JP6523358B2 - バイオ人工近位尿細管システム及びその使用方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2011年5月27日出願の米国特許仮出願第61/490,890号に基づく利益を主張し、当該出願の内容をその全容において援用するものである。
本発明は、一般的に、生物学的足場材、及び足場材上で腎近位尿細管細胞の単層に分化させられる1つ又は2つ以上の前駆細胞(例えば哺乳動物の腎臓由来細胞)を含むバイオ人工近位尿細管装置に関する。本発明は更に、バイオリアクター内で本装置を調製及び培養するための方法に関する。インビトロでの腎毒性又は薬学的化合物のスクリーニングにおいて本装置を使用するための方法も提供される。
図1〜6は、ヒト腎由来細胞の代謝パラメータの分析結果を示す。
この実験では、異なる形態の細胞外(すなわち脱細胞化された)マトリクス足場材、及びコラーゲンコーティングしたトランスウェル上の従来の培養へのヒト腎由来細胞(「hKDC」)の付着、増殖及び分化について試験を行う。
hKDCを、24穴プレート中、2枚のコラーゲンゲル層の間で培養した。下側のゲルは、最初に冷たいゲル中和溶液をコラーゲン(ラットの尾の腱から単離した1型コラーゲン、0.1%酢酸中、6mg/mL)と1:2の比で混合し、次いで各ウェル当たり500μLのこの溶液を加えることにより流し込んだ。この溶液を37℃/5% CO2で15分間インキュベートすることによりゲル化した。その後、細胞を各ウェル当たり1mLの培地中に播種した。24時間後、カバーゲルを流し込んだ。培地を吸引し、300μLのゲル溶液(上記のようにして調製したもの)を各ウェルにピペットで加えた。この溶液を37℃/5% CO2で15分間インキュベートすることによりゲル化した。最後に、各ウェル当たり1mLの培地を加えた。
従来の方法を用いて小腸粘膜下層(SIS)の切片を脱細胞化することにより、足場材を調製した。簡単に述べると、ブタ小腸の切片の粘膜を機械的に除去した。その後、小腸切片を3.4%のデオキシコール酸ナトリウム中、4℃で1時間、振盪しながらインキュベートすることにより脱細胞化を行った。次いで脱細胞化された切片をPBSでよく洗い、γ線照射により滅菌した。SIS単層の培養には12穴プレートを使用した。脱細胞化されたSISを円形の金属フレームに架け渡し、細胞を播種する前日に各ウェル当たり1mLの培地で覆った。架け渡したSIS表面は、24穴プレートのウェルの表面にほぼ等しい。SIS上に細胞を播種するため、細胞培地を除去し、適量の細胞を各ウェル当たり1mLの培地中に播種した。
上記に述べたのと同様にしてSIS足場材を調製し、hKDCを播種した。細胞を24時間付着させてから、コラーゲンサンドウィッチ培養と同様にして(上記を参照)カバーゲルを細胞を覆って流し込んだ。
トランスウェルを12穴プレートに移し、それぞれを200μLの1型コラーゲンでコーティングした(0.1%酢酸中、100μg/mL)。コーティング溶液を室温で20分間インキュベートしてから吸引した。適量の細胞を、各ウェル当たり1.5mLの培地中に播種した。
実施例1では、コラーゲンを含まない2次元的な脱細胞化された足場材上に播種された細胞は、コンフルエントな上皮単層を形成し、培養の3週間後に近位尿細管マーカーを発現することが示された。以下の実験を行って、細胞の播種密度を最適化し、単層の形成に要する培養期間を短縮することを試みた。
