CN110511901A - 生物人工近端小管系统及使用方法 - Google Patents

生物人工近端小管系统及使用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110511901A
CN110511901A CN201910284404.0A CN201910284404A CN110511901A CN 110511901 A CN110511901 A CN 110511901A CN 201910284404 A CN201910284404 A CN 201910284404A CN 110511901 A CN110511901 A CN 110511901A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
kidney
bracket
bio
source property
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910284404.0A
Other languages
English (en)
Inventor
C.卡札内基
D.C.科特
J.香兹
A.霍彭萨克
J.汉斯曼恩
H.瓦勒斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
DePuy Products Inc
DePuy Synthes Products Inc
Original Assignee
DePuy Products Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by DePuy Products Inc filed Critical DePuy Products Inc
Publication of CN110511901A publication Critical patent/CN110511901A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0684—Cells of the urinary tract or kidneys
    • C12N5/0686—Kidney cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/54—Collagen; Gelatin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue
    • C12N2533/92—Amnion; Decellularised dermis or mucosa

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)

Abstract

本发明公开一种生物人工近端小管装置，所述生物人工近端小管装置通过以下方法构成：制备脱细胞生物基质、用哺乳动物肾源性细胞和任选地哺乳动物内皮细胞来接种所述生物基质。接着，可对所述装置静态培养或利用生物反应器培养使其成熟，以允许肾脏细胞分化成功能近端小管细胞。所述装置能够执行近端小管功能。本申请还描述用于制造所述近端小管装置的各种方法。本申请还描述使用生物人工近端小管装置对小管细胞转运、各种化合物的毒性效应、或药物化合物筛选进行例如体外研究的方法。

