ES2764850T3 - Sistemas de túbulos proximales bioartificiales y métodos de uso - Google Patents

Abstract

Un dispositivo de túbulo proximal bioartificial que comprende un andamiaje de matriz biológico descelularizado derivado de tejido de mamífero y sembrado con una o más células precursoras bajo condiciones suficientes para permitir la diferenciación de las células precursoras en células epiteliales de los túbulos proximales renales, en donde las células diferenciadas forman una monocapa epitelial en el andamiaje, y en donde la una o más células precursoras se seleccionan del grupo que consiste de células epiteliales de los túbulos renales primarios, células madre pluripotentes inducibles, células progenitoras renales, células progenitoras diferenciadas en células renales o células progenitoras renales, células madre aisladas del riñón o células progenitoras aisladas del riñón, y mezclas de las mismas; en donde el andamiaje de matriz biológico descelularizado se deriva de tejido mucoso o submucoso, o en donde el andamiaje de matriz biológico descelularizado se deriva de un canal alimentario de mamíferos.

Description

DESCRIPCION

Sistemas de túbulos proximales bioartificiales y métodos de uso

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere de manera general a un dispositivo de túbulos proximales bioartificial que comprende un andamiaje biológico y una o más células progenitoras (como, por ejemplo, células derivadas de riñón de mamífero) que se diferencian en una monocapa de células de los túbulos proximales renales en el andamiaje. La invención se refiere además a los métodos de preparación y cultivo del dispositivo en un biorreactor. También se proporcionan métodos de uso del dispositivo para nefrotoxicidad in vitro o detección de compuestos farmacéuticos. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La enfermedad renal crónica (ERC) y la enfermedad renal en etapa terminal (ERT) se definen por una disminución de la función renal, principalmente la tasa de filtración glomerular. Esto da como resultado una incapacidad del riñón para excretar desechos metabólicos tóxicos producidos por el cuerpo. En los Estados Unidos, la ERC se está volviendo cada vez más común y se asocia con pobres resultados de salud y altos costos médicos. La National Kidney Foundation estima que 20 millones de estadounidenses tienen ERC, y por lo menos 20 millones de personas adicionales corren el riesgo de desarrollar ERC. La ERT afecta a más de 500.000 pacientes, con una población de riesgo que tiene ERC que alcanza los 1,5 millones de pacientes. Los costos totales de ERC y ERT representan casi el 30% de los costos totales de Medicare, sin embargo, estos pacientes representan solo el 8,1% de la población total de Medicare (2008 US Renal Data Service, Informe anual 2008). La incidencia de ERT ha aumentado más del 50% en los últimos 10 años y el número de pacientes con o en riesgo de ERC está aumentando constantemente. En consecuencia, hay una gran necesidad de nuevas opciones terapéuticas para permitir la reparación de riñones dañados, así como de sistemas in vitro que puedan determinar la nefrotoxicidad de los compuestos de interés.

Muchos xenobióticos, o moléculas derivadas de su degradación, se depuran de la sangre mediante el transporte activo en el filtrado destinado para la vejiga por las células de los túbulos proximales renales del riñón. Como consecuencia de llevar a cabo esta importante función, las células de los túbulos proximales renal a menudo se dañan por el efecto tóxico de estos compuestos. Por tanto, las pruebas de nefrotoxicidad de compuestos terapéuticos potenciales en un sistema in vitro que podrían reemplazar potencialmente a las pruebas en animales han ganado un interés significativo.

Los modelos basados en cultivos celulares actuales para probar la formación y función de la monocapa epitelial de los túbulos proximales renales utilizan células primarias o se han desarrollado principalmente usando líneas celulares establecidas de varias fuentes, como por ejemplo MDCK (riñón canino Madin-Darby), LLC-PK1 (riñón porcino de cáncer de pulmón de Lewis 1), o células HK-2, que son una línea celular de riñón humano inmortalizada por transducción con genes del virus del papiloma humano 16 E6/E7. Los sistemas de ensayo que usan estas células hacen uso típicamente de filtros porosos (como, por ejemplo, los filtros TRANSWELL®), que permiten la exposición a fluidos en tanto el lado apical como el basolateral de las células, promoviendo la diferenciación epitelial.

Sin embargo, el uso de estas líneas celulares tiene varias desventajas. Muchas de estas líneas celulares se transforman o derivan de un tumor, alterando potencialmente su crecimiento, diferenciación y, en última instancia sus características funcionales. Además, muchas de estas líneas celulares no se derivan de humanos. Por lo tanto, puede haber diferencias específicas de especies en función y en las respuestas de estas células a varios compuestos. El uso de células primarias es engorroso ya que las células están típicamente recién aisladas y mínimamente expandidas antes de usarse para experimentos. El proceso de aislamiento puede ser laborioso con la contaminación de poblaciones de células no deseadas. Además, puede haber una variabilidad significativa del material fuente del donante.

Otro problema común es la duración limitada en la cual las células primarias formarán una monocapa intacta; esto limita la utilidad de las células para estudios in vitro. Las células primarias frecuentemente crecen en exceso, se separan de la superficie y forman agregados tridimensionales, requiriendo que se añadan factores adicionales, como los inhibidores de MEK para mantener la inhibición de contacto (como se divulga, por ejemplo, en la Publicación de Solicitud de Estados Unidos 2009/0209019). Los filtros porosos (como, por ejemplo, los filtros TRANSWELL®), aunque son algo eficaces, están hechos de materiales sintéticos y, por lo tanto, no representan con precisión la matriz subyacente a la que las células de los túbulos renales están típicamente expuestas in vivo.

Otros han descrito métodos alternativos para la detección que se basan en la formación de estructuras de túbulos tridimensionales aprovechando el crecimiento excesivo de células primarias mencionado anteriormente en superficies sólidas (ver la Wo 2010/064995 A1), dentro de geles 3D como, por ejemplo MATRIGEL™, o el cultivo de túbulos renales aislados de animales. Esto último es problemático debido a la laboriosa técnica de aislamiento y las diferencias de especies que deben considerarse. Otra desventaja de estas alternativas es su capacidad para evaluar solamente el transporte de compuestos xenobióticos, que se aplican a los medios de cultivo, a la luz de los túbulos renales. El efecto de tales compuestos sobre las funciones normales de los túbulos, como por ejemplo, la reabsorción de glucosa o la captación de albúmina no se pueden evaluar ya que no hay una forma fiable de introducir sustancias de prueba marcadas en la luz o tomar muestras del fluido luminal de los túbulos para el ensayo. Además, no se pueden evaluar los efectos de los cambios en el flujo y las condiciones dinámicas fisiológicas que pueden tener lugar bajo varios escenarios in vivo.

Por lo tanto, hay una necesidad en el campo de desarrollar un bioensayo que refleje mejor la fisiología normal del epitelio de los túbulos proximales renales. Esto finalmente permitirá el desarrollo de terapias nuevas y más eficaces para la enfermedad renal.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Esta solicitud abarca dispositivos de túbulos proximales bioartificiales que tienen un andamiaje de matriz biológico descelularizado en el que se forma una monocapa de células de túbulos proximales renales a partir de células precursoras (como, por ejemplo, células derivadas de riñón de mamífero (por ejemplo, humano)).

La presente invención describe un dispositivo de túbulos proximales bioartificial, construido preparando una matriz biológica descelularizada, sembrando la matriz biológica con células derivadas de riñón de mamífero y opcionalmente células endoteliales de mamífero. El dispositivo puede cultivarse luego estáticamente o madurarse usando cultivo de biorreactor para permitir la diferenciación de las células renales en células de los túbulos proximales en funcionamiento. El dispositivo resultante es capaz de llevar a cabo funciones de los túbulos proximales, por ejemplo, el transporte de moléculas de un lado de la membrana biológica a otro. La presente invención también describe varios métodos para elaborar y madurar los dispositivos de túbulos proximales bioartificiales. La presente invención también describe métodos de uso de los dispositivos de túbulos proximales bioartificiales para estudios in vitro de transporte de células de los túbulos, efectos de toxicidad de varios compuestos o detección de compuestos farmacéuticos.

En una realización, el dispositivo de túbulo proximal bioartificial comprende un andamiaje de matriz biológico descelularizado sembrado con una o más células diferenciables en células renales (por ejemplo, una célula precursora que puede diferenciarse en células renales) bajo condiciones suficientes para permitir la diferenciación de estas células en células renales de los túbulos proximales mediante lo cual las células diferenciadas forman una monocapa epitelial en el andamiaje. El dispositivo de túbulo proximal bioartificial puede comprender opcionalmente además células endoteliales vasculares.

En otra realización, el dispositivo de túbulo proximal bioartificial comprende un andamiaje biológico descelularizado que tiene por lo menos dos superficies en las que por lo menos una superficie se siembra con una o más células diferenciables en células renales (por ejemplo, una célula precursora que puede diferenciarse en una célula renal) bajo condiciones suficientes para permitir la diferenciación de las células en células epiteliales de los túbulos proximales renales, por medio de lo cual las células forman una monocapa celular en la superficie del andamiaje.

En una realización alternativa, el dispositivo proximal bioartificial comprende un andamiaje biológico descelularizado derivado de tejido de mamífero que tiene una o más superficies y una monocapa epitelial de los túbulos proximales renales en una superficie del andamiaje, en donde la monocapa epitelial se forma sembrando la superficie con una o más más células derivadas de riñón de mamífero bajo condiciones suficientes para permitir la diferenciación de las células derivadas de riñón en células de los túbulos proximales renales y la formación de la monocapa. La siembra de la superficie puede llevarse a cabo en un biorreactor. Tal biorreactor puede tener un elemento del cuerpo superior, un elemento del cuerpo inferior con un área para el crecimiento celular y uno o más conectores.

Las una o más células diferenciables en células renales (por ejemplo, células precursoras) pueden ser células epiteliales de los túbulos renales primarias, células madre pluripotentes inducibles o células progenitoras diferenciadas en células renales o células progenitoras renales, células madre aisladas del riñón o células progenitoras aisladas del riñón, y mezclas de las mismas. En una realización, la una o más células diferenciables en células renales son células derivadas de riñón de un mamífero como, por ejemplo, un humano. Estas células derivadas de riñón pueden obtenerse de la corteza renal, médula renal, región subcapsular renal y mezclas de los mismos.

En otra realización más, el dispositivo de túbulo proximal bioartificial comprende un andamiaje biológico descelularizado que tiene por lo menos dos superficies en las que por lo menos una superficie se siembra con una o más células derivadas de riñón de mamífero bajo condiciones suficientes para permitir la diferenciación de las células derivadas de riñón en células de los túbulos proximales renales, en donde las células forman una monocapa epitelial en la superficie del andamiaje. El mamífero puede ser un humano y las células pueden obtenerse de la corteza renal, la médula renal o la región subcapsular renal.

El andamiaje de matriz biológico descelularizado se deriva del tejido de mamíferos. El andamiaje se deriva de tejido de mamífero como, por ejemplo, tejido porcino. Por ejemplo, el andamiaje puede derivarse del estómago, el duodeno, el yeyuno, el íleon o el colon de un mamífero. En una realización de la invención, el andamiaje se deriva de la submucosa del intestino delgado. En otra realización, la matriz biológica descelularizada puede derivarse de tejido mucoso o submucoso.

En una realización de la invención, las células derivadas de riñón son capaces de autorrenovarse y expandirse en cultivo, son positivas para la expresión de uno o más de Oct-4, Pax-2 y Rex-1 y negativas para la expresión de uno o más de Sox2, FGF4, hTert y Wnt-4. En otra realización, las células derivadas de riñón son capaces de autorrenovarse y expandirse en cultivo, son positivas para la expresión de uno o más de Oct-4 y Pax-2 y negativas para la expresión de uno o más de Sox2, FGF4, hTert y Wnt-4.

En otra realización, las células derivadas de riñón son capaces de autorrenovarse y expandirse en cultivo, son positivas para la expresión de por lo menos uno de Eyal, Pax-2, WT1, FoxD1, BMP7, BMP2, GDF5, EpoR o Rex-1, y negativas para la expresión de por lo menos uno de Sox2, FGF4, hTert o Wnt-4. En ciertas realizaciones, las células derivadas de riñón también pueden ser positivas para por lo menos uno de los marcadores de superficie celular HLA I, CD24, CD29, CD44, CD49c, CD73, CD90, ^c D166 o SSEA-4, y negativas para por lo menos uno de los marcadores de superficie celular HLA II, CD31, CD34, CD45, CD56, CD80, CD86, CD104, CD105, CD117, CD133, CD138, CD141 o E-cadherina.

En algunas realizaciones, una segunda superficie del andamiaje puede sembrarse con células endoteliales vasculares de mamífero. Por ejemplo, las células endoteliales vasculares pueden ser líneas de células endoteliales, células progenitoras endoteliales, células endoteliales primarias, células endoteliales microvasculares y mezclas de las mismas.

Una realización alternativa de la invención es un dispositivo de túbulo proximal bioartificial que comprende un andamiaje de matriz biológico descelularizado sembrado con una o más células precursoras (es decir, células precursoras que pueden diferenciarse en células renales) bajo condiciones suficientes para permitir la diferenciación de la célula precursora en células epiteliales de los túbulos proximales renales, en donde las células diferenciadas forman una monocapa epitelial en el andamiaje. El andamiaje de matriz biológico descelularizado puede derivarse de tejido de mamífero (por ejemplo, tejido porcino) como, por ejemplo, tejido mucoso o submucoso. En una realización, el andamiaje de matriz biológico descelularizado se deriva de un canal alimentario de mamífero. En otra realización, el andamiaje de matriz biológico descelularizado se deriva (por ejemplo, se obtiene) del estómago, duodeno, yeyuno, íleon o colon de un mamífero. La una o más células precursoras se seleccionan del grupo que consiste de células epiteliales de los túbulos renales primarios, células madre pluripotentes inducibles diferenciadas en células renales o células progenitoras renales, células progenitoras diferenciadas en células renales o células progenitoras renales, células madre aisladas del riñón o células progenitoras aisladas del riñón y mezclas de las mismas. En una realización, las células progenitoras son células derivadas de riñón humano. En una realización, las células derivadas de riñón humano son capaces de autorrenovarse y expandirse en cultivo y son positivas para la expresión de por lo menos uno de Oct-4, Rex-1, Pax-2, Cadherina-11, FoxD1, WT1, Eya1, HNF3B, CXC-R4, Sox-17, EpoR, BMP2, BMP7 o GDF5; y negativas para la expresión de por lo menos uno de Sox2, FGF4, hTert, Wnt-4, SIX2, E-cadherina o GATA-4. Opcionalmente, estas células también son positivas para por lo menos uno de los marcadores de la superficie celular HLA-I, CD24, CD29, CD44, CD49c, CD73, Cd90, c D166 o SSEA-4; y negativas para por lo menos uno de los marcadores de la superficie celular HLA II, CD31, CD34, CD45, CD56, ^c D80, CD86, CD104, CD105, CD117, CD133, CD138 y CD141. Además, las células opcionalmente secretan además por lo menos uno de los factores tróficos FGF2, HGF, TGFa, TIMP-1, TIMP-2, MMP-2 o VEGF; y no secretan por lo menos uno de los factores tróficos PDGF-bb o IL12p70.