実施例1で述べたように、小腸粘膜下層(SIS)の脱細胞化された切片により足場材を調製した。継代数4のhKDCを、5×104細胞/足場材でSIS足場材上に播種し、REGM(商標)腎上皮増殖培地(ロンザ社(Lonza)、ウォーカーズビル)により3週間培養した。3週間後に各試料を組織学的分析用に取り出し、ブアン固定液で1時間固定した。この後、各試料を水で少なくとも4時間洗ってからパラフィン中に包埋した。この後、厚さ3μmの切片を調製した。免疫組織化学法(IHC)を行って、近位尿細管細胞によって発現される排出輸送体であるP糖タンパク質1(pgp−1、MDR1としても知られる)の発現を確認した。脱パラフィン化した切片の標的回復は、プロテイナーゼKにより酵素処理するか、クエン酸緩衝液(pH 6)(ダコ社(Dako)、#S2369)中で加熱するか、又はTris/EDTA緩衝液(pH 9)(ダコ社(Dako)、#S2367)中で加熱することによって行った。3%水素ペルオキシダーゼによるブロッキング工程を行って、内因性のペルオキシダーゼをブロックした。次いで、一次抗ヒトpgp−1(バイオ・ジェネックス社(Biogenex)、#AM−391−5M)を1時間インキュベートした後、ENVISION(商標)検出システムペルオキシダーゼ/DABウサギ/マウス(ダコ社(Dako)、#K5007)により検出を行った。切片をヘマトキシリンで対比染色した。
実施例1で述べたように、小腸粘膜下層(SIS)の脱細胞化された切片により足場材を調製した。継代数4のhKDCを、5×104細胞/足場材でSIS足場材上に播種し、REGM(商標)腎上皮増殖培地(ロンザ社(Lonza)、ウォーカーズビル)により3週間培養した。アルブミンの取り込みを評価するため、細胞播種した試料を最初に無血清培地(REBM基礎培地、ロンザ社(Lonza)、ウォーカーズビル)中で1時間予めインキュベートした。次いで、培地を、200μg/mLの蛍光標識ウシ血清アルブミン(BSA−FITC)(シグマ社(Sigma)、#A9771)を含んだREBM基礎培地に置き換え、30〜60分間インキュベートした。次いで、各試料をPBSで洗い、DAPI(ジアミノジノ−2−フェニルインドール)で対比染色して、蛍光顕微鏡で画像化した。
この実施例では、ローダミン、ルシファーイエロー、又はカルボキシフルオレスセインなどの蛍光色素の輸送をアッセイすることにより、有機アニオン輸送体、及び排出輸送体であるpgp−1の機能について試験を行う。細胞内への輸送は、各種の有機アニオン輸送体(OAT)によって媒介される。pgp−1輸送体がペラパミルによって阻害されると、ローダミンなどの適用された色素が細胞外に輸送されなくなり、細胞の蛍光が増大する。
上記に述べたようにしてバイオリアクターシステムを準備した。足場材を、バイオリアクター100の上部本体要素110と下部本体要素120との間に配置し、セルクラウンと同等の張力で固定した(図15を参照)。バイオリアクター内に配置された足場材上の張力は変化させることができ、細胞の単層の形成及びこれに続く分化に最も適した張力の範囲を決定するために実験を行う。足場材の一方の側にはhKDCを播種した後、(流れのない)適当な接着期間を置く。次いで、足場材の他方の側に内皮細胞を播種することができる。コントロールとして、これらの細胞型の一方のみを有するバイオリアクターも置く。次いで適当な細胞接着の時間の後、バイオリアクターの隔室を灌流する。流速を、分化及び上皮単層の形成を促進するように腎臓の条件に合わせて調節する。単層の形成及び完全性を、経上皮電気抵抗(TEER)を定期的に測定し、蛍光FITC−イヌリンの漏れを測定することによって監視する。両方の細胞型が使用される場合では、流れの条件を上皮及び内皮細胞の両方の単層が維持される適当な条件に調節する。TEER及びイヌリンの監視以外に、試料を1、2、及び3週間後に固定する。上皮の形態及び単層の形成を、ヘマトキシリン及びエオジン染色により評価する。