Description

生物人工近端小管系统及使用方法
本申请是与母案发明名称相同的分案申请，其母案的中国申请号是201280036409.8，国际申请号是PCT/US2012/039732，申请日是2012年5月25日。
相关申请的交叉引用
本申请要求2011年5月27日提交的美国临时申请No.61/490,890的权益，该申请内容全文以引用方式并入本文。
技术领域
本发明一般涉及一种生物人工近端小管装置，所述生物人工近端小管装置包括生物支架和一种或多种祖细胞(例如哺乳动物肾源性细胞)，所述一种或多种祖细胞在所述支架上分化成肾近端小管细胞单层。本发明还涉及用于在生物反应器中制造和培养所述装置的方法。本发明还提供使用所述装置进行体外肾毒性或药物化合物筛选的方法。
背景技术
慢性肾脏疾病(chronic kidney disease；CKD)和终末期肾脏疾病(end-stagerenal disease；ESRD)由肾脏功能的衰竭来界定，主要由肾小球滤过率来界定。这会导致肾脏不能排泄由身体产生的有毒代谢废物。在美国，CKD变得越来越普遍，与之伴随的是不良的健康结果和高的医疗成本。美国肾脏基金会估计2000万美国人患有CKD，且至少还有另外的2000万人民存在患上CKD的风险。ESRD则困扰着超过50万患者，而患有CKD的高危人群达到150万患者。用于CKD和ESRD的总成本占总医疗保险成本的几乎30％，然而这类患者仅占总医疗保险人口的8.1％(2008年美国肾病数据服务，2008年年度报告)。ESRD的发生率在过去的10年中增长了超过50％，且患有CKD或存在患上CKD风险的患者人数持续增长。因此，亟需能够修复损伤肾脏的新的治疗方式以及可判断所关注化合物的肾毒性的体外系统。
许多异生物质或因降解产生的分子通过向滤液的主动运转而从血液中清除，所述滤液经由肾脏的肾近端小管细胞而被运往膀胱。作为执行这种重要功能的结果，肾近端小管细胞常常会由于这些化合物的毒性作用而受损。因此，在体外系统中对潜在治疗性化合物的肾毒性测试已引起重大关注，此种测试可能会取代动物测试。
当前用于测试肾近端小管上皮细胞单层形成和功能的基于细胞培养的模型利用原代细胞，或者已利用从各种源(例如MDCK(犬肾传代细胞)、LLC-PK1(Lewis肺癌猪肾1)、或HK-2细胞)建立起的细胞系进行主要开发，所述细胞系是通过用人类乳头状瘤病毒16E6/E7基因转导而永生化的人类肾脏细胞系。利用这些细胞的测定系统通常利用多孔过滤器(例如过滤器)，所述多孔过滤器允许在细胞的顶点和基底外侧上发生流体接触，从而促进上皮细胞分化。
然而，利用这些细胞系具有若干缺点。这些细胞系中有许多是从肿瘤转化或衍生而来的，可能会改变其生长、分化、并最终改变功能特性。此外，这些细胞系中有许多不是来自人类的。因此，这些细胞在功能上和对各种化合物的反应上可存在种族差异。原代细胞的使用是繁重的，这是因为细胞通常是新鲜分离的，且在用于实验之前进行最低限度地增殖。在不期望细胞群的污染下进行分离过程可为费力的。此外，供体来源材料可具有显著可变性。
另一个常见的问题是原代细胞形成未受损单层的时间限制；此限制了进行体外研究的细胞实用性。原代细胞常常会过度生长、挣脱表面并形成三维聚集体，从而需要添加额外的因子(例如MEK抑制剂)来保持接触抑制(例如，如美国公开申请2009/0209019中所公开者)。多孔过滤器(例如过滤器)虽然有一定效果，但是由合成材料制成，因此不能精确地表示肾小管细胞在体内所通常暴露于其中的底层基质。
其他人中已描述了依赖于三维小管结构的形成或依赖于对从动物分离的肾小管的培养的替代筛选方法，所述三维管结构的形成利用原代细胞在3D胶(例如MATRIGELTM)内的固态表面上的上述过度生长而形成(参见WO 2010/064995A1)。后者由于费力的分离技术和所需考虑的物种差异而存在问题。这些替代方法的另一缺点在于，其仅能测定施加到培养基的外源化合物向肾小管官腔中的转运。无法测定这些化合物对肾小管正常功能(例如葡萄糖重吸收或白蛋白摄取)的影响，这是因为不存在可靠的方法将标记的测试物质引入到管腔中或对肾小管的腔液进行取样以进行测定。此外，无法测定流的变化以及可能在各种体外情景中发生的生理动态条件的影响。
因此，在本领域中需要开发一种能够更佳地反映肾近端小管上皮的正常生理机能的生物测定法。此最终能够开发出针对肾脏疾病的新的、更有效的疗法。
发明内容
本申请包括生物人工近端小管装置，所述装置具有脱细胞生物基质支架，在所述支架上由前体细胞(例如哺乳动物(例如人类)肾源性细胞)形成单层肾近端小管。
本发明描述一种生物人工近端小管装置，所述生物人工近端小管装置通过以下方法构成：制备脱细胞生物基质、用哺乳动物肾源性细胞和任选地哺乳动物内皮细胞来接种所述生物基质。接着，可对所述装置静态培养或利用生物反应器培养使其成熟，以允许肾脏细胞分化成功能近端小管细胞。所得装置能够执行近端小管功能，例如能够将分子从生物膜的任一侧转运到另一侧。本发明还描述用于制造所述生物人工近端小管装置并使其成熟的各种方法。本发明还描述使用所述生物人工近端小管装置对小管细胞转运、各种化合物的毒性效应、或药物化合物筛选进行体外研究的方法。
在一个实施例中，所述生物人工近端小管装置包括脱细胞生物基质支架，所述脱细胞生物基质支架在足以允许细胞分化成肾近端小管细胞的条件下用可分化成肾细胞的一种或多种细胞(例如可分化成肾细胞的前体细胞)来接种，其中这些分化细胞在所述支架上形成上皮细胞单层。所述生物人工近端小管装置还可任选地包括血管内皮细胞。
在另一个实施例中，所述生物人工近端小管装置包括脱细胞生物支架，所述脱细胞生物支架具有至少两个表面，其中至少一个表面在足以允许细胞分化成肾近端小管上皮细胞的条件下用可分化成肾细胞的一种或多种细胞(例如可分化成肾细胞的前体细胞)来接种，其中所述细胞在所述支架的表面上形成细胞单层。
在替代实施例中，所述生物人工近端小管装置包括脱细胞生物支架和位于所述支架表面上的肾近端小管上皮细胞单层，所述脱细胞生物支架来源于哺乳动物组织且具有一个或多个表面，其中所述上皮细胞单层是通过以下方法形成：在足以允许肾源性细胞分化成肾近端小管细胞的条件下用一种或多种哺乳动物肾源性细胞来接种所述表面并形成单层。可在生物反应器中执行对所述表面的接种。此种生物反应器可具有上部本体元件、具有供细胞生长的区域的下部本体元件、和一个或多个连接器。
所述可分化成肾细胞的一种或多种细胞(例如前体细胞)可为原代肾小管上皮细胞、诱导性多能干细胞或分化成肾细胞的祖细胞或肾祖细胞、从肾脏分离的干细胞或从肾脏分离的祖细胞、以及它们的混合物。在一个实施例中，所述可分化成肾细胞的一种或多种细胞是来自哺乳动物(例如人类)的肾源性细胞。这些肾源性细胞可从肾皮质、肾髓质、肾包膜下区域及其混合区域获得。
在又一个实施例中，所述生物人工近端小管装置包括具有至少两个表面的脱细胞生物支架，其中在足以允许肾源性细胞分化成肾近端小管细胞的条件下用一种或多种哺乳动物肾源性细胞来接种至少一个表面，所述细胞在所述支架的表面上形成上皮细胞单层。所述哺乳动物可为人类，且所述细胞可从肾皮质、肾髓质或肾包膜下区域获得。
在某些实施例中，所述脱细胞生物基质支架来源于哺乳动物组织。所述支架可来源于哺乳动物组织(例如猪组织)。例如，所述支架可来源于哺乳动物的胃、十二指肠、空肠、回肠或结肠。在本发明的一个实施例中，所述支架来源于小肠粘膜下层在另一个实施例中，所述脱细胞生物基质可来源于粘膜或粘膜下组织。
在本发明的一个实施例中，肾源性细胞能够在培养中自我更新和扩增，对Oct-4、Pax-2和Rex-1中的一种或多种的表达为阳性，且对Sox2、FGF4、hTert和Wnt-4中的一种或多种的表达为阴性。在另一个实施例中，肾源性细胞能够在培养中自我更新和扩增，对Oct-4和Pax-2中的一种或多种的表达为阳性，且对Sox2、FGF4、hTert和Wnt-4中的一种或多种的表达为阴性。
在另一个实施例中，肾源性细胞能够在培养中自我更新和扩增，对Eya1、Pax-2、WT1、FoxD1、BMP7、BMP2、GDF5、EpoR或Rex-1中的至少一种的表达为阳性，且对Sox2、FGF4、hTert或Wnt-4中的至少一种的表达为阴性。在某些实施例中，肾源性细胞也可对细胞表面标志HLA I、CD24、CD29、CD44、CD49c、CD73、CD90、CD166或SSEA-4中的至少一种为阳性，且对细胞表面标志HLA II、CD31、CD34、CD45、CD56、CD80、CD86、CD104、CD105、CD117、CD133、CD138、CD141或E-钙粘素中的至少一种为阴性。
在一些实施例中，可用哺乳动物血管内皮细胞来接种支架的第二表面。例如，所述血管内皮细胞可为内皮细胞系、内皮祖细胞、原代内皮细胞、微血管内皮细胞以及它们的混合物。
本发明的替代实施例是如下生物人工近端小管装置：所述生物人工近端小管装置包括脱细胞生物基质支架，所述脱细胞生物基质支架在足以允许前体细胞分化成肾近端小管上皮细胞的条件下用一种或多种前体细胞(即可分化成肾细胞的前体细胞)来接种，其中所述分化细胞在所述支架上形成上皮细胞单层。脱细胞生物基质支架可来源于哺乳动物组织(例如猪组织)，例如粘膜或粘膜下组织。在一个实施例中，脱细胞生物基质支架来源于哺乳动物消化道。在另一个实施例中，所述脱细胞生物基质支架来源于(例如得自)哺乳动物的胃、十二指肠、空肠、回肠或结肠。所述一种或多种前体细胞选自：原代肾小管上皮细胞、分化成肾细胞或肾祖细胞的诱导性多能干细胞、分化成肾细胞或肾祖细胞的祖细胞、从肾脏分离的干细胞或从肾脏分离的祖细胞、以及它们的混合物。在一个实施例中，所述祖细胞可为人类肾源性细胞。在一个实施例中，人类肾源性细胞能够在培养中自我更新和扩增，对Oct-4、Rex-1、Pax-2、钙粘素-11、FoxD1、WT1、Eya1、HNF3B、CXC-R4、Sox-17、EpoR、BMP2、BMP7或GDF5中的至少一种的表达为阳性；且对Sox2、FGF4、hTert、Wnt-4、SIX2、E-钙粘素或GATA-4中的至少一种的表达为阴性。任选地，这些细胞对细胞表面标志HLA-I、CD24、CD29、CD44、CD49c、CD73、CD90、CD166或SSEA-4中的至少一种为阳性；且对细胞表面标志HLA II、CD31、CD34、CD45、CD56、CD80、CD86、CD104、CD105、CD117、CD133、CD138和CD141中的至少一种为阴性。此外，所述细胞还任选地分泌营养因子FGF2、HGF、TGFα、TIMP-1、TIMP-2、MMP-2或VEGF中的至少一种；且不分泌营养因子PDGF-bb或IL12p70中的至少一种。
本发明的另一个实施例是如下生物人工近端小管装置：所述生物人工近端小管装置包括脱细胞生物支架，所述脱细胞生物支架具有至少两个表面，其中至少一个表面在足以允许细胞分化成肾近端小管上皮细胞的条件下用一种或多种前体细胞(即可分化成肾细胞的前体细胞)来接种，其中所述细胞在所述支架的表面上形成上皮细胞单层。所述脱细胞生物基质支架来源于哺乳动物组织(例如猪组织)。在一个实施例中，所述脱细胞生物基质支架来源于粘膜或粘膜下组织。作为另一种选择，脱细胞生物基质支架来源于哺乳动物消化道。在另一个实施例中，所述脱细胞生物基质支架来源于(例如得自)哺乳动物的胃、十二指肠、空肠、回肠或结肠。所述一种或多种前体细胞选自：原代肾小管上皮细胞、分化成肾细胞或肾祖细胞的诱导性多能干细胞、分化成肾细胞或肾祖细胞的祖细胞、从肾脏分离的干细胞或从肾脏分离的祖细胞、以及它们的混合物。在一个实施例中，所述祖细胞可为人类肾源性细胞。在一个实施例中，人类肾源性细胞能够在培养中自我更新和扩增，对Oct-4、Rex-1、Pax-2、钙粘素-11、FoxD1、WT1、Eya1、HNF3B、CXC-R4、Sox-17、EpoR、BMP2、BMP7或GDF5中的至少一种的表达为阳性；且对Sox2、FGF4、hTert、Wnt-4、SIX2、E-钙粘素或GATA-4中的至少一种的表达为阴性。任选地，这些细胞对细胞表面标志HLA-I、CD24、CD29、CD44、CD49c、CD73、CD90、CD166或SSEA-4中的至少一种为阳性；且对细胞表面标志HLA II、CD31、CD34、CD45、CD56、CD80、CD86、CD104、CD105、CD117、CD133、CD138和CD141中的至少一种为阴性。此外，所述细胞还任选地分泌营养因子FGF2、HGF、TGFα、TIMP-1、TIMP-2、MMP-2或VEGF中的至少一种；且不分泌营养因子PDGF-bb或IL12p70中的至少一种。在另一个实施例中，用哺乳动物的血管内皮细胞来接种支架的第二表面。这些血管内皮细胞可选自内皮细胞系、内皮祖细胞、原代内皮细胞或微血管内皮细胞。
本发明的又一实施例是一种使用所述近端小管装置的方法。因此，一个实施例是一种使一种或多种前体细胞分化成肾细胞的方法，所述方法包括：用一种或多种前体细胞来接种脱细胞生物基质支架(即可分化成肾细胞的前体细胞)；以及在足以允许前体细胞分化成肾近端小管上皮细胞的条件下在所述支架上培养所述细胞，其中所述分化细胞在所述支架上形成上皮细胞单层。所述脱细胞生物基质支架可具有两个表面。在一个实施例中，所述脱细胞生物基质支架来源于哺乳动物(例如猪组织)。因此，所述脱细胞生物基质支架可来源于(例如得自)粘膜组织或粘膜下组织。在另一个实施例中，所述脱细胞生物基质支架来源于(例如得自)哺乳动物的胃、十二指肠、空肠、回肠或结肠。所述方法选所利用的一种或多种前体细胞可选自：原代肾小管上皮细胞、分化成肾细胞或肾祖细胞的诱导性多能干细胞、分化成肾细胞或肾祖细胞的祖细胞、从肾脏分离的干细胞或从肾脏分离的祖细胞、以及它们的混合物。在一个实施例中，所述方法中所用的祖细胞是人类肾源性细胞。
在一个实施例中，所述方法中所用的人类肾源性细胞能够在培养中自我更新和扩增，对Oct-4、Rex-1、Pax-2、钙粘素-11、FoxD1、WT1、Eya1、HNF3B、CXC-R4、Sox-17、EpoR、BMP2、BMP7或GDF5中的至少一种的表达为阳性；且对Sox2、FGF4、hTert、Wnt-4、SIX2、E-钙粘素或GATA-4中的至少一种的表达为阴性。在另一个实施例中，这些细胞对细胞表面标志HLA-I、CD24、CD29、CD44、CD49c、CD73、CD90、CD166或SSEA-4中的至少一种为阳性；且对细胞表面标志HLA II、CD31、CD34、CD45、CD56、CD80、CD86、CD104、CD105、CD117、CD133、CD138和CD141中的至少一种为阴性。在另一个实施例中，所述细胞分泌营养因子FGF2、HGF、TGFα、TIMP-1、TIMP-2、MMP-2或VEGF中的至少一种；且不分泌营养因子PDGF-bb或IL12p70中的至少一种。
本发明的另一个实施例是一种使可分化成肾近端小管上皮细胞的一种或多种细胞在足以进行分化的条件下分化的方法，其中所述分化细胞形成上皮细胞单层，且所述细胞被施加张力。所述方法还可包括如下步骤：在使所述细胞分化之前，在脱细胞支架上接种所述细胞。当所述方法包括此步骤时，所述方法可用于产生本发明的生物人工装置。脱细胞生物基质支架可来源于哺乳动物(例如猪)组织，例如粘膜或粘膜下组织。在一个实施例中，脱细胞生物基质支架来源于哺乳动物消化道。在另一个实施例中，所述脱细胞生物基质支架来源于(例如得自)哺乳动物的胃、十二指肠、空肠、回肠或结肠。所述一种或多种可分化成肾细胞的细胞选自：原代肾小管上皮细胞、分化成肾细胞或肾祖细胞的诱导性多能干细胞或祖细胞、从肾脏分离的干细胞或从肾脏分离的祖细胞、以及它们的混合物。在一个实施例中，所述可分化成肾细胞的一种或多种细胞是哺乳动物的肾源性细胞(例如人类肾源性细胞)。所述哺乳动物肾源性细胞可从肾皮质、肾髓质、肾包膜下区域及其混合区域获得。在一个实施例中，肾源性细胞能够在培养中自我更新和扩增，对Oct-4、Pax-2和Rex-1中的一种或多种的表达为阳性，且对Sox2、FGF4、hTert和Wnt-4中的一种或多种的表达为阴性。在替代实施例中，肾源性细胞能够在培养中自我更新和扩增，对Eya1、Pax2、WT1、FoxD1、BMP7、BMP2、GDF5、EpoR或Rex-1中的至少一种的表达为阳性，且对Sox2、FGF4、hTert或Wnt-4中的至少一种的表达为阴性。在又一个实施例中，肾源性细胞对细胞表面标志HLA I、CD24、CD29、CD44、CD49c、CD73、CD166或SSEA-4中的至少一种也是阳性，且对细胞表面标志HLAII、CD31、CD34、CD45、CD56、CD80、CD86、CD104、CD105、CD117、CD133、CD138、CD141或E-钙粘素中的至少一种为阴性。
附图说明
在结合附图阅读上述发明内容以及以下对本发明的详细说明时能够更好地进行理解。出于说明本发明的目的，附图展示了本发明的实施例。然而应当理解，本发明不局限于示出的精确布置方式、实例和工具。