Otra realización alternativa más de la invención es un dispositivo de túbulo proximal bioartificial que comprende un andamiaje biológico descelularizado que tiene por lo menos dos superficies en las que por lo menos una superficie se siembra con una o más células precursoras (es decir, células precursoras que pueden diferenciarse en células renales) bajo condiciones suficientes para permitir la diferenciación de las células en células epiteliales de los túbulos proximales renales, en donde las células forman una monocapa epitelial en la superficie del andamiaje. El andamiaje de matriz biológico descelularizado se deriva del tejido de mamíferos (por ejemplo, tejido porcino). En una realización, el andamiaje de matriz biológico descelularizado se deriva de tejido mucoso o submucoso. Alternativamente, el andamiaje de matriz biológico descelularizado se deriva de un canal alimentario de mamíferos. En otra realización, el andamiaje de matriz biológico descelularizado se deriva (por ejemplo, se obtiene) del estómago, duodeno, yeyuno, íleon o colon de un mamífero. La una o más células precursoras se seleccionan del grupo que consiste de células epiteliales de los túbulos renales primarios, células madre pluripotentes inducibles diferenciadas en células renales o células progenitoras renales, células progenitoras diferenciadas en células renales o células progenitoras renales, células madre aisladas del riñón o células progenitoras aisladas del riñón, y mezclas de las mismas. En una realización, las células progenitoras son células derivadas de riñón humano. En una realización, las células derivadas de riñón humano son capaces de autorrenovarse y expandirse en cultivo y son positivas para la expresión de por lo menos uno de Oct-4, Rex-1, Pax-2, Cadherina-11, FoxDI, WT1, Eyal, HNF3B, CXC-R4, Sox-17, EpoR, BMP2, BMP7 o GDF5; y negativas para la expresión de por lo menos uno de Sox2, FGF4, hTert, Wnt-4, SIX2, E-cadherina o GATA-4. Opcionalmente, estas células también son positivas para por lo menos uno de los marcadores de la superficie celular HLA-I, CD24, CD29, CD44, CD49c, CD73, CD90, CD166 o SSEA-4; y negativas para por lo menos uno de los marcadores de la superficie celular HLA II, CD31, CD34, CD45, CD56, CD80, C^d86, CD104, CD105, CD117, CD133, CD138 y CD141. Adicionalmente, las células opcionalmente secretan además por lo menos uno de los factores tróficos FGF2, HGF, TGFa, TIMP-1, TIMP-2, Mm P-2 o VEGF; y no secretan por lo menos uno de los factores tróficos PDGF-bb o IL12p70. En otra realización, la segunda superficie del andamiaje se siembra con células endoteliales vasculares de mamífero. Estas células endoteliales vasculares pueden seleccionarse de líneas celulares endoteliales, células progenitoras endoteliales, células endoteliales primarias o células endoteliales microvasculares.

Otra realización más de la invención es un método para usar los dispositivos de túbulos proximales. Por consiguiente, una realización es un método para diferenciar una o más células precursoras en células renales que comprende sembrar un andamiaje de matriz biológico descelularizado (es decir, células precursoras que pueden diferenciarse en células renales) con una o más células precursoras y cultivar las células en el andamiaje bajo condiciones suficientes para permitir la diferenciación de la célula precursora en células epiteliales de los túbulos proximales renales, en donde las células diferenciadas forman una monocapa epitelial en el andamiaje. El andamiaje de matriz biológico descelularizado puede tener dos superficies. En una realización, el andamiaje de matriz biológico descelularizado se deriva de tejido de mamífero (por ejemplo, porcino). Por consiguiente, el andamiaje de matriz biológico descelularizado puede derivarse (por ejemplo, obtenerse) de tejido mucoso o submucoso. En otra realización, el andamiaje de matriz biológico descelularizado se deriva del estómago, el duodeno, el yeyuno, el íleon o el colon de un mamífero. Los métodos pueden utilizar la una o más células precursoras seleccionadas del grupo que consiste de células epiteliales de los túbulos renales primarios, células madre pluripotentes inducibles diferenciadas en células renales o células progenitoras renales, células progenitoras diferenciadas en células renales o células progenitoras renales, células madre aisladas del riñón o células progenitoras aisladas del riñón, y mezclas de las mismas. En una realización, las células progenitoras utilizadas en los métodos son células derivadas de riñón humano.

En una realización, las células derivadas de riñón humano usadas en los métodos son capaces de autorrenovarse y expandirse en cultivo y son positivas para la expresión de por lo menos uno de Oct-4, Rex-1, Pax-2, Cadherina-11, FoxD1, WT1, Eyal, HNF3B, CXC-R4, Sox-17, EpoR, BMP2, BMP7 o GDF5; y negativas para la expresión de por lo menos uno de Sox2, FGF4, hTert, Wnt-4, SIX2, E-cadherina o GATA-4. En otra realización, estas células también son positivas para por lo menos uno de los marcadores de la superficie celular HLA-I, CD24, CD29, CD44, CD49c, CD73, CD90, CD166 o SSEA-4; y negativas para por lo menos uno de los marcadores de la superficie celular HLA II, CD31, CD34, CD45, CD56, CD80, CD86, CD104, CD105, CD117, CD133, CD138 y CD141. En otra realización, las células secretan por lo menos uno de los factores tróficos FGF2, HGF, TGFa, TIMP-1, TIMP-2, MMP-2 o VEGF; u no secretan por lo menos un de los factores tróficos PDGF-bb o IL12p70.

Otra realización de la invención es un método para diferenciar una o más células diferenciables en células renales en células epiteliales de los túbulos proximales renales bajo condiciones suficientes para permitir la diferenciación, por medio de lo cual las células diferenciadas forman una monocapa epitelial y por medio de lo cual se aplica tensión a las células. El método puede comprender además el paso de sembrar las células en un andamiaje descelularizado antes de diferenciar las células. Cuando el método comprende este paso, el método puede usarse para producir un dispositivo bioartificial de la invención. El andamiaje de matriz biológico descelularizado puede derivarse de tejido de mamíferos (como por ejemplo porcino) como el tejido mucoso o submucoso. En una realización, el andamiaje de matriz biológico descelularizado se deriva de un canal alimentario de mamífero. En otra realización, el andamiaje de matriz biológico descelularizado se deriva del estómago, el duodeno, el yeyuno, el íleon o el colon de un mamífero. La una o más células diferenciables en células renales se selecciona del grupo que consiste de células epiteliales de túbulos renales primarios, células madre pluripotentes inducibles o células progenitoras diferenciadas en células renales o células progenitoras renales, células madre aisladas del riñón o células progenitoras aisladas del riñón y mezclas de las mismas. En una realización, la una o más células diferenciables en células renales son células derivadas de riñón de mamífero (como por ejemplo, células derivadas de riñón humano). Las células derivadas de riñón de mamífero pueden obtenerse de la corteza renal, médula renal, región subcapsular renal y mezclas de las mismas. En una realización, las células derivadas de riñón son capaces de autorrenovarse y expandirse en cultivo, son positivas para la expresión de uno o más de Oct-4, Pax-2 y Rex-1 y negativas para la expresión de uno o más de Sox2, FGF4, hTert y Wnt-4. En una realización alternativa, las células derivadas de riñón son capaces de autorrenovarse y expandirse en cultivo, son positivas para la expresión de por lo menos uno de Eyal, Pax2, WT1, FoxD1, BMP7, BMP2, GDF5, EpoR o Rex-1, y negativas para la expresión de por lo menos uno de Sox2, FGF4, hTert o Wnt-4. En otra realización más, las células derivadas de riñón también son positivas para por lo menos uno de los marcadores de superficie celular HLA I, CD24, CD29, CD44, CD49c, CD73, CD166 o SSEA-4, y negativas para por lo menos uno de los marcadores de superficie celular HLA II, CD31, CD34, CD45, CD56, CD80, CD86, CD104, CD105, CD117, CD133, CD138, CD141 o E-cadherina BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

El resumen anterior, así como la siguiente descripción detallada de la invención, se entenderán mejor cuando se lean junto con las figuras adjuntas. Con el propósito de ilustrar la invención, las figuras demuestran realizaciones de la presente invención. Sin embargo, debe entenderse que la invención no se limita a las disposiciones, ejemplos e instrumentos precisos mostrados.

Las Figuras 1 a 6 muestran los resultados del análisis de los parámetros metabólicos para células derivadas de riñón humano. La Figura 1A muestra la liberación de lactato en cultivos celulares derivados de riñón humano ("cultivos SW") en función del tiempo. La Figura 1B muestra el consumo de glucosa en cultivos SW en función del tiempo. La Figura 2A muestra la liberación de LDH en cultivos SW en función del tiempo. La Figura 2B muestra la liberación de lactato en cultivos celulares de células derivadas de riñón humano sembradas en submucosa del intestino delgado (SIS) descelularizada ("cultivos SIS-SW") en función del tiempo. La Figura 3A muestra el consumo de glucosa en cultivos SIS-SW en función del tiempo. La Figura 3B muestra la liberación de LDH en cultivos SIS-SW en función del tiempo. La Figura 4A muestra la liberación de lactato en monocapas cultivadas a partir de células derivadas de riñón humano que se sembraron en submucosa del intestino delgado (SIS) descelularizada ("cultivos SIS-ML") en función del tiempo. La Figura 4B muestra el consumo de glucosa en cultivos SIS-ML en función del tiempo. La Figura 5A muestra la liberación de LDL en cultivos SIS-ML en función del tiempo. La Figura 5B muestra la liberación de lactato en cultivos ML en función del tiempo. La Figura 6A muestra el consumo de glucosa en cultivos ML en función del tiempo. La Figura 6B muestra la liberación de LDH en cultivos ML en función del tiempo. En las Figuras 1 a 6, n = 3.

La Figura 7 y la Figura 8 muestran la tinción histológica de células derivadas de riñón humano (hKDC) en andamiajes de matriz extracelulares (es decir, descelularizados). Se sembraron células derivadas de riñón humano en tres configuraciones de andamiaje diferentes a una concentración de 2,5 x 103 células/andamiaje y se cultivaron durante tres semanas. Luego se fijaron las muestras y los cortes se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E).La Figura 7A muestra la tinción histológica del cultivo intercalado de colágeno. La Figura 7B muestra la tinción histológica del cultivo intercalado de submucosa de intestino delgado descelularizado (SIS) descelularizado de colágeno. La Figura 8A muestra la tinción histológica de cultivo monocapa SIS descelularizado. La Figura 8B muestra la tinción histológica del cultivo transwell recubierto con colágeno. La Figura 9 muestra la detección inmunohistoquímica de Acuaporina-1 por hKDC sembrados en andamiajes de matriz extracelulares (descelularizados). Se sembraron células de riñón derivadas de humano sobre andamiajes SIS descelularizados y se les permitió unirse durante la noche. Las muestras se cultivaron durante tres semanas, luego se fijaron. Posteriormente, se usaron cortes de 3 gm de grosor para inmunohistoquímica (IHC) con un anticuerpo Acuaporina-1 antihumano (Abcam, Cambridge). Las flechas indican áreas de tinción apical de las células.

La Figura 10 muestra la tinción histológica de hKDC sembradas en andamiajes descelularizados. Se sembraron células derivadas de riñón humano sobre andamiajes SIS descelularizados a dos concentraciones celulares diferentes y se cultivaron durante tres semanas, luego se fijaron. Posteriormente, se tiñeron cortes de 3 gm de grosor con hematoxilina y eosina (H&E).La Figura 10A muestra la tinción H&E de una muestra sembrada con 1 x 104 células. La Figura 10B muestra la tinción H&E de una muestra sembrada con 5 x 104 células.

La Figura 11 muestra la tinción de lectina de cultivos de hKDC de tres semanas sembrados sobre andamiajes descelularizados. Se sembraron células derivadas de riñón humano sobre andamiajes SIS descelularizados y se cultivaron durante tres semanas, luego se fijaron. Posteriormente, se tiñeron cortes de 3 gm de espesor con lectina de Lotus tetragonobulus (Figura 11A) y aglutinina de Dolichos biflorus (Figura 11B). Las flechas y líneas en la Figura 11A indican áreas de tinción positiva.

La Figura 12 muestra la tinción con colágeno IV de hKDC sembradas en andamiajes descelularizados. Se sembraron células derivadas de riñón humano sobre andamiajes SIS descelularizados, se cultivaron durante tres semanas y luego se fijaron. Posteriormente, se tiñeron cortes de 3 gm de grosor con anticuerpo anti­ colágeno IV.

La Figura 13 muestra la tinción con Pgp-1 de hKDC sembradas en andamiajes descelularizados. Se sembraron células derivadas de riñón humano sobre andamiajes SIS descelularizados y se cultivaron durante tres semanas, luego se fijaron. Posteriormente, se tiñeron cortes de 3 gm de grosor con anticuerpo P-glicoproteína-1 anantihumano.

La Figura 14 muestra la captación de albúmina de suero bovino marcada con fluorescencia (BSA-FITC) por hKDC sembradas en andamiajes descelularizados. Se sembraron células derivadas de riñón humano sobre andamiajes SIS descelularizados, se cultivaron durante dos semanas y luego se cultivaron en presencia de BSA-FITC durante 1 hora. Posteriormente, las células se contratiñeron con DAPI (diamidino-2-fenilindol) y se obtuvieron imágenes.

La Figura 15 es un esquema de un biorreactor para el cultivo celular que muestra los componentes del reactor principales.

La Figura 16 muestra una vista detallada del elemento del cuerpo inferior del biorreactor.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

A lo largo de la especificación y las reivindicaciones se usan varios términos relacionados con el dispositivo, métodos de uso del dispositivo y otros aspectos de la invención. A tales términos se les da su significado ordinario en la técnica a menos que se indique lo contrario. Otros términos específicamente definidos deben interpretarse en un asunto consistente con la definición proporcionada en la presente.

Esta invención se basa en el descubrimiento de que las células precursoras que pueden diferenciarse en células renales (células diferenciables en células renales) (por ejemplo, células derivadas del riñón), cuando se siembran en un andamiaje de matriz biológico descelularizado bajo condiciones que permiten la diferenciación, forman una monocapa epitelial de los túbulos proximales renales sobre la superficie del andamiaje.

Debe entenderse que esta invención no se limita a los métodos, reactivos, compuestos, composiciones o sistemas biológicos particulares, que pueden, por supuesto, variar. También debe entenderse que la terminología usada en la presente solamente tiene el propósito de describir realizaciones particulares, y no se pretende que sea limitativa. Como se usa en esta especificación y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno" y "el" incluyen referencias plurales a menos que el contenido indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "una célula" incluye una combinación de dos o más células, y similares.

Como se usa en la presente, el término "aproximadamente" cuando se refiere a un valor medible como una cantidad, una duración temporal y similares, se pretende que abarque variaciones del ±20% o ±10%, más preferiblemente del ±5%, incluso más preferiblemente del ±1%, y todavía más preferiblemente del ±0,1% del valor especificado, ya que tales variaciones son apropiadas para realizar los métodos divulgados.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la técnica a la que pertenece la invención. Aunque en la puesta en práctica para probar la presente invención puede usarse cualquier método y material similares o equivalentes a los descritos en la presente, en la presente los materiales y métodos preferidos se describen. Al describir y reivindicar la presente invención, se usará la siguiente terminología.

La "diferenciación" es el proceso mediante el cual una célula no especializada ("no comprometida") o menos especializada adquiere las características de una célula especializada, como una célula renal, por ejemplo. Una "célula diferenciada o inducida por diferenciación" es aquella que ha tomado una posición más especializada ("comprometida") dentro del linaje de una célula. El término "comprometido", cuando se aplica al proceso de diferenciación, se refiere a una célula que ha procedido en la vía de diferenciación hasta un punto en el que, bajo circunstancias normales, continuará diferenciándose en un tipo de célula específico o subconjunto de tipos de células, y no puede, bajo circunstancias normales, diferenciarse en un tipo celular diferente o volver a un tipo celular menos diferenciado. "Desdiferenciación" se refiere al proceso mediante el cual una célula vuelve a una posición menos especializada (o comprometida) dentro del linaje de una célula. Como se usa en la presente, el "linaje" de una célula define la herencia de la célula, es decir, de qué células proviene y a qué células puede dar lugar. El linaje de una célula coloca a la célula dentro de un esquema hereditario de desarrollo y diferenciación. Un "marcador específico de linaje" se refiere a una característica específicamente asociada con el fenotipo de células de un linaje de interés y puede usarse para evaluar la diferenciación de una célula no comprometida con el linaje de interés.

