KR20140016241A

KR20140016241A - 상처 치유 메타카리오틱 줄기 세포 및 그 사용방법

Info

Publication number: KR20140016241A
Application number: KR1020137011269A
Authority: KR
Inventors: 엘레나 브이. 고스트제바; 윌리엄 쥐. 틸리
Original assignee: 메사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지
Priority date: 2010-10-25
Filing date: 2011-10-24
Publication date: 2014-02-07
Also published as: JP2013540276A; CN103354905A; US9499851B2; CA2815787A1; US20130203048A1; WO2012061073A1; EP2633323A1

Abstract

본 발명은 상처 치유 메타카리오틱 줄기 세포를 확인하는 방법, 메타카리오틱 줄기 세포의 증식 및/또는 이동을 조절하는 분자를 확인하는 방법 및 재협착을 포함하는 혈관 상처 치유 장애와 같은 상처 치유 장애를 치료하는 분자를 확인하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 혈관 상처 치유 장애와 같은 상처 치유 장애를 진단 및 치료하는 방법과 메타카리오틱 줄기 세포 이식을 사용함으로써 상처를 치료하는 방법을 제공한다.

Description

상처 치유 메타카리오틱 줄기 세포 및 그 사용방법{WOUND HEALING METAKARYOTIC STEM CELLS AND METHODS OF USE THEREOF}

본 출원은 2010년 10월 25일 출원된 미국 가출원 제61/406,468호의 우선권을 주장한다. 위 출원의 모든 교시는 본 출원에 참조로 포함된다.

상처 및 상처 치유 장애(wound healing disorder)는 만연하며 삶의 질을 손상시킨다. 신경계를 절단하는 상처는 마비를 초래한다. 상처 치유 장애는 외상 및 감염 후 기관 및 조직에서 상처를 악화시키며, 죽상동맥경화증 (atherosclerosis)과 같은 점진적인 이상에서 초래되는 혈관 질환에 자주 요구되는 외과적 개입(surgical intervention)에 따르는 상처 및 상처-유사 상태를 같이 포함한다. 예를 들면, 관상 또는 경동맥 질환과 같은 혈관 질환은 미국에서 수백만의 개인 및 세계적으로 훨씬 많은 개인에서 발생된다. 예를 들면, Ma et al ., J. Clin . Exp . Med., 3(3):192-201 (2010)를 참조하라.

혈관이식, 스텐트 및 혈관성형(angioplasty)과 같은 혈관질환에 대한 치료적 개입은 정상적인 혈류를 회복시킴으로써 혈관 질환의 쇠약효과를 개선할 수 있다. 그러나 상처 치유 장애가 흔하고, 혈관벽 평활근 세포수의 급격한 증가에 의해 유발되는 외과적 개입에 후속되는 재협착이나, 혈관의 재축소와 같은 합병증을 유발할 수 있기 때문에, 이러한 개입에 따른 개선은 단지 일시적일 수 있다.

이러한 새로운 발견은 수술후 재협착과 같은 혈관 상처 치유 장애에 관련된 것과 같은 상처 치유 병소를 만드는 세포의 정체 및/또는 공급원에 관한 본 기술분야에서의 논쟁에 직접적으로 관련된다. 일부 저자는 대동맥궁의 외막(adventitia)에서 분리된 미특정 일부 세포들이 줄기세포-유사 성질(세포 표면 마커의 세포 발현과 같은) 및 죽상동맥경화증을 일으킬 수 있는 세포들을 생산하는 능력을 갖는 것을 보여주는 결과를 제시한 바 있다(Hu et al ., J. Clin . Invest ., 133(9): 1258-65 (2004)). 이 죽상동맥경화증 연구는 본 명세서에 기술된 수술후 재협착과 같은 상처 치유와 구별되는데, 수십년에 걸쳐 서서히 진행되는 죽상동맥경화 플라크(atherosclerotic plaque)가 수술후 재협착에서는 대략 수 주 및 수 개월 내에 재현되기 때문이다. 재협착은 실제 "질주 죽상동맥경화증 (galloping atherosclerosis)"으로 특징 지을 수 있다. 이들 연구는 연구된 특정 세포의 확인 또는 분류에 도움이 되는 예컨대 병리학자나 조직학자에 의한 현미경 검사에 의한 세포의 형태적 특징 규명은 물론, 이들 세포의 질병상태에서의 분명한 역할을 설정하지 않았다.

다른 저자는 특정 표면 항원 및 다른 특징을 갖는 세포의 분포를 기술하면서, 혈관 및/또는 혈관-근위 조직에서 가능한 줄기 세포 유사 특징으로 세포 위치를 규정하였다. 불행하게도 이러한 항원 마커나 줄기 세포는, 줄기세포가 아닌 세포들 위와 사이에 광범위하게 분포됨이 입증되었다. 상기 마커는 세포 혼합물로부터 줄기 세포를 강화하는데 유용하지만 특별히 줄기 세포를 분리하고 관찰하는 것은 허용하지 않는다(Pasquinelli et al ., Cytotherapy, 12:275-87 (2010)). 그러나 이러한 연구들은 줄기-유사 성질을 갖는 세포가 임의의 질병에서 어떤 역할을 하는지 입증하지 않았다. 특히, Pasquinelli 등은 혈관벽에서 메타카리오트(metakaryote)의 대칭 또는 비대칭 무사분열(amitosis)를 관찰하지 않았으며 메타카리오트 세포의 비대칭 무사분열에 의한 평활근 세포의 생성도 관찰하지 않았다. 따라서 상처 치유 및 상처 치유 장애에 관련된 세포 타입을 동정할 필요가 있다. 또한 상처 치유에 관여하는 세포, 즉, 실제 질병 상태에 관여하는 줄기 세포의 성장 및/또는 이동을 조절함으로써 상처 치유 장애를 치료하는 약제를 확인할 필요가 있다. 예를 들어, 병리적 이상의 기저가 되는 줄기 세포를 살해하고/하거나 분화 세포의 이동, 증가 또는 생산을 늦춤으로써 이상 과잉 조직 생성(aberrant excess tissue generation)을 특징으로 하는 상처 치유 장애를 치료하는 약제를 확인하는 방법에 대한 추가적인 요구가 있다. 이는 수술후 재협착의 경우 평활근 세포에 대해 특히 그러하다.

본 발명의 목적은 특히 수술후 재협착과 같은 상처 치유 장애에서 상처 치유 메타카리오틱 줄기세포를 인식하는 방법 및 이러한 상처 치유 장애를 치료하는 분자의 확인방법을 제공하는 데 있다.

본 발명은 적어도 부분적으로, 재협착을 겪는 이식 환자에서 외과적으로 유래된 재협착 병소에서, 대칭 무사분열에 의해 증가하고 비대칭 무사분열에 의해 평활근 세포를 생성하는 종-형태(bell-shaped)의 핵을 갖는 메타카리오틱 세포의 발견에 기초한다. 평활근 핵은 유사 또는 무사 분열 과정 중 어떤 것에 의해서도 더 이상 증가하지 않았음이 주목되었다. 평활근 세포는 혈관강벽(vessel luminal walls) 내/상에서 증가하는 메타카리오틱 줄기세포 자신의 비대칭 무사분열에 의해 한번에 하나씩 생긴다. 이 발견은 인간 태아의 신장 혈관 발생 중에 대칭 및 비대칭 무사분열에 의해 분할하고 평활근 세포를 생성하는 메타카리오틱 줄기 세포의 유사한 관찰과 일치한다. 도 2 내지 도 4를 참조한다. 재협착 병소에서 메타카리오틱 줄기 세포의 공급원은, 수적으로, 그리고 성체 중간엽 줄기 세포에 관련된 세포학적 위치에서 성체(adult) 마우스 및 다수의 인간의 결장 및 타 기관의 중간엽 조직 영역(mesenchymal tissue area)에서의 비-분할, 정지상태의 메타카리오틱 세포에 대한 본 출원인에 의한 별개의 발견에 의해 제안되었다. 이 관찰에서 출원인은 외과적으로 결합된 혈관에 부속된 외막 조직층의 메타카리오틱 성체 줄기 세포가 상처로 들어가 초기 치유를 증진시키지만, 불가해하게 그 수가 계속 증가하고 재협착의 병리적 상태가 초래될 때까지 평활근 세포 수를 증가시킨다고 결론 내렸다.