图1至图6显示对人类肾源性细胞的代谢参数的分析结果。图1A显示人类肾源性细胞培养物(“SW培养物”)中乳酸释放随时间的变化。图1B显示SW培养物中葡萄糖消耗随时间的变化。图2A显示SW培养物中LDH释放随时间的变化。图2B显示接种在脱细胞小肠粘膜下层(small intestine submucosa；SIS)上的人类肾源性细胞的细胞培养物(“SIS-SW培养物”)中乳酸释放随时间的变化。图3A显示SIS-SW培养物中葡萄糖消耗随时间的变化。图3B显示SIS-SW培养物中LDH释放随时间的变化。图4A显示从接种在脱细胞小肠粘膜下层上的人类肾源性细胞生长出的单层(“SIS-ML培养物”)中乳酸释放随时间的变化。图4B显示SIS-ML培养物中葡萄糖消耗随时间的变化。图5A显示SIS-ML培养物中LDL释放随时间的变化。图5B显示ML培养物中乳酸释放随时间的变化。图6A显示ML培养物中葡萄糖消耗随时间的变化。图6B显示ML培养物中LDH释放随时间的变化。在图1至图6中，n＝3。
图7和图8显示细胞外(即脱细胞)基质支架上的人类肾源性细胞(hKDC)的组织学染色。将人类肾源性细胞以2.5×103细胞/支架的浓度接种到三个不同的支架构型上，并培养三周。随后，固定样本并用苏木精-伊红(H&E)染色。图7A显示胶原夹层培养物的组织学染色。图7B显示胶原-脱细胞小肠粘膜下层(SIS)夹层培养物的组织学染色。图8A显示脱细胞SIS单层培养物的组织学染色。图8B显示胶原涂布的细胞小室培养物的组织学染色。
图9显示通过接种在细胞外(脱细胞)基质支架上的hKDC对水通道蛋白-1进行免疫组织化学检测。将人类肾脏细胞接种到脱细胞SIS支架上，并使其附着过夜。将样本培养三周，然后固定。随后，将3μm厚的切片与抗人体水通道蛋白-1抗体(Abcam,Cambridge)一起用于免疫组织化学(IHC)。箭头指示细胞的顶端染色区域。
图10显示接种在脱细胞支架上的hKDC的组织学染色。以两种不同的细胞浓度将人类肾源性细胞接种到脱细胞SIS支架上、培养三周、并固定。随后，用苏木精-伊红(H&E)对3μm厚的切片进行染色。图10A显示样品的H&E染色，该样品接种有1×104个细胞。图10B显示样品的H&E染色，该样品接种有5×104个细胞。
图11显示接种在脱细胞支架上的hKDC的三周培养物的凝集素染色。将人类肾源性细胞接种到脱细胞SIS支架上、培养三周、并固定。随后，用翅荚百脉根凝集素(图11A)和双花扁豆凝集素(图11B)对3μm厚的切片进行染色。图11A中的箭头和线指示阳性染色的区域。
图12显示接种在脱细胞支架上的hKDC的胶原IV染色。将人类肾源性细胞接种到脱细胞SIS支架上、培养三周、并固定。随后，用抗IV型胶原抗体对3μm的切片进行染色。
图13显示接种在脱细胞支架上的hKDC的Pgp-1染色。将人类肾源性细胞接种到脱细胞SIS支架上、培养三周、并固定。随后，用抗人类P-糖蛋白-1抗体对3μm厚的切片进行染色。
图14显示接种在脱细胞支架上的hKDC对荧光标记的牛血清蛋白(BSA-FITC)的摄入。将人类肾源性细胞接种到脱细胞SIS支架上，培养两周，然后在BSA-FITC的存在下培养1小时。随后，用DAPI(二脒基-2-苯基吲哚)对细胞进行复染色并对其成像。
图15是细胞培养生物反应器示意图，其中显示主要的反应器组件。
图16显示生物反应器的下部本体元件的详细视图。
具体实施方式
在本说明书和权利要求书通篇中使用与本发明的装置、使用所述装置的方法、和本发明的其他方面相关的各种术语。除非另外指明，否则此类术语被赋予本领域的通常含义。其他具体定义的术语应按照与本文所提供的定义相符的方式理解。
本发明基于如下发现：当可分化成肾细胞的前体细胞(可分化成肾细胞的细胞)(例如肾源性细胞)在允许分化的条件下被接种在脱细胞生物基质支架上时，会在所述支架的表面上形成肾近侧小管上皮细胞单层。
应当理解，本发明并非仅限于特定的方法、试剂、化合物、成分、或生物系统，当然，所述方法、试剂、化合物、成分、或生物系统可发生变化。另外应当了解，本文所用的术语只是为了描述具体实施例的目的，并非旨在进行限制。如本说明书和所附权利要求中所用，除非内容另有明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数含义。因此，例如，对“一个细胞”的提及包括两个或更多个细胞的组合等等。
如本文所用，用辞“约”在涉及可测量值例如量、时距等等时，意指涵盖与指定值±20％或±10％，更优选地±5％，甚至更优选地±1％，还更优选地±0.1％的变化，因为此类变化适合执行本发明所公开的方法。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。虽然与本文所述的那些方法和材料相似或等效的任意方法和材料都可以用于检验本发明的实践中，然而本文中描述优选材料和方法。在描述和要求保护本发明时，将使用以下术语。
“分化”是非特化(“未定向的”)或特化程度较低的细胞获得特化细胞(例如为肾脏细胞)特征的过程。“分化的细胞或诱导分化的细胞”是已经在细胞谱系中占据更特化的(“定向的”)位置的细胞。当应用于分化过程时，术语“定向的”是指已经在分化通路中进行到一定程度的细胞，其中在正常情况下，该细胞将继续分化成特定的细胞类型或一个亚群的细胞类型，并且在正常情况下，不能分化成不同的细胞类型或回复至分化程度更低的细胞类型。“去分化”指细胞回复到细胞的谱系当中特化(或定向)程度较低的地位的过程。如本文所用，细胞的“谱系”限定细胞的遗传关系，即它来自哪些细胞和它能产生什么细胞。细胞谱系将细胞定位于发育和分化的遗传计划内。“谱系特异性标记”指与所关注谱系的细胞的表型明确相关的特性，可用来评估未定向细胞相对于所关注谱系的分化。
在广义上，“祖细胞”是指能产生比其自身分化程度更高的后代并保持补充祖细胞数目能力的细胞。根据此定义，因为干细胞是最终分化细胞的更直接前体，故其本身也是祖细胞。在指本文所公开的细胞时，可使用“祖细胞”的此种广泛定义。分化细胞可来源于多能细胞，而多能细胞本身是来自多能细胞，以此类推。尽管每个这种多能细胞都可认为是干细胞，然而每个细胞所能产生的细胞类型的范围可显著不同。一些分化细胞也具有产生更大发育潜能的细胞的能力。此种能力可为自然的或者可在各种因子的处理下人工诱导产生。“增殖”是指细胞数目的增大。
本文所用的“肾脏祖细胞”是除产生具有同等潜能的子细胞之外、还可产生细胞(例如脂肪细胞或成骨细胞)或可产生一种或多种类型的组织(例如，肾组织)的哺乳动物(例如人类)肾源性细胞。“肾脏或肾祖细胞”是基本上起源于成人或胎儿肾脏组织的多向分化潜能细胞或多能细胞。已发现这些细胞具有多能干细胞的特征特性，包括快速增殖和分化成其他细胞谱系的潜能。“多向分化潜能”肾脏祖细胞可产生多个细胞谱系，例如，肾细胞谱系、脂肪细胞谱系、或成骨细胞谱系。肾脏祖细胞呈现早期发育基因标记、肾脏发育基因标记、后肾间充质基因标记、以及促进后肾间充质存活的基因的基因表达谱。例如，肾脏祖细胞(例如人类肾源性细胞)所呈现的基因表达谱对包括但不限于Oct-4、Pax-2和Rex-1的基因的表达为阳性，而对包括但不限于Sox2、FGF4、hTERT和Wnt-4的基因的表达为阴性。
“组织”是指特化程度相似的细胞组成的群组或层，这些细胞一起执行某些特定的功能。“器官”是指两个或更多个相邻的组织层，这些组织层保持某种形式的细胞-细胞和/或细胞-基质相互作用，以形成微体系结构。
“肾脏”是指腹腔中的一对器官其中之一。肾脏从血液中移除废物(作为尿)、产生促红细胞生成素以刺激红细胞产生、且在血压调节中起作用。肾脏的作用是维持适当的水-电解液平衡、调节酸碱浓度、以及滤过血液中的代谢废物，所述代谢废物随后以尿的形式被排泄。
“原代培养物”是指允许从组织分离的多种不同细胞类型相互作用的混合细胞群。词语“原代”采用其在组织培养领域中的通常意义。“能够在培养中自我更新和扩增”涉及如下哺乳动物肾源性细胞群：所述细胞群在细胞培养中成长和分裂，且如细胞标志所测量保持基本上相同的表型，并保持从母细胞到子细胞的营养因子分泌。在哺乳动物肾源性细胞群增殖过程中的某一时间点，所述表型可变化至肾源性细胞的特化或分化程度更高的状态。
有多个术语用于描述培养中的细胞。“细胞培养物”一般是指取自活体且在控制条件下生长(例如“培养中”的细胞。“原代细胞培养物”是直接取自有机体的细胞、组织或器官在第一继代培养之前的培养物。当在利于细胞生长和/或分裂的条件下将细胞放置在生长培养基中时，细胞会“扩增”，从而产生更大的细胞群。当细胞在培养中扩增时，有时通过细胞数目翻倍所需的时间量来测量细胞增殖率。此被称为“倍增时间”。
“细胞系”是由原代细胞培养物的一个或多个继代培养形成的细胞群。每一轮继代培养都被称为传代。当对细胞进行继代培养时，所述细胞称为被“传代”。有时特定的细胞群或细胞系是指被传代的次数或以被传代的次数为特征。例如，一个已传代了十次的培养细胞群可以被称为“P10”培养物。原代培养物(即，在将细胞从组织分离后的第一次培养物)被指定为P0。在第一次继代培养后，细胞被描述为次代培养物(P1或第1代)。在第二次继代培养后，细胞变成三代培养物(P2或第2代)，依此类推。本领域的技术人员应当理解，在传代期间，可以有多次群体倍增；因此，培养物的群体倍增数通常大于传代数。细胞在各次传代之间的期间中的扩增(即群体倍增数目)取决于许多因素，包括但不限于接种密度、基底、培养基和各次传代之间的时间。
一般来讲，“营养因子”被定义为促进细胞存活、生长、增殖、成熟、分化、和/或维持，或刺激细胞活动增强的物质。本文所用的“营养支持”是指促进细胞存活、生长、增殖、成熟、分化、和/或维持，或刺激细胞活动增强的能力。本发明的哺乳动物肾源性细胞群产生营养因子，包括但不限于：生长因子、细胞因子、和分化因子。所述营养因子包括但不限于：FGF2、HGF、TGFα、TIMP-1、TIMP-2、VEGF、MMP-2或其组合。
“非免疫原性”是指在大部分哺乳动物治疗对象中不会引起有害免疫反应的细胞或细胞群，所述有害免疫反应是危害哺乳动物对象的健康或干扰哺乳动物治疗对象的治疗反应的免疫反应。
“基因”是指核酸序列编码基因产物。基因任选地包括基因表达所需的序列信息(例如，启动子、增强子等)。术语“基因组”是指有机体的基因组。
“基因表达数据”是指包含与不同方面的基因表达相关的信息的一组或多组数据。所述数据组任选地包括与以下有关的信息：靶转录在细胞或细胞源性样品中的存在；靶转录的相对和绝对丰度水平；诱导特定基因表达的各种处理能力；和使特定基因的表达改变至不同水平的各种处理能力。
“基因表达谱”是指多个基因在无选定表达条件(即，基线或控制)的情况下、或响应于选定的表达条件(例如，在一个或多个时间点处存在标准化合物或测试化合物的孵育)的表达水平的表示。可依据为每一基因转录的mRNA的绝对数量将基因表达表示成测试细胞中的转录mRNA相对于对照细胞中的转录mRNA的比率。也涉及单个基因及由单个基因构成的组合在受试者中的表达。
“分离”或“纯化”是指“经人手”从自然状态改变，即自然中存在的任何事物从其原始环境被移除时便定义为“分离”，或者上述两种情形。“分离”也定义与污染物(即与细胞不同的物质)分离的组合物，例如哺乳动物肾源性细胞群。在一方面，细胞群或组合物基本上不存在自然环境中可与其相关联的细胞和材料。关于哺乳动物肾源性细胞所述的“分离”或“纯化”或“基本上纯化”是指构成总细胞群的哺乳动物肾源性细胞具有至少约50％、至少约75％、优选地至少约85％、更优选地至少约90％、最优选地约95％的纯度。另一种说法，术语“基本上纯化”是指本发明的哺乳动物肾源性细胞群在后续培养和扩增之前在初始分离的未扩增群中包含少于约50％、优选地少于约30％、优选地少于约20％、更优选地少于约10％、最优选地少于约5％的谱系定向肾脏细胞。细胞群或组合物的纯度可通过本领域中已知的适当方法来测定。
如本文所用，术语“源性”也指获得。因此，例如人类肾源性细胞是从人类肾脏组织分离和获得的细胞。该术语也包含从组织获得(例如分离)并随后进行培养的细胞。
本发明公开一种近端小管装置，所述近端小管装置包括脱细胞生物支架和肾近端小管细胞上皮单层，所述肾近端小管细胞上皮单层是由可分化成肾细胞的细胞形成。所述支架和细胞一起形成多组分二维近端小管装置。此种肾近端小管细胞上皮单层由功能性近端小管细胞构成。
本发明的近端小管装置最佳地在不使用抑制剂(例如MEK抑制剂)的情况下促进接触抑制和未受损单层形成的自然调节机制的运作。通过使用脱细胞生物支架，本发明的近端小管装置也有利地表示和/或模仿肾细胞在体内所通常暴露于其中的底层基质。最佳地，在自然脱细胞支架上接种使细胞能够分化并形成上皮细胞单层，所述上皮细胞单层比通过传统方法产生的那些单层更稳定。
本发明描述一种二维近端小管装置，所述二维近端小管装置可用作用于转运研究、肾毒性筛选、或用于筛选治疗剂效果的体外测试系统。在一个实施例中，所述二维生物人工肾近端小管装置通过以下方式构成：用肾脏祖细胞来接种脱细胞生物支架，且任选地，在一些情况下也用微血管内皮细胞来接种所述支架，随后进行静态培养或在生物反应器中进行培养，以允许肾脏细胞分化成功能性近端小管细胞并保持用于体外测试的组装装置。这些功能性近端小管细胞在所述支架的表面上形成单层。
本发明还描述了使用脱细胞生物支架作为所述生物人工近端小管装置的组件。可用细胞来接种脱细胞生物支架的一个或多个表面。在一个实施例中，脱细胞支架可来源于任何哺乳动物组织，优选地来源于消化道的某些部分，最优选地来源于胃、十二指肠、空肠、回肠或结肠。在一个实施例中，支架最优选地来源于空肠的一部分。在一个实施例中，所述脱细胞生物支架来源于粘膜或粘膜下组织。在另一个实施例中，所述脱细胞生物支架来源于哺乳动物小肠粘膜下层。脱细胞支架或其某些部分可固定在允许对支架表面的每一侧进行接种的装置中。
用于形成脱细胞支架的源组织可为任何哺乳动物组织，包括但不限于人类、灵长类动物、牛、羊、猪或大鼠组织。在本发明的一个实施例中，所述组织是从哺乳动物分离。在另一个实施例中，脱细胞支架来源于哺乳动物细胞培养物。在另一个实施例中，所述源组织是猪组织。在优选的实施例中，所述支架来源于从幼龄动物分离的猪组织，例如小于6个月大的幼龄动物或小于3个月大的动物。在更优选的实施例中，所述支架是从约10到25kg重、(作为另一选择)约10到20kg重、以及(作为另一选择)约15到约20kg重的幼龄动物分离的猪组织。在最优选的实施例中，支架来源于从约10到约15kg重的动物分离的猪组织。
可使用传统的方法来执行组织的去细胞(例如脱细胞)。在一个实施例中，在分离期间保留所分离组织的粘膜结构。在优选的实施例中，所述粘膜结构随后被部分或全部移除以暴露粘膜下层，从而进行细胞附着。在本发明的一个实施例中，在粘膜结构上培养肾脏祖细胞。据观察，在粘膜下结构上培养时采用上皮细胞形态的肾脏祖细胞的比例比在粘膜结构上培养时更高。因此，在替代实施例中，最佳地在粘膜下结构上培养肾脏祖细胞。
如本文所用，术语“可分化成肾细胞的细胞”是指可分化成肾细胞的前体细胞，例如可分化成肾细胞的任何祖细胞、前体细胞或原代细胞。在一个实施例中，细胞可选自以下细胞：原代肾小管上皮细胞、分化成肾细胞或肾祖细胞的祖(例如干)细胞(例如诱导性多能干细胞)、人类肾源性细胞、从肾脏分离的干细胞或从肾脏分离的祖细胞、以及它们的混合物。可使用任何可分化成肾细胞或肾祖细胞的祖(例如干)细胞，包括但不限于例如胚胎干细胞、iPS细胞、脐源性细胞、胎盘源性细胞或间充质干细胞。
在本发明的一个实施例中，可分化细胞是哺乳动物肾源性细胞。因此，本发明的一个实施例是使用从哺乳动物的肾脏(例如人类肾脏)分离的哺乳动物肾源性细胞作为所述生物人工肾系统的组成。前文已述，如授予Colter等人的美国公开申请2008/0112939所述，祖细胞可来源于人类肾脏组织以及可自我组织成小管结构并可用于治疗患病肾脏的那些肾源性细胞，该申请的公开内容全文以引用的方式并入本文。
授予Colter等人的美国公开申请2008/0112939中描述了用于分离、培养和表征哺乳动物肾源性细胞的示例性技术。如美国公开申请2008/0112939所述，人类肾源性细胞是从人类肾脏分离且适于器官移植。在一个实施例中，在分离细胞之前，通过用任何适宜的介质或缓冲液(例如磷酸盐缓冲盐水)冲洗而从肾脏组织移除血液和杂物。接着，通过酶消化法从哺乳动物肾脏组织分离肾源性细胞(例如人类肾源性细胞)。利用酶使细胞从哺乳动物(例如人类)肾脏组织游离。在一个实施例中，使用分散酶。作为另外一种选择，可使用中性蛋白酶(例如分散酶)、金属蛋白酶(例如胶原酶)和透明质酸酶的组合使细胞从哺乳动物(例如人类)肾脏组织游离。随后将分离的细胞转移到初始涂布有明胶的无菌组织培养皿。在能够维持细胞生长的任意培养基中培养哺乳动物(例如人类)肾源性细胞，所述培养基例如为但不限于REGMTM肾上皮细胞生长培养基(Lonza,Walkersville,MD)或AdvancedTMDMEM/F12(Invitrogen)。
可分化成肾细胞的细胞(例如可分化成肾细胞的前体细胞)或哺乳动物肾源性细胞可为细胞群。在一个实施例中，使用人类肾源性细胞群。在另一个实施例中，该群为同质群。在另一个实施例中，该群为基本上同质的群。
在一些实施例中，所述肾源性细胞可从肾皮质、肾髓质、或肾包膜下区域及其混合区域获得。
哺乳动物(例如人类)肾源性细胞由表型特性(例如形态、生长势、表面标志表型、早期发育基因表达、肾脏发育基因表达和营养因子分泌)表征。培养中的人类肾源性细胞群经多次传代之后保持表面标志、基因表达和营养因子分泌表型。
在优选的实施例中，分离的哺乳动物肾源性细胞(即细胞群)能够在培养中自我更新和扩增，并表现出独特的表达谱(例如下述表达谱的任一种)。