この実施例では、フローバイオリアクター内においてSIS足場材上に播種された場合の、近位尿細管上皮細胞へのhKDCの機能的分化を、一方の培地区画から細胞播種された膜を通過して別の培地区画へと向かうグルコース及び他の溶質の能動輸送を分析することによって実証する。
ビタミンDの活性化は、腎臓の近位尿細管細胞の固有の機能の1つである。したがって、この実施例では、不活性型の25−OH−D3前駆体をその活性型である1,25−(OH)2D3に変換する25−(OH)D3−12−ヒドロキシラーゼ酵素の活性を試験することにより、ビタミンDの活性化について試験を行う。
この実施例では、特定の腎毒性物質(例えば、シスプラチン、ビンブラスチン)又は腎保護性試薬の作用を、hKDC/SIS腎近位尿細管モデルシステムに適用する。これを行うため、hKDCを、静的及び/又はフロー条件下でSIS上に播種し、増殖させて近位尿細管上皮の単層に分化させる。次いで、異なる腎毒性物質をhKDC/SISシステムに適用し、細胞生存率、形態、及び近位尿細管の機能の評価を行う。腎機能のパラメータとしては、例えば、溶質の輸送、TEER、イヌリンの漏れ、アルブミンの取り込み、ビタミンD合成、エリスロポエチン及びプロスタグランジンの産生が挙げられる。更に、hKDC近位尿細管システムを、異なる腎保護性及び他の細胞保護性試薬の作用を検出する能力について試験する。
正常なヒト腎臓を、米国立疾患研究交流機関(National Disease Research Interchange)(NDRI、ペンシルバニア州、フィラデルフィア)より入手した。各腎臓を、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM−低グルコース、インビトロジェン社(Invitrogen)、カリフォルニア州カールスバッド)、又はリン酸緩衝溶液(PBS、インビトロジェン社(Invitrogen))中で洗浄して、血液及び組織片を除去した。組織を、腎臓の外側の皮質領域、内側の髄質領域、及び被膜下領域から切り離した。次いで組織を、微細なパルプに細片化されるまで組織培養プレート中で機械的に解離させた。次いで、組織を50mLのコニカルチューブに移した。次いで組織を、0.25単位PZ活性/mLのコラゲナーゼ(NB6、N0002779、セルバ・エレクトロフォレシス社(Serva Electrophoresis GmbH)、ドイツ、ハイデルベルグ)、2.5単位/mLのディスパーゼ(Dispase II 165 859、ロシュ・ダイアグノスティクス社(Roche Diagnositics Corporation)、インディアナ州インディアナポリス)、1単位/mLのヒアルロニダーゼ(Vitrase、アイ・エス・ティー・エー・ファーマシューティカルズ社(ISTA Pharmaceuticals)、カリフォルニア州アーバイン)を含む、優良製造所基準(Good Manufacturing Practice)(GMP)の酵素混合物、又は、500単位/mLのコラゲナーゼ(シグマ社(Sigma)、ミズーリ州セントルイス)、50単位/mLのディスパーゼ(インビトロジェン社(Invitrogen))及び5単位/mLのヒアルロニダーゼ(シグマ社(Sigma))を含む非GMPグレードの酵素混合物中で消化した。腎由来細胞を50単位/mLのディスパーゼによっても単離した。酵素混合物を、腎上皮増殖培地(REGM)(カンブレックス社(Cambrex)、メリーランド州ウォーカーズビル)、又は間葉系幹細胞増殖培地(MSCGM)(カンブレックス社(Cambrex))と合わせた。組織、培地、及び消化酵素が入ったコニカルチューブを、オービタルシェーカーで225rpmで1時間、37℃でインキュベートした。
単離7日後、腎由来細胞の集団を光学顕微鏡により評価し、細胞の形態学的特徴を観察した。いずれの単離条件も一貫して上皮の形態を有する細胞を生じた。(表11−1を参照)。