일 양태에서, 본 발명은 일반적으로 대칭 및 비대칭 무사 분열 양자에 의해 활동적으로 분할하는 종-형태의 핵을 갖는 신시튬(syncytia) 및/또는 세포를 인식함으로써 상처 치유 줄기 세포를 확인하는 방법을 제공한다. 이러한 예는 각막 이식 후 상처 가장자리에 메타카리오틱 세포의 급격한 출현 및 골격근 상처의 치유 중 메타카리오틱 관 신시튬(metakaryotic tubular syncytia)의 출현을 포함한다.

추가적 양태에서, 본 발명은 체내 도처에 조직의 중간엽 영역에 광범위하게 분포된 비-분할 상태의 상처 치유 메타카리오틱 줄기 세포 (본원에서 성체 중간엽-관련 메타카리오틱 줄기 세포로 지칭되기도 한다)를 확인하는 방법을 제공한다. 이러한 인식은 특히 비 줄기 세포 타입 및 세포간 물질 덩어리에 부착하는 항체로 인식하는 것과 같은 비교적 비-특이적인 방법에 의존함 없이, 예를 들면 레이저-캡쳐 (laser-capture)와 같은 성체 중간엽 줄기세포의 특이적 물리적 분리를 허용하한다.

따라서, 다른 양태에서 본 발명은 메타카리오틱 줄기 세포의 대칭 및 비대칭 분열에 의해 구동된 잘못 조절된 성장 및 분화에 관련된 병리로서 상처 치유 장애를 진단하는 방법을 제공한다. 이러한 장애의 일 예는 수술후 재협착으로 알려진 혈관 상처 치유 장애이다. 이 방법은 분리된 조직 샘플에서 세포핵을 가시화하는 단계를 포함한다. 조직 샘플은 후속하는 현미경 검사에 의해 그 형태가 인식될 수 있도록 DNA-함유 세포핵의 물리적 구조를 고정하는 방법에 의해 제조된다. 일부 실시형태에서, 제조 방법은 실질적으로 약 50 마이크론 까지 최대 직경을 갖는 핵내 핵 구조의 완전한 상태(integrity)를 보존한다. 이 방법은 또한 조직 샘플내 이형 핵 형태(heteromorphic nuclear morphotypes)를 갖는 핵의 존재 및/또는 부재를 결정하는 단계를 포함한다. 재협착의 경우에서 이 방법은 임의로 메타카리오틱 세포로부터 비대칭 무사분열에 의해 동일 세트의 불규칙 핵을 갖는 평활근 세포의 생성을 나타내는 무사분열적 핵분열 및 특징적인 불규칙 핵 형태를 갖는 평활근 세포 수 증가를 인식하는 것을 포함한다. 도 9 내지 도 13, 도 14의 A 및 도 15 내지 도 17을 참조한다. 수술후 재협착이 아닌 병소에서 비대칭 무사분열에 의해 메타카리오틱 줄기 세포에서부터 생기는 정상 조직에 관련하여 특정 이핵 핵 형태를 갖는 세포의 존재는 메타카리오틱 줄기 세포의 미조절 분할에 기초한 상처 치유 장애의 지표이다. 일 실시형태에서, 상처 치유이상을 구동하는 세포는, 인간 기관형성 및 발암의 줄기세포로서 기능하는 것으로 밝혀진 종-형태의 큰 메타카리오틱핵이다(Gostjeva et al ., Organogenesis , 5:4, 191-200 (2009); Gostjeva et al ., Cancer Genetics and Cytogenetics , 14:16-24 (2006)). 다른 실시형태에서 메타카리오틱 세포는 비대칭 무사분열을 통해 상처 치유가 병소로 진행되는 조직의 특징적인 폐쇄 진핵 핵(closed eukaryotic nuclei)을 생성한다. 특정 실시형태에서 메타카리오틱 줄기 세포는 활동적으로 분할한다. 더 구체적인 실시형태에서, 메타카리오틱 줄기 세포는 무사분열적 분할이 진행된다. 더욱 더 구체적인 실시형태에서, 무사분열적 분할은 대칭 무사분열적 분할이다. 다른 특정 실시형태에서, 무사분열적 분할은 비대칭 분할이다.

임의의 실시형태에서, 상처 치유 장애는 손상-유도 신생혈관내막비대(injury-induced neointimal hyperplasia), 문합 후 합병증(post-anastomatosis complication) 또는 재협착과 같은 혈관 상처 치유 장애다.

본 발명의 전술한 양태에서 더욱 구체적인 실시형태에서, 혈관 벽 이상은 재협착이다.

본 발명에 의해 제공된 방법에서 사용된 조직 샘플은 물리적으로(예, 샘플 동결) 또는 화학적으로(예, 알콜, 알데하이드, 유기산 및 이들의 조합에서 선택되는 하나 이상의 화학적 고정제로 처리) 고정될 수 있다. 일부 특정 실시형태에서, 조직 샘플은 메탄올 및 아세트산을 포함하는 고정제로 고정된다. 임의의 실시형태에서, 조직 샘플은 조직 샘플 내 핵의 세포 분해 전에 고정된다(예, 분리 약 20, 30, 40, 50, 60, 90, 또는 120 분 이내). 더 구체적인 실시형태에서, 조직 샘플은 분리후 30분 이내에 고정되고 더욱 더 구체적인 실시형태에서 분리후 15분 이내에 고정된다. 일부 실시형태에서, 신선한(fresh), 고정 또는 동결된 조직 샘플 세포는 조직 침연(maceration) 및 도말(spreading)에 의해 부분적으로 해리(dissociate)된다. 임의의 실시형태에서, 조직 샘플의 세포 또는 거대분자는 염색되고, 이로써 핵 가시화(visualization)가 가능하다. 더욱 구체적인 실시형태에서, DNA가 염색되고, 이로써 DNA 및 핵의 가시화가 가능하다. 임의의 실시형태에서 세포는 적절한 조건하에서 염색 시 형광성(fluorescence)을 띤다(Gostjeva et al ., 2006, 2009).

본 발명의 임의의 실시형태에서, 조직 샘플은 척추동물과 같은 다세포 동물에서 수득된다. 더 구체적인 실시형태에서, 척추동물은 영장류(primate), 설치류 (rodent), 개, 고양이, 돼지, 양, 소 및 토끼와 같은 포유동물이다. 더욱 더 구체적인 실시형태에서, 포유동물은 인간이다. 일부 실시형태에서, 다세포 동물은 사망한 것(deceased), 즉 조직 샘플은 사후(post-mortem)에 수득된 것이다.

특정 실시형태에서, 본 발명에 의해 제공된 방법은 불규칙한 방추-형태(spindle-shaped), 담배-형태, 응축-구형(condensed-spherical), 구형, 타원형, 소시지-형태, 신장-형태, 총알-형태 및 이들의 조합인 핵을 포함하는 이형 핵 형태를 가시화하는 단계를 추가로 포함한다. 더 구체적인 실시형태에서, 이형 핵 형태는 메타카리오틱 줄기 세포 핵의 종-형태 핵이며 평활근 세포의 특징적인 불규칙 핵이다. 도 9의 B 및 13의 A 내지 C를 참조한다. 용어 "불규칙한"은 여기에서 지렁이-유사체(도 9의 B, 도 13의 C) 또는 비틀린 형태(도 13의 A 내지 C)와 닮은 평활근 핵의 수개의 형태학적 형태를 특징으로 하는 것을 의미한다.