在本发明的另一个实施例中，人类肾源性细胞对Oct-4、Rex-1、Pax-2、钙粘素-11、FoxD1、WT1、Eya1、HNF3B、CXC-R4、Sox-17、EpoR、BMP2、BMP7或GDF5中的至少一种的表达为阳性。在又一个实施例中，所述细胞对Sox2、FGF4、hTert、Wnt-4、SIX2或GATA-4中的至少一种的表达为阴性。在替代实施例中，所述细胞对Oct-4、Rex-1、Pax-2、钙粘素-11、FoxD1、WT1、Eya1、HNF3B、CXC-R4、Sox-17、EpoR、BMP2、BMP7或GDF5中的至少一种的表达为阳性，且对Sox2、FGF4、hTert、Wnt-4、SIX2或GATA-4中的至少一种的表达为阴性。在替代实施例中，所述细胞对Eya1、WT1、FoxD1、BMP7、BMP2、GDF5、EpoR或Rex-1中的至少一种的表达为阳性。在又一个替代实施例中，所述细胞对Sox2、FGF4、hTert或Wnt-4中的至少一种的表达为阴性。在替代实施例中，所述细胞对Eya1、WT1、FoxD1、BMP7、BMP2、GDF5、EpoR或Rex-1中的至少一种的表达为阳性，且对Sox2、FGF4、hTert或Wnt-4中的至少一种的表达为阴性。在本发明的一个实施例中，人类肾源性细胞对细胞表面标志HLA I、CD24、CD29、CD44、CD49c、CD73、CD166或SSEA-4中的至少一种也是阳性。在另一个实施例中，人类肾源性细胞对细胞表面标志HLA II、CD31、CD34、CD45、CD56、CD80、CD86、CD104、CD105、CD117、CD133、CD138、CD141或E-钙粘素中的至少一种也是阴性。在替代实施例中，人类肾源性细胞对细胞表面标志HLAI、CD24、CD29、CD44、CD49c、CD73、CD166或SSEA-4中的至少一种也是阳性，且对细胞表面标志HLA II、CD31、CD34、CD45、CD56、CD80、CD86、CD104、CD105、CD117、CD133、CD138、CD141或E-钙粘素中的至少一种为阴性。在一个实施例中，人类肾源性细胞可分泌营养因子FGF2、HGF、TGFα、TIMP-1、TIMP-2、MMP-2或VEGF中的至少一种。在优选的实施例中，所述细胞不分泌营养因子PDGFbb和IL12p70中的至少一种。
在替代实施例中，和所述生物人工近端小管装置一起使用的祖细胞是人类肾源性细胞。这些人类肾源性细胞能够在培养中自我更新和扩增，对Oct-4、Rex-1、Pax-2、钙粘素-11、FoxD1、WT1、Eya1、HNF3B、CXC-R4、Sox-17、EpoR、BMP2、BMP7或GDF5中的至少一种的表达为阳性；且对Sox2、FGF4、hTert、Wnt-4、SIX2、E-钙粘素或GATA-4中的至少一种的表达为阴性。此外，人类肾源性细胞对细胞表面标志HLA-I、CD24、CD29、CD44、CD49c、CD73、CD90、CD166或SSEA-4中的至少一种也可为阳性；且对细胞表面标志HLA II、CD31、CD34、CD45、CD56、CD80、CD86、CD104、CD105、CD117、CD133、CD138和CD141中的至少一种为阴性。此外，这些细胞任选地分泌营养因子FGF2、HGF、TGFα、TIMP-1、TIMP-2、MMP-2或VEGF中的至少一种；且不分泌营养因子PDGF-bb或IL12p70中的至少一种。
在又一个实施例中，人类肾源性细胞(1)对Oct-4、Rex-1、Pax-2、钙粘素-11、FoxD1、WT1、Eya1、HNF3B、CXC-R4、Sox-17、EpoR、BMP2、BMP7和GDF5的表达为阳性，且(2)对Sox2、FGF4、hTert、SIX2和Gata-4的表达为阴性。在替代实施例中，肾源性细胞(1)对Oct-4、Rex-1、Pax-2、钙粘素-11、FoxD1、WT1、Eya1、HNF3B、CXC-R4、Sox-17、EpoR、BMP2、BMP7和GDF5的表达为阳性；(2)对Sox2、FGF4、hTert、SIX2和Gata-4中的至少一种的表达为阴性；(3)对细胞表面标志HLA I、CD24、CD29、CD44、CD49c、CD73、CD166和SSEA-4为阳性；且(4)对HLAII、CD31、CD34、CD45、CD56、CD80、CD86、CD90、CD104、CD105、CD117、CD133、CD138、CD141和E-钙粘素为阴性。
在另一个实施例中，人类肾源性细胞能够在培养中自我更新和扩增，对HLA I和CD44的细胞表面标志表达为阳性，对Oct-4、Pax-2和WT1的基因表达为阳性，且对CD133的细胞表面标志表达和Wtn-4的基因表达为阴性。在一个实施例中，人类肾源性细胞还对BMP7、BMP2、GDF4、EpoR和Rex-1的基因表达为阳性，且对Sox2、FGF4和hTert的基因表达为阴性。
在替代实施例中，人类肾源性细胞满足以下条件：(1)能够在培养中自我更新和扩增。(2)对HLA-I的表达和Oct-4、Rex-1、Pax-2、钙粘素-11、FoxD1、WT1、Eya1、HNF3B、CXC-R4、Sox-17、EpoR、BMP2、BMP7或GDF5中的至少一种的表达为阳性；且(3)对CD133的表达和SOX2、FGF4、hTert、Wnt-4、SIX2、E-钙粘素或GATA-4中的至少一种的表达为阴性。这些细胞还满足以下条件：(4)对细胞表面标志CD24、CD29、CD44、CD49c、CD73、CD90、CD166或SSEA-4中的至少一种为阳性，且(5)对细胞表面标志HLA II、CD31、CD34、CD45、CD56、CD80、CD86、CD104、CD105、CD117、CD133、CD138、CD141和E-钙粘素中的至少一种为阴性。这些细胞也可分泌营养因子FGF2、HGF、TGFα、TIMP-1、TIMP-2、MMP-2或VEGF中的至少一种，且不分泌营养因子PDGFbb或IL12p70中的至少一种。在替代实施例中，人类肾源性细胞是细胞群。
可将哺乳动物(例如人类)肾源性细胞传代到单独的培养皿中，该培养皿包含与最初使用的培养基相同或不同类型的新鲜培养基，细胞群能够在该培养皿中以有丝分裂方式扩增。随后，将哺乳动物(例如人类)肾源性细胞接种到生物基质中并进行培养，以使肾源性细胞分化成功能性近端小管细胞。本发明的细胞可在零代和衰老之间的任何时间点使用。细胞优选地传代约3次至约20次、约5次至约10次、约15次至20次、约5次至约7次，更优选地传代约3次至约7次。
在本发明的一个实施例中，在脱细胞生物支架的两个或更多个表面上接种细胞。在一个实施例中，在支架的一个表面上接种血管内皮细胞，在另一表面上接种哺乳动物肾源性细胞。随后培养已接种的支架，以使肾源性细胞分化成功能性近端小管细胞，并使相对的表面上形成血管内皮单层。
在一个实施例中，用于支架增殖的人类血管内皮细胞可选自内皮细胞系、骨髓或全血内皮祖细胞、或原代内皮或微血管内皮细胞。利用传统方法分离所用的血管内皮细胞。在优选的实施例中，用于支架增殖的细胞是原代微血管内皮细胞。在一个实施例中，可从任何哺乳动物源分离所用的血管内皮细胞。在优选的实施例中，所分离的血管内皮细胞来自人类。在替代的优选实施例中，血管内皮细胞是从哺乳动物(人类)肾脏分离的原代微血管内皮细胞。
本发明的另一个实施例是一种用于制作所述近端小管装置的设备。
在一个实施例中，利用专门设计的设备(“冠”)完成对脱细胞支架的接种，脱细胞支架的一部分被插入到该设备中，使支架的边缘置于两个金属或塑料片之间，从而有效地密封所述边缘，以形成由支架隔开的上部凹槽和下部凹槽。冠还将一些拉伸和张力引入到脱细胞支架中。随后，将细胞接种到上部凹槽中并使其安放在脱细胞支架上。也可将冠翻过来，以对支架的另一侧接种，或者可将冠拆卸，将支架翻过来，并重新组装到冠，以接种相对的表面。可以如下密度将肾细胞接种到支架上：约500个细胞/cm2至约350,000个细胞/cm2、(作为另一选择)约1,000个细胞/cm2至约100,000个细胞/cm2、(作为另一选择)约750个细胞/cm2至约75,000个细胞/cm2、(作为另一选择)约10,000个细胞/cm2至约300,000个细胞/cm2、(作为另一选择)约7,500个细胞/cm2至约200,000个细胞/cm2、和优选地约5,000个细胞/cm2至约70,000个细胞/cm2。
接着，利用传统技术培养用所述设备接种细胞的支架，以允许肾细胞分化并形成连续的上皮细胞单层。培养时间可为培养1至6周、优选地培养2至4周、最优选地培养3至4周。然后，可利用所得的成熟近端小管装置以传统方法进行肾转运研究、肾毒性测试、或治疗剂的测试。
在另一个实施例中，接种支架上的细胞以及体外测试系统的培养通过以下方式实现：将支架放置在定制设计的生物反应器中，使得支架在两个隔室之间形成屏障。生物反应器腔室连接至流体流系统，该流体流系统被设计成允许流体流穿过支架的两个表面。通过改变流动系统的特性(例如流率)，可根据所接种的细胞类型为支架的每一侧建立细胞特定流体力学条件，例如以支持基底外侧的内皮细胞的功能。可在将支架放置到生物反应器中之前对支架预先接种细胞，或者在将支架放置到生物反应器中之后在生物反应器内接种细胞。在另一方面，生物反应器被设计成使施加到放置在生物反应器内的脱细胞构造的张力可视需要改变，以利于细胞的接种和/或分化。
在一个实施例中，使用所述用于接种肾细胞和任选地内皮细胞的设备用细胞来接种脱细胞支架。然后从所述设备移除接种有细胞的支架并将其转移到生物反应器腔室中以进行培养或测定，如下文中的各实例所述。在转移到生物反应器腔室之前，可首先将接种有细胞的支架在所述设备中培养约0至4周。可以如下密度将肾细胞接种到支架上：约500个细胞/cm2至约350,000个细胞/cm2、优选地约5000个细胞/cm2至约70,000个细胞/cm2。培养条件(包括在设备中的孵育时间长短)可根据细胞源和细胞培养基而改变。
在另一个实施例中，首先将脱细胞支架放置在生物反应器腔室内，然后通过将细胞悬液灌注到生物反应器腔室中并孵育一段时间来对支架进行接种，以允许细胞附着到脱细胞支架上。此种生物反应器包括上部本体元件和下部本体元件，所述下部本体元件具有设计用于支架生长的区域。
图15中显示适用于本发明的一个示例性生物反应器。结合图15，生物反应器100的组件为：主体元件、上部本体元件110和下部本体元件120、两个夹子—前夹130和后夹160、外闭合盖—下部外闭合盖140和上部外闭合盖150、和连接器170。前夹130和后夹160将生物反应器100的主要反应器上部本体元件110和下部本体元件120保持在一起。上部外闭合盖150位于上部本体元件110的顶部上。下部外闭合盖140位于下部本体元件120的下方。图16是生物反应器的下部本体元件120的视图，其显示沟槽180，该沟槽的深度可随上部本体元件中的框架改变以调整脱细胞支架上的张力。下部本体元件120还包含供细胞生长的区域190。
在一个实施例中，可将未接种的支架放置在生物反应器100的上部本体元件110和下部本体元件120之间(参见图15)。利用下部本体元件120中的对应沟槽结构在上部本体元件110中研磨出圆形框架构造，该圆形框架构造使支架的固定相当于细胞冠。可利用沟槽深度和框架桥宽不同的专门设计的框架/沟槽组合来调整张力。框架可运动到沟槽180中的距离(参见图16)决定支架的张力，且距离越大导致张力越高。必须考虑像支架直径和支架厚度等因素。在将支架定位之后，生物反应器的前夹130和后夹160将上部本体元件110和下部本体元件120保持在一起，且此构造可像细胞冠那样手持。下部外闭合盖140和上部外闭合盖能将系统闭合，且可经由生物反应器的连接器170将细胞悬液引入到支架的一侧。细胞在细胞生长区域190中生长。在其中所接种细胞可进行附着的细胞特异性时间段中，可将闭合的生物反应器翻转并在支架的另一侧上接种第二种细胞类型或相同的细胞类型。在一个实施例中，用于接种的细胞悬液可介于约103个细胞/ml至约107个细胞/ml。为避免接种在第一侧上的细胞失去生活力，可用培养基填充第一侧的隔室。如果需要静态条件，则可用细胞培养基填充隔室。作为另外一种选择，可利用连接器170在各种流动条件下开始灌注培养基。
在细胞附着到支架之后，可仅通过用培养基灌注腔室隔室并闭合生物反应器的连接器而对细胞进行静态培养。作为另外一种选择，将流动系统的管联接到生物反应器并开始灌注。随后培养在生物反应器内被接种到脱细胞支架上的细胞，以使细胞生长并分化成肾小管细胞的功能单层。细胞的培养可包括静态培养，或更优选地包括在动态条件(例如线性流或脉动流)下培养。流率、压力和脉动条件均可发生改变以利于细胞生长和分化成功能肾细胞。培养基在生物反应器中的平均流率可介于1至25ml/min、作为另一选择介于约1至约10ml/min、作为另一选择介于约2.5至约10ml/min、作为另一选择介于约5至20ml/min。在优选的实施例中，平均流率可介于约2.5至15ml/min。培养期可介于约1周至约4周、作为另一选择介于约1周至约2周、作为另一选择介于约1周至约3周、作为另一选择介于约2周至约4周。在优选的实施例中，培养期可优选地介于约2周至3周。在此期间，可利用本领域中已知的技术来监视细胞层整体性。在一个实施例中，可通过以下方式来监视细胞层整体性：利用整合在生物反应器的每一隔室中的电极测量跨上皮的电阻，或者测量各种荧光标记分子(例如菊粉或肌酐酸)穿过单层的渗漏。在另一个实施例中，在每一腔室中使用不同的细胞培养基。在又一个实施例中，可在每一腔室中采用不同的流率、压力和脉动条件，以经由流动指数剪切应力实现细胞特异性培养。也可在专利申请No.DE 102008056037.5-41和EP2184344中找到对生物反应器的描述，所述专利申请的公开内容全文以引用方式并入本文。
本发明的另一个实施例是一种通过使细胞在张力下分化而使可分化成肾细胞的细胞(例如哺乳动物(人类)肾源性)细胞分化成稳定的肾近端小管细胞单层的方法。此种方法还可包括使用本发明的支架产生本发明的近端小管装置。
本发明的近端小管装置可用作进行肾毒性筛选或治疗剂筛选的体外测试系统。在另一个实施例中，所述装置可用于在暴露于化合物或颗粒期间或之后监视小管细胞功能(例如转运)。针对每一表面上方的流可采用不同的培养基配方，使得能够研究穿过细胞和支架层从一个培养基隔室到另一个隔室的转运。此种培养基配方的一个例子将在接种有mvEC的隔室中遵循内皮细胞培养基，且在包含肾小管单层的相对隔室中遵循模仿肾小球滤液的的培养基配方。
接着，可利用本领域中的技术人员已知的标准技术和标记分子来评估肾小管单层的转运功能。可通过以下方式实现毒性筛选：将所关注的化合物或颗粒添加到为内皮细胞提供营养素且接触内皮细胞的血管隔室流动路径中，或者将化合物或颗粒引入到为肾小管细胞提供营养素且接触肾小管细胞的小管隔室流动路径，以分别模仿毒性异生化合物在血液和尿液中的出现。可通过测定所述流动路径其中之一或二者的培养基来监视化合物或颗粒的转运。此外，可通过在暴露至所关注的化合物之后测定细胞生活力、形态、或转运功能效果来监视毒性。用于评估化合物或颗粒的毒性或治疗作用的测定方法并不仅限于上述方法。
可通过首先损害生物人工装置的肾源性细胞、然后用测试治疗颗粒治疗所述细胞来测定治疗靶点。所述损害可以物理或化学方式引入，例如将细胞暴露在有毒化合物或颗粒(例如顺铂或链脲佐菌素)中。可通过将测试治疗化合物或颗粒添加到装置的血管隔室流动路径中而使所述化合物或颗粒与细胞接触，其浓度例如将模仿对治疗剂进行静脉(IV)输液之后细胞所暴露其中的浓度。随后可利用对肾小管细胞功能的监视来判断所施用测试治疗化合物的有效程度。
监视小官功能包括但不限于检测或评估以下内容：肾小管细胞对化合物或颗粒的摄入；细胞所摄入的化合物或颗粒从近端小管装置的一个培养基隔室到另一个隔室的转运；抑制剂对摄入或转运的影响；以及肾小管细胞基因或蛋白表达、形态、细胞标记表达、酶活性或成活率的变化。用于评估化合物或颗粒的毒性或治疗作用的测定方法并不仅限于上述方法。
本发明的另一个实施例是包括本发明生物人工近端小管装置的试剂盒。在一个实施例中，所述试剂盒包括生物人工小管装置和产品说明书。
本发明的替代实施例是包括本发明的生物人工近端小管装置的组合物。在一个实施例中，所述组合物包括本发明的生物人工近端小管装置和药学上可接受的载体。
无需进一步描述，相信本领域的普通技术人员能够利用前述说明和以下例示性实例制造和利用本发明并实践本发明所主张的方法。因此，以下工作实例具体指出本发明的优选实施例，且不应被视为以任何方式限制本公开的其余内容。另外，如以下实例和本说明书在别处所用，可用于本发明的装置和方法的肾源性细胞(“hKDC”)可根据美国专利公布No.2008/0112939的公开内容来分离和表征，所述专利公布涉及hKDC的描述、分离和表征的全部内容以引用方式并入本文。
实例
实例1：hKDC在细胞外基质支架上的接种和分化
本实验测试人类肾源性细胞(“hKDC”)在各种构型的细胞外(即脱细胞)基质支架上的附着、生长和分化以及测试在胶原涂布的细胞小室上的传统培养。
将4次传代的hKDC接种到三个不同的支架构型上和细胞小室(Corning,CorningNY)上。用REGMTM肾上皮细胞生长培养基(Lonza,Walkersville MD)将细胞培养超过三周的时间。用三种不同的细胞浓度对每一种支架构型进行测试：2.5×103、5×103、和1×104个细胞。所测试的构型为：1)胶原夹层培养；2)胶原-SIS夹层培养；3)SIS单层培养；和4)胶原涂布的细胞小室。