En un sentido amplio, una "célula progenitora" es una célula que tiene la capacidad de crear una progenie que está más diferenciada que ella misma y que todavía conserva la capacidad de reponer el grupo de progenitores. Según esa definición, las células madre también son en sí mismas células progenitoras, ya que son los precursores más inmediatos de las células diferenciadas terminalmente. Cuando se hace referencia a las células divulgadas en la presente, puede usarse esta definición amplia de "célula progenitora". Una célula diferenciada puede derivarse de una célula multipotente que a su vez se deriva de una célula multipotente, y así sucesivamente. Aunque cada una de estas células multipotentes puede considerarse células madre, el intervalo de tipos de células a las que puede dar lugar puede variar considerablemente. Algunas células diferenciadas también tienen la capacidad de dar lugar a células de mayor potencial de desarrollo. Dicha capacidad puede ser natural o puede ser inducida artificialmente tras el tratamiento con varios factores. La "proliferación" indica un aumento en el número de células.

Las "células progenitoras renales", como se usan en la presente, son células derivadas de riñón de mamífero (por ejemplo, humano) que pueden dar lugar a células como adipocitos u osteoblastos, o pueden dar lugar a uno o más tipos de tejido, por ejemplo, tejido renal, además de producir células hijas de potencial equivalente. Una "célula progenitora del riñón o renal" es una célula multipotente o pluripotente que se origina sustancialmente del tejido renal adulto o fetal. Se ha descubierto que estas células poseen rasgos y características de las células madre pluripotentes, incluyendo la proliferación rápida y el potencial de diferenciación en otros linajes celulares. Las células progenitoras renales "multipotentes" pueden dar lugar a múltiples linajes celulares, por ejemplo, linajes de células renales, linajes de adipocitos o linajes de osteoblastos. Las células progenitoras del riñón demuestran un perfil de expresión génica para marcadores genéticos de desarrollo temprano, marcadores genéticos de desarrollo renal, marcadores genéticos mesenquimatosos metanefricos, y genes que promueven la supervivencia del mesénquima metanefrico. Por ejemplo, las células progenitoras renales (por ejemplo, células derivadas de riñón humano) demuestran un perfil de expresión génica que es positivo para la expresión de genes que incluyen, pero no están limitados a, Oct-4, Pax-2 y Rex-1, y negativo para la expresión de genes que incluyen, pero no están limitados a, Sox2, FGF4, hTERT y Wnt-4.

Tejido "se refiere a un grupo o capa de células especializadas de manera similar, que juntas realizan ciertas funciones especiales." Órgano "se refiere a dos o más capas de tejido adyacentes, cuyas capas de tejido mantienen alguna forma interacción de célula-célula y/o célula-matriz para formar una microarquitectura.

"Riñón" se refiere a uno de un par de órganos en el abdomen. Los riñones eliminan los desechos de la sangre (como orina), producen eritropoyetina para estimular la producción de glóbulos rojos y desempeñan un papel en la regulación de la presión sanguínea. Los riñones funcionan para mantener el equilibrio adecuado de agua y electrolitos, regular la concentración ácido-base, y filtrar la sangre de los desechos metabólicos, que luego se excretan como orina.

"Cultivo primario" se refiere a una población celular mixta de células que permite la interacción de muchos tipos de células diferentes aisladas de un tejido. La palabra "primario" toma su significado habitual en el técnica del cultivo de tejidos. "Capaz de autorrenovación y expansión en cultivo" se refiere a poblaciones de células derivadas de riñón de mamíferos que crecen y se dividen en cultivo celular y mantienen sustancialmente el mismo fenotipo medido por los marcadores celulares y la secreción de factores tróficos de célula madre a célula hija. En algún punto temporal durante la replicación de la población de células derivadas de riñón de mamíferos, el fenotipo puede cambiar a un estado más especializado o diferenciado de la célula derivada de riñón.

Se usan varios términos para describir las células en cultivo. "Cultivo celular" se refiere generalmente a células tomadas de un organismo vivo y cultivadas bajo condiciones controladas, por ejemplo, "en cultivo". Un "cultivo celular primario" es un cultivo de células, tejidos u órganos tomados directamente de organismos y antes del primer subcultivo. Las células se "expanden" en cultivo cuando se colocan en un medio de crecimiento bajo condiciones que facilitan el crecimiento y/o la división celular, dando como resultado una población más grande de células. Cuando las células se expanden en cultivo, la tasa de proliferación celular se mide a veces por la cantidad de tiempo necesaria para que las células se dupliquen en número. Esto es referido como "tiempo de duplicación".

Una "línea celular" es una población de células formadas por una o más subcultivos de un cultivo celular primario. Cada ronda de subcultivo es referida como un pase. Cuando las células se subcultivan, se hace referencia a ellas como que han sido "pasadas". A veces se hace referencia o se caracteriza a una población específica de células, o una línea celular, por la cantidad de veces que se han pasado. Por ejemplo, una población de células cultivadas que se ha pasado diez veces puede ser referida como cultivo "P10". El cultivo primario, es decir, el primer cultivo que sigue al aislamiento de las células del tejido se designa P0. Después del primer subcultivo, las células se describen como un cultivo secundario (PI o pase 1). Después del segundo subcultivo, las células se convierten en un cultivo terciario (P2 o pase 2), y así sucesivamente. Los expertos en la técnica entenderán que puede haber muchas duplicaciones de población durante el período de pase; por lo tanto, el número de duplicaciones de población de un cultivo suele ser mayor que el número de pases. La expansión de las células (es decir, el número de duplicaciones de población) durante el período entre pases depende de muchos factores, incluyendo, pero no limitados a la densidad de sembrado, el sustrato, el medio y el tiempo entre pases.

Generalmente, un "factor trófico" se define como una sustancia que promueve la supervivencia, el crecimiento, la proliferación, la maduración, la diferenciación y/o el mantenimiento de una célula, o estimula la actividad aumentada de una célula. El "soporte trófico" se usa en la presente para referirse a la capacidad de promover la supervivencia, el crecimiento, la proliferación, la maduración, la diferenciación y/o el mantenimiento de una célula, o para estimular la actividad aumentada de una célula. La población celular derivada de riñón de mamífero de la presente invención produce factores tróficos, que incluyen, pero no están limitados a, factores de crecimiento, citoquinas y factores de diferenciación. Los factores tróficos incluyen, pero no están limitados a, FGF2, HGF, TGFa, TIMP-1, TIMP-2, VEGF, MMP-2, o una combinación de los mismos.

"No inmunogénico" se refiere a células o una población celular que no provoca una respuesta inmune perjudicial en una mayoría de sujetos mamíferos tratados, es decir, una respuesta inmune que compromete la salud del sujeto mamífero o que interfiere con una respuesta terapéutica en el sujeto mamífero tratado.

"Gen" se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un producto génico. El gen comprende opcionalmente información de secuencia requerida para la expresión del gen (por ejemplo, promotores, potenciadores, etc.). El término "genómico" se refiere al genoma de un organismo.

Los "datos de expresión génica" se refieren a uno o más conjuntos de datos que contienen información referente a diferentes aspectos de la expresión génica. El conjunto de datos incluye opcionalmente información referente a: la presencia de transcritos objetivo en células o muestras derivadas de células; los niveles de abundancia relativa y absoluta de los transcritos objetivo; la capacidad de varios tratamientos para inducir la expresión de genes específicos; y la capacidad de varios tratamientos para cambiar la expresión de genes específicos a diferentes niveles.

"Perfil de expresión génica" se refiere a una representación del nivel de expresión de una pluralidad de genes sin (es decir, valor de referencia o control), o en respuesta a una condición de expresión seleccionada (por ejemplo, incubación de la presencia de un compuesto estándar o compuesto de prueba en uno o varios puntos temporales). La expresión génica puede expresarse en términos de una cantidad absoluta de ARNm transcrito para cada gen, como una relación de ARNm transcrito en una célula de prueba en comparación con una célula de control, y similares. También se refiere a la expresión de un gen individual y de conjuntos de genes individuales en un sujeto.

"Aislado" o "purificado" se refiere a alterado "por la mano del hombre" a partir del estado natural, es decir, todo lo que tiene lugar en la naturaleza se define como aislado cuando se ha retirado de su entorno original, o ambos. "Aislado" también define una composición, por ejemplo, una población de células derivadas de riñón de mamífero, que está separada de los contaminantes (es decir, sustancias que difieren de la célula). En un aspecto, una población o composición de células está sustancialmente libre de células y materiales con los que puede estar asociada en la naturaleza. "Aislado" o "purificado" o "sustancialmente puro", con respecto a las células derivadas de riñón de mamífero, se refiere a una población de células derivadas de riñón de mamífero que es por lo menos aproximadamente un 50%, por lo menos aproximadamente un 75%, preferiblemente por lo menos aproximadamente un 85%, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 90%, y lo más preferible por lo menos aproximadamente un 95% puro, con respecto a las células derivadas de riñón de mamífero que constituyen una población celular total. Reformulado, el término "sustancialmente puro" se refiere a una población de células derivadas de riñón de mamífero de la presente invención que contienen menos de aproximadamente el 50%, preferiblemente menos de aproximadamente el 30%, preferiblemente menos de aproximadamente el 20%, más preferiblemente menos de aproximadamente el 10%, lo más preferible menos de aproximadamente el 5%, de las células renales comprometidas del linaje en la población original no amplificada y aislada antes del cultivo y la amplificación posteriores. La pureza de una población o composición de células puede evaluarse mediante métodos apropiados que son bien conocidos en la técnica.

Como se usa en la presente, el término "derivado" también significará obtenido. Así, por ejemplo, las células derivadas de riñón humano son células que se aislaron y se obtuvieron de tejido de riñón humano. El término también abarca células que se obtuvieron (por ejemplo, se aislaron) de un tejido y luego se cultivaron posteriormente.

La invención divulga un dispositivo de túbulo proximal que comprende un andamiaje biológico descelularizado y una monocapa epitelial de células de los túbulos proximales renal formada a partir de células que son diferenciables en células renales. El andamiaje y las células juntas crean un dispositivo de túbulo proximal bidimensional de múltiples componentes. Esta monocapa epitelial de células de los túbulos proximales renales está compuesta por células de los túbulos proximales que funcionan.

Los dispositivos de túbulos proximales de la invención promueven óptimamente el funcionamiento de los mecanismos reguladores naturales de la inhibición de contacto y la formación de una monocapa intacta sin el uso de inhibidores como, por ejemplo, inhibidores de MEK. Mediante el uso del andamiaje biológico descelularizado, los dispositivos de túbulos proximales de la invención también representan y/o imitan ventajosamente la matriz subyacente a la que las células renales están típicamente expuestas in vivo. Óptimamente, la siembra sobre un andamiaje descelularizado natural permite a las células diferenciarse y formar monocapas epiteliales, que son más estables que las producidas mediante métodos tradicionales.

La presente invención describe un dispositivo de túbulo proximal bidimensional que puede usarse como un sistema de prueba in vitro para estudios de transporte, detección de toxicidad renal o para la detección de los efectos de agentes terapéuticos. En una realización, el dispositivo de túbulo proximal renal bioartificial bidimensional se construye sembrando un andamiaje biológico descelularizado con células progenitoras del riñón y, opcionalmente, en algunos casos también células endoteliales microvasculares, seguido de cultivo estático o cultivo en un biorreactor para permitir la diferenciación de las células renales en células de los túbulos proximales en funcionamiento y manteniendo el dispositivo ensamblado para pruebas in vitro. Estas células de los túbulos proximales en funcionamiento forman una monocapa en la superficie del andamiaje.

La presente invención también describe el uso de andamiajes biológicos descelularizados como un componente del dispositivo de túbulo proximal bioartificial descrito. Una o más de las superficies del andamiaje biológico descelularizado pueden sembrarse con células. En una realización, el andamiaje descelularizado puede derivarse de cualquier tejido de mamífero, preferiblemente porciones del canal alimentario, más preferiblemente el estómago, el duodeno, el yeyuno, el íleon o el colon. En una realización, el tejido del que se deriva el andamiaje es lo más preferible una porción del yeyuno. En una realización, el andamiaje biológico descelularizado se deriva de tejido mucoso o submucoso. En otra realización, el andamiaje biológico descelularizado se deriva de la submucosa del intestino delgado de mamífero. Los andamiajes descelularizados, o porciones de los mismos, pueden asegurarse a dispositivos que permiten la siembra de cada lado de la superficie del andamiaje.

El tejido fuente usado para crear los andamiajes descelularizados puede ser cualquier tejido de mamífero, incluyendo pero no limitado a, tejido humano, de primate, bovino, ovino, porcino o de rata. En una realización de la invención, el tejido se aísla del mamífero. En otra realización, los andamiajes descelularizados se derivan de cultivos celulares de mamífero. En otra realización, el tejido fuente es tejido porcino. En realizaciones preferidas, los andamiajes se derivan de tejidos porcinos aislados de animales más jóvenes, como por ejemplo. animales más jóvenes de menos de 6 meses o animales de menos de 3 meses. En realizaciones más preferidas, los andamiajes se derivan de tejidos porcinos aislados de animales más jóvenes de aproximadamente 10 a 25 kg de peso, alternativamente de aproximadamente 10 a 20 kg de peso, y alternativamente de aproximadamente 15 a aproximadamente 20 kg de peso. En una realización más preferida, los andamiajes se derivan de tejidos porcinos aislados de animales de aproximadamente 10 a aproximadamente 15 kg de peso.

Pueden usarse métodos convencionales para realizar la acelularización (por ejemplo, descelularización) del tejido. En una realización, las estructuras mucosas del tejido aislado se conservan durante el aislamiento. En una realización preferida, las estructuras mucosas se eliminan posteriormente parcial o totalmente para exponer la capa de submucosa para la unión celular. En una realización de la invención, las células progenitoras renales se cultivan en estructuras mucosas. Se observó que un porcentaje más alto de células progenitoras renales adoptan una morfología epitelial cuando se cultivan en las estructuras submucosas en comparación con las estructuras mucosas. Por consiguiente, en una realización alternativa, las células progenitoras renales se cultivan óptimamente en estructuras submucosas.

Como se usa en la presente, el término "células diferenciables en células renales" significará una célula precursora que se diferencia en células renales, por ejemplo, cualquier célula progenitora, precursora o primaria que pueda diferenciarse en una célula renal. En una realización, las células pueden seleccionarse de células epiteliales de los túbulos renales primarios, células progenitoras (por ejemplo, células madre) diferenciadas en células renales o células progenitoras renales (como, por ejemplo, células madre pluripotentes inducibles), células derivadas de riñón humano, células madre aisladas del riñón o células progenitoras aisladas del riñón, y mezclas de las mismas. Puede usarse cualquier célula progenitora (por ejemplo, células madre) que pueden diferenciarse en células renales o células progenitoras renales incluyendo, pero no limitadas a, por ejemplo, células madre embrionarias, células iPS, células derivadas del cordón umbilical, células derivadas de la placenta o células madre mesenquimatosas.

En una realización de la invención, las células diferenciables son células derivadas de riñón de mamífero. Por consiguiente, una realización de la invención es el uso de células derivadas de riñón de mamífero, aisladas del riñón de mamífero (como, por ejemplo, un riñón humano), como un componente del sistema renal bioartificial descrito. Se ha demostrado anteriormente, como se describe en la Publicación de Solicitud de Estados Unidos 2008/0112939 de Colter et al., que las células progenitoras pueden derivarse del tejido de riñón humano y que estas células derivadas de riñón pueden autoorganizarse en la estructura del túbulo y pueden usarse para tratar un riñón enfermo.

