용 스크리닝, 이식, 조직/기관 재생, 및 간 손상 또는 기타 간 질환 치료를 포함하는 다양한 환경에 유용하다.

일 구체예에 있어서, 본 발명은 화합물(예를 들면, 약물 또는 후보 약물)의 활성을 조사하는 방법을 제공한다. 화합물의 활성은 본 발명의 이자 β 섬-유사 세포의 생존성 및/또는 대사 활성에 대한 약물 효과, 또는 약물 운반 전달체에 대한 약물 효과를 측정함으로써 평가될 수 있다. 본 발명에 비추어 당업자들이 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 이자 β 섬-유사 세포는 인슐린 생성에 대한 분석, 섬 세포를 이용하는 현재의 약물 스크리닝 분석 등과 같은 임의의 공지 약물 스크리닝 분석에 이용될 수 있다. 본 발명은 본 발명의 이자 β 섬-유사 세포가 용이하게 생성되고, 유전적 배경이 다양한 개체 기원의 다양한 조직으로부터 유래될 수 있다는 이점을 제공한다.

일 구체예에 있어서, 본 발명은 본 발명의 이자 β 섬-유사 세포를 화합물과 접촉시키고; 상기 이자 β 섬-유사 세포의 생존성을 측정함으로써 화합물의 활성(예컨대 독성)을 조사하는 방법을 제공한다. 이때 시험 화합물의 존재시 생존성이 시험 화합물의 부재시와 비교하여 감소된 것은 화합물이 생체내에서 독성적임을 제시한다. 세포의 생존성은 당업자들에게 널리 알려진 기술을 이용하여, 예컨대 염색 후 유세포분석을 실시하거나, 또는 간단히 혈구계수기를 사용하여 현미경으로 세포를 관찰함으로써 결정될 수 있다.

다른 구체예에 있어서, 본 발명은 본 발명의 이자 β 섬-유사 세포를 화합물과 접촉시키고, 동일 세포의 대사 활성을 측정함으로써 화합물의 활성을 조사하는 방법을 제공한다. 시험 화합물의 존재시 대사 활성이 화합물의 부재시와 비교하여 감소 또는 증가된 것은 약물이 생체내에서 활성을 가진다는 것을 나타낸다.

본 발명의 또 다른 구체예는 약물의 상호작용을 평가하는 방법을 제공한다. 약물의 상호작용은 본 발명의 세포를 두 화합물과 접촉시키고, 어느 한 화합물의 세포에 대한 효과가 제2 화합물의 존재로 영향을 받는지를 결정함으로써 평가될 수 있다. 예를 들어, 이 방법은 이자 β 섬-유사 세포의 제1 집단을 제1 화합물과 접촉시키고, 이자 β 섬-유사 세포의 제2 집단을 제2 화합물과 접촉시키며, 이자 β 섬-유사 세포의 제3 집단을 제1 화합물 및 제2 화합물 모두와 접촉시킨 다음에, 각 집단의 특정 효과(예를 들면, 세포 생존성, 대사 활성, 인슐린 생성)를 측정하는 것을 포함할 수 있으며, 여기에서 양 화합물과 접촉된 제3 집단의 효과가 제1 또는 제2 집단과 비교하여 통계적으로 유의적인 수준으로 감소 또는 증가하였다면 약물에 상호작용이 있었음을 제시한다. 약물의 상호작용은 임의의 한 약물이 다른 약물을 저해하거나, 임의의 한 약물이 다른 약물의 활성을 증가시키는 것을 포함할 수 있다.

당업자들이 알 수 있는 바와 같이, 유전자 발현은 정량적 중합효소 연쇄 반응(QC-PCR 또는 QC-RT PCR)을 포함하나 이에만 한정되지는 않는 당업계에 공지된 임의의 각종 기술을 이용하여 측정될 수 있다. mRNA 발현을 검출하기 위한 다른 방법은 당업계에 주지되어 있으며, 확립되었고, 전사 매개 증폭(TMA), 중합효소 연쇄 반응 증폭(PCR), 역전사 중합효소 연쇄 반응 증폭(RT-PCR), 리가제 연쇄 반응 증폭(LCR), 가닥 치환 증폭(SDA) 및 핵산 서열 기반 증폭(NASBA)을 포함할 수 있으나, 이들에만 한정되는 것은 아니다.