임의의 실시형태에서, 본 발명의 방법은 조직 샘플내 이형 핵 형태의 공간적(spatial) 및/또는 수적(numerical) 분포를 결정하는 단계를 포함한다. 이들 실시형태에서, 이형 핵 형태의 공간적 및/또는 수적 분포는 조직 샘플을 추가적으로 특징짓는다. 임의의 실시형태에서, 이형 핵 형태는 다핵 신시튬(multinuclear syncytia) 또는 단핵 세포(mononuclear cell) 내에 함유되어 있다. 일부 실시형태에서, 이형 핵 형태는 종-형태 핵이고 더 구체적인 실시형태에서, 종-형태의 핵은 무사분열 대칭 핵 분할을 나타내는(indicative) 구조에 관련된다. 일부 실시형태에서 이형 핵 형태는 종-형태 핵이고 더 구체적인 실시형태에서, 종-형태 핵은 무사분열 비대칭 핵 분할을 나타내는 구조에 관련된다.

본 발명은 또한 예를 들면 1) 원하지 않는 줄기 세포 활성을 중단시키거나 2) 특정 줄기 세포 활성을 증진시켜 혈관 상처 치유 장애와 같은 상처 치유 장애를 치료하는 하나 이상의 약제(agent)를 확인하는 방법을 제공한다. 예를 들면, 상기 물질은 상처 치유 이상을 비정상적으로 생성하는 상처 치유 메타카리오틱 줄기 세포의 중간엽 조직 영역으로부터의 이동, 대칭 무사분열 및/또는 비대칭 무사분열을 저해함으로써 작용할 수 있다. 상기 메타카리오틱 무사분열의 저해는 메타카리오트를 비-분할 상태(non-dividing state)로 유지하고 이들이 상처부위를 떠나도록 하거나 또는 수술후 재협착의 경우에서와 같이 상처 치유 장애의 비정상적인 성장에 관여하는 메타카리오틱 세포를 살해함으로써 달성될 수 있다. 더욱 특정 실시형태에서 상기 메타카리오틱 무사분열의 저해는 상처 치유 장애에 관여된 모든 메타카리오틱 세포를 살해하는데 충분한 농도 및 지속시간에 시험물질을 노출함으로써 달성된다.

이들 방법들은 상처 또는 혈관 상처 치유 장애와 같은 상처 치유 장애를 갖는 포유동물을 후보물질(candidate agent)로 처리하고, 후속하여 포유동물로부터 유래된 혈관 벽과 같은 관련된 조직 및 상처를 포함하는 분리된 조직 샘플 내에 함유된 세포의 수와 핵 형태를 결정하는 단계를 포함한다. 이 방법들은 후보물질로 처리한 포유동물에서 유래된 조직 샘플내 세포의 수 및 핵 형태를, 상처 치유 장애를 갖지만 후보물질로 처리되지 않은 포유동물로부터 유래된 분리된 조직 샘플내 함유된 세포와 비교하는 단계를 추가적으로 포함한다. 미처리되거나 샘(sham) 처리된 포유동물에서의 상처와 비교하여, 상처 치유 장애 영역에서 메타카리오틱 줄기세포의 증가의 정지, 감소 또는 제거 또는 수술후 재협착의 특별한 경우에서 메타카리오틱 줄기 세포의 비대칭 무사분열에 의한 평활근 세포 증가의 정지는 잠재적으로 가치 있는 치료제를 인식시킨다. 어떤 실시형태에서, 후보물질로 처리된 포유동물은 돼지, 개 또는 설치류와 같은 실험동물이며, 더 구체적인 실시형태에서, 설치류는 랫트, 마우스 또는 기니아 피그(guinea pig)이다. 특정 실시형태에서, 메타카리오틱 종-형태의 핵은 다핵 신시튬내에 배열되며 메타카리오틱 줄기세포의 제거는 신시튬의 파괴, 소멸 또는 죽음에 관련된다.

다른 양태에서, 본 발명은 (예를 들면, 메타카리오틱 줄기 세포의 증식 및/또는 이동을 조절함으로써) 혈관벽 이상과 같은 상처 치유 장애를 치료하는 하나 이상의 물질을 확인하는 인 비트로 방법을 제공한다. 이 방법은 수술후 재협착의 경우 평활근 세포와 같은 상처 조직에 통상 존재하는 세포 및 메타카리오틱 줄기 세포를 포함하는 배양 세포를 하나 이상의 후보물질과 특정 농도 및 노출 지속 기간 동안 접촉시키고 후속하여 배양된 세포의 수 및 핵 형태를 평가하는 것을 포함한다. 후보물질과 접촉하지 않은 대조 세포 배양물에 비교된 메타카리오틱 줄기세포의 성장 또는 수의 변화는 혈관벽 상처 치유 장애와 같은 상처 치유 장애를 치료하는 물질의 효능(effectiveness)을 가리킨다. 더욱 더 구체적인 실시형태에서, 세포 배양에서 잠재적으로 가치 있는 치료제의 인식은 추가적으로 수술후 재협착과 같은 특별한 경우 평활근 세포의 불규칙한 핵 특징을 갖는 세포와 같은 상처 치유 병리에 연관된 세포가 되게 하는 메타카리오틱 줄기세포의 비대칭 무사분열 활성의 중단 변화(ceased change)를 관찰하는 것을 포함한다.

다른 양태에서, 본 발명은 (예를 들면, 메타카리오틱 줄기 세포의 증식 및/또는 이동을 조절함으로써) 혈관벽 이상과 같은 상처 치유 장애를 치료하는 하나 이상의 물질을 확인하는 인 비트로 방법을 제공한다. 이 방법은 포유동물 태아나 암에서 유래된 메타카리오틱 줄기 세포를 포함하는 배양 세포를 하나 이상의 후보물질과 특정 농도 및 노출 지속 기간 동안 접촉시키고 후속하여 배양된 세포의 수 및 핵 형태를 평가하는 것을 포함한다. 후보물질과 접촉하지 않은 대조 세포 배양물에 비교된 메타카리오틱 줄기세포의 성장 또는 수의 변화는 혈관벽 상처 치유 장애와 같은 상처 치유 장애를 치료하는 물질의 효능을 가리킨다. 더욱 더 구체적인 실시형태에서, 세포 배양에서 잠재적으로 가치 있는 치료제의 인식은 추가적으로 수술 후 재협착과 같은 특별한 경우 평활근 세포의 불규칙한 핵 특징을 갖는 세포와 같은 상처 치유 병리에 관련된 세포가 되게 하는 메타카리오틱 줄기세포의 비대칭 무사분열 활성의 중단 변화를 관찰하는 것을 포함한다.

본 발명의 추가적인 양태는 중간엽 메타카리오틱 줄기 세포의 인식에 의한 상처 치료 방법을 제공하며, 이들의 특징적인 종-형태의 핵을 인식함으로써 이들을 농축되도록 강화하거나 또는 인 비트로 성장에 의해 그 수를 증가시키고 상처 부위에 이들을 시딩(seeding)하여 상처를 치료하는 방법을 제공한다. 상기 이식 요법을 위한 메타카리오틱 줄기 세포는 환자, 면역학적으로 매칭된(matched) 인간 제공자(donor), 면역적으로 비매칭된 인간 제공자 또는 비-인간 동물로부터 수득될 수 있다. 상기 이식 요법을 위한 메타카리오틱 줄기 세포는 줄기 세포 이식 요법에 사용되기 전에 배양에서 팽창될 수 있다.

본 발명의 추가적인 양태는 상처 치유 줄기 세포의 이동, 대칭 무사분열 및/또는 비대칭 무사분열을 조절함으로써 우월한 상처 치유 숙주 반응을 일으키는 시험 분자를 인식하는 방법을 제공한다.

본원에서 기술된 본 출원인 발명의 결과로서, 소집(recruitment)을 기다리거나 (예, "대기하고 있는(on call"), 소집되는 동안(예, 이동) 및 일반적으로 조직의 중간엽 영역 및 수술후 재협착의 경우와 같이 특이적으로 혈관의 중간엽 외막에서부터 상처가 치유되는 동안(예, 증식)의 상처 치유 메타카리오트(성체 줄기 세포)를 인식, 분리 및 연구하는 방법이 가능해 졌다.