Las técnicas ejemplares usadas para aislar, cultivar y caracterizar las células derivadas de riñón de mamífero se describen en la Publicación de Solicitud de Estados Unidos 2008/0112939 de Colter et al. Como se describe en la Publicación de Solicitud de Estados Unidos 2008/0112939, las células derivadas de riñón humano se aíslan de un riñón humano y son adecuadas para el trasplante de órganos. En una realización, la sangre y los desechos se eliminan del tejido renal antes del aislamiento de las células mediante lavado con cualquier medio o tampón adecuado como solución salina tamponada con fosfato. Las células derivadas de riñón, como por ejemplo, las células derivadas de riñón humano se aíslan luego del tejido renal de mamífero mediante digestión enzimática. Las enzimas se usan para disociar las células del tejido renal de mamífero (por ejemplo, humano). En una realización, puede usarse dispasa. Alternativamente, pueden usarse combinaciones de una proteasa neutra (por ejemplo, dispasa), metaloproteasa (por ejemplo, colagenasa) e hialuronidasa para disociar las células del tejido renal de mamífero (por ejemplo, humano). Luego, las células aisladas se transfieren a recipientes de cultivo de tejidos estériles que inicialmente están recubiertos con gelatina. Las células derivadas de riñón de mamífero (por ejemplo, humano) se cultivan en cualquier medio de cultivo capaz de sostener el crecimiento de las células, como por ejemplo, pero no limitado a, medio de crecimiento epitelial renal REGM™ (Lonza, Walkersville, MD) o ADVANCED™ DMEM/F12 (Invitrogen).

Las células diferenciables en células renales (por ejemplo, células precursoras que pueden diferenciarse en células renales) o las células derivadas de riñón de mamífero pueden ser una población de células. En una realización, se usa una población de células derivadas de riñón humano. En otra realización, la población es homogénea. En otra realización, la población es sustancialmente homogénea.

En algunas realizaciones, las células derivadas de riñón pueden obtenerse de la corteza renal, la médula renal o la región subcapsular renal y mezclas de las mismas.

Las células derivadas de riñón de mamífero (por ejemplo, humano) se caracterizan por características fenotípicas, por ejemplo, morfología, potencial de crecimiento, fenotipo de marcador de superficie, expresión génica de desarrollo temprano, expresión génica de desarrollo renal y secreción de factor trófico. El marcador de superficie, la expresión génica y el fenotipo de secreción del factor trófico se retienen después de múltiples pases de la población de células derivadas de riñón humano en cultivo.

En realizaciones preferidas, las células derivadas de riñón de mamífero aisladas (es decir, las poblaciones celulares) son capaces de autorrenovarse y expandirse en cultivo y muestran un perfil de expresión único, como cualquiera de los descritos a continuación.

En otra realización de la invención, las células derivadas de riñón humano son positivas para la expresión de por lo menos uno de Oct-4, Rex-1, Pax-2, Cadherina-11, FoxD1, WT1, Eyal, HNF3B, CXC-R4, Sox-17, EpoR, BMP2, BMP7 o GDF5. En otra realización más, las células son negativas para la expresión de por lo menos uno de Sox2, FGF4, hTert, Wnt-4, SIX2 o GATA-4. En una realización alternativa, las células son positivas para la expresión de por lo menos uno de Oct-4, Rex-1, Pax-2, Cadherina-11, FoxD1, w T1, Eyal, HNF3B, CXC-R4, Sox-17, EpoR, BMP2, BMP7 o GDF5 y negativas para la expresión de por lo menos uno de Sox2, FGF4, hTert, Wnt-4, SIX2 o GATA-4. En una realización alternativa, la célula es positiva para la expresión de por lo menos uno de Eyal, WT1, FoxD1, BMP7, BMP2, GDF5, EpoR o Rex-1. En otra realización alternativa más, las células son negativas para la expresión de por lo menos uno de Sox2, FGF4, hTert o Wnt-4. En una realización alternativa, las células son positivas para la expresión de por lo menos uno de Eyal, WT1, FoxD1, BMP7, BMP2, GDF5, EpoR o Rex-1, y negativas para la expresión de por lo menos uno de Sox2, FGF4, hTert o Wnt -4. En una realización de la invención, las células derivadas de riñón humano también son positivas para por lo menos uno de los marcadores de superficie celular HLA I, CD24, CD29, CD44, CD49c, CD73, CD166 o SSEA-4. En otra realización, las células derivadas de riñón humano también son negativas para por lo menos uno de los marcadores de superficie celular HLA II, CD31, CD34, CD45, CD56, CD80, CD86, CD104, CD105, CD117, CD133, CD138, CD141 o E-cadherina. En una realización alternativa, las células derivadas de riñón humano también son positivas para por lo menos uno de los marcadores de superficie celular HLA I, CD24, CD29, CD44, CD49c, CD73, CD166, o SSeA-4, y negativas para por lo menos uno de los marcadores de superficie celular H^lA II, CD31, CD34, CD45, CD56, CD80, CD86, CD104, CD105, CD117, CD133, CD138, CD141 o E-cadherina. En una realización, las células derivadas de riñón humano pueden secretar por lo menos uno de los factores tróficos FGF2, HGF, TGFa, TIMP-1, TIMP-2, MMP-2 o VEGF. En una realización preferida, las células no secretan por lo menos uno de los factores tróficos PDGFbb e IL12p70.

En una realización alternativa, las células progenitoras usadas con el dispositivo de túbulo proximal bioartificial son células derivadas de riñón humano. Estas células derivadas de riñón humano son capaces de autorrenovarse y expandirse en cultivo y son positivas para la expresión de por lo menos uno de Oct-4, Rex-1, Pax-2, Cadherina-11, FoxD1, WT1, Eyal, HNF3B, CXC-R4, Sox-17, EpoR, BMP2, BMP7 o GDF5; y negativas para la expresión de por lo menos uno de Sox2, FGF4, hTert, Wnt-4, SIX2, E-cadherina o GATA-4. Además, las células derivadas de riñón humano también pueden ser positivas para por lo menos uno de los marcadores de la superficie celular HLA-I, CD24, CD29, CD44, CD49c, CD73, CD90, CD166 o SSEA-4; y negativas para por lo menos uno de los marcadores de la superficie celular HLA II, CD31, CD34, CD45, CD56, CD80, CD86, CD104, CD105, CD117, CD133, CD138 y CD141. Adicionalmente, estas células opcionalmente secretan por lo menos uno de los factores tróficos FGF2, HGF, TGFa, TIMP-1, TIMP-2, MMP-2 o VEGF; y no secretan por lo menos uno de los factores tróficos PDGF-bb o IL12p70.

En otra realización más, las células derivadas de riñón humano son (1) positivas para la expresión de Oct-4, Rex-1, Pax-2, Cadherina-11, FoxD1, WT1, Eyal, HNF3B, CXC-R4, Sox-17, EpoR, ^bM^p2, BMP7 y GDF5 y (2) negativas para la expresión de por lo menos uno de Sox2, FGF4, hTert, SIX2 y Gata-4. En una realización alternativa, las células derivadas de riñón son (1) positivas para la expresión de Oct-4, Rex-1, Pax-2, Cadherina-11, FoxD1, WT1, Eyal, HNF3B, CXC-R4, Sox-17, EpoR, BMP2, BMP7 y Gd F5; (2) negativas para la expresión de por lo menos uno de Sox2, FGF4, hTert, SIX2 y Gata-4; (3) positivas para los marcadores de superficie celular HLA I, CD24, CD29, CD44, CD49c, CD73, CD166 y SSEA-4; y (4) negativas para HLA II, CD31, CD34, CD45, CD56, CD80, CD86, CD90, CD104, CD105, CD117, CD133, CD138, CD141 y E-cadherina.

En otra realización, las células derivadas de riñón humano son capaces de autorrenovarse y expandirse en cultivo, positivas para la expresión de los marcadores de superficie celular HLA I y CD44, positivas para la expresión génica de Oct-4, Pax-2 y WT1, negativas para la expresión del marcador de superficie celular de CD133 y la expresión génica de Wtn-4. En una realización, las células derivadas de riñón humano son adicionalmente positivas para la expresión génica de BMP7, BMP2, GDF4, EpoR y Rex-1, y negativas para la expresión génica de Sox2, FGF4 y hTert.

En una realización alternativa, las células derivadas de riñón humano son: (1) capaces de autorrenovación y expandirse en cultivo; (2) positivas para la expresión de HLA-I y por lo menos uno de Oct-4, Rex-1, Pax-2, Cadherina-11, FoxD1, WT1, Eyal, HNF3B, CXC-R4, Sox-17, EpoR, b Mp2, BMP7 o GDF5; y (3) negativas para la expresión de CD133 y por lo menos uno de SOX2, FGF4, hTert, Wnt-4, SIX2 , E-cadherina o Ga Ta -4. Estas células pueden ser además (4) positivas para por lo menos uno de los marcadores de superficie celular CD24, CD29, CD44, CD49c, CD73, CD90, CD166 o SSEA-A y (5) negativas para por lo menos uno de los marcadores de superficie celular HLA II, CD31, CD34, CD45, CD56, CD80, CD86, CD104, CD105, CD117, CD133, CD138, CD141 y E-cadherina. Estas células también pueden secretar por lo menos uno de los factores tróficos FGF2, HGF, TGFa, TIMP-1, TIMP-2, MMP-2 o VEGF y carecen de secreción de por lo menos uno de los factores tróficos PDGFbb o IL12p70. En una realización alternativa, las células derivadas de riñón humano son una población.

Las células derivadas de riñón de mamífero (por ejemplo, humano) se pasan a un recipiente de cultivo separado que contiene medio fresco del mismo tipo o uno diferente al que se usó inicialmente, donde la población de células puede expandirse mitóticamente. Las células derivadas de riñón de mamífero (por ejemplo, humano) se siembran luego en la matriz biológica y se cultivan para permitir la diferenciación de las células derivadas de riñón en células de los túbulos proximales en funcionamiento. Las células de la invención pueden usarse en cualquier punto entre el pase cero y la senescencia. Las células se pasan preferiblemente entre aproximadamente 3 y aproximadamente 20 veces, entre aproximadamente 5 y aproximadamente 10 veces, entre aproximadamente 15 y 20 veces, entre aproximadamente 5 y aproximadamente 7 veces, y más preferiblemente entre aproximadamente 3 y aproximadamente 7 veces.

En una realización de la invención, dos o más superficies del andamiaje biológico descelularizado se siembran con células. En una realización, las células endoteliales vasculares se siembran en una superficie del andamiaje, y la otra superficie se siembra luego con células derivadas de riñón de mamífero. El andamiaje sembrado se cultiva luego para permitir la diferenciación de las células derivadas del riñón en células de los túbulos proximales en funcionamiento y la formación de una monocapa endotelial vascular en la superficie opuesta.

En una realización, las células endoteliales vasculares humanas usadas para la repoblación del andamiaje pueden seleccionarse de líneas celulares endoteliales, células progenitoras endoteliales de la médula ósea o la sangre completa, o células endoteliales o endoteliales microvasculares primarias. Las células endoteliales vasculares usadas se aíslan usando métodos convencionales. En una realización preferida, las células usadas para la repoblación del andamiaje son células endoteliales microvasculares primarias. En una realización, las células endoteliales vasculares usadas pueden aislarse de cualquier fuente de mamífero. En una realización preferida, las células endoteliales vasculares aisladas son de origen humano. En una realización preferida alternativa, las células endoteliales vasculares son células endoteliales microvasculares primarias aisladas de un riñón de mamífero (humano).

Otra realización de la invención es un aparato para elaborar los dispositivos de túbulos proximales.

En una realización, la siembra de los andamiajes descelularizados se logra usando un aparato especialmente diseñado ("corona") en el que se inserta una pieza del andamiaje descelularizado de tal manera que sus bordes se coloquen entre dos piezas de metal o plástico, sellando eficazmente los bordes para crear un pocillo superior e inferior separados por el andamiaje. La corona también introduce algo de estiramiento y tensión en el andamiaje descelularizado. Luego, las células se siembran en el pocillo superior y se deja que se depositen sobre el andamiaje descelularizado. La corona también se puede voltear para permitir la siembra del otro lado del andamiaje, o la corona y se desmonta, el andamiaje se voltea y se vuelve a montar en la corona para sembrar la superficie opuesta. Las células renales pueden sembrarse sobre los andamiajes a una densidad que varía de aproximadamente 500 células/cm2 a aproximadamente 350.000 células/cm2, alternativamente de aproximadamente 1.000 células/cm2 a aproximadamente 100.000 células/cm2, alternativamente de aproximadamente 750 células/cm2 a aproximadamente 75.000 células/cm2, alternativamente de aproximadamente 10.000 células/cm2 a aproximadamente 300.000 células/cm2, alternativamente de aproximadamente 7.500 células/cm2 a aproximadamente 200.000 células/cm2 y preferiblemente de aproximadamente 5.000 células/cm2 a aproximadamente 70.000 células/cm2.

El andamiaje sembrado de células con el aparato se cultiva usando técnicas convencionales para permitir la diferenciación de las células renales y la formación de una monocapa epitelial continua. El tiempo de cultivo puede ser de 1 a 6 semanas de cultivo, preferiblemente de 2 a 4 semanas de cultivo, lo más preferiblemente de 3 a 4 semanas. El dispositivo de túbulo proximal maduro resultante puede usarse para estudios de transporte renal, pruebas de nefrotoxicidad, o pruebas de agentes terapéuticos usando métodos convencionales.

En otra realización, el cultivo de células en el andamiaje sembrado, así como el sistema de prueba in vitro, se logra colocando los andamiajes en un biorreactor diseñado a medida de tal manera que el andamiaje crea una barrera entre dos compartimentos. La cámara del biorreactor está conectada a un sistema de flujo de fluido diseñado para permitir el flujo de fluido a través de ambas superficies del andamiaje. Alterando las características del sistema de flujo, como los caudales, pueden establecerse condiciones mecánicas de fluido específicas para cada lado del andamiaje, dependiendo del tipo de célula sembrada, por ejemplo, para apoyar la funcionalidad de las células endoteliales en el lado basolateral. Los andamiajes pueden sembrarse previamente con células antes de colocarlos en el biorreactor, o colocarlos en el biorreactor seguido de la siembra de células dentro del biorreactor. En otro aspecto, el biorreactor está diseñado de tal manera que la tensión aplicada al constructo desceluralizado colocado dentro del biorreactor puede alterarse como sea necesario para facilitar la siembra y/o la diferenciación de las células.

En una realización, el andamiaje descelularizado se siembra con células usando el aparato descrito para sembrar las células renales y, opcionalmente, células endoteliales. Los andamiajes sembrados con células se retiran luego del aparato y se transfieren a la cámara del biorreactor para cultivo o evaluaciones, como se describe a continuación en los ejemplos. Los andamiajes sembrados con células pueden cultivarse primero dentro del aparato durante un período de aproximadamente 0 a 4 semanas antes de transferirlos a la cámara del biorreactor. Las células renales pueden sembrarse sobren los andamiajes a una densidad que varía de aproximadamente 500 células/cm2 a aproximadamente 350.000 células/cm2, preferiblemente de aproximadamente 5000 células/cm2 a aproximadamente 70.000 células/cm2. Las condiciones de cultivo, incluyendo la duración de la incubación en el aparato, pueden variar dependiendo de la fuente de la célula y el medio de cultivo.

En otra realización, los andamiajes descelularizados se colocan primero dentro de una cámara del biorreactor, y luego se siembran los andamiajes perfundiendo una suspensión celular en la cámara del biorreactor e incubando durante un período de tiempo para permitir la unión celular al andamiaje descelularizado. Tal biorreactor comprende un elemento del cuerpo superior y un elemento del cuerpo inferior que tiene un área designada para el crecimiento del andamiaje.

Un biorreactor ejemplar adecuado para su uso en la presente invención se muestra en la Figura 15. Con referencia a la Figura 15, los componentes del biorreactor 100 son los elementos del cuerpo principal, el elemento del cuerpo superior 110 y el elemento del cuerpo inferior 120, dos clips, el clip frontal 130 y el clip posterior 160, las tapas de cierre exteriores, la tapa de cierre exterior inferior 140 y la tapa de cierre exterior superior 150 y los conectores 170. El elemento del cuerpo superior del reactor principal 110 y el elemento del cuerpo inferior 120 del biorreactor 100 se mantienen unidos por el clip frontal 130 y el clip posterior 160. La tapa de cierre exterior superior 150 está en la parte superior del elemento de cuerpo superior 110. La tapa del cierre inferior exterior 140 está debajo del elemento inferior del cuerpo 120. La Figura 16 es una vista del elemento del cuerpo inferior 120 del biorreactor que muestra la ranura 180 cuya profundidad puede alterarse junto con un marco en el elemento del cuerpo superior para ajustar la tensión sobre el andamiaje descelularizado. El elemento del cuerpo inferior 120 también contiene el área para el crecimiento celular 190.