腎由来細胞は、培養中で大規模に増殖させることが可能であり、短時間で相当数の細胞を生成することが可能である。これは、同種細胞療法の開発の基準の1つである。
ヒト腎由来細胞にフローサイトメロリー分析を行って、表面マーカーの表現型を調べた。実施例11の単離番号のうちの9つからの細胞を、REGM中、T75フラスコ上で37℃、5%二酸化炭素中で継代数4及び継代数10まで増殖させた。接着細胞をPBSで洗い、TrypLE Select(ギブコ社(Gibco)、ニューヨーク州グランドアイランド)により解離させた。細胞を収穫し、遠心して、PBS中3%(v/v)のFBS中に2×105細胞/mLの濃度で再懸濁した。特異的な抗体を100μLの細胞懸濁液に加え、混合液を暗所で、4℃で30〜45分間インキュベートした。インキュベート後、細胞をPBSで洗い、遠心分離して余分な抗体を除去した。細胞を500μLのPBS中に再懸濁し、フローサイトメトリーで分析した。フローサイトメトリー分析は、Guava装置(グアバ・テクノロジーズ社(Guava Technologies)、カリフォルニア州ヘイワード)により行った。表面マーカーの表現型を特徴付けるために用いた抗体を表13−1に示す。
RNA抽出キット(RNeasy Mini Kit、キアゲン社(Qiagen)、カリフォルニア州バレンシア)を使用して、単離番号1、2及び17〜23の細胞からRNAを抽出した。RNAを50μLのDEPC処理水で溶出し、−80℃で保存した。ランダムヘキサマーをTaqMan逆転写試薬(アプライド・バイオシステムズ社(Applied Biosystems)、カリフォルニア州フォスターシティー)とともに使用し、25℃で10分間、37℃で60分間、及び95℃で10分間、RNAを逆転写した。各試料を−20℃で保存した。表14−1に示すプライマーを使用し、選択した遺伝子を従来のPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)により調べた。PCRは、RT2 PCRプライマーセット(スーパーアレイ・バイオサイエンシーズ社(SuperArray Biosciences Corp)、メリーランド州フレデリック)を使用して、cDNA試料で行った。
分析を行ったすべての細胞単離物は、一定かつ安定した遺伝子発現プロファイルを示した。単離番号1、2及び17〜23にRT−PCR分析を行って、初期発生遺伝子マーカー(Oct−4、Rex−1、Sox2、FGF4、hTert)、腎発生遺伝子マーカー(Pax−2、WT−1、Eya−1、Wnt−4、BMP−7、カドヘリン−11、FoxD1)、後腎間葉遺伝子マーカー(Pax−2、Eya−1、WT−1、Six2、及びFoxD1)、及び後腎間葉の生存を促進する遺伝子(BMP−7)の発現を検出した。更に、内胚葉遺伝子(HNF3B、CXC−R4、Sox−17、GATA−4)、及び腎修復を促進するか又は腎疾患を治療する治療効果を有する遺伝子マーカー(Epo、EpoR、BMP−7、BMP−2、GDF5)などの他の発生遺伝子の発現についても分析を行った。
腎由来細胞は、腎臓を保護及び修復する栄養因子を一貫して産生することが示されている。したがって、これらの細胞は、腎疾患を治療するための治療薬となるものと考えられうる。
単離番号17〜21で27種類の異なる増殖因子及びサイトカインの分泌について分析を行った。その結果を表15−1にまとめて示す。いずれの単離番号も、TIMP−1、TIMP−2、VEGF、及びMMP−2を、300pg(ピコグラム)/mL/1×106細胞/8時間を上回る量で分泌した。いずれの単離番号も、50〜300pg/mL/1×106細胞/8時間のFGF2及びHGF、並びに1〜50pg/mL/1×106細胞/8時間のKGF、PDGF−bb、b−NGF、IL−12p40及びIL−11を分泌した。SDF−1、ANG−2、HGH及びIl−12p70は検出されなかった。