본원은 하나 이상의 컬러(color) 도면을 포함한다. 컬러 도면을 갖는 본원 사본은 요구 및 필요한 경비의 지불 시 관청에 의해 제공될 것이다.
도 1은 정상 발달 및 중요한 병리적 상태의 메타카리오틱 줄기 세포의 역할을 도시한다.
도 2의 A 내지 C는 종모양의 핵(화살표로 표시)을 갖는 인간 태아 신장 동맥(9주) 내 신시튬 구조(syncytial structure)를 보여주는 현미경 사진이다. 도 2의 A는 크로마틴(chromatin)의 인식가능한 "고리"를 갖는 단일 종-형태의 핵이다. 도 2의 B는 대칭(종 대 종) 핵 분열이다. 도 2의 C는 신시튬 종-형태의 핵(화살표로 표시), 포일겐(자주색) 및 포일겐(녹색) 형광 병합 이미지를 도시한다(x20).
도 3의 A 내지 G는 9주된 인간 태아 신장 동맥의 비-신시튬 종-형태의 핵(화살표)을 보여주는 현미경 사진을 도시한다. 평활근 세포에서 발견되는 불규칙 핵을 갖는 세포를 포함하는 새로운 세포 형태가 비대칭 무사분열과 함께 메타카리오틱 세포에서 생기는 것이 보인다.
도 4의 A 내지 E는 9주된 인간 태아 신장 동맥의 현미경 사진을 도시한다. 도 4의 A는 메타카리오틱 종-형태의 핵이 혈관 내피 세포에서 발견되는 것과 같은 구형 핵을 낳는 비대칭 무사분열 형태와 상기 과정을 그림으로 묘사한 것을 함께 도시한다. 도 4의 B는 메타카리오틱 줄기 세포의 순 성장(net growth)을 나타내는, 하나의 메타카리오틱 종-형태의 핵으로부터 두개의 종-형태의 메타카리오틱 핵이 생기는 대칭 무사분열을 도시한다. 도 4의 C는 혈관벽 내 수개의 종-형태의 핵 및 상이한 형태를 갖는 수개의 폐쇄된 핵과 함께 자주색 포일겐 염색된 핵(자주색)을 도시한다. 도 4의 D는, 형광(녹색)이 미지의 구조, 아마도 종-형태의 핵에서 나오거나 또는 혈관벽에 홀로 존재하는 세포질 사카라이드와 포일겐 시프 염기(Feulgen Schiff's base) 반응에 의해 생성되는 것으로 추정되는 것을 제외하고는, 도 4C에 나타낸 필드의 형광 이미지를 도시한다. 도 4의 E는 도 4의 C 및 도 4의 D를 결합한 것으로 자주색 및 녹색 형광 포일겐 염색된 구조를 도시한다.
도 5의 A 내지 D는 상처 치유에서 태아-유사 관 신시튬(fetal-like tubular syncytial; 근관(myotube))의 출현을 보여주는 현미경 사진을 도시한다. 도 5의 A는 재생되는 포유동물 골격(횡문)근의 근관(화살표)이 현미경 하에서 어떻게 보이는 지를 보여주는 현미경 사진이다. 이들은 배아 근육에서 발견되는 근관과 매우 유사하다. 도 5의 B는 9주된 인간 태아 골격 근육에서의 근관(화살표)를 보여주는 현미경 사진이다. 도 5의 C 및 도 5의 D는 9주된 인간 태아 근관에서 종 대 종 핵 분열을 보여주는 현미경 사진이다.
도 6의 A 내지 D는 하기의 사항을 보여주는 현미경 사진인데, 도 6의 A는 정상의 비-질병 상태의 인간 동맥을 보여주는 것이다(종-형태의 핵을 갖는 세포 부분(fraction)(어린이에서)이 약 1 x 10^-4 내지 1 x 10^-5로 낮다). 도 6의 B는 비대칭 핵 분열 '줄기세포-평활근 세포'(화살표)를 보여주고, 도 6의 C 및 도 6의 D는 젊은 성체 돼지 폐동맥에서 종-형태의 핵(화살표)이 드물다(약 1 x 10^-5)는 것을 보여주는 현미경 사진이다.
도 7은 정상 비-질병 상태의 심장 및 실패한 제공자 심장 동맥을 갖는 어린이(2세) 심장의 일련의 현미경 사진을 도시한다. 도 7의 A는 메타카리오틱 세포 부분이 정상 심장 내 약 1 x 10^-5임을 결정하는데 사용된 샘플 예를 보여준다. 도 7의 B는 플라크(plaque)내 메타카리오틱 세포 부분이 실패한 제공자 심장내 약 1 x 10^-4임을 결정하는데 사용된 샘플예를 보여준다. 도 7의 C, D, 및 E는 이식된 심장내 우(및 좌) 심실 심근 세포가 구균에 감염되었음을 보여주는 현미경 사진이다. 이러한 감염된 조직 표면에 메타카리오틱 세포 부분은 약 2 x 10^- ⁴ 인 것을 발견하였다.
도 8은 심장 이식 후 이식후 재협착을 앓는 소아 환자로부터의 생검 시료(biopsy)의 현미경 사진이다. 밝은 마젠타색 침상체(magenta spicule)는 혈관벽을 따라 분포된 피브로넥틴 섬유 상의 석회화된 구조이며, 이는 급속히 진행된 재협착의 경우 "질주 죽상동맥경화증"으로도 알려져 있는 "동맥 경화"를 구성한다.
도 9는 이식후 재협착으로 고통받는 환자로부터의 생검 시료내 피브로넥틴을 보여주는 한 쌍의 현미경 사진이다. 여기에서 도 9의 A는 종-형태의 메타카리오틱 핵과 특징적인 세트의 불규칙 핵을 갖는 평활근 세포의 핵에 함께 관련되는 초기 피브로넥틴 섬유(nascent fibronectin fiber)를 나타내며, 도 9의 B는 하나의 종-형태의 핵과 수개의 불규칙한 형태의 평활근 세포의 핵을 갖는 두꺼운 피브로넥틴 매트(mat)를 도시한다.
도 10은 이식후 재협착으로 고통 받는 환자로부터의 생검 시료내 석회화를 보여주는 한 쌍의 현미경 사진을 도시한다. 도 10의 A는 피브로넥틴 섬유를 따라 석회화를 보여주며, 한편 도 10의 B는 더 높은 배율에서 플라크 도처에 일반적으로 분포된 수개의 종-형태의 핵을 보여준다.
도 11은 이식후 재협착으로 고통 받는 환자로부터의 생검 시료의 현미경 사진이다. 피브로넥틴 덩어리가 종 및 다른 형태의 핵을 갖는 부속 세포와 함께 우측에 보여진다. 좌측에 다양한 종-형태의 핵이 평활근 세포를 포함하여 다른 핵 형태를 갖는 세포를 발생하는 것이 보이며, 더 높은 해상도에서 확대한 것은 도 4의 A에 묘사된 것과 같은 비대칭 무사분열의 다른 예를 보여준다.
도 12의 A 내지 E는 메타카리오틱 세포 부분이 약 1 x 10^-3로 추정되는 재협착 플라크(심장 이식, 2세 어린이) 내 종-형태의 핵(화살표)을 보여주는 현미경 사진이다.
도 13의 A 내지 D는 도 12에서와 같이 평활근 세포핵을 생성하는 종-형태의 핵의 추가적인 예를 보여주는 일련의 현미경 사진이다.
도 14는 재협착 플라크 내(심장 이식, 2세)(도 14의 A), 태아 내장(5 내지 7주)(도 14의 B), 및 HT 29 암 세포주 (도 14의 C)에서의 메타카리오틱 줄기 세포핵 쌍들의 일련의 현미경사진이다.
도 15는 수술후 재협착을 앓는 환자로부터의 생검 시료의 일련의 현미경 사진이다. 도 15의 A는 종-형태 및 다른 모양의 핵과 관련된 피브로넥틴 섬유를 보여준다. 도 15의 B는 종-형태의 핵이 평활근 세포의 핵 또는 핵 형태를 생성시키는 것으로 보여지는 최근의 비대칭 무사분열 결과를 보여준다. 도 15의 C는 평활근 세포의 두 핵에 바로 인접한 두 개의 종-형태의 핵을 보여준다. 도 15의 D는 좌측의 종-형태의 메타카리오틱 줄기 세포 핵에서 피브로넥틴이 기원되는 것으로 보이는 거의 구형 핵을 생성하는 최근의 비대칭 무사분열로 보이는 것을 포착한 것이다.
도 16은 수술후 재협착을 앓고 있는 환자에서 유래된 생검 시료의 현미경사진을 도시한 것이다. 두개의 종-형태의 메타카리오틱 줄기 세포핵(화살표)이 평활근 세포의 핵 및 다른 부정형 핵과 함께 피브로넥틴 가까이에 보인다.
도 17의 A 내지 D는 방광 폴립 카테터 손상(bladder polyp catheter injury)을 입은 환자에서 신생 혈관 생성(neovasculogenesis) 및 상처 치유를 보여주는 현미경사진이다.
도 18은 6개월된 어린이의 피부에서 상처 치유에 관여된 메타카리오틱 줄기 세포를 포함한 세포들의 현미경사진을 도시한다.
도 19의 A 내지 C는 6개월된 어린이의 피부에서 상처 치유에 관여된 메타카리오틱 줄기 세포를 포함한 세포들의 현미경사진을 도시한다.
도 20은 6개월된 어린이의 피부에서 상처 치유에 관여된 메타카리오틱 줄기 세포를 포함한 세포들의 현미경사진을 도시한다.
도 21은 6개월된 어린이의 피부에서 상처 치유에 관여된 메타카리오틱 줄기 세포를 포함한 세포들의 현미경사진을 도시한다.
도 22의 A 내지 C는 하기를 보여주는 현미경사진이다: 도 22의 A는 메타카리오틱 세포가 없는 정상 폐정맥을 나타내고, 도 22의 B는 많은 메타카리오틱 세포와 함께 협착성 좌우 폐정맥을 나타낸 것이며, 도 22의 C는 수많은 메타카리오틱 세포와 문합 합류(confluence of anastomosis)를 나타낸 것이다.
도 23의 A 내지 C는 협착성 정맥에서의 비대칭 핵 분열 현미경사진이다(평활근 세포의 비-유사분열 유래); 핵 DAN에 대해 포일겐 자주색 염색. 도 23의 C는 메타카리오틱 줄기 세포의 비대칭 무사분열로부터 나타난 후 평활근 세포핵 모양을 나타낸다(확대).
도 24는 메타카리오틱 줄기 세포에서 무사분열에 의해 생성된 평활근 세포의 불규칙 핵의 다른 예를 포함하여 좌우 폐정맥의 협착 부위에서의 메타카라오틱 줄기 세포의 현미경 사진을 도시한다.
도 25의 A 내지 D는 평활근 세포 그룹 및 이들의 "모" 메타카리오틱 줄기 세포를 보여주는 문합 합류/재협착 현미경사진이다.
도 26은 문합 부위에서 비-유사분열 비대칭 핵분열 현미경사진으로서 특히 메타카리오틱 줄기 세포로부터 비대칭 무사분열에 의해 생성되는 평활근 세포의 불규칙 핵(자주색)을 보여준다.
도 27은 협착 조직의 다른 예를 나타낸 현미경사진이며; 여기 및 모든 도면에서 유사분열 또는 무사분열에 의해 분할되는 평활근 세포가 없는 것이 주목된다.
도 28은 마우스 결장의 현미경사진을 도시한다. 도 28의 A는 마우스 상행 결장에서 약 256 세포의 전체 크립트(whole crypt)를 보여준다. 도 28의 B는 크립트 밑부분의 확대 부분이며, 크립트 밑부분에 종-형태의 메타카리오틱 줄기 세포(적색 화살표)와 별도의 지지 실질층(supporting stromal layer)으로부터 평활근 세포의 특징적인 불규칙 핵(청색 화살표)을 보인다. 포일겐 DNA 염색(자주색). Gostjeva et al ., 2006을 참조한다.
도 29는 크립트가 없는 성체 상행 마우스 결장에서의 지지 실질을 나타낸 현미경사진이다: 파란 화살표는 평활근 세포의 핵을 나타내며 적색 화살표는 결장 상피 부분 하부 중간엽 부분에서 종-형태의 핵을 갖는 메타카리오틱 줄기 세포를 나타낸다(크립트-세포 우측으로, 흑색 화살표).
도 30은 성체 마우스 상행 결장의 중간엽 부분에서 메타카리오틱 줄기 세포(적색 화살표) 및 평활근 세포의 불규칙한 핵(청색 화살표)의 X 100 현미경 이미지이다. 포일겐 DNA 염색.
도 31은 4세 어린이의 정상 방광 혈관내 메타카리오틱 줄기 세포(적색 화살표) 및 평활근 세포의 방추형 핵(청색 화살표)의 X 100 현미경 이미지이다. 포일겐 DNA 염색(자주색).
도 32의 A 및 B는 방광 조직의 현미경사진이다. 도 32의 A는 4세 어린이의 정상 방광내 가지 혈관을 나타낸다: 종-형태 핵을 갖는 메타카리오틱 줄기 세포(적색 화살표), 불규칙 핵을 갖는 평활근 세포(청색 화살표) 및 혈액 세포(녹색 화살표). 포일겐 DNA 염색(자주색). 도 32의 B는 4세 어린이의 정상 방광의 평활근 세포의 열을 보인다: 종-형태 핵을 갖는 메타카리오틱 줄기 세포(적색 화살표), 불규칙핵을 갖는 평활근 세포(청색 화살표). 포일겐 DNA 염색(자주색).
도 33의 A 및 B는 3세 남성의 방광 폴립 혈관내 종-형태 핵을 갖는 메타카리오틱 줄기 세포(적색 화살표), 신장된 불규칙 핵을 갖는 평활근 세포(청색 화살표)의 한 쌍의 X 100 이미지를 도시한다.