대사 활성의 측정은, 예를 들면, 세포를 시험 화합물과 접촉시킨 다음, 상등액을 수집함으로써 당업계에 공지된 기술을 이용하여 수행된다. 상등액에 존재하는 화합물의 대사산물을 공지 기술, 예를 들면 적절한 타입의 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 측정한다. 배양 세포에 의한 티미딘 도입은 시험관내에서 세포 증식을 평가하여 측정될 수 있다.

본 발명은 또한 이자섬-β 세포 손실로 야기되는 손상 또는 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 이와 관련하여, 본 발명의 분화된 인슐린 생성 이자섬 세포는 I형 및 II형 당뇨병 둘 다를 포함하나 이들에 한정되지는 않는, 이자섬 세포 손실로 야기되는 임의의 질환을 치료하는 데에 사용될 수 있다.

본 발명은 섬 세포 손상의 치료를 필요로 하는 개체에 본 발명의 분화된 이자 β 섬-유사 세포를 유효량 투여함으로써 섬 세포 손상을 치료하는 방법을 제공한다. 유효량이란 치료를 받는 개체에 유익한 효과를 제공하기에 충분한 양, 예를 들면 당뇨병 증상을 개선시켜 간 기능을 향상시키는 양을 가리킨다. 특정 구체예에 있어서, 유효량은 이자 β 섬 세포의 기능을 재생하기에 충분한 양이다. "치료적" 치료는 병적 징후를 나타내는 대상에 상기 징후를 경감시키거나 제거할 목적으로 적용되는 치료이다.

일 구체예에 있어서, 본 발명은 본 발명의 분화된 이자 β 섬-유사 세포를 유효량 투여함으로써 이자 인슐린 생성을 향상시키거나, 회복시키는 방법을 제공한다. 이와 관련하여, 이자 β 섬-유사 세포는 자가(적절한 세포가 출현 시기에 수확되고 저장될 수 있는 상황에서), 또는 본 원에 기술되고 업계에서 실시되는 방법에 따라 조직적합 수여자에 동종 이식하기 위해, 바람직하게는 개개 환자의 전구세포로부터 본 원에 기술된 바와 같은 방법으로 분화된다

세포는 본 원에 기술된 바와 같이 배양되고, 수확되며, 바이러스성 감염, 독소 섭취 또는 선천성 대사 이상 등에 의해 수반되는 임의 기원의 인슐린 생성 손실 또는 감소로 고통받는 환자의 지라, 순환계 및/또는 복막에 도입될 수 있다. 경우에 따라서는, 방사선 유도 최소 침습 방법이 세포를 이식하기 위해 사용된다. 간 기능을 개선하도록 설계된 효소 코딩 유전자로 유전자 조작된 세포 또한 본 원에서 고려된다.

특정 일 구체예에 있어서, 본 발명의 이자 β 섬-유사 세포는 β 섬 세포가 이식된 개체에 투여된다. 본 발명의 세포는 단독으로 투여되거나, 희석제 및/또는 섬 세포 성장 인자(예를 들면, BMPs, TGF-베타 1, IGF, FGF) 또는 기타 호르몬 또는 세포 집단과 같은 다른 성분과 배합하여 약학적 조성물로 투여될 수 있다.

요약하여 나타내면, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 약학적 또는 생리적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 본 원에 기술된 바와 같은 이자 β 섬-유사 세포 집단을 포함할 수 있다. 이 조성물은 중성 완충 염수, 포스페이트 완충 염수 등과 같은 완충제; 글루코스, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란, 만니톨과 같은 탄수화물; 단백질; 폴리펩티드 또는 글리신과 같은 아미노산; 항산화제; EDTA 또는 글루타티온과 같은 킬레이트제; 보조제(예를 들면, 수산화알루미늄); 및 보존제를 포함할 수도 있다. 본 발명의 조성물은 정맥내 또는 비경구 투여 또는 간에 직접 투여하도록 제형화될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 질환을 치료(또는 예방)하기에 적절한 방식으로 투여될 수 있다. 투여량 및 빈도는 환자의 상태, 및 환자의 질환 종류 및 경중도와 같은 요인에 의해 결정될 것이지만, 적절 용량은 임상 시험으로도 결정될 수 있다.