継代数4及び継代数10の腎由来細胞を解凍してから粉砕し、66% vitrogen 100(3mg/mL(コヒージョン・テクノロジーズ社(Cohesion Technologies)、カリフォルニア州パロアルト)を含むI型コラーゲン溶液中で4×104細胞/mLの単細胞懸濁液とすることができる。懸濁液中の細胞を、脱細胞化された大網膜上に播種することができる。次いで、コラーゲン/細胞混合物を、37℃、5% CO2、95%空気中で30分間インキュベートすることによってコラーゲンをゲル化させた後、培地を加えることができる。細胞は、3日ごとに7日間供給する。7日目に、培養を異なる濃度の肝細胞増殖因子で処理し、尿細管形成が観察されるまで更に培養する。
3つの35/65 PCL/PGA(直径10cm×厚さ2mm)フィルムにヒト腎由来細胞(10,000細胞/cm2)を播種し、REGM(カンブレックス社(Cambrex))中、37℃、5%二酸化炭素中で8日間培養した。35/65 PCL/PGA発泡足場材は、本明細書にその全容を援用するところの米国特許第6,355,699号に述べられる方法に従って調製した。次いで細胞/フィルム構築体をフィルム注型皿から取り出し、3層に積層して、35/65 PCL/PGA発泡足場支持体に貼着した。この構築体を更に24時間培養した後、移植に先立って3×3mmの正方形の小片に切断した。各移植片は、PBSで洗い、移植用にPBSで満たした6穴プレートに移した。
(1) 1つ又は2つ以上の前駆細胞が、該前駆細胞の腎近位尿細管上皮細胞への分化を可能とするのに充分な条件下で播種された、脱細胞化された生物学的マトリクス足場材を含むバイオ人工近位尿細管装置であって、前記分化した細胞が前記足場材上に上皮単層を形成する、バイオ人工近位尿細管装置。
(2) 少なくとも2つの表面を有する脱細胞化された生物学的足場材を含むバイオ人工近位尿細管装置であって、少なくとも1つの表面に1つ又は2つ以上の前駆細胞が、該前駆細胞の腎近位尿細管上皮細胞への分化を可能とするのに充分な条件下で播種され、前記前駆細胞が前記足場材の前記表面に上皮単層を形成する、バイオ人工近位尿細管装置。
(3) 前記脱細胞化された生物学的マトリクス足場材が、哺乳動物組織に由来する、実施態様1又は2に記載のバイオ人工近位尿細管装置。
(4) 前記脱細胞化された生物学的マトリクス足場材が、粘膜又は粘膜下組織に由来する、実施態様3に記載のバイオ人工近位尿細管装置。
(5) 前記脱細胞化された生物学的マトリクス足場材が、哺乳動物消化管に由来する、実施態様3に記載のバイオ人工近位尿細管装置。
(7) 前記1つ又は2つ以上の前駆細胞が、初代腎尿細管上皮細胞、腎細胞若しくは腎前駆細胞に分化させた人工多能性幹細胞、腎細胞若しくは腎前駆細胞に分化させた前駆細胞、腎臓から単離した幹細胞、又は腎臓から単離した前駆細胞、及びこれらの混合物からなる群から選択される、実施態様1〜6のいずれかに記載のバイオ人工近位尿細管装置。
(8) 前記前駆細胞がヒト腎由来細胞である、実施態様7に記載のバイオ人工近位尿細管装置。
(9) 前記ヒト腎由来細胞が、培養中で自己複製及び増殖することが可能であり、Oct−4、Rex−1、Pax−2、カドヘリン−11、FoxD1、WT1、Eya1、HNF3B、CXC−R4、Sox−17、EpoR、BMP2、BMP7、又はGDF5のうちの少なくとも1つの発現について陽性であり、かつ、Sox2、FGF4、hTert、Wnt−4、SIX2、E−カドヘリン又はGATA−4のうちの少なくとも1つの発現について陰性である、実施態様8に記載のバイオ人工近位尿細管装置。