본 발명의 예시적 실시형태를 하기에 기술한다.

본원에 보고된 발명은, 부분적으로, 1) 성체 마우스와 인간의 결장 및 다른 기관의 중간엽 조직 영역 및 성체 중간엽 줄기 세포를 갖는 다른 것에 의해 부속되는 세포학적 위치에서 수적으로 비-분할 정지 상태에 있는, 2) 대칭 및 비대칭 무사분열에 의해 분할하여 인간 태아의 일차 신장 동맥의 평활근 세포를 생성하는, 및 3) 치명적인 수술후 재협착을 앓고 있는 심장 이식 환자의 혈관 결찰(vascular ligature) 근처에서, 대칭 및 비대칭 무사분열에 의해 신속히 분할하여 메타카리오틱 세포 및 평활근 세포의 수를 증가시키는, 종-형태의 핵을 갖는 성체 메타카리오틱 줄기 세포의 발견에 기초한다. 이들 발견은 본 출원인의 기존의 발견과 결합하여 조직 중간엽(미분화된 조직, 실질, 외막 등 다양하게 지칭된다)의 메타카리오틱 줄기세포가 상처 치유 및 이에 유래된 병적 상태에서 상처 치유 줄기 세포로 작용하여, 클론 질병 죽상동맥경화 및 수술후 재협착의 다클론 상태에서 평활근 세포를 불리하게 증가시킨다는 간단한 패러다임을 제공한다. 본 발명은 예컨대 조직병리학적 방법을 포함하는 수단으로 재협착과 같은 상처 치유 장애의 진단 및 연구 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 외막-부속 메타카리오틱 줄기 세포(adventitia-associated metakaryotic stem cell)의 증식을 자극하거나 저해하는 물질을 확인하는 인 비트로 및 인 비보 방법을 제공한다.