胶原夹层培养
在24孔培养板上将hKDC培养在两个胶原凝胶层之间。通过以下方式浇铸底部凝胶：首先将冷凝胶中和液与胶原(从大鼠尾腱分离的类型1，在0.1％的乙酸中为6mg/ml)以1:2的比例混合，随后在每个孔中添加500μl的这种溶液。在37℃/5％CO2的条件下孵育15分钟，该溶液形成凝胶。之后，在每个孔中，将细胞接种在1ml培养基中。24小时后，浇铸覆盖凝胶。将培养基抽出，并用移液管将300μl的凝胶溶液(上文中所制备者)吸移到每个孔中。在37℃/5％CO2条件下孵育15分钟，该溶液形成凝胶。最后，在每个孔中添加1ml的培养基。
小肠粘膜下层(SIS)单层培养
通过以下方式制备支架：利用传统方法将小婵粘膜下层(SIS)的某些片段脱细胞化。简言之，用物理方法将猪小肠的某些片段的黏液移除。之后，通过以下方式执行脱细胞化：在4摄氏度下、3.4％的脱氧胆酸钠中伴随震荡将所述肠片段1孵育小时。随后用PBS大量冲洗脱细胞片段并用伽马射线杀菌。对于SIS单层培养使用12孔培养板。在接种细胞的前一天，使脱细胞的SIS横跨圆的金属支架并在每个孔中对其覆盖1ml的培养基。横跨的SIS表面大小近似等于24孔培养板中的孔的表面。为将细胞接种到SIS上，移除细胞培养基，且在每个孔中将适量的细胞接种在1ml培养基中。
SIS夹层培养
如上所述制备SIS支架并接种hKDC。在使细胞附着24小时之后，像在胶原夹层培养中一样在细胞上方浇铸覆盖凝胶(参见上文)。
细胞小室培养
将细胞小室转移到12孔培养板中并将每一个涂布200μl的1型胶原(在0.1％乙酸中为100μg/ml)。在室温下将涂布溶液孵育20分钟，随后抽出。在每个孔中将适量的细胞接种在1.5ml培养基中。
将多个样品在上述每一种条件中培养三周。在一周、两周、和三周之后移除样品进行组织学分析。此外，用RANDOX RX DAYTONATM临床分析仪分析培养基样品，已得到以下代谢参数：葡萄糖浓度、乳酸和乳酸脱氢酶。用Bouin氏固定液将用于组织学分析的样品固定1小时。接着将样品在水中洗涤至少4小时，并将其埋置到石蜡中。随后，制备3μm厚的切片。用苏木精-伊红(H&E)对切片染色，以评估细胞形态。此外，执行免疫组织化学(IHC)以利用以下抗体来表征细胞的分化：Anti-hPAX2、Anti-hAQP1、Anti-Ki67、抗钙粘素hE抗体和抗钙粘素hN抗体(参见下表1)。为进行免疫组织化学，将3μm的横截面脱蜡。通过以下方式实现靶检索：用蛋白酶K进行酶处理或在柠檬酸盐缓冲液pH 6(Dako，#S2369)或Tris/EDTA缓冲液pH9(Dako，#S2367)中加热。包括用3％的过氧化氢酶进行的阻断步骤，以阻断内源性过氧化物酶。接着，将一级抗体孵育1小时，随后用ENVISIONTM检测系统过氧化物酶/DAB兔/小鼠(Dako，#K5007)对其进行检测。用苏木精对切片进行复染色。
对代谢参数的分析结果表明，接种有hKDC的孔在所用测试条件下均增殖(参见图1至图6)。利用H&E进行的组织学染色显示，在胶原夹层和SIS-胶原夹层两种培养条件下，细胞生长成几乎连续的双层或多层，进而发展成类似管或囊肿的三维结构。相比之下，在SIS上培养的细胞形成融合的单层，该单层显示高度的棱柱形态，该形态表征上皮分化(参见图7和图8)。无论所用的初始细胞接种浓度大小，均可在培养三周后观察到此种形态。在具有胶原涂布PET膜的小室上培养的hKDC显示第一形态、多层形成、以及据观察从表面剥离的团聚体，而此会导致不连续的细胞层。胶原涂布的PET膜上的hKDC的这些观察特性使其不适于转运测定。对于聚酯和聚碳酸酯细胞小室膜，也观察到类似的多层结构，表明这种效果是合成膜的普遍特性，而不是实验所用特定膜的特性。对于SIS培养物则观察不到这种特性，暗示此种支架能够促进接触抑制和未受损单层形成的自然调节机制的运作。
利用Ki67抗体得到的免疫组织化学结果表明hKDC在每一种所测试的支架构型中均增殖。在整个培养期中，肾脏转录因子Pax-2的表达也是阳性。作为细胞桥粒和粘着连接成分的钙粘素参与细胞-细胞接触，且钙粘素的表达是细胞分化的标记。钙粘素对细胞极化和细胞功能是必需的。在肾脏中，N-钙粘素由近端小管细胞表达，而E-钙粘素则普遍存在于远曲小管细胞中。IHC结果显示，在所有支架构型中，hKDCs对于N-钙粘素均具有强的免疫染色。对照而言，尽管观察到几处极微弱的染色区域，但大部分不存在对E-钙粘素的免疫染色。
水通道蛋白促进水穿过细胞膜的转运，因此对肾脏功能非常重要。水通道蛋白1由肾脏近端小管细胞表达，而水通道蛋白2主要存在于远曲小管细胞中。水通道蛋白1表达可在培养2周和3周之后检测到，而水通道蛋白2表达则观察不到。在一些区域中，观察到水通道蛋白1的染色仅位于立方形细胞的顶面(参见图9)，同样指示细胞的主要近侧分化。还测定钠葡萄糖的协同转运蛋白1(SGLT-1)的IHC，但任何样品中均未观察到标记表达，SGLT-1是由远曲小管细胞表达的转运蛋白。
此实例表明，hKDC能够分化成近端小管细胞，且此种分化依赖于细胞所接种到的基底的成分。对于hKDC上皮形态和分化而言，平面的自然细胞外(即脱细胞)基质胜过胶原、SIS/胶原支架以及标准细胞小室培养。一旦实现融合，未经转化的近端小管细胞(例如原代细胞)通常继续生长，使得合成的平面表面(例如细胞小室)上形成三维聚集体。在自然脱细胞支架(例如SIS)上接种能使细胞分化并形成上皮细胞单层，此种上皮细胞单层比通过传统方法产生的单层更稳定。
实例2：脱细胞支架上的hKDC的细胞接种浓度的优化
实例1显示，接种到无胶原的二维脱细胞支架上的细胞形成融合的上皮细胞单层，该单层在培养三周之后表达近端小管标记。执行以下实验来优化细胞接种密度并尝试缩短形成单层所需的培养期。
通过以下方式来制备支架：如实例1所述，将小肠粘膜下层(SIS)的某些片段脱细胞化。以三种不同的浓度(1×104、5×104和1×105个细胞/孔)将4次传代的hKDC接种到SIS支架上，并用REGMTM肾上皮细胞生长培养基(Lonza，Walkersville)将其培养三周。在两周和三周之后移除样品以进行组织学分析，并用Bouin氏固定液固定1小时。然后，将其在水中洗涤至少4小时并埋置到石蜡中。随后，制备3μm厚的切片。用苏木精-伊红(H&E)对切片进行染色，以评估细胞形态。此外，与在实例1中一样，执行免疫组织化学(IHC)以表征细胞的分化。首先，将3μm的横截面脱蜡。通过以下方式实现靶检索：用蛋白酶K进行酶处理、在柠檬酸盐缓冲液pH 6(Dako，#S2369)中加热、或者在Tris/EDTA缓冲液pH9(Dako，#S2367)中加热。用3％的过氧化氢酶执行阻断步骤，以阻断内源性过氧化物酶。接着，将一级抗体孵育1小时，随后用ENVISIONTM检测系统过氧化物酶/DAB兔/小鼠(Dako，#K5007)对其进行检测。用苏木精对切片进行复染色。
执行凝集素染色以进一步评价细胞分化。如上所述，将3μm的横截面脱蜡，并用过氧化氢酶阻断。接着将生物素酰化凝集素(翅荚百脉根凝集素(Biozol，#B-1325)或双花扁豆凝集素(Biozol，#B1035)孵育1小时，然后用链霉抗生物素蛋白(Biogenex，#LP000-ULE)进行标记，并添加氨乙基咔唑生色团(AEC)(Biogenex，#HK129-5KE)进行检测。用苏木精对切片进行复染色。
H&E染色结果表明，在培养两周之后，所检测的接种密度中无一达到100％融合。然而，在培养三周之后，以所有密度接种的细胞均形成几乎融合的单层，且一些区域形成典型的立方形上皮形态，其中细胞核位于细胞的下三分之一。以较高密度接种的细胞也几乎融合，但细胞形态的均匀性较差且外观上不是上皮(参见图10)。
免疫组织化学结果总结在下表2中。较低接种密度三周样品的IHC检测到近端小管标记AQP-1(40-50％)和N-钙粘素(～90％)的表达，而远曲小管标记则无表达(AQP-2和SGLT-1)或仅非常微弱地表达(E-钙粘素)。此外，在整个样品中均检测到PAX-2表达，且在样品的若干区域中检测到Claudin-2(紧密连接标记)。Ki67(增殖标记)仅在单层不完全融合的区域中检测到。重要的是，在样品的许多区域中观察到IV型胶原(基底膜蛋白)的基底染色。IV型胶原的表达表明细胞在重构支架并沉积新的基底膜。
用生物素酰化凝集素翅荚百脉根凝集素(LTL)(近端小管细胞的标记物)和双花扁豆凝集素(DBA)(远曲小管细胞的标记物)对较低接种密度的三周样品进行染色的结果也表明，细胞的绝大部分分化成近端小管细胞。在样品的许多区域中也观察到LTL的表达，而DBA的表达则稀少且微弱(参见图10)。
本实例说明，细胞的分化程度取决于接种密度。然而，出乎意料地，与通常所认为的情况相反，接种密度越低，分化程度越高。
也对以1×104个细胞/孔的密度接种的样品进行分析，如上所述利用抗人体IV型胶原抗体(Dako，#M0785)通过免疫组织化学来分析IV型胶原的表达。如图11所示，结果显示细胞基底外侧表面上的IV型胶原染色为阳性，表明所述细胞在脱细胞自然支架上活跃地分泌细胞外基质成分；表明脱细胞自然支架上可形成未受损的单层，其在生理上的相关性比合成支架(例如细胞小室)更高。此外，表明细胞接种密度对细胞分化和单层形成具有直接影响。
实例3：p-糖蛋白-1的免疫组织化学
通过以下方式来制备支架：如实例1所述，将小肠粘膜下层(SIS)的某些片段脱细胞化。以5×104个细胞/支架的浓度将4次传代的hKDC接种到SIS支架上，并用REGMTM肾上皮细胞生长培养基(Lonza,Walkersville)将其培养三周。在三周之后移除样品以进行组织学分析，并用Bouin氏固定液固定1小时。之后，将样品在水中洗涤至少4小时，并将其埋置到石蜡中。随后，制备3μm厚的切片。执行免疫组织化学(IHC)来确认p-糖蛋白-1(pgp-1，又称为MDR1)的表达，其为近端小管细胞所表达的外排性转运蛋白。通过以下方式实现脱蜡区段的靶检索：用蛋白酶K进行酶处理、在柠檬酸盐缓冲液pH 6(Dako，#S2369)中加热、或者在Tris/EDTA缓冲液pH 9(Dako，#S2367)中加热。用3％的过氧化氢酶执行阻断步骤，以阻断内源性过氧化物酶。接着将一级抗人体pgp-1抗体(Biogenex，#AM-391-5M)孵育1小时，随后用ENVISIONTM 检测系统过氧化物酶/DAB兔/小鼠(Dako，#K5007)对其进行检测。用苏木精对切片进行复染色。
结果显示，细胞单层的顶侧膜上对于pgp-1的染色是阳性的(参见图13)，确认了近端小管细胞的功能标记物的表达，还表明所述支架和接种方法能使hKDC分化成功能性近端小管细胞。
实例4：接种在脱细胞支架上的hKDC对白蛋白的摄入
通过以下方式来制备支架：如实例1所述，将小肠粘膜下层(SIS)的某些片段脱细胞化。以5×104个细胞/孔的浓度将4次传代的hKDC接种到SIS支架上，并用REGMTM肾上皮细胞生长培养基(Lonza,Walkersville)将其培养三周。为评估白蛋白摄入，首先在不含血清的培养基(REBM基础培养基，Lonza,Walkersville)中将接种细胞的样品预孵育1小时。然后将该培养基换成含有200μg/ml荧光标记牛血清蛋白(BSA-FITC)的REBM基础培养基(Sigma，#A9771)并孵育30分钟至60分钟。然后用PBS洗涤样品、用Dapi(二脒基-2-苯基吲哚)复染色、并在荧光显微镜上成像。
结果显示细胞能够摄入BSA-FITC(参见图14)，这是近端小管细胞的功能。这些结果表明，接种到脱细胞支架上的hKDC不仅表达肾近端小管细胞分化的标记，还起到近端小管上皮细胞的作用。
下文的实例5至实例9是设计用于进一步阐明本发明支架性能的假想实例。可利用功能测定(例如BSA-FITC摄入)来评估细胞损伤或肾毒性、以及治疗化合物对肾转运功能恢复的效果。
实例5：接种到脱细胞支架上的hKDC对有机阴离子的转运
本实例测试通过测定荧光染料(例如若丹明、荧光黄、或羧基荧光素)的转运来测试有机阴离子转运蛋白以及pgp-1(外排转运蛋白)的功能。向细胞中的转运是由各种有机阴离子转运蛋白(OAT)所介导的。当pgp-1转运蛋白被异搏定抑制时，所施加的染料(例如若丹明)不再被转运出细胞外，从而导致细胞荧光增多。
将通过以下方式来制备支架：如实例1所述，将小肠粘膜下层(SIS)的某些片段脱细胞化。将以5×104个细胞/支架的浓度将4次传代的hKDC接种到SIS支架上，并用REGMTM肾上皮细胞生长培养基(Lonza,Walkersville)将其培养三周。接着，将顶部隔室中的培养基换成不含酚红的培养基，该培养基包含各种浓度的若丹明、荧光黄、或羧基荧光素染料。在向顶部隔室中添加含有荧光染料的培养基(培养基中含有或不含有额外的异搏定)之前，也可在两个隔室中用各种浓度的异搏定对一些孔进行预孵育。接着可将孔孵育30至120分钟。然后用PBS洗涤样品、固定、用DAPI进行复染色、并在荧光显微镜上对其成像。此外，取培养基的样品，以对荧光染料的存在进行定量分析。
实例6：在流式生物反应器中hKDC(在有或无微血管内皮细胞的情况下)在脱细胞 支架上的接种和分化
如上所述制备生物反应器系统。将支架定位在生物反应器100的上部本体元件110和下部本体元件120之间，并用相当于细胞冠的张力将其固定(参见图15)。定位在生物反应器中的支架上的张力可改变，且可进行实验来判断最适于细胞单层的形成和后续分化的张力范围。支架的一侧将接种hKDC，之后是适当的附着期(不发生流动)。支架的另一侧可接种内皮细胞。作为对照，也存在仅具有一种细胞类型的生物反应器。接着，在适当的细胞附着期之后对生物反应器腔室进行灌注。将流率调整至肾脏条件，以促进分化和上皮细胞单层的形成。通过周期性测量跨上皮电阻(TEER)以及测量荧光FITC-菊粉的渗漏来监视单层的形成和整体性。在使用两种细胞类型的情况下，将流动条件调整成适于维持上皮细胞单层和内皮细胞单层两者。除进行TEER和菊粉监视之外，还在1周、2周、和3周之后固定样品。通过苏木精-伊红染色来评估上皮形态和单层的形成。
实例7：接种到SIS支架且在流式生物反应器中培养的hKDC(在有或无微血管内皮 细胞的情况下)对葡萄糖的功能性转运和对其他溶质的重吸收
本实例通过分析葡萄糖和其他溶质从一个培养基隔室穿过接种有细胞的膜进入另一培养基隔室的主动转运，显示当hKDC在流式生物反应器中接种到SIS支架上时，hKDC向近端小管上皮细胞的功能分化。
如实例1中所述制备SIS支架。将依照传统方法分离的微血管内皮细胞(mvEC)接种到支架的一侧上。随后将hKDCs接种到支架的另一侧上。然后将支架放置到生物反应器腔室中，以使培养基流能够穿过支架的每一侧，并进行培养，使得能够如实例6所述形成单层。如在实例6中所述，通过TEER测量和FITC-菊粉渗漏来监视单层的形成。此时，将每一培养基隔室包围在小的圈中，所述圈仅由SIS支架上的未受损细胞单层隔开。为进行葡萄糖测量，在添加或不添加葡萄糖转运抑制剂(例如根皮苷)的情况下在不同的培养基隔室中采用包含已知浓度葡萄糖的培养基。使培养基穿过成熟的细胞单层流动约48小时的时间段，期间周期性地取出培养基样品，以通过比色测定来测量葡萄糖浓度。在两个隔室中具有不同葡萄糖浓度的情况下进行多次实验，以检测葡萄糖浓度随时间的变化。可用这些测量的结果来计算葡萄糖转运与细胞消耗之间的相对量随时间的变化。对于细胞所转运或摄入和降解的其他溶质(例如白蛋白)可执行类似的实验。
实例8：维生素D活性
维生素D活性是肾脏近端小管细胞的特定函数。因此，本实例通过测试25-(OH)D3-12-羟化酶的活性来测试维生素D活性，该酶将无活性的25-OH-D3前体转化成有活性的1,25-(OH)2D3形式。
为测定维生素D活性，将hKDC接种到SIS上，SIS如实例1所述进行制备。以5×104个细胞/支架的浓度将4次传代的hKDC接种到SIS支架上，并用REGMTM肾上皮细胞生长培养基(Lonza,Walkersville)将其培养三周。
将培养基换成包含无活性25-OH-D3前体的培养基。在约15分钟至2个小时的孵育时间之后，采集培养基，并通过HPLC分析或ELSIA来分析前体和有活性的1,25-(OH)2D3形式的量。孵育时间可根据孵育培养基和孵育温度而改变。还可通过添加甲状旁腺激素来诱导转化或通过添加磷酸盐来抑制转化。
实例9：用于肾毒性测试和药物发现应用的hKDC/SIS肾近端小管系统
在本实例中，将对hKDC/SIS肾近端小管模式系统施加特定肾毒性物质(e.g.顺铂、长春花碱)或肾脏保护试剂的效果。为此，在静态和/或流动条件下将hKDC接种到SIS上，并使其生长和分化成近端小管上皮的单层。接着对hKDC/SIS系统施加各种肾毒性物质并评估细胞生活力、形态、和近端小管功能。肾功能参数包括例如溶质转运、TEER、菊粉渗漏、白蛋白摄入、维生素D合成、促红细胞生成素和前列腺素的生产。此外，将测试hKDC近端小管系统的检测各种肾脏保护和其他细胞保护试剂效果的能力。
实例10：人类肾源性细胞的分离