(10) 前記ヒト腎由来細胞が、細胞表面マーカーHLA−I、CD24、CD29、CD44、CD49c、CD73、CD90、CD166、又はSSEA−4のうちの少なくとも1つについて陽性であり、かつ、細胞表面マーカーHLA II、CD31、CD34、CD45、CD56、CD80、CD86、CD104、CD105、CD117、CD133、CD138、及びCD141のうちの少なくとも1つについて陰性である、実施態様8又は9に記載のバイオ人工近位尿細管装置。
(12) 前記ヒト腎由来細胞が、培養中で自己複製及び増殖することが可能であり、HLA−I、及びOct−4、Rex−1、Pax−2、カドヘリン−11、FoxD1、WT1、Eya1、HNF3B、CXC−R4、Sox−17、EpoR、BMP2、BMP7、又はGDF5のうちの少なくとも1つの発現について陽性であり、かつ、CD133、及びSox2、FGF4、hTert、Wnt−4、SIX2、E−カドヘリン又はGATA−4のうちの少なくとも1つの発現について陰性である、実施態様8に記載のバイオ人工近位尿細管装置。
(13) 1つ又は2つ以上の前駆細胞を腎細胞に分化させる方法であって、脱細胞化された生物学的マトリクス足場材に1つ又は2つ以上の前駆細胞を播種することと、前記前駆細胞を前記足場材上で、前記前駆細胞の腎近位尿細管上皮細胞への分化を可能とするのに充分な条件下で培養することとを含み、前記分化した細胞が前記足場材上に上皮単層を形成する、方法。
(14) 前記脱細胞化された生物学的マトリクス足場材が、哺乳動物組織に由来する、実施態様13に記載の方法。
(15) 前記脱細胞化された生物学的マトリクス足場材が、粘膜又は粘膜下組織に由来する、実施態様14に記載の方法。
(17) 前記1つ又は2つ以上の前駆細胞が、初代腎尿細管上皮細胞、腎細胞若しくは腎前駆細胞に分化させた人工多能性幹細胞、腎細胞若しくは腎前駆細胞に分化させた前駆細胞、腎臓から単離した幹細胞、又は腎臓から単離した前駆細胞、及びこれらの混合物からなる群から選択される、実施態様13〜16のいずれかに記載の方法。
(18) 前記前記細胞がヒト腎由来細胞である、実施態様17に記載の方法。
(19) 前記ヒト腎由来細胞が、培養中で自己複製及び増殖することが可能であり、Oct−4、Rex−1、Pax−2、カドヘリン−11、FoxD1、WT1、Eya1、HNF3B、CXC−R4、Sox−17、EpoR、BMP2、BMP7、又はGDF5のうちの少なくとも1つの発現について陽性であり、かつ、Sox2、FGF4、hTert、Wnt−4、SIX2、E−カドヘリン又はGATA−4のうちの少なくとも1つの発現について陰性である、実施態様18に記載の方法。
(20) 前記ヒト腎由来細胞が、細胞表面マーカーHLA−I、CD24、CD29、CD44、CD49c、CD73、CD90、CD166、又はSSEA−4のうちの少なくとも1つについて陽性であり、かつ、細胞表面マーカーHLA II、CD31、CD34、CD45、CD56、CD80、CD86、CD104、CD105、CD117、CD133、CD138、及びCD141のうちの少なくとも1つについて陰性である、実施態様19に記載の方法。
Claims (25)
- 哺乳動物組織に由来する脱細胞化された生物学的マトリクス足場材と、前記生物学的マトリクス足場材の表面に1つ又は2つ以上の前駆細胞を播種し、前記1つ又は2つ以上の前駆細胞を腎近位尿細管上皮細胞へと分化させることにより形成された、前記脱細胞化された生物学的マトリクス足場材上の安定な機能性腎近位尿細管上皮細胞単層と、を含むバイオ人工近位尿細管装置であって、前記脱細胞化された生物学的マトリクス足場材が、粘膜又は粘膜下組織に由来し、前記前駆細胞が、MEK阻害剤を使用することなく、接触阻害を維持し、前記1つ又は2つ以上の前駆細胞が、初代腎尿細管上皮細胞、人工多能性幹細胞、腎前駆細胞、腎臓から単離した幹細胞、又は腎臓から単離した前駆細胞、及びこれらの混合物からなる群から選択される、バイオ人工近位尿細管装置。