En una realización, el andamiaje no sembrado puede colocarse entre el elemento del cuerpo superior 110 y el elemento del cuerpo inferior 120 del biorreactor 100 (ver Figura 15). Una construcción de marco circular, que se acordona en el elemento del cuerpo superior 110 con una estructura de ranura correspondiente en el elemento del cuerpo inferior 120, permite la fijación del andamiaje comparable a las coronas de las células. La tensión puede ajustarse usando combinaciones de marco/ranura diseñadas específicamente, que difieren en profundidad de la ranura y la anchura del puente del marco. La distancia a la que el marco puede moverse dentro de la ranura 180 (ver la Figura 16), determina la tensión del andamiaje, con una distancia más larga llevando a una tensión más alta. Deben considerarse factores como el diámetro del andamiaje y el grosor del andamiaje. Después de la colocación del andamiaje, el clip frontal 130 y el clip posterior 160 del biorreactor mantienen el elemento del cuerpo superior 110 y el elemento del cuerpo inferior 120 juntos y el constructo puede manejarse como una corona de células. La tapa de cierre exterior inferior 140 y la tapa de cierre exterior superior permiten el cierre del sistema y se puede introducir una suspensión celular a un lado del andamiaje a través de los conectores 170 del biorreactor. Las células crecen en el área de crecimiento celular 190. Después de un período de tiempo específico de la célula, en el que las células sembradas pueden adherirse, el biorreactor cerrado se puede voltear y se puede sembrar un segundo tipo de célula o el mismo tipo de célula en el otro lado del andamiaje. En una realización, las suspensiones celulares usadas para la siembra pueden variar de aproximadamente 103 células/ml a aproximadamente 107 células/ml. Para evitar una pérdida de viabilidad de las células sembradas en el primer lado, el compartimento del primer lado puede llenarse con medio. Si se requieren condiciones estáticas, el compartimento puede llenarse con medio de cultivo celular. Alternativamente, puede iniciarse la perfusión de medios bajo varias condiciones de flujo usando los conectores 170.

Después de la adhesión de las células al andamiaje, las células pueden cultivarse estáticamente simplemente inundando los compartimentos de la cámara con medio y cerrando los conectores del biorreactor. Alternativamente, se conectan los tubos de un sistema de flujo al biorreactor y se puede iniciar la perfusión. Las células sembradas en andamiajes descelularizados dentro de las cámaras del biorreactor se cultivan para permitir el crecimiento y la diferenciación de las células en una monocapa funcional de células tubulares renales. El cultivo de las células puede incluir cultivo estático, o más preferiblemente cultivo bajo condiciones dinámicas como flujo lineal o flujo pulsátil. Los caudales, la presión y las condiciones pulsátiles pueden variarse para facilitar el crecimiento y la diferenciación de las células en células renales funcionales. El caudal de flujo medio de los medios dentro del biorreactor puede variar de 1 a 25 ml/min. alternativamente de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 ml/min, alternativamente de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 10 m/min, alternativamente de aproximadamente 5 a 20 ml/min. En una realización preferida, el caudal medio puede variar de aproximadamente 2,5 a 15 ml/min. El período de cultivo puede variar de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 semanas, alternativamente de aproximadamente 1 a aproximadamente 2 semanas, alternativamente de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 semanas, alternativamente de aproximadamente 2 a aproximadamente 4 semanas. En una realización preferida, el período de cultivo puede variar preferiblemente de aproximadamente 2 a 3 semanas. Durante este tiempo, la integridad de la capa celular puede monitorizarse usando técnicas bien conocidas en la técnica. En una realización, la integridad de la capa celular puede monitorizarse midiendo la resistencia eléctrica trans-epitelial usando electrodos integrados en cada compartimento del biorreactor o midiendo la pérdida a través de la monocapa de varias moléculas marcadas fluorescentemente, como por ejemplo, inulina o creatinina. En otra realización, se usan diferentes medios de cultivo celular en cada cámara. En otra realización más, pueden usarse diferentes caudales, presión y condiciones pulsátiles en cada cámara para permitir el cultivo específico de células a través de índices de flujo de esfuerzo de cizallamiento. Una descripción del biorreactor también se puede encontrar en la Solicitud de Patente N2 DE 102008056037.5-41 y EP 2184344.

Otra realización de la invención es un método para diferenciar las células diferenciables en células renales (como, por ejemplo, las células derivadas de riñón de mamífero (humano)) en una monocapa estable de células de los túbulos proximales renales diferenciando las células bajo tensión. Este método puede comprender además el uso de los andamiajes de la invención para producir dispositivos de túbulos proximales de la invención.

Los dispositivos de túbulos proximales de la invención pueden usarse como sistemas de prueba in vitro para la detección de toxicidad renal o para la selección de agentes terapéuticos. En otra realización, los dispositivos pueden usarse para monitorizar la función de las células de los túbulos, como el transporte, durante o después de la exposición a un compuesto o partícula. Pueden usarse diferentes formulaciones de medios para el flujo sobre cada superficie, permitiendo estudiar el transporte a través de las capas de células y andamiajes desde un compartimento de medios a otro. Un ejemplo de tales formulaciones de medios sería hacer fluir un medio de células endoteliales en el compartimiento que tenía los mvEC sembrados en él, y hacer fluir una formulación de medios que imita el filtrado glomerular en el compartimiento opuesto que contiene la monocapa tubular renal.

Las funciones de transporte de la monocapa tubular renal pueden evaluarse usando técnicas estándar y moléculas marcadas conocidas por los expertos en la técnica. La detección de toxicidad puede lograrse añadiendo compuestos o partículas de interés a la ruta de flujo del compartimento vascular que proporciona nutrientes y contacta con las células endoteliales, o mediante la introducción de compuestos o partículas en la ruta de flujo del compartimento del túbulo que proporciona nutrientes y contacta con las células tubulares renales, imitando la aparición de compuestos xenobióticos tóxicos en la sangre y la orina, respectivamente. El transporte de compuestos o partículas puede monitorizarse analizando el medio de una o ambas rutas de flujo. Además, la toxicidad puede monitorizarse analizando la viabilidad celular, la morfología o el efecto sobre las funciones de transporte después de la exposición a los compuestos de interés. Los ensayos usados para la evaluación de la toxicidad o los efectos terapéuticos de los compuestos o partículas no están limitados a los descritos anteriormente.

Los objetivos terapéuticos pueden analizarse dañando primero las células derivadas de riñón del dispositivo bioartificial, luego tratando las células con la partícula terapéutica de prueba. La lesión puede introducirse por medios físicos o químicos, como por ejemplo exponiendo las células a compuestos o partículas tóxicas, como por ejemplo cisplatino o estreptozotocina. Los compuestos o partículas terapéuticos de prueba pueden ponerse en contacto con las células mediante la adición a la ruta de flujo del compartimento vascular del dispositivo, por ejemplo, en una concentración que imitaría las concentraciones a las que las células estarían expuestas después de la administración intravenosa (IV) del agente terapéutico. Luego puede usarse la monitorización de la función de las células tubulares renales para determinar el grado de efectividad de los compuestos terapéuticos de prueba aplicados.

La monitorización de la función tubular incluye, pero no está limitada a, detectar o evaluar la captación de un compuesto o partícula por las células tubulares renales, el transporte de un compuesto o partícula captada por las células desde un compartimento de medios de los dispositivos de los túbulos proximales al otro, el efecto de los inhibidores sobre la captación o el transporte, y los cambios en la expresión, la morfología, la expresión de marcadores de superficie, la actividad enzimática o la supervivencia de los genes o las células de los túbulos renales. Los ensayos usados para la evaluación de la toxicidad o los efectos terapéuticos de compuestos o partículas no están limitados a los descritos anteriormente.

Otra realización de la invención son los kits que comprenden los dispositivos de túbulos proximales bioartificiales de la invención. En una realización, el kit comprende el dispositivo de túbulo bioartificial y un inserto de producto.

Una realización alternativa de la invención es una composición que comprende los dispositivos de túbulos proximales bioartificiales de la invención. En una realización, la composición comprende un dispositivo de túbulo proximal bioartificial de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable.

Sin una descripción adicional, se cree que un experto en la técnica puede, usando la descripción precedente y los siguientes ejemplos ilustrativos, elaborar y utilizar la presente invención y poner en práctica los métodos reivindicados. Los siguientes ejemplos de trabajo, por lo tanto, señalan específicamente las realizaciones preferidas de la presente invención, y no deben interpretarse de ninguna manera como limitativos del resto de la divulgación. Además, como se usa en los siguientes ejemplos y en otras partes de la especificación, las células derivadas de riñón ("hKDC") útiles en los dispositivos y métodos de la invención pueden aislarse y caracterizarse de acuerdo con la divulgación de la Publicación de Patente de los Estados Unidos N° 2008/0112939, en lo que se refiere a la descripción, aislamiento y caracterización de hKDC.

Ejemplos

Ejemplo 1: Siembra y diferenciación de hKDC en andamiajes de matriz extracelular

Este experimento prueba la unión, el crecimiento y la diferenciación de células derivadas de riñón humano ("hKDC") sobre varias configuraciones de andamiajes de matriz extracelular (es decir, descelularizados), así como al cultivo tradicional en transwells recubiertos de colágeno.

Se sembraron hKDC en el pase 4 en tres configuraciones de andamiajes diferentes y en transwells (Corning, Corning NY). Las células se cultivaron durante un período de tiempo de tres semanas con medio de crecimiento epitelial renal REGM™ (Lonza, Walkersville MD). Cada configuración de andamiaje se probó con tres concentraciones celulares diferentes: 2,5 x 103, 5 x 103 y 1x104 células. Las configuraciones probadas fueron: 1) cultivo intercalado de colágeno; 2) cultivo intercalado de colágeno-SIS; 3) cultivo monocapa SIS; y 4) transwells recubiertos de colágeno.

Cultivos intercalados de colágeno

Se cultivaron hKDC entre dos capas de gel de colágeno en placas de 24 pocillos. Los geles inferiores se moldearon mezclando primero una solución de neutralización de gel frío con colágeno (tipo 1 aislado de tendones de cola de rata, 6 mg/ml en ácido acético al 0,1%) a una proporción de 1:2 y luego añadiendo 500 pl de esta solución por pocillo. La solución se gelificó por incubación a 37° C/5% de CO2 durante 15 minutos. Posteriormente, las células se sembraron en 1 ml de medio por pocillo. Después de 24 horas, se fundieron los geles de cubierta. El medio se aspiró y se pipetearon 300 pl de solución de gel (preparada como antes) en cada pocillo. La solución se gelificó por incubación durante 15 minutos a 37° C/5% de CO2. Finalmente, se añadió 1 ml de medio por pocillo.

Cultivos de monocapa de submucosa del intestino delgado (SIS)

Se prepararon andamiajes descelularizando segmentos de la submucosa del intestino delgado (SIS) usando métodos convencionales. Brevemente, se eliminó mecánicamente la mucosa de segmentos de intestino delgado porcino. Posteriormente, se realizó la descelularización incubando los segmentos intestinales en desoxicolato de sodio al 3,4% durante 1 hora a 4 grados Celsius con agitación. Los segmentos descelularizados se enjuagaron luego extensivamente con PBS y se esterilizaron por irradiación gamma. Se usaron placas de 12 pocillos para los cultivos de monocapa SIS. El SIS descelularizado se extendió sobre marcos metálicos redondos y se cubrió con 1 ml de medio por pocillo el día antes de sembrar las células. La superficie abarcada con SIS es aproximadamente equivalente a la superficie de un pocillo en una placa de 24 pocillos. Para sembrar las células sobre el SIS, se retiró el medio de cultivo celular y se sembró la cantidad apropiada de células en 1 ml de medio por pocillo.

Cultivos intercalados con SIS

Se prepararon andamiajes de SIS y se sembraron con hKDC como se ha descrito anteriormente. Después de permitir que las células se unieran durante 24 horas, se echó un gel de cobertura sobre las células como en los cultivos intercalados de colágeno (ver arriba).

Cultivos Transwell

Los transwell se transfirieron a placas de 12 pocillos y se recubrieron, cada una con 200 pl de colágeno tipo 1 (100 pg/ml en ácido acético al 0,1%). La solución de recubrimiento se incubó durante 20 minutos a temperatura ambiente y luego se aspiró. La cantidad apropiada de células se sembró en 1,5 ml de medio por pocillo.

Se cultivaron múltiples muestras durante tres semanas en cada una de las condiciones anteriores. Las muestras se retiraron para el análisis histológico después de una, dos y tres semanas. Además, las muestras de medios se analizaron con un analizador clínico RANDOX RX DAYTONA™ para seguir los parámetros metabólicos: concentración de glucosa, lactato y lactato deshidrogenasa. Las muestras tomadas para el análisis histológico se fijaron con el fijador de Bouin durante 1 hora. Luego se lavaron en agua durante por lo menos 4 horas y se incrustaron en parafina. Posteriormente, se prepararon cortes de 3 pm de espesor. Los cortes se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E) para evaluar la morfología celular. Además, se realizó inmunohistoquímica (IHC) para caracterizar la diferenciación de las células usando los siguientes anticuerpos: Anti-hPAX2, Anti-hAQP1, Anti-Ki67, Anti hE-cadherina y Anti-hN-cadherina (ver la Tabla 1 a continuación). Para la inmunohistoquímica, se desparafinaron secciones transversales de 3 pm. La recuperación del objetivo se logró o mediante tratamiento enzimático con proteinasa K o calentando en tampón citrato pH 6 (Dako, N° S2369) o tampón de Tris/EDTA pH9 (Dako, N° S2367). Se incluyó un paso de bloqueo con peroxidasa de hidrógeno al 3% para bloquear las peroxidasas endógenas. Luego se incubaron los anticuerpos primarios durante 1 hora, seguido de su detección con el sistema de detección ENVISION™ de peroxidasa/DAB conejo/ratón (Dako, N° K5007). Los cortes se contratiñeron con hematoxilina.

Los resultados del análisis de los parámetros metabólicos indicaron que las hKDC se sembraron bien y proliferaron bajo todas las condiciones de cultivo probadas (ver Figuras 1 a 6) La tinción histológica con H&E mostró que tanto en las condiciones de cultivo de intercalado de colágeno como de intercalado de SIS-colágeno, las células crecieron en capas dobles o múltiples casi continuas, que progresaron en estructuras tridimensionales que se asemejan a tubos o quistes. Por el contrario, las células cultivadas en el SIS formaron una monocapa confluente que mostró una morfología altamente prismática que es indicativa de una diferenciación epitelial (ver Figuras 7 y 8). Esta morfología se observó después de tres semanas de cultivo, independientemente de la concentración de siembra celular inicial usada. Las hKDC cultivadas en transwells con membranas de PET recubiertas de colágeno muestran una morfología plana, formación de múltiples capas y aglomerados que se observó que se desprenden de la superficie, lo que lleva a una capa celular no continua. Estas propiedades observadas de las hKDC en membranas de PET recubiertas de colágeno las hacen inadecuadas para los ensayos de transporte. También se ha observado estratificación múltiple similare con membranas transwell de poliéster y policarbonato, indicando que este efecto es una propiedad de las membranas sintéticas en general, no de las membranas específicas usadas en el experimento. Estas propiedades no se observaron para el cultivo de SIS, lo que implica que este andamiaje promueve el funcionamiento de los mecanismos reguladores naturales de la inhibición de contacto y la formación de una monocapa intacta.