从National Disease Research Interchange(国家疾病研究交流中心)(NDRI,Philadelphia,PA)获得正常的人类肾脏。为了去除血液和杂物，要在达尔伯克氏改良伊格尔培养基(低糖DMEM；Invitrogen,Carlsbad,CA)或磷酸盐缓冲盐水(PBS,Invitrogen)中洗涤每一个肾脏。从肾脏的外皮质区、内髓质区、和包膜下区切开组织。然后，在细胞培养板上机械地分离组织，直到组织被剁碎成细浆。然后，将组织转移到50mL的锥形管中。接着，将组织溶解在优质生产规范(GMP)酶混合物中或非GMP级酶混合物中，所述GMP酶混合物包含0.25单位PZ活性/毫升的胶原酶(NB6,N0002779,Serva Electrophoresis GmbH,Heidelberg,Germany)、2.5单位/毫升的分散酶(Dispase II 165 859,RocheDiagnositics Corporation,Indianapolis,IN)、1单位/毫升的透明质酸酶(Vitrase,ISTAPharmaceuticals,Irvine,Ca)，而所述非GMP级酶混合物包含500单位/毫升的胶原酶(Sigma,St Louis,MO)、50单位/毫升的分散酶(Invitrogen)和5单位/毫升的透明质酸酶(Sigma)。也用50单位/毫升的分散酶分离肾源性细胞。将酶混合物与肾上皮细胞生长培养基(REGM)(Cambrex,Walkersville,MD)或间充质干细胞(MSCGM)((Cambrex)组合。将含组织、培养基和消化酶的锥形管在37℃、225rpm的轨道式震荡器中培养1小时。
将溶解液在150×g下离心5分钟，并抽取上清液。将所得的细胞沉淀物重新悬浮在20毫升的REGM或MSCGM中通过一个40微米尼龙BD FALCON的细胞滤网(BD Biosciences,SanJose,CA)过滤细胞悬液。将滤液重悬于培养基(总体积为50毫升)中，并在150×g下离心5分钟。吸出上清液，并将细胞沉淀物重悬于50毫升新鲜培养基中。这个过程再重复两次。
在最后一次离心时，吸出上清液，并将细胞沉淀物重悬于5毫升新鲜培养基中。使用Guava仪器(Guava Technologies,Hayward,CA)测定活细胞数。然后将细胞以5000个细胞/cm2的接种密度平铺到2％明胶或层粘连蛋白涂布的组织培养瓶上，并在低氧(缺氧)或正常(常氧)气氛下培养。表1显示供体信息和用于分离肾源细胞群的生长条件。为获得肾脏细胞的单细胞克隆，执行限制稀释技术。总而言之，利用24种不同的条件从年龄为39岁、46岁、21岁和10岁的四个不同的尸体供者分离细胞。
实例11：人类肾源性细胞的形态
在分离七天后，通过光学显微镜来评估肾源性细胞群，并观察细胞的形态特性。所有分离条件均一致地产生具有上皮形态的细胞。(参见表11-1)。
此数据表明，可从任意年龄或性别的供体上分离肾源性细胞，并可利用各种生长培养基配方或培养条件进行分离。分离程序的方便性和一致性表明，肾源性细胞是用于细胞疗法的有价值的细胞来源。
实例12：肾源细胞生长势
肾源细胞可在培养中大量繁殖，并能够在短时间内产生大量细胞。这是同种异体细胞疗法的开发标准。
以5,000个细胞/cm2的浓度将肾源性细胞接种至T75培养瓶的REGM或MSCGM中，于37℃和5％二氧化碳下进行培养。细胞每2-5天传代一次。用Guava仪(Guava Technologies,Hayward,CA)测定每一代的细胞数量以及生活力。细胞群连续传代数周，直至衰老。当细胞在研究时间间隔期间未能达到大于一个群体培增数时，判断其达到衰老。然后计算群体倍增数[ln(最终细胞收率/细胞的初始接种数)/ln2]。
为进行核型分析，将来自分离组22和23的4次传代和10次传代的肾源性细胞接种到T25培养瓶中并使其隔夜附着。然后用REGM填充培养瓶并执行核型分析。
表12-1是所测试分离群的生长数据总结。供体年龄、组织来源、或用于分离细胞的酶对于细胞生长特性没有明显影响。
对4次传代和10次传代的分离组22和23执行核型分析。4次传代和10次传代均显示正常核型。
衰老时的群体倍增数(PD)平均为28.5，而平均生活力为97.6％。
概括而言，肾源性细胞在培养中具有强生长势。这些数据可用于估计从一整个人类肾脏产生的细胞总数。如果肾脏组织全部进行传代，并将所得细胞培养至31个群体倍增数，则一整个人类肾脏将总共产生估计1.89×1016个细胞。因此，考虑一个细胞治疗剂量为每人1×108个细胞，则从单个肾脏分离出的肾源性细胞将足以治疗1.89亿个患者。最后，这些细胞是用于同种异体细胞疗法的可高度扩增的细胞源。
实例13：hKDC表面标志表型
对人类肾源性细胞执行流式细胞术分析，以判断表面标志表型。来自实例11中的9组分离细胞在T75培养瓶上的REGM中在37℃和5％的二氧化碳下扩增至第4次传代和第10次传代。用PBS洗涤附着的细胞并用TrypLE Select(Gibco,Grand Island,NY)使其脱离。将细胞收获、离心并以2×105个细胞/毫升的浓度重悬于PBS中的3％(体积比)FBS中。将特异性抗体加入100微升的细胞悬浮液中，将混合物在黑暗环境中于4℃下孵育30-45分钟。孵育后，用PBS洗涤细胞，并离心去除多余抗体。将细胞重悬于500微升PBS中，并通过流式细胞术进行分析。用Guava仪器(Guava Technologies,Hayward,CA)执行流式细胞术分析。表13-1中显示用于表征表面标志表型的抗体。
表13-1：用于表征肾源性细胞的细胞表面标志表型的抗体
表13-2显示所有表面标志表型数据的总结。所测试的所有分离组对于CD24、CD29、CD44、CD49c、CD73、CD166、SSEA-4和HLA I显示阳性染色，且对于CD31、CD34、CD45、CD56、CD80、CD86、CD104、CD105、CD117、CD133、CD138、CD141、E-钙粘素和HLA II显示阴性染色。此外，所分析的所有分离组均扩增数代(10次传代)且仍保持其表面标志表型。
这些细胞表达HLA I，但不表达HLA II、CD80或CD86。这些细胞表达特性反映细胞逃避宿主免疫系统的能力。这些数据显示，肾源性细胞是非免疫原性的，并可在无需组织分型或免疫抑制的条件下施用至患者。
概括而言，这些数据显示，来自多个供体的肾源性细胞可在各种条件(参见表11-1)下分离并仍保持其表面标志表型。此外，这些细胞表达推定的祖细胞标记(例如CD24和SSEA-4)，但不表达成熟的、谱系定向的标记(例如E-钙粘素)。最后，肾源性细胞是非免疫原性的，因此是用于同种异体细胞疗法的引人注目的细胞源。
表13-2：表面标志分析的总结。尚未确定(ND)。阳性染色(+)。阴性染色(-)。
实例14：肾源性细胞基因表达
利用RNA提取试剂盒(RNeasy Mini Kit；Qiagen,Valencia,CA)从分离组1、2和17-23的细胞中提取RNA。用50微升经DEPC处理的水洗脱RNA并在-80℃下保存。用无规六聚体引物和TaqMan逆转录试剂(加利福尼亚州福斯特城的应用生物系统公司(AppliedBiosystems,Foster City,CA))将RNA进行逆转录，在25℃下保持10分钟，在37℃下保持60分钟，在95℃下保持10分钟。将样品在-20℃下保存。利用表14-1中所述的引物通过传统的PCR(聚合酶链反应)对所选择的基因进行研究。利用RT2PCR引物组(SuperArrayBiosciences Corp,Frederick MD)对cDNA样品执行PCR。
根据制造商的说明书，将引物与1微升的cDNA和2X ReactionReadyTM SYBR GreenPCR Master Mix(SuperArray Biosciences)混合，并用ABI Prism 7000系统(AppliedBiosystems,Foster City,CA)执行PCR。热循环条件为最初50℃2分钟和95℃10分钟，接着95℃15秒和60℃1分钟进行34个循环。对于GAPDH，根据制造商的说明书，利用来自AppliedBiosystems(目录号402869)的GAPDH引物、1微升的cDNA溶液、和1×AmpliTaq Golduniversal mix PCR反应缓冲液(Applied Biosystems,Foster City,CA)执行PCR。最终PCR反应中的正向引物和反向引物的浓度均为0.5微摩尔，且未添加TaqMan探针。将样品在2％(重量体积比)琼脂糖凝胶上进行电泳，并用溴化乙锭(密苏里州圣路易斯的西格玛公司)染色。用667Universal Twinpack胶片(VWR International,South Plainfield,NJ)和焦距PolaroidTM照相机(VWR International,South Plainfield,NJ)采集图像。对于每个所分析的基因，从凝胶切离最终PCR产物并通过DNA测序确认靶序列。
RT-PCR分析
所有经分析的细胞分离组均显示恒定和稳定的基因表达谱。对分离组1、2和17-23执行RT-PCR分析，以检测早期发育基因标记(Oct-4、Rex-1、Sox2、FGF4、hTert)、肾脏发育基因标记(Pax-2、WT-1、Eya-1、Wnt-4、BMP-7、钙粘素-11、FoxD1)、后肾间充质基因标记(Pax-2、Eya-1、WT-1、Six2和FoxD1)、和促进后肾间充质存活的基因(BMP-7)的表达。此外，还分析了其他发育基因(例如内胚层基因HNF3B、CXC-R4、Sox-17、GATA-4)的表达以及促进肾脏修复或在治疗肾脏疾病上具有治疗价值的基因标记(Epo、EpoR、BMP-7、BMP-2、GDF5)的表达。
如表14-2所示，所有分离组均对Oct-4和Rex-1显示阳性表达，且对Sox2、FGF4、hTERT和Wnt-4显示阴性表达。分离组17-23对Pax-2、WT1、钙粘素-11和FoxD1显示阳性表达。分离组22和23对Eya-1、Sox-17和CXCR-4显示阳性表达，且对GATA-4显示阴性表达。分离组17-23表达EpoR，但不表达Epo。分离组17-22表达BMP-2、BMP-7和GDF5。此外，所有分离组均可扩增多代(10次传代)并仍保持其基因表达表型。
表14-2：基因表达分析的总结。阳性表达(+)。阴性表达(-)。尚未确定(ND)。在早期发育期间起作用的基因(早期发育)。在肾脏发育期间起作用的基因(肾脏发育)。后肾间充质标记(Met)。内胚层谱系标记(内胚层)。参与肾脏存活的基因(肾脏保护)。参与后肾间充质存活的基因(存活)。
概括而言，肾源性细胞表达参与早期发育和肾脏发育的基因。其表达后肾间充质的标记和肾祖细胞的标记。其表达内胚层标记以及参与肾脏修复和小管生成的因子。
总而言之，这些数据表明，肾源性细胞是可用于细胞疗法以保护或修复损伤肾组织的推定肾祖细胞源。
实例15：营养因子分泌分析
据显示，肾源性细胞一致地产生用于保护和修复肾脏的营养因子。因此，这些细胞可用作治疗肾脏疾病的治疗剂。
将来自分离组17-21的3次传代细胞以5,000个细胞/cm2接种到均包含15毫升REGM的一个T75培养瓶/分离组中。在37℃、5％的二氧化碳下培养细胞。在隔夜培养之后，将培养基换成无血清培养基(低糖DMEM(Gibco)，0.1％(w/v)牛血清白蛋白(Sigma)，青霉素(50单位/毫升)和链霉素(50微克/毫升(Gibco))，并继续培养8小时。在孵育结束时通过在14,000×g下离心5分钟收集调理过的无血清培养基，并储存于–20℃下。
为了评估每个培养瓶中的细胞数量，用PBS洗涤细胞，再用4毫升TrypLE Select(Gibco)分离，然后用Guava仪(Guava Technologies Hayward,CA)计数。随后，利用Searchlight蛋白质组阵列(Searchlight Proteome Array(Pierce Biotechnology Inc公司))通过ELISA测定样品中的以下营养因子：基质金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP-1)、基质金属蛋白酶组织抑制剂2(TIMP-2)、血小板源性上皮生长因子bb(PDGF-bb)、角化细胞生长因子(KGF)、肝细胞生长因子(HGF)、碱性成纤细胞生长因子(FGF2)、血管内皮生长因子(VEGF)、肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、白介素6(IL-6)、白介素8(IL-8)、转化生长因子α(TGFα)、脑原性神经营养因子(BDNF)、基质细胞源性因子1b(SDF1b)、睫状神经营养因子(CNTF)、碱性神经生长因子b-NGF)、神经营养因子3(NT-3)、与生长相关的癌基因α(GRO-α)、白介素1b(IL-1b)、白介素12p40(IL-12p40)、白介素12p70(IL-12p70)、白介素11(IL-11)、白介素15(IL-15)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、促血管生成素2(ANG-2)和人类生长激素(HGH)。
营养因子产量分析
对分离组17-21分析27个不同生长因子和细胞因子的分泌。结果汇总于表15-1中。所有分离组均以超过300皮克/毫升/1×106个细胞/8小时分泌TIMP-1、TIMP-2、VEGF和MMP-2。其分泌50-300皮克/毫升/1×106个细胞/8小时的FGF2和HGF以及1-50皮克/毫升/1×106个细胞/8小时的KGF、PDGF-bb、b-NGF、IL-12p40和IL-11。未分泌SDF-1、ANG-2、HGH和Il-12p70。
概括而言，此数据显示，肾源性细胞分泌用于保护和修复受损肾脏组织的若干营养因子。例如，FGF2、HGF和TGFα涉及肾脏修复。肾源性细胞以升高且一致的水平分泌这些因子。因此，这些细胞是用于治疗肾脏疾病疗法的有价值的细胞来源。
表15-1：肾源性细胞所产生的营养因子产量的SearchLight Multiplexed ELISA测定。分离组“仅培养基”是仅在无血清培养基中而未进行调理的对照样品。所示数据的单位是皮克/毫升/1×106个细胞/8小时。所示结果是重复测量的平均值。
实例16：肾源性细胞在体外形成小管
可将肾源性细胞在4次和10次传代时解冻，然后在I型胶原溶液中将其研磨成4×104个细胞/毫升的单细胞悬液，该胶原溶液包含66％的vitrogen 100(3毫克/毫升(Cohesion Technologies,Palo Alto,CA)。将悬液中的细胞平铺到去细胞化的网膜。然后将胶原/细胞混合物在37℃、5％CO2、95％空气下孵育30分钟，以使胶原凝胶化，然后添加培养基。细胞每3天或7天进料一次。在第7天，用各种浓度的肝细胞生长因子处理培养物并进一步培养直到观察到小管生成为止。
这些观察表明，肾源性细胞可在体外自我组织成小管结构。这种结构具有为肾脏重构应用以及开发药物筛选和毒性测定打基础的价值。
实例17：肾源性细胞在体内形成小管
在三个35/65PCL/PGA(10cm直径×2mm厚度)膜上接种人类肾源性细胞(10,000个细胞/cm2)并在REGM(Gambrex)中、在37℃和5％二氧化碳下培养8天。35/65PCL/PGA泡沫支架是根据美国专利6,355,699中所述的方法制备，该专利全文以引用的方式并入本文。然后从铸膜培养皿中移除细胞/膜构造，将其堆叠成三层并涂覆到35/65PCL/PGA泡沫支架支撑件上。然后将此构造再培养24小时，并在植入之前将其切成3×3mm的正方形片。然后用PBS洗涤植入物，并将其转移到填充有PBS的6孔板上进行转运。
在皮下将植入物植入到SCID小鼠的背外侧胸腰椎区域中。雄性SCID小鼠(FoxChase SCID CB17SC品系)购自Taconic Inc.公司(Hudson,NY)且年龄为5周。在每个SCID小鼠中放置两个植入物。在小鼠的背部制作每个长度约为5mm的两个皮肤切口。在中线的每一侧上制作一个切口，并将切口横向置于腰椎区域上方所触摸到的髂嵴头向约5mm处。然后将皮肤和下层结缔组织分离以形成小袋，并将植入物放置在切口的头向10mm处。然后用Reflex 7金属伤口夹闭合皮肤伤口。在3周之后，从皮下小袋中移除植入物，在10％的福尔马林中进行固定，并将其埋置于石蜡中，用苏木精-伊红(H&E)进行染色，并由病理学家利用光学显微镜技术进行评估。
肾源性细胞在PCL/PGA膜的层中形成小管状结构。据显示，这些小管具有明显的上皮壁和清晰的官腔。肾源性细胞透过泡沫支架，沉积细胞外基质，并形成稠密的组织状结构。此外，泡沫中的肾源性细胞刺激血管生成和血管网络的形成。
概括而言，人类肾源性细胞在暴露至体内微环境之后形成小管结构。肾源性细胞响应微环境信号和将细胞构建成小管的能力还说明了这些细胞具有肾祖细胞性质。此外，前移到泡沫支架中且形成组织状结构的细胞促进了血管生成。此数据表明了肾源性细胞用作重构肾脏小管且最终用于肾脏组织工程应用的细胞基础的实用性。
尽管已结合各种具体材料、程序和例子描述和例示了本发明，然而应当理解，本发明并不限于所选材料和程序的特定组合。本领域的技术人员将理解，可对这些细节作出多种改变。说明书和示例应被认为仅为示例性的，本发明的真实精神和范围由随附权利要求书限定。本申请中所提到的所有参考文献、专利和专利申请均全文以引用方式并入本文中。