- 哺乳動物組織に由来する少なくとも2つの表面を有する脱細胞化された生物学的マトリクス足場材を含む、バイオ人工近位尿細管装置であって、少なくとも1つの表面が、前記少なくとも1つの表面上に形成された安定な機能性腎近位尿細管上皮細胞単層を有し、
前記脱細胞化された生物学的マトリクス足場材が、粘膜又は粘膜下組織に由来し、
前記安定な機能性腎近位尿細管上皮細胞単層が、前記少なくとも1つの表面に1つ又は2つ以上の前駆細胞を、前記生物学的マトリクス足場材の前記表面上での該前駆細胞の腎近位尿細管上皮細胞への分化を可能とするのに充分な条件下で播種することにより形成されており、
前記前駆細胞が、MEK阻害剤を使用することなく、接触阻害を維持し、
前記1つ又は2つ以上の前駆細胞が、初代腎尿細管上皮細胞、人工多能性幹細胞、腎前駆細胞、腎臓から単離した幹細胞、又は腎臓から単離した前駆細胞、及びこれらの混合物からなる群から選択される、バイオ人工近位尿細管装置。 - 前記脱細胞化された生物学的マトリクス足場材が、粘膜下組織に由来する、請求項1又は2に記載のバイオ人工近位尿細管装置。
- 前記脱細胞化された生物学的マトリクス足場材が、哺乳動物消化管に由来する、請求項1又は2に記載のバイオ人工近位尿細管装置。
- 前記脱細胞化された生物学的マトリクス足場材が、哺乳動物の胃、十二指腸、空腸、回腸又は結腸に由来する、請求項4に記載のバイオ人工近位尿細管装置。
- 前記前駆細胞がヒト腎由来細胞である、請求項1又は2に記載のバイオ人工近位尿細管装置。
- 前記ヒト腎由来細胞が、培養中で自己複製及び増殖することが可能であり、Oct−4、Rex−1、Pax−2、カドヘリン−11、FoxD1、WT1、Eya1、HNF3B、CXC−R4、Sox−17、EpoR、BMP2、BMP7、又はGDF5のうちの少なくとも1つの発現について陽性であり、かつ、Sox2、FGF4、hTert、Wnt−4、SIX2、E−カドヘリン又はGATA−4のうちの少なくとも1つの発現について陰性である、請求項6に記載のバイオ人工近位尿細管装置。
- 前記ヒト腎由来細胞が、細胞表面マーカーHLA−I、CD24、CD29、CD44、CD49c、CD73、CD90、CD166、又はSSEA−4のうちの少なくとも1つについて陽性であり、かつ、細胞表面マーカーHLA II、CD31、CD34、CD45、CD56、CD80、CD86、CD104、CD105、CD117、CD133、CD138、及びCD141のうちの少なくとも1つについて陰性である、請求項6又は7に記載のバイオ人工近位尿細管装置。
- 前記ヒト腎由来細胞が、栄養因子FGF2、HGF、TGFα、TIMP−1、TIMP−2、MMP−2又はVEGFのうちの少なくとも1つを分泌し、かつ、栄養因子PDGF−bb又はIL12p70の少なくとも一方を分泌しない、請求項6〜8のいずれか一項に記載のバイオ人工近位尿細管装置。
- 前記ヒト腎由来細胞が、培養中で自己複製及び増殖することが可能であり、HLA−I、及びOct−4、Rex−1、Pax−2、カドヘリン−11、FoxD1、WT1、Eya1、HNF3B、CXC−R4、Sox−17、EpoR、BMP2、BMP7、又はGDF5のうちの少なくとも1つの発現について陽性であり、かつ、CD133、及びSox2、FGF4、hTert、Wnt−4、SIX2、E−カドヘリン又はGATA−4のうちの少なくとも1つの発現について陰性である、請求項6に記載のバイオ人工近位尿細管装置。