Los resultados de inmunohistoquímica usando anticuerpos Ki67 indican que las hKDC están proliferando en cada una de las configuraciones de andamiaje probadas. La expresión del factor de transcripción renal Pax-2 también fue positiva durante todo el período de cultivo. Las cadherinas como constituyentes de los desmosomas y las uniones adherentes están involucradas en los contactos célula-célula y su expresión es un marcador para la diferenciación celular. Son esenciales para la polarización de las células y, por tanto, para su funcionalidad. En el riñón, la N-Cadherina se expresa por las células de los túbulos proximales, mientras que la E-Cadherina prevalece en las células del túbulo distal. Los resultados de IHC muestran una fuerte inmunotinción para la N-Cadherina por las hKDC en todas las configuraciones de andamiajes. Por el contrario, la inmunotinción para E-cadherina estuvo ausente en gran medida, aunque se observaron pocas áreas de tinción extremadamente débil.

Las acuaporinas catalizan el transporte de agua a través de la membrana celular y, por tanto, son muy importantes para la funcionalidad renal. La acuaporina 1 se expresa en las células renales proximales, mientras que la acuaporina 2 predomina en las células de los túbulos distales. La expresión de Acuaporina 1 pudo detectarse después de 2 y 3 semanas de cultivo, mientras que la expresión de Acuaporina 2 no se observó. En áreas, se observó que la tinción de Acuaporina-1 solo se produce en el lado apical de las células cuboidales (ver la Figura 9) indicando de nuevo una diferenciación principalmente proximal de las células. También se analizó el IHC del cotransportador de glucosa sódica 1 (SGLT-1), que es un transportador expresado por las células del túbulo distal, pero no se pudo observar expresión de marcador en ninguna de las muestras.

Este ejemplo demuestra que las hKDC pueden diferenciarse en células de los túbulos proximales, y que esta diferenciación depende de la composición del sustrato sobre el que se siembran las células. Una matriz extracelular natural plana (es decir matriz descelularizada) superó los andamiajes de colágeno, SIS/colágeno, así como el cultivo transwell estándar con respecto a la morfología y diferenciación epitelial de las hKDC. Las células de los túbulos proximales no transformadas (como las células primarias) típicamente continuarán creciendo una vez que se alcance la confluencia, lo que dará como resultado la formación de agregados tridimensionales sobre superficies planas sintéticas como los transwells. La siembra en un andamiaje descelularizado natural, como el SIS, permite a las células diferenciarse y formar monocapas epiteliales que son más estables que las producidas mediante métodos tradicionales.

Ejemplo 2: Optimización de la concentración de siembra celular de hKDC en andamiajes descelularizados

El Ejemplo 1 demostró que las células sembradas en andamiajes descelularizados bidimensionales sin colágeno formaron una monocapa epitelial confluente que expresaba marcadores de túbulos proximales después de tres semanas de cultivo. Los siguientes experimentos se realizaron para optimizar la densidad de siembra celular e intentar reducir el período de cultivo necesario para la formación de la monocapa.

Los andamiajes se prepararon descelularizando segmentos de la submucosa del intestino delgado (SIS) como se describe en el Ejemplo 1. Se sembraron hKDC en el pase 4 sobre los andamiajes SIS a tres concentraciones diferentes (1 x 104, 5 x 104 y 1 x 105 células/pocillo) y se cultivaron durante tres semanas con medio de crecimiento epitelial renal REGM™ (Lonza, Walkersville). Las muestras se retiraron para el análisis histológico después de dos y tres semanas y se fijaron con el fijador de Bouin durante 1 hora. Posteriormente se lavaron en agua durante por lo menos 4 horas y se incrustaron en parafina. Posteriormente, se prepararon cortes de 3 gm de espesor. Los cortes se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E) para evaluar la morfología celular. Además, se realizó inmunohistoquímica (IHC), como en el Ejemplo 1, para caracterizar la diferenciación de las células. Primero, se desparafinaron secciones transversales de 3 gm. La recuperación del objetivo se logró mediante tratamiento enzimático con proteinasa K, calentando en tampón citrato pH 6 (Dako, N° S2369) o calentando en tampón de Tris/EDTA pH 9 (Dako, N° S2367). Se incluyó un paso de bloqueo con peroxidasa de hidrógeno al 3% para bloquear las peroxidasas endógenas. Luego se incubaron los anticuerpos primarios durante 1 hora, seguido de su detección con el sistema de detección ENVISION™ de peroxidasa/DAB conejo/ratón (Dako, N° K5007). Los cortes se contratiñeron con hematoxilina.

La tinción con lectina se realizó para evaluar adicionalmente la diferenciación celular. Como se ha descrito anteriormente, se desparafinaron secciones transversales de 3 gm y se bloquearon con peroxidasa de hidrógeno. Las lectinas biotiniladas, ya sea lectina de Lotus tetragonobolus (Biozol, N° B-1325) o aglutinina de Dolichos biflorus (Biozol, N° B1035), se incubaron durante 1 hora, seguido de marcado con estreptavidina (Biogenex, N° LP000-ULE) y detección por adición de cromógeno de aminoetil carbazol (AEC) (Biogenex, N° HK129-5KE). Los cortes se contratiñeron con hematoxilina.

Los resultados de la tinción con H&E indicaron que después de dos semanas de cultivo, ninguna de las densidades de siembra examinadas había alcanzado el 100% de confluencia. Sin embargo, después de tres semanas de cultivo, las células sembradas a todas las densidades habían formado una monocapa casi confluente y tenían áreas que desarrollaron una morfología epitelial cuboidal típica con núcleos localizados en el tercio inferior de la célula. Las células sembradas a la densidad más alta también eran casi confluentes, pero la morfología de las células era menos uniforme y no tan epitelial en apariencia (ver Figura 10)

Los resultados de inmunohistoquímica se resumen en la Tabla 2 a continuación. El IHC de las muestras de tres semanas de menor densidad de siembra detectó la expresión de los marcadores de los túbulos proximales AQP-1 (40-50%) y N-Cadherina (~90%), mientras que no lo hizo de los marcadores distales (AQP-2 y SGLT-1) o solo se expresaron muy débilmente (E-Cadherina). Además, se detectó la expresión de PAX-2 en toda la muestra, y la Claudina-2, un marcador de unión estrecha, se detectó en varias regiones de las muestras. El Ki67, un marcador de proliferación, solo se detectó en áreas donde la monocapa no era completamente confluente. De manera importante, la tinción basolateral de colágeno IV, una proteína de membrana basal se observó en muchas áreas de las muestras. La expresión de colágeno IV indicó que las células estaban remodelando el andamiaje y depositando una nueva membrana basal.

La tinción de las muestras de tres semanas de menor densidad de siembra con las lectinas biotiniladas lectina de Lotus tetragonobulus (LTL), un marcador de células de los túbulos proximales, y aglutinina de Dolichos biflorus (DBA), un marcador de células de los túbulos distales, también indicó que la mayor parte de la células se diferenciaron en células de los túbulos proximales. Se observó expresión de LTL en muchas áreas de las muestras, mientras que la expresión de DBA fue escasa y débil (ver Figura 10)

Este ejemplo demuestra que el grado de diferenciación de las células depende de la densidad de siembra. Sin embargo, inesperadamente, al contrario que lo que se supondría normalmente, una densidad de siembra más baja dio como resultado un mayor grado de diferenciación.

La muestra sembrada a 1 x 104 células/pocillo también se analizó para la expresión de colágeno tipo IV por inmunohistoquímica, como se ha descrito anteriormente, usando anticuerpo de colágeno IV anti-humano (Dako, N° M0785). Los resultados, que se muestran en la Figura 11, demuestran una tinción positiva de colágeno IV en la superficie basolateral de las células, indicando que las células secretaban activamente componentes de la matriz extracelular en el andamiaje natural descelularizado; demostrando que las monocapas intactas pueden desarrollarse en andamiajes naturales descelularizados, que son más relevantes fisiológicamente que los andamiajes sintéticos, como los transwells. Además, sugiere que la densidad de siembra celular tiene un efecto directo sobre la diferenciación celular y la formación de monocapas.

Ejemplo 3: inmunohistoquímica de p-glicoproteína-1

Los andamiajes se prepararon descelularizando segmentos de la submucosa del intestino delgado (SIS) como se describe en el Ejemplo 1. Se sembraron hKDC en el pase 4 sobre los andamiajes SIS a 5 x 104 células/andamiaje y se cultivaron durante tres semanas con medio de crecimiento epitelial renal REGM™ (Lonza, Walkersville). Las muestras se retiraron para el análisis histológico después de tres semanas y se fijaron con el fijador de Bouin durante 1 hora. Posteriormente, se lavaron en agua durante por lo menos 4 horas y se incrustaron en parafina. Posteriormente, se prepararon cortes de 3 pm de espesor. La inmunohistoquímica (IHC) se realizó para confirmar la expresión de p-glicoproteína-1 (pgp-1, también conocida como MDR1), que es un transportador de eflujo expresado por las células de los túbulos proximales. La recuperación del objetivo de las secciones desparafinizadas se logró mediante tratamiento enzimático con proteinasa K, calentando en tampón de citrato pH 6 (Dako, N° S2369), o calentando en tampón de Tris/EDTA pH 9 (Dako, N° S2367). Se incluyó un paso de bloqueo con peroxidasa de hidrógeno al 3% para bloquear las peroxidasas endógenas. Luego se incubó pgp-1 antihumano primario (Biogenex, N° AM-391-5M) durante 1 hora seguido de su detección con el Sistema de Detección ENVISION™ de peroxidasa/DAB conejo/ratón (Dako, N° K5007). Los cortes se contratiñeron con hematoxilina.

Los resultados mostraron tinción positiva para pgp-1 en la membrana apical de la monocapa celular (ver Figura 13), confirmando la expresión de un marcador funcional de células de los túbulos proximales, indicando además que el andamiaje y los métodos de siembra descritos permiten la diferenciación de las hKDC en células de los túbulos proximales en funcionamiento.

Ejemplo 4: Captación de albúmina por hKDC sembradas en andamiajes descelularizados

Se prepararon andamiajes descelularizando segmentos de la submucosa del intestino delgado (SIS) como se describe en el Ejemplo 1. Se sembraron hKDC en el pase 4 sobre los andamiajes de SIS a 5 x 104 células/andamiaje y se cultivaron durante tres semanas con medio de crecimiento epitelial renal REGM™ (Lonza, Walkersville). Para evaluar la captación de albúmina, las muestras sembradas con células se pre-incubaron primero en medio libre de suero (medio basal REBM, Lonza, Walkersville) durante 1 hora. Los medios se intercambiaron luego con medio basal REBM que contenía 200 pg/ml de albúmina de suero bovino marcado fluorescentemente (BSA-FITC) (Sigma, N° A9771) y se incubaron durante 30 a 60 minutos. Las muestras se lavaron luego con PBS, se contratiñeron con DAPI (diamidino-2-fenilindol) y se tomaron imágenes en un microscopio fluorescente.

Los resultados mostraron que las células son capaces de absorber BSA-FITC (ver Figura 14), una función de las células de los túbulos proximales. Estos resultados demostraron que las hKDC sembradas en andamiajes descelularizados no solo expresan marcadores de diferenciación de los túbulos proximales renales sino que también funcionan como células epiteliales de los túbulos proximales.

Los ejemplos 5 a 9 que siguen son ejemplos proféticos diseñados para elucidar aún más las propiedades de los andamiajes de la invención. Los ensayos funcionales, como la captación de BSA-FITC, pueden usarse para evaluar la lesión celular o la nefrotoxicidad, así como la eficacia de los compuestos terapéuticos sobre la restauración de las funciones de transporte renal.

Ejemplo 5: Transporte de aniones orgánicos por hKDC sembradas en andamiajes descelularizados Este ejemplo prueba la función de los transportadores de aniones orgánicos, así como pgp-1, un transportador de eflujo, ensayando el transporte de colorantes fluorescentes, como rodamina, amarillo de lucifer o carboxifluoresceína. El transporte a la célula está mediado por varios transportadores de aniones orgánicos (OAT). Cuando el verapamilo inhibe el transportador pgp-1, el colorante aplicado como la rodamina deja de ser transportado fuera de la célula, lo que da como resultado un aumento de la fluorescencia celular.

Los andamiajes se prepararán descelularizando segmentos de la submucosa del intestino delgado (SIS) como se describe en el Ejemplo 1. Las hKDC en el pase 4 se sembrarán sobre los andamiajes de SIS a 5 x 104 células/andamiaje y se cultivarán durante tres semanas con medio de crecimiento epitelial renal REGM™ (Lonza, Walkersville). Los medios en el compartimento superior se intercambiarán luego con medio libre de rojo fenol que contiene varias concentraciones de colorante de rodamina, amarillo lucifer o carboxifluoresceína. Algunos pocillos también se pre-incubarán con varias concentraciones de verapamilo en ambos compartimentos antes de la adición del medio que contiene el colorante fluorescente (con y sin verapamilo adicional en el medio) al compartimento superior. Los pocillos se incubarán durante 30 a 120 minutos. Las muestras se lavarán luego con PBS, se fijarán, se contrateñirán con DAPI y se obtendrán imágenes en un microscopio fluorescente. Además, se tomarán muestras del medio para el análisis cuantitativo de la presencia de colorante fluorescente.

Ejemplo 6: Siembra y diferenciación de hKDC (con o sin células endoteliales microvasculares) en andamiajes descelularizados dentro de un biorreactor de flujo.

El sistema de biorreactor se preparará como se ha descrito anteriormente. El andamiaje se coloca entre el elemento del cuerpo superior 110 y el elemento del cuerpo inferior 120 del biorreactor 100 y se fija con una tensión comparable a las coronas de las células (ver la Figura 15) La tensión sobre el andamiaje colocado en el biorreactor puede alterarse y se realizarán experimentos para determinar los intervalos de tensión más apropiados para la formación de una monocapa de células y la diferenciación posterior. Un lado del andamiaje se sembrará con hKDC seguido de un período de adherencia apropiado (sin flujo). El otro lado del andamiaje puede sembrarse luego con células endoteliales. Como control, también habrá biorreactores con solo uno de los tipos de células. Las cámaras del biorreactor se perfundirán después de un período apropiado de adhesión celular. El caudal se ajustará a las condiciones renales para promover la diferenciación y la formación de la monocapa epitelial. La formación y la integridad de la monocapa se controlarán mediante la medición periódica de la resistencia eléctrica transepitelial (TEER), así como midiendo la pérdida de FITC-inulina fluorescente. En los casos en que se usan ambos tipos de células, las condiciones de flujo se ajustarán a las apropiadas para el mantenimiento de las monocapas de células tanto epiteliales como endoteliales. Además de la monitorización de TEER e inulina, las muestras se fijarán después de 1, 2 y 3 semanas. La morfología epitelial y la formación de monocapa se evaluarán mediante tinción con hematoxilina y eosina.

Ejemplo 7: Transporte funcional de glucosa y reabsorción de otros solutos por hKDC (con o sin células endoteliales microvasculares) sembradas en andamiajes SIS y cultivadas dentro de un biorreactor de flujo Este ejemplo demuestra la diferenciación funcional de hKDC en células epiteliales de los túbulos proximales cuando se siembran en andamiajes de SIS en un biorreactor de flujo analizando el transporte activo de glucosa y otros solutos desde un compartimento de medios a través de la membrana sembrada de células a otro compartimento de medios.