Claims (25)

1.一种生物人工近端小管装置，包括脱细胞生物基质支架，所述脱细胞生物基质支架在足以允许细胞分化成肾近端小管上皮细胞的条件下用一种或多种前体细胞接种，其中分化细胞在所述支架上形成稳定和功能性肾近端小管上皮细胞单层，并且其中所述一种或多种前体细胞选自：原代肾小管上皮细胞、分化成肾细胞或肾祖细胞的诱导性多能干细胞、分化成肾细胞或肾祖细胞的祖细胞、从肾脏分离的干细胞或从肾脏分离的祖细胞、人类肾源性细胞，以及它们的混合物。
2.一种生物人工近端小管装置，包括脱细胞生物支架，所述脱细胞生物支架具有至少两个表面，其中至少一个表面在足以允许细胞分化成肾近端小管上皮细胞的条件下用一种或多种前体细胞接种，其中所述细胞在所述支架的表面上形成稳定和功能性肾近端小管上皮细胞单层，并且其中所述一种或多种前体细胞选自：原代肾小管上皮细胞、分化成肾细胞或肾祖细胞的诱导性多能干细胞、分化成肾细胞或肾祖细胞的祖细胞、从肾脏分离的干细胞或从肾脏分离的祖细胞、人类肾源性细胞，以及它们的混合物。
3.根据权利要求1或2所述的生物人工近端小管装置，其中所述脱细胞生物基质支架来源于哺乳动物组织。
4.根据权利要求3所述的生物人工近端小管装置，其中所述脱细胞生物基质支架来源于粘膜或粘膜下组织。
5.根据权利要求3所述的生物人工近端小管装置，其中所述脱细胞生物基质支架来源于哺乳动物消化道。
6.根据权利要求5所述的生物人工近端小管装置，其中所述脱细胞生物基质支架来源于哺乳动物的胃、十二指肠、空肠、回肠或结肠。
7.根据权利要求1或2所述的生物人工近端小管装置，其中不使用MEK抑制剂的情况下细胞维持接触抑制。
8.根据权利要求1或2所述的生物人工近端小管装置，其中细胞维持接触抑制的天然调节机制的功能并形成完整的单层。
9.根据权利要求1或2所述的生物人工近端小管装置，其中所述前体细胞是人类肾源性细胞。
10.根据权利要求9所述的生物人工近端小管装置，其中所述人类肾源性细胞能够在培养中自我更新和扩增，并且对Oct-4、Rex-1、Pax-2、钙粘素-11、FoxD1、WT1、Eya1、HNF3B、CXC-R4、Sox-17、EpoR、BMP2、BMP7或GDF5中的至少一种的表达为阳性；且对Sox2、FGF4、hTert、Wnt-4、SIX2、E-钙粘素或GATA-4中的至少一种的表达为阴性。
11.根据权利要求10所述的生物人工近端小管装置，其中所述人类肾源性细胞对细胞表面标志HLA-I、CD24、CD29、CD44、CD49c、CD73、CD90、CD166或SSEA-4中的至少一种为阳性；且对细胞表面标志HLA II、CD31、CD34、CD45、CD56、CD80、CD86、CD104、CD105、CD117、CD133、CD138和CD141中的至少一种为阴性。
12.根据权利要求11所述的生物人工近端小管装置，其中所述人类肾源性细胞分泌营养因子FGF2、HGF、TGFα、TIMP-1、TIMP-2、MMP-2或VEGF中的至少一种；且不分泌营养因子PDGF-bb或IL12p70中的至少一种。
13.根据权利要求9所述的生物人工近端小管装置，其中所述人类肾源性细胞对细胞表面标志HLA-I、CD24、CD29、CD44、CD49c、CD73、CD90、CD166或SSEA-4中的至少一种为阳性；并且对细胞表面标志HLA II、CD31、CD34、CD45、CD56、CD80、CD86、CD104、CD105、CD117、CD133、CD138和CD141中的至少一种为阴性。
14.根据权利要求11所述的生物人工近端小管装置，其中人类肾源性细胞分泌营养因子FGF2、HGF、TGFα、TIMP-1、TIMP-2、MMP-2或VEGF中的至少一种；且不分泌营养因子PDGF-bb或IL12p70中的至少一种。
15.根据权利要求9所述的生物人工近端小管装置，其中所述人类肾源性细胞能够在培养中自我更新和扩增，并且对HLA-I的表达以及Oct-4、Rex-1、Pax-2、钙粘素-11、FoxD1、WT1、Eya1、HNF3B、CXC-R4、Sox-17、EpoR、BMP2、BMP7或GDF5中的至少一种的表达为阳性；且对CD133的表达以及Sox2、FGF4、hTert、Wnt-4、SIX2、E-钙粘素或GATA-4中的至少一种的表达为阴性。
16.一种使一种或多种前体细胞分化成肾细胞的方法，包括：用一种或多种前体细胞来接种脱细胞生物基质支架；以及在足以允许所述细胞分化成肾近端小管上皮细胞的条件下在所述支架上培养所述细胞，其中分化细胞在所述支架上形成稳定和功能性肾近端小管上皮细胞单层，并且其中所述一种或多种前体细胞选自：原代肾小管上皮细胞、分化成肾细胞或肾祖细胞的诱导性多能干细胞、分化成肾细胞或肾祖细胞的祖细胞、从肾脏分离的干细胞或从肾脏分离的祖细胞、人类肾源性细胞，以及它们的混合物。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述脱细胞生物基质支架来源于哺乳动物组织。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述脱细胞生物基质支架来源于粘膜或粘膜下组织。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述脱细胞生物基质支架来源于哺乳动物的胃、十二指肠、空肠、回肠或结肠。
20.根据权利要求16-19中任一项所述的方法，其中不使用MEK抑制剂的情况下细胞维持接触抑制。
21.根据权利要求16-19中任一项所述的方法，其中细胞维持接触抑制的天然调节机制的功能并形成完整的单层。
22.根据权利要求16所述的方法，其中所述前体细胞是人类肾源性细胞。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述人类肾源性细胞能够在培养中自我更新和扩增，并且对Oct-4、Rex-1、Pax-2、钙粘素-11、FoxD1、WT1、Eya1、HNF3B、CXC-R4、Sox-17、EpoR、BMP2、BMP7或GDF5中的至少一种的表达为阳性；且对Sox2、FGF4、hTert、Wnt-4、SIX2、E-钙粘素或GATA-4中的至少一种的表达为阴性。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述人类肾源性细胞对细胞表面标志HLA-I、CD24、CD29、CD44、CD49c、CD73、CD90、CD166或SSEA-4中的至少一种为阳性；且对细胞表面标志HLA II、CD31、CD34、CD45、CD56、CD80、CD86、CD104、CD105、CD117、CD133、CD138和CD141中的至少一种为阴性。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述人类肾源性细胞分泌营养因子FGF2、HGF、TGFα、TIMP-1、TIMP-2、MMP-2或VEGF中的至少一种；且不分泌营养因子PDGF-bb或IL12p70中的至少一种。
CN201910284404.0A 2011-05-27 2012-05-25 生物人工近端小管系统及使用方法 Pending CN110511901A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161490890P 2011-05-27 2011-05-27
US61/490890 2011-05-27
CN201280036409.8A CN103842497A (zh) 2011-05-27 2012-05-25 生物人工近端小管系统及使用方法