- 哺乳動物組織に由来する脱細胞化された生物学的マトリクス足場材に播種された1つ又は2つ以上の前駆細胞を、前記脱細胞化された生物学的マトリクス足場材上で前記1つ又は2つ以上の前駆細胞を機能性腎近位尿細管上皮細胞単層へと分化させることを可能とするのに充分な条件下で、培養することを含む、バイオ人工近位尿細管装置を製造する方法であって、前記脱細胞化された生物学的マトリクス足場材が、粘膜又は粘膜下組織に由来し、前記前駆細胞が、MEK阻害剤を使用することなく、接触阻害を維持し、前記1つ又は2つ以上の前駆細胞が、初代腎尿細管上皮細胞、人工多能性幹細胞、腎前駆細胞、腎臓から単離した幹細胞、又は腎臓から単離した前駆細胞、及びこれらの混合物からなる群から選択される、方法。
- 前記脱細胞化された生物学的マトリクス足場材が、粘膜下組織に由来する、請求項11に記載の方法。
- 前記脱細胞化された生物学的マトリクス足場材が、前記哺乳動物の胃、十二指腸、空腸、回腸又は結腸に由来する、請求項11に記載の方法。
- 前記前駆細胞がヒト腎由来細胞である、請求項11に記載の方法。
- 前記ヒト腎由来細胞が、培養中で自己複製及び増殖することが可能であり、Oct−4、Rex−1、Pax−2、カドヘリン−11、FoxD1、WT1、Eya1、HNF3B、CXC−R4、Sox−17、EpoR、BMP2、BMP7、又はGDF5のうちの少なくとも1つの発現について陽性であり、かつ、Sox2、FGF4、hTert、Wnt−4、SIX2、E−カドヘリン又はGATA−4のうちの少なくとも1つの発現について陰性である、請求項14に記載の方法。
- 前記ヒト腎由来細胞が、細胞表面マーカーHLA−I、CD24、CD29、CD44、CD49c、CD73、CD90、CD166、又はSSEA−4のうちの少なくとも1つについて陽性であり、かつ、細胞表面マーカーHLA II、CD31、CD34、CD45、CD56、CD80、CD86、CD104、CD105、CD117、CD133、CD138、及びCD141のうちの少なくとも1つについて陰性である、請求項15に記載の方法。
- 前記ヒト腎由来細胞が、栄養因子FGF2、HGF、TGFα、TIMP−1、TIMP−2、MMP−2又はVEGFのうちの少なくとも1つを分泌し、かつ、栄養因子PDGF−bb又はIL12p70の少なくとも一方を分泌しない、請求項16に記載の方法。
- インビトロでの腎毒性又は薬学的化合物のスクリーニングのための、請求項1又は2に記載のバイオ人工近位尿細管装置。
- 前記脱細胞化された生物学的マトリクス足場材が、脱細胞化されたブタ小腸粘膜下層である、請求項1又は2に記載のバイオ人工近位尿細管装置。
- 前記方法が、5,000細胞/cm2〜70,000細胞/cm2で播種することを含む、請求項11に記載の方法。
- 前記前駆細胞が、連続的な上皮単層を形成する、請求項11に記載の方法。
- 前記前駆細胞が、張力下で分化される、請求項11に記載の方法。
- 細胞層の完全性を監視することをさらに含む、請求項11に記載の方法。
- 前記バイオ人工近位尿細管装置が、インビトロでの腎毒性又は薬学的化合物のスクリーニングのためのものである、請求項11に記載の方法。
- 前記哺乳動物組織に由来する前記脱細胞化された生物学的マトリクス足場材の表面上に播種された前記1つ又は2つ以上の前駆細胞を、前記前駆細胞を前記脱細胞化された生物学的マトリクス足場材上で前記機能性腎近位尿細管上皮細胞単層へと分化させることを可能とするのに充分な条件下で培養することを含む、請求項11に記載の方法。
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