출원인은 이전에 많은 태아 기관의 발달적 팽창에 신시튬(syncytia; 다핵 세포) 및 각 핵이 중공의 종 형태(hollow bell shape)를 갖는 단핵 세포로 구성된 줄기 세포계통(stem cell lineage)이 관여함을 발견하였다. 이들 세포는 핵 분할시 유사분열을 사용하지 않았으며, "무사분열"로 명명되는 분할 방법인 크로모좀 응축(chromosome condensation) 없이 분할되었다. 이들 종-형태 핵의 순 성장(net growth)은, 하나의 종-형태의 핵이 분할되어 동일한 형태를 가지며 각각 두배수체 인간세포(diploid human cells)의 전체 DNA 보체를 함유하는 두개의 종-형태의 핵을 형성하는 대칭 무사분열에 의해 수행되었다. 이들 세포는 종-형태의 핵이 무사분열에 의해 새로운 중공의 종-형태의 핵과 폐쇄된 핵(closed nuclei)으로 분할되는 비대칭 무사분열 과정에 의해 태아 발달에서 세포 분화에 필요한 단계를 수행하였다. 폐쇄된 핵을 갖는 세포는 이후 연속적인 유사분열에 의해 세포수가 증가하여 이들 유사분열적 세포 타입은 각 조직 및 기관의 실질조직(parenchyma) 세포의 광범위한 다수가 되었다. 흥미롭게도 종-형태 핵의 대칭 및 비대칭 무사분열 모두에서, DNA의 게놈 보체는 핵 분할 전에 2배로 되지 않았으나 과정 동안 및 약간 후에 완결되었다. 종-형태의 핵을 갖는 이들 세포는 크로모좀 응축 및 핵 분할 몇 시간 전에 DNA를 복제하는 "진핵"세포(eukaryotic cell)의 특징을 갖지 않았기 때문에, 이들은 새로운 세포 클래스 "메타카리오트(metakaryote)"로 명명되었다. 이들은 기관의 발달 과정 중 그리고 중요하게 이들로부터 유래된 암에서 실질조직 유사분열 세포의 공급원으로 확인되었기 때문에, 메타카리오틱 세포는 수정란(fertilized ovum)과 성체 동물 또는 식물의 분화된 세포 사이에서 줄기 세포 계통(stem cell lineage)의 중요한 부분을 포함하는 줄기세포로 확인되었다(Gostjeva, et al . 2005, 2006, 2009 참조).

출원인은 기관형성(organogenesis) 및 발암(carcinogenesis)의 성장 및 분화 과정이 메타카리오틱 세포에 의해 구동됨을 확립하면서, 세포 성장 및 분화가 동시에 일어나는 다른 질병, 이중에서도 상처 치유 과정 및 조직 재생의 관련 현상에 주목하였다.

본 발명은 재협착와 같은 상처 치유 장애를 진단하는 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 외막-부속 메타카리오틱 줄기 세포의 증식을 저해하는 물질을 확인하는 인 비트로 및 인 비보 방법을 제공한다.

인간에서 종-형태의 핵을 갖는 메타카리오틱 줄기 세포는 수정 후 4 및 5주에 처음으로 관찰되며, 분명히 전구체 유사분열적 배아 줄기세포(precursor mitotic embryonic stem cell)의 다른 형태 무사분열로부터 생성되는 것으로 보인다. 이때 메타카리오틱 세포는 초기 발달 기관 전체에 랜덤하지 않게 방사상-구형 클러스터(radial-spherical cluster) 내에 분포된 다핵 신시튬(multinuclear syncytia)에서 증가한다. 임신 약 12주에 신시튬이 분해되고 모든 메타카리오틱 핵이 예컨대 결장 크립트에서 태아 및 소아 발달 동안 기관형성 줄기 세포로 추정되는 니치(niche)에서 발견된다. 단일 단핵 메타카리오틱 세포는 이들 크립트 밑부분에서 제일 낮은 위치에서만 발견된다. 기관 성숙시 또는 조금 전에 메타카리오틱 핵은 유사분열적 "유지" 줄기세포로 바뀌고, 이 유지 줄기세포는 분할하여 거의 모든 조직에서 발견되는 정상 "프로그램된" 치사가 진행되는 조직 세포를 대체한다(Gostjeva et al., 2009).

본 출원인은 수술후 재협착의 의학적 중요성을 인식하고 이러한 생명을 위협하고 종종 치사에 이르는 과정을 만드는 세포 분할 캐스캐이드를 이해하고자 하였다. 인간 기관 및 암 연구에서 비교적 소수의 메타카리오틱 줄기세포가 수개의 상이한 타입의 진핵세포를 만들고 이들이 후속하여 일련의 이진 유사분열적 세포 분할에 의해 기관 덩어리를 생성한다. 이러한 기관 또는 암의 성장 속도는 세포자멸(apoptosis) 과정에 의해 프로그램된 세포 치사를 진행하는 세포수에 대해 보정된 유사분열 빈도수의 차이에 의해 측정될 수 있다.

그러나 수술후 재협착에서 평활근 세포의 증가 동안에 이러한 분할하는 유사분열적 평활근 세포는 관찰되지 않았다. 따라서 평활근 세포 증가의 수단은 불명확하였다. 그러나, 본 출원인은 대칭 무사분열(메타카리오틱 세포의 순 증가) 및 특히 평활근 세포의 특징적인 불규칙 형태의 핵을 생성하는 비대칭 무사분열을 진행하는 종-형태의 핵을 갖는 세포를 확인하였다(도 9 내지 13, 도 14의 A, 도 15, 도 16 및 도 17 참조). 모든 발달 조직 및 이로부터 유래되는 암들과 구별되게, 재협착 병소에서 메타카리오틱 무사분열에 의해 생성되는 평활근 세포는 더 이상 분할되지 않았으며 오로지 메타카리오틱 세포의 작용에 의해서 증가되는 것으로 보여졌다. 즉 이들은 직속 메타카리오틱 전구체에서 한번에 한 세포씩 증가되었다.

평활근 세포가 메타카리오틱 줄기 세포의 비대칭 무사분열에 의해 생성된다는 사실의 발견은 수술후 재협착 및 다른 상처 치유 현상에서 평활근 세포의 행동에 대해 두가지 의아하고 상반되는 관찰을 설명할 수 있었다. 평활근 세포 수는 세계적으로 죽상동맥경화 플라크에서와 같이 느리게 증가하거나 또는 수술후 재협착에서와 같이 신속히 증가하는 것으로 보고되었으나 유사분열이나 무사분열 중 어떤 기전에 의해 평활근 세포가 분할하여 그 수가 증가되는 지에 대해서는 보고가 없다. 그러나 인간 또는 실험동물에 삼중 티미딘 또는 브로모데옥시우리딘과 같은 DNA 특이적 생화학적 전구체를 처리하였을 때, 많은 평활근 세포의 핵이 이들 특이적 DNA 전구체를 안정화 형태로 즉 DNA로 취하는 것으로 관찰되었다. 많은 과학자들은 이러한 발견을 사용하여 평활근 세포가 활동적으로 분할하는 것으로 결론내렸다. 그러나 평활근 세포는 전술한 바와 같이 본 출원인의 주의 깊은 연구 결과 유사분열 또는 무사분열에 의한 세포 분할을 진행하지 않는 것으로 밝혀졌다. 본 출원인의 다른 발견은 이제 이러한 명백한 모순을 설명할 수 있다.