Los andamiajes de SIS se prepararán como se describe en el Ejemplo 1. Las células endoteliales microvasculares (mvEC), aisladas siguiendo métodos convencionales, se sembrarán en un lado del andamiaje. Las hKDC se sembrarán posteriormente en el otro lado de los andamiajes. Luego, los andamiajes se colocarán en cámaras de biorreactor, que permiten el flujo de medios a través de cada lado de los andamiajes, y se cultivarán para permitir la formación de la monocapa como en el Ejemplo 6. La formación de la monocapa se monitorizará mediante la medición de TEER y la pérdida de FITC-inulina como en el Ejemplo 6. En este punto, cada compartimento de medios está encerrado en un pequeño bucle, que está separado solo por las monocapas de células intactas en el andamiaje de SIS. Para mediciones de glucosa, se usarán medios que contienen concentraciones conocidas de glucosa en los diferentes compartimentos de medios con o sin la adición de un inhibidor del transporte de glucosa como, por ejemplo, floridzina. Se permitirá que los medios fluyan a través de las monocapas de células maduras durante un período de aproximadamente 48 horas, con las muestras de medios siendo retiradas periódicamente para las mediciones de concentración de glucosa mediante un ensayo colorimétrico. Se realizarán múltiples experimentos con diferentes concentraciones de glucosa en los dos compartimentos para examinar el cambio en las concentraciones de glucosa con el tiempo. Los resultados de estas mediciones se usarán para calcular la cantidad relativa de transporte de glucosa frente al consumo de las células con respecto al tiempo. Pueden realizarse experimentos similares con otros solutos que son o transportados o absorbidos y degradados por las células como, por ejemplo, albúmina.

Ejemplo 8: Activación de vitamina D

La activación de la vitamina D es una función específica de las células de los túbulos proximales del riñón. Por consiguiente, este ejemplo prueba la activación de la vitamina D probando la actividad de la enzima 25-(OH)D3-12-hidroxilasa que convierte el precursor inactivo 25-OH-D3 en su forma activa 1,25-(OH)2D3.

Para analizar la activación de la vitamina D, se sembrarán hKDC en SIS, que se preparará como se describe en el Ejemplo 1. Las hKDC se sembrarán en el pase 4 en los andamiajes de SIS a 5x104 células/andamiaje y se cultivarán durante tres semanas con medio de crecimiento epitelial renal REGM™ (Lonza, Walkersville).

El medio se intercambiará a un medio que contiene el precursor 25-OH-D3 inactivo. Después de un tiempo de incubación de aproximadamente 15 minutos a 2 horas, el medio se recogerá y analizará para determinar la cantidad de tanto el precursor como la forma activa de 1,25-(OH)2D3 mediante análisis por HPLC o ELSIA. El tiempo de incubación puede variar dependiendo del medio de incubación y la temperatura de incubación. La conversión puede inducirse adicionalmente mediante la adición de hormona paratiroidea o inhibirse mediante la adición de fosfato.

Ejemplo 9: Sistema de túbulo proximal renal de hKDC/SIS para pruebas de nefrotoxicidad y aplicaciones de descubrimiento de fármacos

En este ejemplo, los efectos de sustancias nefrotóxicas específicas (por ejemplo, cisplatino, vinblastina) o reactivos renoprotectores se aplicarán en el sistema modelo de túbulos proximales renales de hKDC/SIS. Para hacer esto, se sembrarán hKDC sobre SIS, bajo condiciones estáticas y/o de flujo, y se les permitirá crecer y diferenciarse en una monocapa de epitelio del túbulo proximal. Luego se aplicarán varias sustancias nefrotóxicas al sistema de hKDC/SIS y se evaluará la viabilidad celular, la morfología y la funcionalidad del túbulo proximal. Los parámetros funcionales renales incluyen, por ejemplo, transporte de solutos, TEER, pérdida de inulina, captación de albúmina, síntesis de vitamina D, producción de eritropoyetina y prostaglandina. Además, se probará el sistema de túbulo proximal de hKDC para determinar su capacidad de detectar los efectos de varios reactivos renoprotectores y otros reactivos citoprotectores.

Ejemplo 10: Aislamiento de células derivadas de riñón humano

Se obtuvieron riñones humanos normales del National Disease Research Interchange (NDRI, Philadelphia, PA). Cada riñón se lavó en medio de Eagles modificado de Dulbecco (DMEM-glucosa baja, Invitrogen, Carlsbad, CA) o solución salina tamponada con fosfato (PBS, Invitrogen) para eliminar la sangre y los desechos. Se diseccionó tejido de la región de la corteza externa, la región medular interna y la región subcapsular del riñón. Luego, los tejidos se disociaron luego mecánicamente en placas de cultivo de tejidos hasta que el tejido se troceó en una pulpa fina. El tejido se transfirió luego a un tubo cónico de 50 mililitros. El tejido se digirió luego en cualquiera de las mezclas de enzimas de buenas prácticas de fabricación (GMP) que contenían 0,25 unidades de actividad de PZ/mililitro de colagenasa (NB6, N0002779, Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Alemania), 2,5 unidades/mililitro de dispasa (Dispase II 165859, Roche Diagnositics Corporation, Indianápolis, IN), 1 unidad/mililitro de hialuronidasa (Vitrase, ISTA Pharmaceuticals, Irvine, Ca) o mezclas de enzimas de grado no GMP que contenían 500 unidades/mililitro de colagenasa (Sigma, St Louis, MO), 50 unidades/mililitro de dispasa (Invitrogen) y 5 unidades/mililitro de hialuronidasa (Sigma). Las células derivadas de riñón también se aislaron con 50 unidades/mililitro de dispasa. La mezcla enzimática se combinó con medio de crecimiento epitelial renal (REGM) (Cambrex, Walkersville, MD) o medio de crecimiento de células madre mesenquimales (MSCGM) (Cambrex). Los tubos cónicos que contenía el tejido, medio y enzimas de digestión se incubaron a 37° C en un agitador orbital a 225 rpm durante 1 hora.

La solución de digestión se centrifugó a 150 x g durante 5 minutos y se aspiró el sobrenadante. El sedimento celular resultante se resuspendió en 20 mililitros de REGM o MSCGM. La suspensión celular se filtró a través de un filtro celular BD FALCON de nylon de 40 micras (BD Biosciences, San Jose, CA). El filtrado se resuspendió en medio (volumen total 50 mililitros) y se centrifugó a 150 x g durante 5 minutos. El sobrenadante se aspiró y el sedimento celular se resuspendió en 50 mililitros de medio de cultivo fresco. Este proceso se repitió dos veces más.

Después de la centrifugación final, se aspiró el sobrenadante y se resuspendió el sedimento celular en 5 mililitros de medio de cultivo fresco. El número de células viables se determinó utilizando un instrumento Guava (Guava Technologies, Hayward, CA). Las células se colocaron luego en placas a una densidad de siembra de 5000 células/cm2 en matraces de cultivo de tejidos recubiertos con 2% de gelatina o laminina y se cultivaron o en una atmósfera de oxígeno bajo (hipoxia) o normal (normoxia). La Tabla 1 muestra la información del donante y las condiciones de crecimiento usadas para aislar poblaciones de células derivadas de riñón. Para obtener clones de células renales derivados de células individuales, se realizaron técnicas de dilución limitante. En total, las células se aislaron usando veinticuatro condiciones diferentes, de cuatro donantes cadáveres diferentes de 39, 46, 21 y 10 años de edad.

Ejemplo 11: Morfología de células derivadas de riñón humano

Siete días después del aislamiento, se evaluaron las poblaciones de células derivadas de riñón mediante microscopía óptica y se observaron las características morfológicas de las células. Consistentemente, todas las condiciones de aislamiento dieron lugar a células con una morfología epitelial. (ver la Tabla 11-1).

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Estos datos ilustran que las células derivadas de riñón pueden aislarse de un donante de cualquier edad o sexo, así como aislarse usando varias formulaciones de medios de crecimiento o condiciones de cultivo. La facilidad y consistencia del procedimiento de aislamiento muestra que las células derivadas de riñón son una fuente valiosa de células para su uso en terapias basadas en células.

Ejemplo 12: Potencial de crecimiento de células derivadas de riñón

Las células derivadas de riñón pueden propagarse ampliamente en cultivo y son capaces de generar un número significativo de células en poco tiempo. Este es un criterio para el desarrollo de terapias de células alogénicas.

Se colocaron en placas células derivadas de riñón a 5.000 células/cm2 en matraces T75 en REGM o MSCGM y se cultivaron a 37° C en 5% de dióxido de carbono. Las células se pasaron cada 2-5 días. En cada pase, se contaron las células y se midió la viabilidad usando un instrumento de Guava (Guava Technologies, Hayward, CA). Las poblaciones de células se pasaron continuamente durante varias semanas hasta que se alcanzó la senescencia. La senescencia se determinó cuando las células no lograron duplicar más de una población durante el intervalo de tiempo del estudio. Luego se calcularon las duplicaciones de la población [ln(rendimiento celular final/número inicial de células en placas)/ln2].

Para el análisis de cariotipo, las células derivadas de riñón del pase 4 y del pase 10, de los aislamientos 22 y 23, se colocaron en placas en matraces T25 y se dejaron unir durante la noche. Los matraces se llenaron luego con REGM y se realizó el análisis de cariotipo.

La Tabla 12-1 es un resumen de los datos de crecimiento para los aislamientos probados. No hubo un efecto notable sobre las características de crecimiento celular con respecto a la edad del donante, la fuente de tejido, o las enzimas usadas para aislar las células.

El análisis de cariotipo se realizó en los aislamientos 22 y 23 tanto en el pase 4 como en el pase 10. Ambos demostraron un cariotipo normal en el pase 4 y el pase 10.

De media, la duplicación de la población (PD) en la senescencia fue de 28,5, mientras que la viabilidad media fue del 97,6%.

En resumen, las células derivadas de riñón tienen un potencial de crecimiento robusto en cultivo. Estos datos pueden usarse para estimar el número total de células generadas a partir de un riñón humano completo. Si se procesara todo el tejido renal, y las células resultantes se cultivaran para 31 duplicaciones de población, un riñón humano completo produciría un total estimado de 1,89 x 1016 células totales. Por lo tanto, considerando que una dosis terapéutica de células es de 1 x 108 células por persona, las células derivadas de riñón, aisladas de un solo riñón serán suficientes para tratar a 189 millones de pacientes. En última instancia, estas células son una fuente de células altamente expandible para su uso en terapias celulares basadas en alogénicos.

Ejemplo 13: Fenotipo del marcador de superficie de hKDC

El análisis de citometría de flujo se realizó en células derivadas de riñón humano para determinar el fenotipo del marcador de superficie. Las células de 9 de los aislamientos en el Ejemplo 11 se expandieron al pase 4 y al pase 10 en REGM en matraces T75 a 37° C y 5% de dióxido de carbono. Las células adherentes se lavaron en PBS y se separaron con TrypLE Select (Gibco, Grand Island, NY). Las células se recogieron, se centrifugaron y se resuspendieron en FBS al 3% (v/v) en PBS a una concentración de 2 x 105 células/mililitro. El anticuerpo específico se añadió a 100 microlitros de suspensión celular y la mezcla se incubó en la oscuridad durante 30-45 minutos a 4° C. Después de la incubación, las células se lavaron con PBS y se centrifugaron para eliminar el exceso de anticuerpo. Las células se resuspendieron en 500 microlitros de PBS y analizadas por citometría de flujo. El análisis de citometría de flujo se realizó con un instrumento Guava (Guava Technologies, Hayward, CA). Los anticuerpos usados para caracterizar el fenotipo del marcador de superficie se muestran en la Tabla 13-1.

Tabla 13-1: Anticuerpos usados en la caracterización celular del fenotipo del marcador de superficie de células derivadas de riñón

La Tabla 13-2 muestra un resumen de todos los datos de fenotipo de marcadores de superficie. Todos los aislamientos probados mostraron tinción positiva para CD24, CD29, CD44, CD49c, CD73, CD166, SSEA-4 y HLA I y tinción negativa para CD31, CD34, CD45, CD56, CD80, CD86, CD104, CD105, CD117, CD133, CD138, CD141, E-cadherina y HLA II. Además, todos los aislamientos analizados se expandieron durante varias generaciones (pase 10) y aún conservaron su fenotipo de marcador de superficie.

Estas células expresan HLA I, pero no expresan HLA II, CD80 o CD86. Estas características de expresión celular reflejan la capacidad de la célula para evadir un sistema inmune del huésped. Estos datos demuestran que las células derivadas de riñón no son inmunogénicas y pueden administrarse a un paciente sin la necesidad de tipificación de tejidos o inmunosupresión.

En resumen, estos datos demuestran que las células derivadas de riñón de múltiples donantes pueden aislarse bajo varias condiciones (ver Tabla 11-1) y mantener todavía su fenotipo de marcador de superficie. Además, expresan marcadores progenitores putativos como CD24 y SSEA-4, pero no expresan marcadores maduros comprometidos con el linaje como E-cadherina. Finalmente, las células derivadas de riñón no son inmunogénicas y, por lo tanto, son una fuente atractiva de células para su uso en terapias celulares alogénicas.

Tabla 13-2: Resumen del análisis de marcadores de superficie. No determinado (ND). Tinción positiva (+). Tinción n iv -.

Ejemplo 14: Expresión génica de células derivadas de riñón

Se extrajo ARN de las células de los aislamientos 1, 2 y 17-23 usando un kit de extracción de ARN (RNeasy Mini Kit; Qiagen, Valencia, CA). El ARN se eluyó con 50 microlitros de agua tratada con DEPC y se almacenó a -80° C. El ARN se transcribió de manera inversa usando hexámeros aleatorios con los reactivos de transcripción inversa TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA) a 25° C durante 10 minutos, 37° C durante 60 minutos y 95° C durante 10 minutos. Las muestras se almacenaron a -20° C. Usando los cebadores descritos en la Tabla 14-1, los genes seleccionados se investigaron por PCR convencional (reacción en cadena de la polimerasa). La PCR se realizó en muestras de ADNc usando conjuntos de cebadores de RT2 PCR (SuperArray Biosciences Corp, Frederick MD).

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Los cebadores se mezclaron con 1 microlitro de ADNc y mezcla maestra de PCR verde 2X ReactionReady™ SYBR (SuperArray Biosciences) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y la PCR se realizó usando un sistema ABI Prism 7000 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Las condiciones del ciclo térmico fueron inicialmente de 50° C durante 2 minutos y 95° C durante 10 minutos seguidos de 34 ciclos de 95° C durante 15 segundos y 60° C durante 1 minuto. Para GAPDH, la PCR se realizó usando cebadores GAPDH de Applied Biosystems (N° de cat: 402869) 1 microlitro de solución de ADNc y 1 x tampón de reacción de PCR de mezcla universal AmpliTaq Gold (Applied Biosystems, Foster City, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La concentración del cebador en la reacción de PCR final fue de 0,5 micromolar para tanto el cebador directo como el inverso y no se añadió la sonda TaqMan. Las muestras se procesaron en gel de agarosa al 2% (p/v) y se tiñeron con bromuro de etidio (Sigma, St. Louis, MO). Las imágenes se capturaron usando una película 667 Universal Twinpack (VWR International, South Plainfield, NJ) y una cámara Polaroid™ de distancia focal (VWR International, South Plainfield, NJ). Para cada gen analizado, el producto de PCR final se escindió del gel y la secuencia objetivo se confirmó mediante secuenciación de ADN.

Análisis de RT-PCR

Todos los aislados celulares analizados mostraron un perfil de expresión génica constante y estable. El análisis de RT-PCR se realizó en los aislamientos 1, 2 y 17-23 para detectar la expresión del marcador génico de desarrollo temprano (Oct-4, Rex-1, Sox2, FGF4, hTert), marcadores génicos del desarrollo renal (Pax- 2, WT-1, Eya-1, Wnt-4, BMP-7, Cadherina-11, FoxD1), marcadores génicos mesenquimales metanefricos (Pax-2, Eya-1, WT-1, Six2 y FoxD1) y genes que promueven la supervivencia del mesénquima metanefrico (BMP-7). Además, se analizó la expresión de otros genes del desarrollo, como los genes endodérmicos (HNF3B, CXC-R4, Sox-17, GATA-4), así como los marcadores génicos que promueven la reparación renal o tienen valor terapéutico en el tratamiento de la enfermedad renal (Epo, EpoR, Bm P-7, BMP-2, GDF5).