"유효량" 또는 "치료량"은 나이, 체중, 질병, 감염 또는 간손상 정도 및 환자(대상) 상태의 개별적인 차이를 고려하여 의사가 투여를 결정할 수 있는 본 발명의 조성물의 정확한 양을 가리킨다. 특정 구체예로, 본 원에 기술된 바와 같은 세포를 포함하는 약학적 조성물은 체중 1 kg당 10³ 내지 10⁷세포의 용량, 특정 구체예에 있어서 체중 1 kg당 10⁵ 내지 10⁶세포의 용량으로 투여될 수 있으며, 값은 상기 범위내에 있는 모든 정수를 포함한다. 세포 조성물은 이들 용량으로 다회 투여될 수도 있다. 특정 환자에 가장 적합한 용량 및 치료 계획은 환자의 질병 증상을 관찰하고 이에 따라 치료를 조절함으로써 의학업계의 숙련자들이 용이하게 결정할 수 있다.

대상 조성물의 투여는 주사, 수혈, 삽입 또는 이식을 비롯하여 임의의 통상적인 방식으로 행해질 수 있다. 본 원에 기술된 바와 같은 조성물은 환자에 피하, 피내, 종양내, 방실내, 골수내, 근육내, 정맥내(i.v.) 주사 또는 복강내적으로 투여될 수 있다.

본 발명의 세포 조성물은 또한 많은 매트릭스를 사용하여 투여될 수 있다. 매트릭스는 조직 공학 분야에서 수년간 이용되어 오고 있다. 본 발명은 인공 보조물로 작용하고, β 섬 기능을 유지 또는 조절하는 새로운 배경하에서 상기 매트릭스를 이용한다. 따라서, 본 발명은 조직 공학에서 유용성이 입증된 상기 매트릭스 조성물 및 제제를 이용할 수 있다.

매트릭스는 본 원에서 생체적합성 물질의 일례로서 사용된다. 그러나, 본 발명은 매트릭스에만 한정되지 않으며, 따라서 매트릭스(들)라는 용어가 쓰인 곳은 어디에서나 세포 정체 또는 세포 통과가 가능하고, 생체적합성이며, 마크로분자가 물질을 직접 통과할 수 있어서 물질 자체가 반투과막이거나 특정 반투과 물질과 함께 사용되는 장치나 다른 물질을 포함하는 것으로 이해하여야 한다.

본 발명의 특정 구체예에 있어서, 본 발명의 세포 조성물은 항바이러스제, 화학요법, 방사선, 사이클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트 및 미코페놀레이트와 같은 면역억제제 등의 약제로 치료하는 것을 포함하나 이들에만 한정되지는 않는 많은 관련 치료법과 병용하여(예를 들면, 전, 동시 또는 후에) 개체에 투여된다.

실시예 I - 간 줄기 세포의 인슐린-생성 이자 세포로의 분화

본 실시예는 인간 간 줄기 세포가 이자 β 섬-유사 세포로 분화하는 것에 대해 설명한다.

인비트론(Invitrogen)사 제품인 StemPro^®EZPassage^TM 수단을 이용하여 전 간세포의 혼합 집단으로부터 태아 줄기 세포를 기계적으로 해리하였다. 줄기 세포를 풀링하고, 콜라겐 I 코팅된 12-웰 디시상에 분배하였다. 분화 유도전에 세포를 밤새 부착되도록 하였다. 보다 구체적으로, 세포를 0.1% 콜라겐 I 코팅된 조직 배양 플레이트에 2.0-3.0x10⁶세포/플레이트의 밀도로 시딩하고, 밤새 부착되도록 하였다. 이어서, 세포를 무혈청 이소코브 변형 듈베코 배지(IMDM), 2 mmol/L 소듐 부티레이트 및 Pen/Strep으로 구성된 유도전 배지에서 2 일동안 처리하였다. 세포를 IMDM, 2% KSR 및 Pen/Strep을 함유하는 분화 배지에서 적어도 24 시간동안 배양하여 분화를 이루었다. 배지를 3 일마다 교환하고, 분화를 시간대별(즉, 1, 2 및 3 일)로 평가하였다.

분화 유도 1 또는 3 일후에 세포 용해물을 분리하였다. 이자-특이적 유전자의 발현을 스크리닝하기 위해 이들 용해물로부터 cDNA를 준비하였다. Pdx-1 및 소마토스타틴 발현을 3 일째에 검출하였다(각각 도 1의 레인 1 및 4). 쿠보타 확장 배지 단독에서 증식시킨 세포(대조군)는 Pdx-1 또는 소마토스타틴을 발현하지 않았다. 그러나, Glut-2는 발현하였으며(레인5), 이는 Glut-2가 이자 세포뿐 아니라 간 줄기 세포에서도 발현되었음을 나타내는 것이다.