첫째로, 평활근 세포가 평활근 세포의 분할에서 오는 것이 아니라 특이적으로 메타카리오틱 세포에서 온다는 입증은 왜 분할하는 평활근 세포가 관찰되지 않는지를 설명해준다. 따라서 메타카리오틱 세포는 기관형성 및 발암에서와 같이 대칭 무사분열적 분할에 의해 상처 치유시 증가된다. 둘째로, 본 출원인은 메타카리오틱 줄기세포가 DNA 이중 나선이 먼저 두개의 DNA 이중 나선의 형태로 복제된 후 두개의 딸세포 핵에 분리되는 원핵 및 진핵 세포에서 사용되는 DNA 복제 모드를 사용하지 않는 것을 발견하였다. 대신에, 2011년 6월 2일 출원된 미국 가출원 제61/492,738호에 기술한 바와 같이, 출원인은 메타카리오틱 줄기세포는 먼저 이들 게놈의 두개의 전게놈 카피(pangenomic copy)를 이중 RNA/DNA 헤테로듀플렉스로 생성하고 이 dsRNA/DNA 복제 중간체가 재협착 병소의 메타카리오틱 줄기세포의 비대칭 무사분열에 의해 유래 딸 핵으로 분리된다는 것을 발견하였다. 분리후 dsRNA/DNA는 RNA 전게놈 카피의 분해 및 후속하는 각 딸 세포에서 단일 DNA 가닥(strand)이 복사되는 것을 포함하는 과정에 의해 표준형(canonical) dsDNA 나선 형태로 전환된다. 따라서 비-분할 평활근 세포는 후속하여 분할되지 않을 지라도 삼중 티미딘 또는 브로모데옥시우리딘 또는 다른 특이적 DNA 전구체를 섭취할 것이다. 이러한 발견은 비-분할 평활근 세포의 DNA 게놈내로 DNA 전구체가 섭취되는 파라독스를 설명한다. 후속적으로 분할하지 않은 세포내 분리후 DNA 복사에 의해 유발될 때 DNA 이중화의 출현을 생성한 것은 평활근 게놈의 dsRNA/DNA 복제 중간체의 단일 DNA 가닥의 복사이다. 급속한 수술후 재협착에서 평활근 세포의 명백한 "증식"은 비대칭 무사분열적 분할에 의해 "한번에 하나씩(one-at-a-time)" 비-분할 평활근 세포를 생성하는 메타카리오틱 줄기세포 증식의 결과로 교시된다.

또한 성체에서의 다수 기관, 특히 인간 및 마우스의 결장에 대한 출원인의 연구 결과, 많은 저자에 의해 상처 치유를 위해 "대기하고 있는" 성체 중간엽 줄기세포의 주거지로서 제안된 조직 니치인 "외막" 또는 비교적 비조직화된 중간엽 조직 요소에 부속된 조직의 비-상피 부분에 광범위하게 분포되어 있는 비 분할 메타카리오틱 세포를 발견하였다. 메타카리오틱 세포가 풍부한 유사한 니치는 인간 암의 "미분화 덩어리(undifferentiated mass)", "외막", "중간엽" 또는 "실질"로서 발견될 수 있다. 이러한 니치는 본 출원인에 의해 종-형태의 핵이 부착된 메타카리오틱 세포의 비핵 "세포질 기관"에서 풍부하게 발견되는 점액성 물질에 관련된 "점액성(mucinous)" 성질인 점이 종종 주목된다.

게다가 본 출원인은 다양한 종류의 상처를 치유하는 줄기 세포 이식 분야가, 수 및 가설적으로 그 속에 함유된 줄기 세포의 정체(identity) 측면에서 특정되지 않은 조직 세포 혼합물의 분리에 의존한다는 점을 주목하였다. 체내 도처에서 중간엽 조직 영역에 분포된 메타카리오틱 세포 형태의 발견은, 미확인 줄기 세포가 "농축된" 중간엽 추출물에 풍부히 존재하는 비-줄기 세포로 인한 희석이나 저해 없이 환자 치료에 사용하기 위한, 메타카리오틱 상처 치유 줄기 세포를 특이적으로 확인하고 분리하는 방법을 제공한다.

본 출원인은 살아있는 메타카리오틱 줄기세포를 증가시키고 열거하는 방법이, 많은 경우 줄기 세포 이식 요법, 이러한 인 비보 요법에 필요한 메타카리오틱 줄기세포의 성장을 촉진하는데 효과적인 약물 및 그 유효 농도를 결정하는 데, 수술후 재협착과 같은 상처 치유 장애를 일으키는 메타카리오틱 줄기세포를 살해하는 약물 및 그 유효 농도를 결정하는 데 요구될 것임을 교시한다.

출원인은 특이적 형태에 기초하여 분리된 중간엽 메타카리오틱 줄기세포의 성공적인 사용이 어떤 경우에는 상처 치유를 개시하고 촉진하는데 충분할 것이나, 다른 경우에는 성공적인 요법을 위해 다량의 줄기세포가 요구될 것임을 주목한다. 이를 위해 조직 또는 암에서 온 메타카리오틱 세포는 메타카리오틱 줄기세포의 수가 치료적 용도로 사용되기 충분한 정도로 될 때까지 실험실의 세포 배양에서 성장할 수 있음을 교시한다. 세포배양에 일반적으로 사용되는 방법이 표면적으로 사용될 수 있으나, 본 출원인은 메타카리오틱 세포수의 손쉬운 팽창을 허용하기 위해 그들에 의해 디자인된 연구 실험실에서 일반적으로 사용되지 않는 세포 배양 조건에서 메타카리오틱 세포가 급속히 성장하는 것을 관찰하였다. 특히 다수의 기초적인 세포 배양 매질 레시피 예를 들어, MEM, BME, DMEM 등을 사용하는 반면, 글루코스를 프락토스(510 mM)로 대체하고, 소듐 바이카보네이트를 전적으로 추가하는 것을 생략하여 이 레시피를 변경하였다; 교시한 상기 프락토스(또는 갈락토스와 같은 비-글루코스 사카라이드)를 갖는 매질은 공기 단독 존재하에 사용되고 일반적으로 이산화탄소가 혼합된 공기 존재, 예를 들면 5% 이산화탄소와 95% 공기 혼합물에서는 일반적으로 사용되지 않는다.

메타카리오틱 세포

메타카리오틱 세포는 두드러지나 극히 최근에 인식된 핵 형태: 중공의 종-형태의 핵을 나타낸다. 리뷰를 위해 Gostjeva and Thilly, Stem Cell Reviews 2: 243-252 (2005); 미국 특허 제7,427,502호의 도 1, 2, 3, 6 및 7 및 개시내용을 참조하며, 이들은 본원에 참조로 포함된다. 이들 세포에서는 또한 대칭(추가적인 종-형태의 핵을 낳는다) 및 비대칭(비-종-형태의 핵을 낳는다) "무사분열"모두 진행된다. 무사분열은 유사분열 및 부속 크로모좀 응축이 없는 분열이다. 이 무사분열을 통해 메타카리오틱 세포는, 발달되는 조직의 실질조직(parenchyma), 전신생 병소(preneoplastic lesion) 및 암에 존재하고, 종-형태, 담배-형태, 응축-구형, 구형, 타원형, 소시지-형태, 신장-형태, 총알-형태, 불규칙한 방추-형태 및 이들의 조합을 포함하는 이형 핵 형태를 발생시킨다. 예를 들어, 미국 특허 제7,427,502호의 도 1을 참조한다. "메타카리오트", "메타카리오틱 세포", "메타카리오틱 줄기세포", "상처 치유 메타카리오트" 등은 무사분열(대칭 또는 비대칭 무사분열)에 의해 세포가 분할되는 중공의 종-형태 핵을 갖는 세포를 지칭한다.

당업자는 본 발명에 의해 제공된 방법을 실행할 때 메타카리오틱 세포를 용이하게 확인할 수 있을 것이다. 예를 들면, 본원에 제공된 스크리닝, 진단 및 치료 방법은 조직 샘플 또는 배양된 세포에서 메타카리오틱 세포를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 가시화되는 배양된 세포 또는 조직 샘플내 세포는 실질적으로 약 10, 20, 30, 40, 50, 60 또는 70 마이크론까지, 더욱 구체적인 실시형태에서 약 50 마이크론까지의 최대 직경을 갖는 핵 구조의 통합성(integrity)을 유지하는 방법으로 제조된다. 세포를 제조하는 방법 또한 미국 특허 제7,427,502호에 기술되어 있으며, 그 교시내용 전체가 본원에 참조로 삽입된다. 특정 실시형태에서, 제조는 실질적으로 약 10 내지 15 마이크론의 핵내 핵구조의 통합성을 유지한다. 예를 들면, 일부 실시형태에서 조직 샘플은 최소한 약 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1000, 1250, 1500 마이크론 또는 그 이상의 두께의 제제로 분석될 수 있다. 임의의 실시형태에서, 조직 샘플은 예를 들면 분석용 제제에서 약 45% 아세트산을 포함하는 용액에 인큐베이션하여 침연된다(macerated).