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201280036409.8A Division CN103842497A (zh) 2011-05-27 2012-05-25 生物人工近端小管系统及使用方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110511901A true CN110511901A (zh) 2019-11-29

Family

ID=46229935

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201280036409.8A Pending CN103842497A (zh) 2011-05-27 2012-05-25 生物人工近端小管系统及使用方法
CN201910284404.0A Pending CN110511901A (zh) 2011-05-27 2012-05-25 生物人工近端小管系统及使用方法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201280036409.8A Pending CN103842497A (zh) 2011-05-27 2012-05-25 生物人工近端小管系统及使用方法

Country Status (15)

Country Link
US (1) US20120301958A1 (zh)
EP (1) EP2714894B1 (zh)
JP (2) JP6158175B2 (zh)
KR (1) KR102034496B1 (zh)
CN (2) CN103842497A (zh)
AU (1) AU2012262382B2 (zh)
BR (1) BR112013030567B1 (zh)
CA (1) CA2837462C (zh)
ES (1) ES2764850T3 (zh)
MX (1) MX2013013877A (zh)
PL (1) PL2714894T3 (zh)
RU (1) RU2620947C2 (zh)
SG (1) SG195125A1 (zh)
WO (1) WO2012166668A1 (zh)
ZA (1) ZA201309678B (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160101133A1 (en) * 2013-05-08 2016-04-14 Regenmedtx, Llc Organoids comprising isolated renal cells and use thereof
JP6599310B2 (ja) * 2014-03-31 2019-10-30 テルモ株式会社 シート状細胞培養物の品質評価方法
JP6755085B2 (ja) * 2015-11-10 2020-09-16 日機装株式会社 細胞支持複合体および細胞支持複合体の製造方法
WO2018186185A1 (ja) 2017-04-06 2018-10-11 日機装株式会社 細胞の培養方法、細胞支持複合体の製造方法、培養細胞及び細胞支持複合体
CN108588006A (zh) * 2018-05-10 2018-09-28 华东理工大学 一种用于肝细胞三维培养的生物支架及其制备方法和应用
JP7141688B2 (ja) * 2018-05-15 2022-09-26 学校法人北里研究所 近位尿細管上皮細胞株及びその使用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090209019A1 (en) * 2006-10-17 2009-08-20 Tokai University Educational System Bioartificial Renal Tubule
CN101595212A (zh) * 2006-10-12 2009-12-02 伊西康公司 肾源细胞及在组织修复和再生中的使用方法
WO2010064995A1 (en) * 2008-12-02 2010-06-10 Agency For Science, Technology And Research Method for formation of renal tubules
US20110008892A1 (en) * 2007-06-04 2011-01-13 The Regents Of The University Of California Methods of tissue generation and tissue engineered compositions

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5695998A (en) * 1995-02-10 1997-12-09 Purdue Research Foundation Submucosa as a growth substrate for islet cells
US6355699B1 (en) 1999-06-30 2002-03-12 Ethicon, Inc. Process for manufacturing biomedical foams
US6479064B1 (en) * 1999-12-29 2002-11-12 Children's Medical Center Corporation Culturing different cell populations on a decellularized natural biostructure for organ reconstruction
US7078033B2 (en) * 2001-12-07 2006-07-18 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Urinary tract tissue graft compositions and methods for producing same
AU2002340463A1 (en) * 2001-11-16 2003-06-10 Children's Medical Center Corporation Augmentation of organ function
CN104630129A (zh) * 2002-03-15 2015-05-20 北卡罗来纳大学查伯山分校 原肝干细胞和近肝干细胞
US8568761B2 (en) * 2005-07-15 2013-10-29 Cormatrix Cardiovascular, Inc. Compositions for regenerating defective or absent myocardium
CA2618731C (en) * 2005-08-26 2021-12-28 Regents Of The University Of Minnesota Decellularization and recellularization of organs and tissues
US9580688B2 (en) * 2007-06-08 2017-02-28 Wake Forest University Health Sciences Kidney structures and methods of forming the same
WO2009072990A1 (en) * 2007-12-06 2009-06-11 Agency For Science, Technology And Research Method for extracellular matrix mediated differentiation and proliferation of stem cells
EP2177603A1 (en) * 2008-09-25 2010-04-21 Gambro Lundia AB Device for renal cell expansion
DE102008056037B4 (de) 2008-11-05 2012-10-31 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Mikrofluidischer Bioreaktor
JP2012522511A (ja) * 2009-03-31 2012-09-27 リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミネソタ 臓器および組織を脱細胞化および再細胞化する方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101595212A (zh) * 2006-10-12 2009-12-02 伊西康公司 肾源细胞及在组织修复和再生中的使用方法
US20090209019A1 (en) * 2006-10-17 2009-08-20 Tokai University Educational System Bioartificial Renal Tubule
US20110008892A1 (en) * 2007-06-04 2011-01-13 The Regents Of The University Of California Methods of tissue generation and tissue engineered compositions
WO2010064995A1 (en) * 2008-12-02 2010-06-10 Agency For Science, Technology And Research Method for formation of renal tubules

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NAKAYAMA K H ET AL: "Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering", 《TISSUE ENGINEERING: PART A》 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP6523358B2 (ja) 2019-05-29
ES2764850T3 (es) 2020-06-04
CA2837462A1 (en) 2012-12-06
KR102034496B1 (ko) 2019-10-22
US20120301958A1 (en) 2012-11-29
EP2714894A1 (en) 2014-04-09
AU2012262382A1 (en) 2013-12-12
BR112013030567B1 (pt) 2021-02-17
JP6158175B2 (ja) 2017-07-05
AU2012262382A8 (en) 2014-01-16
RU2013158327A (ru) 2015-07-10
PL2714894T3 (pl) 2020-04-30
BR112013030567A2 (pt) 2017-07-04
JP2017099417A (ja) 2017-06-08
WO2012166668A1 (en) 2012-12-06
MX2013013877A (es) 2014-05-28
EP2714894B1 (en) 2019-10-30
CN103842497A (zh) 2014-06-04
JP2014515270A (ja) 2014-06-30
SG195125A1 (en) 2013-12-30
CA2837462C (en) 2021-06-01
RU2620947C2 (ru) 2017-05-30
ZA201309678B (en) 2015-08-26
KR20140042824A (ko) 2014-04-07
AU2012262382B2 (en) 2016-10-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6523358B2 (ja) バイオ人工近位尿細管システム及びその使用方法
EP4123014A1 (en) Cardiac organoid, manufacturing method therefor, and method for evaluating drug toxicity by using same
CN102787094B (zh) 培养基、细胞培养用试剂盒及细胞培养方法
CN104937095B (zh) 肾细胞群及其用途
WO2010079602A1 (ja) 動物肝細胞の培養方法
Lowe et al. Neurogenesis and precursor cell differences in the dorsal and ventral adult canine hippocampus
US20200385683A1 (en) Composition and method for culturing organoids
Nielsen et al. Improved method for the establishment of an in vitro blood-brain barrier model based on porcine brain endothelial cells
JP2001238681A (ja) 共培養による血液脳関門再構築モデル
CN108570446A (zh) 一种尿液来源细胞的培养方法
KR20140016241A (ko) 상처 치유 메타카리오틱 줄기 세포 및 그 사용방법
CN102171332A (zh) 促进肾前体细胞增殖的方法
CN104755610B (zh) 脂肪组织细胞
Kanazawa et al. Transformed growth phenotype of mouse mammary epithelium in primary culture induced by specific fetal mesenchymes
Kuramitsu et al. A new anti-metastatic drug, ND-2001, inhibits lung metastases in rat hepatoma cells by suppressing haptotaxis of tumor cells toward laminin
Yang et al. Benchmark for establishment of organoids from gastrointestinal epithelium and cancer based on available consumables and reagents
CN102787093B (zh) 培养基、细胞培养用试剂盒及细胞培养方法
CN114317398B (zh) Gli1和EpCAM基因共同标记的肝祖细胞群及其应用
Sengel Study of organogenesis by dissociation and reassociation of embryonic rudiments in vitro
CN117987370B (zh) 一种人原代胶质母细胞瘤获得性耐药细胞系及其应用
Cartwright Investigation of In Vitro Milk Production Using Mammary Epithelial Cell Culture
KR20240058788A (ko) 신장 근위 세뇨관 오가노이드, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 약물 평가 방법
CN109689073A (zh) 器官纤维化的预防或治疗剂
RO132002A0 (ro) Metodă de stabilire a chemogramei personalizate, utilizată în managementul pacientului cu cancer pancreatic
Hammerman Microvessel formation from mouse embryonic aortic explants is oxygen and VEGF dependent Tetsu Akimoto, Helen Liapis, and Marc R. Hammerman

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20191129