Como se muestra en la Tabla 14-2, todos los aislamientos mostraron expresión positiva para Oct-4 y Rex-1 y expresión negativa para Sox2, FGF4, hTERT y Wnt-4. Los aislamientos 17-23 mostraron una expresión positiva para Pax-2, WT1, Cadherina-11 y FoxDI. Los aislamientos 22 y 23 mostraron expresión positiva para Eya-1, Sox-17 y CXCR-4 y expresión negativa para GATA-4. Los aislamientos 17-23 expresaron EpoR, pero no expresaron Epo. Los aislamientos 17-22 expresaron BMP-2, BMP-7 y GDF5. Además, todos los aislamientos pueden expandirse múltiples generaciones (pase 10) y aún conservan su fenotipo de expresión génica.

Tabla 14-2: Resumen del análisis de expresión génica. Expresión positiva (+). Expresión negativa (-). No determinado (ND). Genes que funcionan durante el desarrollo temprano (desarrollo temprano). Genes que funcionan durante el desarrollo renal (desarrollo renal). Marcadores mesenquimales metanefricos (Met). Marcadores de linaje endodérmico (endodermo). Genes implicados en la supervivencia renal (renoprotector). Genes involucrados en la supervivencia del mesén uima metanefrico su ervivencia

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En resumen, las células derivadas de los riñones expresan genes involucrados en el desarrollo temprano y el desarrollo renal. Expresan marcadores para mesénquima metanefrico y marcadores para células progenitoras renales. Expresan marcadores endodérmicos, así como factores involucrados en la reparación renal y la tubulogénesis.

En total, estos datos demuestran que las células derivadas de riñón son una fuente de supuestas células progenitoras renales que pueden usarse para terapias basadas en células para proteger o reparar el tejido renal dañado.

Ejemplo 15: Análisis de secreción de factor trófico

Se demostró que las células derivadas de riñón producen consistentemente factores tróficos que protegen y reparan el riñón. Por lo tanto, estas células pueden servir como agente terapéuti

Las células del pase 3, a partir de aislamientos 17-21 se sembraron a 5.000 células/cm2 en un matraz T75/aislamiento, cada uno conteniendo 15 mililitros de REGM. Las células se cultivaron a 37° C en 5% de dióxido de carbono. Después del cultivo durante la noche, el medio se cambió a un medio libre de suero (DMEM-glucosa baja (Gibco), albúmina de suero bovino al 0,1% (p/v) (Sigma), penicilina (50 unidades/mililitro) y estreptomicina (50 microgramos/mililitro) (Gibco)) y se cultivó adicionalmente durante 8 horas. Se recogió medio libre de suero acondicionado al final de la incubación por centrifugación a 14.000 x g durante 5 minutos y se almacenó a -20° C.

Las células se lavaron con PBS, se separaron usando 4 mililitros de TrypLE Select (Gibco) y se contaron con un instrumento Guava (Guava Technologies, Hayward, CA) para estimar el número de células en cada matraz. Usando las matrices de proteomas Searchlight (Pierce Biotechnology Inc), las muestras se analizaron mediante ELISA para los siguientes factores tróficos: inhibidor tisular de metaloproteinasa-1 (TIMP-1), inhibidor tisular de metaloproteinasa-2 (TIMP-2), factor de crecimiento epitelial derivado de plaquetas bb (PDGF-bb), factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de crecimiento de fibroblastos básico (FGF2), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento epidérmico de unión a heparina (HB-EGF), proteína quimiotáctica monocítica 1 (MCP-1), interleucina-6 (IL-6), interleucina-8 (IL-8), factor de crecimiento transformante alfa (TGFa), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), factor derivado del estroma 1b (SDF1b), factor neurotrófico ciliar (CNTF), factor de crecimiento nervioso básico (b-NGF), neurotrofina-3 (NT-3), oncogén alfa relacionado con el crecimiento (GRO-a), interleucina-lb (IL-1 b), interleucina-12p40 (IL-12p40), interleucina-12p70 (IL-12p70), interleucina-11 (IL-11), interleucina-15 (IL-15), metaloproteinasa-2 de la matriz (M^m P-2), metaloproteinasa-9 de la matriz (MMP-9), angiopoyetina-2 (ANG-2) y hormona de crecimiento humano (HGH). Análisis de la producción de factores tróficos.

Se analizó la secreción de veintisiete factores de crecimiento y citoquinas diferentes en los aislamientos 17­ 21. Los resultados se resumen en la Tabla 15-1. Todos los aislamientos secretaron TIMP-1, TIMP-2, VEGF y MMP-2 a más de 300 picogramos/mililitro/1x106 células/8 horas. Secretaron 50-300 picogramos/mililitro/1x106 células/8 horas de FGF2 y HGF y 1-50 picogramos/mililitro/1x106 células/8 horas de Kg F, PDGF-bb, b-NGF, IL-12p40 e IL-11). No se detectaron SDF-1, ANG-2, HGH e Il-12p70.

En resumen, estos datos muestran que las células derivadas de riñón secretan varios factores tróficos para proteger y reparar el tejido renal dañado. Por ejemplo, FGF2, HGF y TGFa se han implicado en la reparación renal. Las células derivadas de riñón secretan estos factores a niveles elevados y consistentes. Por lo tanto, estas células son una fuente valiosa de células para su uso en terapias dirigidas a enfermedades renales.

Tabla 15-1: Análisis de ensayo ELISA multiplexado SearchLight de producción de factores tróficos de células derivadas del riñón. El aislamiento “solo en medio” es una muestra de control en medio libre de suero solamente sin acondicionamiento. Las unidades en los datos mostrados son picogramosmililitro/lx 106 células/8 horas. Los resultados mostrados son la media de las mediciones de duplicados.

Ejemplo 16: Tubulogénesis de células derivadas de riñón in vitro

Las células derivadas de riñón pueden descongelarse en el pase 4 y el pase 10 y luego triturarse en una suspensión de células individuales a 4 x 104 células/mililitro en una solución de colágeno tipo I que contiene vitrógeno 100 al 66% (3 miligramos/mililitro (Cohesion Technologies, Palo Alto, CA). Las células en suspensión pueden colocarse en placas sobre una membrana omentum descelularizada. La mezcla de colágeno/células puede incubarse durante 30 minutos a 37° C, 5% de CO2, 95% de aire para permitir que el colágeno se gelifique y luego se añade medio de cultivo. Las células se alimentan cada 3 días durante 7 días. En el día 7, los cultivos se tratan con concentraciones variables de factor de crecimiento de hepatocitos y se cultivan adicionalmente hasta que se observe tubulogénesis.

Estas observaciones demuestran que las células derivadas de riñón pueden autoorganizarse en estructuras de túbulos in vitro. Estas estructuras tienen valor como unidades estructurales para las aplicaciones de reconstrucción renal, así como para el desarrollo de ensayos de toxicología y detección de fármacos.

Ejemplo 17: Tubulogénesis de células derivadas de riñón in vivo

Se sembraron tres películas de 35/65 PCL/PGA (10 cm de diámetro x 2 mm de grosor) con células derivadas de riñón humano (10.000 células/cm2) y se cultivaron en REGM (Cambrex) a 37° C y 5% de dióxido de carbono durante 8 días. El andamiaje de espuma 35/65 PCL/PGA se preparó de acuerdo con los métodos descritos en la Patente de Estados Unidos 6.355.699, incorporada en la presente por referencia en su totalidad. Los constructos de células/películas se retiraron luego del plato de fundición de películas, se apilaron en tres capas y se aplicaron a un soporte de andamiaje de espuma 35/65 PCL/PGA. Este constructo se cultivó durante 24 horas adicionales y luego se cortó en piezas cuadradas de 3 x 3 mm antes de la implantación. Los implantes se lavaron luego con PBS y se transfirieron a una placa de 6 pocillos llena de PBS para su transporte.

Los implantes se implantaron por vía subcutánea bilateralmente en la región torácica-lumbar lateral dorsal de ratones SCID. Se adquirieron ratones SCID macho (cepa Fox Chase SCID CB17SC) de Taconic Inc., (Hudson, NY). y tenían 5 semanas de edad. Se colocaron dos implantes en cada ratón SCID. Se realizaron dos incisiones en la piel, cada una de aproximadamente 5 mm de longitud, en el dorso de los ratones. Las incisiones se colocaron transversalmente sobre el área lumbar aproximadamente 5 mm craneal a la cresta ilíaca palpada, con una a cada lado de la línea media. Luego se separó la piel del tejido conectivo subyacente para formar un pequeño bolsillo, y el implante se colocó aproximadamente 10 mm craneal a la incisión. Las incisiones de la piel se cerraron con clips para heridas metálicos Reflex 7. Después de 3 semanas, los implantes se retiraron de la bolsa subcutánea, se fijaron en formalina al 10%, se embebieron en cera de parafina, se seccionaron, se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E) y se evaluaron por un patólogo usando técnicas de microscopía óptica.

Las células derivadas de riñón formaron estructuras tipo túbulos dentro de las capas de película PCL/PGA. Estos túbulos mostraron una pared epitelial distinta y una luz clara. Las células derivadas de riñón infiltraron el andamiaje de espuma, depositaron la matriz extracelular y formaron una estructura densa, similar a tejido. Además, las células derivadas de riñón dentro de la espuma estimularon la angiogénesis y la formación de redes vasculares.

En resumen, las células específicas de riñón humano formaron estructuras de túbulos después de la exposición a un microambiente in vivo. La capacidad de las células derivadas de riñón para responder a las señales microambientales y para instruir a las células que formen túbulos, ilustra adicionalmente la naturaleza progenitora renal de estas células. Además, las células migraron a los andamiajes de espuma, formando una estructura similar a un tejido que promovió la angiogénesis. Estos datos ilustran la utilidad de las células derivadas de riñón como unidades estructurales celulares para reconstruir los túbulos renales y, en última instancia, para su uso en aplicaciones de diseño de tejidos renales.

Aunque la invención se ha descrito e ilustrado en la presente mediante referencias a varios materiales, procedimientos y ejemplos específicos, se entiende que la invención no está restringida a las combinaciones particulares de materiales y procedimientos seleccionados para ese propósito. Pueden implicarse numerosas variaciones de tales detalles como apreciarán los expertos en la técnica. Se pretende que la especificación y los ejemplos se consideren solo a modo de ejemplo, con el verdadero alcance de la invención estando indicado por las siguientes reivindicaciones.

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Un dispositivo de túbulo proximal bioartificial que comprende un andamiaje de matriz biológico descelularizado derivado de tejido de mamífero y sembrado con una o más células precursoras bajo condiciones suficientes para permitir la diferenciación de las células precursoras en células epiteliales de los túbulos proximales renales, en donde las células diferenciadas forman una monocapa epitelial en el andamiaje, y en donde la una o más células precursoras se seleccionan del grupo que consiste de células epiteliales de los túbulos renales primarios, células madre pluripotentes inducibles, células progenitoras renales, células progenitoras diferenciadas en células renales o células progenitoras renales, células madre aisladas del riñón o células progenitoras aisladas del riñón, y mezclas de las mismas; en donde el andamiaje de matriz biológico descelularizado se deriva de tejido mucoso o submucoso, o en donde

el andamiaje de matriz biológico descelularizado se deriva de un canal alimentario de mamíferos.

2. Un dispositivo de túbulo proximal bioartificial que comprende un andamiaje biológico descelularizado derivado de tejido de mamífero y que tiene por lo menos dos superficies en donde por lo menos una superficie está sembrada con una o más células precursoras bajo condiciones suficientes para permitir la diferenciación de las células en células epiteliales de los túbulos proximales renales, en donde las células forman una monocapa epitelial en la superficie del andamiaje, y en donde la una o más células precursoras se seleccionan del grupo que consiste de células epiteliales de los túbulos renales primarios, células madre pluripotentes inducibles, células progenitoras renales, células progenitoras diferenciadas en células renales o células progenitoras renales, células madre aisladas del riñón o células progenitoras aisladas del riñón, y mezclas de las mismas; en donde

el andamiaje de matriz biológico descelularizado se deriva de tejido mucoso o submucoso, o en donde

el andamiaje de matriz biológico descelularizado se deriva de un canal alimentario de mamífero.

3. Un método para diferenciar una o más células precursoras en células renales que comprende sembrar un andamiaje de matriz biológico descelularizado derivado de tejido de mamífero con una o más células precursoras y cultivar las células en el andamiaje bajo condiciones suficientes para permitir la diferenciación de la célula precursora en células epiteliales de los túbulos proximales renales, en donde las células diferenciadas forman una monocapa epitelial en el andamiaje.

4. El método de la reivindicación 3, en donde el andamiaje de matriz biológico descelularizado se deriva de tejido mucoso o submucoso.

5. El método de la reivindicación 3, en donde el andamiaje de matriz biológico descelularizado se deriva de un canal alimentario de mamífero.

6. El dispositivo de túbulo proximal bioartificial de las reivindicaciones 1 o 2 o el método de la reivindicación 5, en donde el andamiaje de matriz biológico descelularizado derivado del canal alimentario de mamífero se deriva del estómago, el duodeno, el yeyuno, el íleon o el colon de un mamífero.

7. El método de la reivindicación 3, en donde la una o más células precursoras se seleccionan del grupo que consiste de células epiteliales de los túbulos renales primarios, células madre pluripotentes inducibles diferenciadas en células renales o células progenitoras renales, células progenitoras diferenciadas en células renales o células progenitoras renales, células madre aisladas del riñón o células progenitoras aisladas del riñón, y mezclas de las mismas.

8. El dispositivo de túbulo proximal bioartificial de las reivindicaciones 1,2 o 6 o el método de las reivindicaciones 3 a 7, en donde las células progenitoras aisladas del riñón son células derivadas de riñón humano.

9. El dispositivo de túbulo proximal bioartificial de la reivindicación 8 o el método de la reivindicación 8, en donde las células derivadas de riñón humano son capaces de autorrenovarse y expandirse en cultivo y son positivas para la expresión de por lo menos uno de Oct-4, Rex-1, Pax-2, Cadherina-11, FoxD1, WT1, Eya1, HNF3B, CXC-R4, Sox-17, EpoR, BMP2, BMP7 o GDF5; y negativas para la expresión de por lo menos uno de Sox2, FGF4, hTert, Wnt-4, SIX2, E-cadherina o GATA-4.

10. El dispositivo de túbulo proximal bioartificial de las reivindicaciones 8 o 9 o el método de las reivindicaciones 8 o 9, en donde las células derivadas de riñón humano son positivas para por lo menos uno de los marcadores de superficie celular HLA-I, CD24, CD29, CD44, CD49c, CD73, CD90, CD166 o SSEA-4; y negativas para por lo menos uno de los marcadores de la superficie celular H^lA II, CD31, ^c D34, CD45, CD56, CD80, CD86, CD104, CD105, CD117, CD133, CD138 y CD141.

11. El dispositivo de túbulo proximal bioartificial de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 o el método de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en donde las células derivadas de riñón humano secretan por lo menos uno de los factores tróficos FGF2, HGF, TGFa, TIMP-1, TIMP- 2, MMP-2 o VEGF; y no secretan por lo menos uno de los factores tróficos PDGF-bb o IL12p70.

12. El dispositivo de túbulo proximal bioartificial de la reivindicación 9 o el método de la reivindicación 9, en donde las células derivadas de riñón humano son capaces de autorrenovarse y expandirse en cultivo y además tienen una de las siguientes características:

a) son positivas para la expresión de uno o más de Oct-4 y Rex-1 y negativas para la expresión de uno o más de Sox2, FGF4, hTert y Wnt-4; o

b) son positivas para la expresión de por lo menos uno de Eya1, WT1, FoxD1, BMP7, BMP2, GDF5, EpoR o Rex-1, y negativas para la expresión de por lo menos uno de Sox2, FGF4, hTert o Wnt-4.

13. El método de las reivindicaciones 3 y 7, en donde el método promueve el funcionamiento de los mecanismos reguladores naturales de inhibición de contacto y la formación de una monocapa intacta sin el uso de inhibidores de contacto.