실시예 II - HUMC의 인슐린-생성 이자 세포로의 분화

본 실시예는 인간 제대 기질 줄기 세포가 이자 β 섬-유사 세포로 분화하는 것에 대해 설명한다.

제대 준비:

제대의 무게를 재어 측정하고, 냉 멸균 PBS(500 mL)에서 5 분동안 2회 철저히 세척하였다. 그 다음에, 제대를 (500 mL) 베타딘 용액에서 5 분동안 1회 재세척한 다음, 냉 멸균 PBS(500 mL)에서 5 분동안 2회 철저히 헹구어 베타딘을 제거하였다. 수술용 칼을 이용하여 클램프 범위밖 ½-1 인치내에서 클램프된 제대 단부를 제거하였다. 혈액을 배액하고, 혈관을 대형 게이지 바늘 및 50 mL 주사기를 사용해서 VIASPAN^®로 플러싱하여 모든 혈액/혈전을 제거하였다.

제대 기질 세포의 분리:

제대 양 단부를 멸균 호프만(Hoffman) 클램프로 클램핑하고, 바늘/삽입관 단부 상에 3 루어락(3-way luer-lock)을 위치시켰다. 콜라게나제 용액(0.3-1%)이 들어 있는 주사기를 3 루어락에 부착하고, 용액을 제대가 적당히 팽창할 때까지 적용하였다. 이어, 제대를 습윤화된 37 ℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 콜라게나제 용액의 농도에 따라(즉, 효소액의 농도가 높으면 완전히 소화하는데 걸리는 시간이 더 짧다) 0.5 내지 3 시간동안 배양하였다. "콜라게나제 용액"은 콜라게나제(0.3-1.0%); 디스파제(0.4%-1.0%); 히알우로니다제(0.1-1.0%); DNase(0.03%) 중 하나 이상의 성분을 포함할 수 있다.

소화되면, 호프만 클램프를 제대로부터 제거하고, 용액을 멸균 용기로 배액하였다. 그 다음에, 제대에 멸균 PBS를 플러싱하여 세척을 생략하였다. 제대 단부를 호프만 클램프로 다시 클램핑하고, 히알우로니다제(0.1-1.0%)/DNase(0.3%)를 루어락을 통해 제대가 적당히 팽창될 때까지 적용하였다. 또 다시, 제대를 1 내지 12 시간동안 배양하였다. 배양 후, 제대 및 용액을 세척하여 멸균 용기에 수집하였다.

삽관법에 따른 불충분한 소화는 37 ℃, 소화 완충제중에 0.25% 히알우로니다제/0.25% 콜라게나제 I에서 4 시간 이하로 더 소화시킴으로써 해결할 수 있다. 그 다음에, 조직을 세포 해리체를 구비한 40 내지 60 메쉬의 스크린을 통해 가루로 만들었다.

이렇게 해서 얻은 세포는 CD31 세포를 발현하는 세포가 없었다. (CD-31은 보통 내피 세포, 혈소판, 대식세포 및 쿠퍼(Kupffer) 세포, 과립구, T/NK 세포, 림프구, 거대핵세포, 섬유모세포, 파골세포, 중성구 및 HUVEC 세포상에서 발현되는 마커이다). CD31 결핍 세포 현탁액에 CD44 세포를 풍부히 하였다. CD44는 히알우론산 수용체이다.

플라스틱 부착제 선택:

세포 현탁액을 플레이팅하였다. 분리하고 24 내지 48 시간후에, 비부착 세포를 멸균 PBS로 3회 세척하여 제거하였다. 신선한 DM을 첨가하고, 이틀마다 교환하였다. 배양물이 50 내지 80% 컨플루언시에 도달하면, 0.05% 트립신/0.53 mM EDTA 용액을 사용하여 세포를 수확하고, DM에서 추가 확장되도록 T75 젤라틴 코팅 배양 플라스크에 재플레이팅하였다. 배양물을 증식을 위해 5% CO₂로 조절한 37 ℃ 습윤화 인큐베이터에서 50 내지 80% 컨플루언시로 유지하였다.

분화:

유도전에, 세포를 0.1% 콜라겐 I 코팅된 조직 배양 플레이트에 2.0-3.0x10⁶세포/플레이트의 밀도로 시딩하고, 밤새 부착되도록 하였다. 이어서, 세포를 무혈청 이소코브 변형 듈베코 배지(IMDM), 2 mmol/L 소듐 부티레이트 및 Pen/Strep로 구성된 유도전 배지에서 2 일동안 처리하였다. 세포를 IMDM, 2% KSR 및 Pen/Strep을 함유하는 분화 배지에서 적어도 24 시간동안 배양하여 분화를 이루었다. 배지를 3 일마다 교환하고, 분화를 시간대별(즉, 1, 2 및 3 일)로 평가하였다.

세포 분화를 다음과 같이 평가하였다:

면역세포화학

분화된 세포를 PBS에서 4% 파라포름알데하이드로 10 분간 고정시킨 후, PBS로 세척하였다. 세포에 PBS 중 0.2% 트리톤 X-100을 5 분동안 침투화시키고, 세척한 다음, PBS 중 0.2% 트리톤 X-100, 2% 정상 혈청에서 1 시간동안 블록킹시키고, 인슐린에 대한 항체와 함께 배양하였다. PBS로 3회 세척한 후, 세포를 이차 항체와 함께 배양하였다. 도 2에서 어둡게 염색된 원형 세포가 세포내 인슐린 발현을 나타낸다. 비분화된 UCM 세포는 항인간 인슐린으로 염색되지 않는다.

RNA 분리 및 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR):

RNeasy 퀵 스핀 칼럼상에서 세포로부터 RNA를 분리하고, 랜덤 헥사머 및 SuperScript II 역전사효소를 사용하여 cDNA로 전환시켰다. PCR 산물을 2% 아가로스겔 전기이동으로 분해시키고, 에티듐 브로마이드 염색으로 가시화하였다. Pdx-1, 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, glut2 및 GADPH(cDNA 로딩 대조군)를 포함하여 다수의 이자섬 β 세포-특이적 유전자 발현을 분석하였다(도 3 참조).

인슐린의 세포 분비:

인슐린 배양 배지의 농도를 상술한 바와 같이 ELISA로 측정하였다(도 4 참조).

본 발명이 특정 구체예와 관련하여 기재되었지만, 추가 변경이 가능하고, 본 출원은 차후 임의의 변형, 사용 또는 변화를 포함하도록 의도되는 것으로 이해하여야 한다. 일반적으로, 본 발명의 개시내용에 가해진 상기 수정은 본 발명이 속하는 기술 범위내에서 공지되었거나 통상적인 실시에 속하고, 상술된 본질적인 특성에 적용될 수 있으며 청구범위 영역을 따르기 때문에, 본 발명의 원리에 포함된다.

Claims

전구 세포가 인슐린 생성 이자 세포로 분화하기에 충분한 시간동안,
(a) 전구 세포를 소듐 부티레이트를 포함하는 무혈청 유도전 배지에서 배양한 다음;
(b) 상기 전구 세포를 녹아웃(knock-out) 대체 혈청을 포함하는 유도 배지에서 배양하는 단계를 포함하는,
전구 세포를 인슐린-생성 이자 세포로 분화시키는 방법.
제 1 항에 있어서, 전구 세포가 인간 전구 세포인 방법.
제 1 항에 있어서, 전구 세포가 간 줄기 세포인 방법.
제 1 항에 있어서, 전구 세포가 제대 기질 줄기 세포인 방법.
제 1 항에 있어서, 전구 세포가 지방 줄기 세포인 방법.
제 1 항에 있어서, 유도 배지가 약 2%의 녹아웃 대체 혈청을 포함하는 방법.
전구 세포가 인슐린 생성 이자 세포로 분화하기에 충분한 시간동안,
(a) 전구 세포를 히스톤 탈아세틸라제 저해제(HDACI)를 포함하는 무혈청 유도전 배지에서 배양한 다음;
(b) 상기 전구 세포를 녹아웃 대체 혈청을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는,
전구 세포를 인슐린-생성 이자 세포로 분화시키는 방법.
제 7 항에 있어서, HDACI가 소듐 부티레이트, 페닐 부티레이트, 레티노산, 발프론산, APHA 화합물 8, 아피시딘, (-)데푸데신, 스크립타이드, 시르티놀 및 트리코스타틴인 방법.