일부 실시형태에서, 메타카리오트를 더욱 잘 검출하기 위해 배양된 세포 또는 조직 샘플을 염색할 수 있다. 특정 실시형태에서, 염색은 예컨대 시프 염기 시약(Schiff's base reagent), 포일겐 시약(Feulgen reagent) 또는 푹신(fuchsin)으로 염색하는 것을 포함할 수 있다. 더 구체적인 실시형태에서, 조직 샘플은 제2 염색제로 더 염색될 수 있다. 더욱 더 특정한 실시형태에서, 제2 염색제는 김사 염색제일 수 있다.

임의의 실시형태에서, 전부는 아니지만 일부 메타카리오틱 세포는 시프 시약과 같은 비-형광 염색으로 처리한 후 세포질의 형광성으로 검출할 수 있다. 예를 들면, 본원에 참조로서 포함되는 미국 특허 출원 공개 제2010/0075366 A1호 실시예 5, 도 20 내지 도 27 및 그 개시내용을 참조한다. 본 발명에서 "상처 치유 장애에 관련된 메타카리오틱 줄기세포,""상처 치유 메타카리오트" 등은 예를 들어 미국 특허출원 공개 제2010/0075366 A1호에 기재된 기타 기관 및 조직의 발달, 전신생 병소 및 종양에서의 크고, 점액성의 풍선-형태의 세포질을 갖는 메타카리오틱 세포 뿐 아니라, 예컨대 수술후 재협착에서나 기타 정상 및 혈관 트리의 발달과 병적 조건에서의 크고 점액성의 풍선-형태의 세포질을 나타내지 않는 메타카리오틱 줄기 세포도 포함한다. 출원인은 특히 평활근 세포를 생성함으로써 혈관생성(vasculogenesis) 및 재협착에 관련된 메타카리오틱 줄기세포의 포일겐 형광성은 검출될 수 없는 세포질 포일겐 형광을 포함하는 다른 형태의 세포질 염색을 보임을 교시한다.

독특한 핵 형태 및 세포 분할 이외에, 일부 실시형태에서, 메타카리오트는 특정 마커 유전자를 검출함으로써 추가적으로 특징지어질 수 있으나 이에 의해 구별되지는 않는다. 특정 실시형태에서, 마커 유전자는 하나 이상의 CD133 (프로미닌 1; human GeneID 8842, 최장 이소형에 대한 대조 mRNA 및 단백질은 각각 NM_006017.2 및 NP_006008.1이다) 및 CD44 (human GeneID 960, 이소형 1 전구체에 대한 대조 mRNA 및 단백질 서열은 각각 NM_000610.3 및 NP_000601.3이다)를 포함할 수 있다. 이들 마커의 사용은 인간 종양에 대한 말단 희석 이종 기관이식 검정(end dilution xenotransplant assay)에 정의된 줄기 세포 강화에 유용하다고 보고되었다. 출원인은 이 두 특정 마커는 단핵 메타카리오트 내 메타카리오틱 세포질 기관의 바깥에서 항원을 인식하는 것이고 신시튬 형태의 다핵 메타카리오트 내 어떠한 항원도 인식하지 못함을 교시한다. 출원인 및 증가하는 다른 연구자들은 이들 두 항원에 대한 항체가 추가적으로 어떤 진핵 세포를 인식하며 세포 배양물 및 특정 조직 샘플에서 보편적으로 발견되는 무정형 물질을 인식함을 교시한다. 다른 실시형태에서, 특히 세포 분할을 진행하는 메타카리오틱 세포를 확인 및/또는 추가적으로 특징화하는 마커는 DNA 폴리머라제 베타(human GeneID 5423), DNA 폴리머라제 제타(human GeneID 5980), 및 RNAseH1(human GeneID 246243)을 포함한다. 마커 유전자는 핵산(예, RNA) 또는 단백질 수준에서 검출될 수 있다. 더 구체적인 실시형태에서, 마커 유전자는 메타카리오트의 풍선-형태의 세포질의 주변부에서 검출될 수 있다. 전술한 GeneID들은 NCBI웹사이트에서 공개적으로 입수가능한 주해가 붙은 mRNA 또는 단백질 서열을 검색하는데 사용될 수 있다. 이들 GeneID에 관련된 정보는 참조 서열 및 부속 주해를 포함하여 모두 본원에 참조로 포함된다. 다른 유기체에서 온 참조 서열도 역시 NCBI 웹사이트에서 용이하게 입수될 수 있을 것이다.

메타카리오틱 세포는 또한 분할하는 메타카리오틱 세포를 검출함으로써 예컨대 무사분열의 중간체를 검출함으로써 확인 및/또는 정량화될 수 있다. 무사분열의 중간체는 예컨대 전체적인 핵 형태(예, 대칭 무사분열의 경우, 분리되는 적층 컵) 또는 게놈을 포함하는 단일-가닥 DNA (ssDNA)를 포함하는 복제성 중간체를 검출하는 가능하다. 예를 들면, ssDNA는 본 기술분야의 표준 기술을 사용하여 검출할 수 있다. 복제성 중간체를 포함하는 ssDNA는 이전에 RNA를 분해하는 처리에 후속하여 메타카리오트내에서 확인된 바 있다(국제 공개 WO 2008/156629 A2 (예, 도 11 내지 도 14, 17, 및 18 및 이들의 설명) 및 WO 2007/067795 참조, 이들의 모든 교시는 본원에 참조로 포함된다). 중간체 dsRNA/DNA 듀플렉스 게놈 존재에 의해 메타카리오트를 확인하는 추가적인 방법이 2011년 6월 2일 출원된 미국 가출원 제61/492,738호에 기술되어 있다.

진단방법

본 발명에 의해 제공되는 진단방법은 대상내 상처 치유 장애를 진단하기 위해 대상으로부터 유래된 조직 샘플내 메타카리오틱 세포의 존재 및/또는 양 및/또는 이동을 결정(예, 측정)하는 것을 포함한다. 특정 실시형태에서, 분할하는 메타카리오틱 세포의 존재 및/또는 양이 결정된다.

I. 장애

"상처 치유 장애(wound healing disorder)"는 외과적 개입(surgical intervention)에 따른 조직 및/또는 기관에 대한 손상의 치료, 감염(예컨대 식육 감염), 및/또는 급성 외상(trauma) 동안 일어나는 이상 조직 생성(aberrant tissue generation)을 특징으로 하는 질병 또는 장애로서, 이상 조직 생성은 비-암성(non-cancerous)이며, 비-전암성(non-precancerous)이다. 일부 실시형태에서, 상처 치유 장애는 이상 과잉 조직 생성을 특징으로 한다. 다른 실시형태에서, 상처 치유 장애는 이상 부적합 조직 생성(aberrant inadequate tissue generation)을 특징으로 한다. 예시적인 상처 치유 장애는 혈관 상처 치유장애, 척수 상처 치유장애, 기관이식에 관련된 상처 치유장애 및 외과적 손상에 관련된 상처를 포함한다. 더욱 구체적인 실시형태에서, 상처 치유장애는 수술후(post-surgical)이다. 기관 이식(예, 심장, 간, 폐, 각막 등)과 같은 수술, 또는 혈관성형술, 스텐트 설치 등과 같은 수술적 개입은 자주 재협착(동맥 또는 정맥)을 초래한다. 이러한 재협착은 이식 수용자에서 빈번한 치사원인이 된다. 급성 외상은 예컨대 화상, 절상 및 총상을 포함한다. 본 발명은 평활근 생성이 표준적인 유사분열에 의한 것이 아니라 메타카리오틱 세포로부터 비대칭 무사분열에 의해 일어나는 것을 보이는 첫번째 실험증거를 제공한다. 따라서, 이론에 얽매이는 것을 원하지 않으나, 재협착을 포함하여 혈관 상처 치유 장애와 같은 상처 치유 장애가 평활근 생성에 의해 일어나며, 여기에서 평활근 세포는 평활근 세포의 분할이 아니라 메타카리오틱 세포의 비대칭 무사분열적 분할에 의해 생성된다. 출원인은 정상 상처 치유 및 다른 상처 치유 장애는, 혈관에서의 수술후 재협착과 달리, 단핵 및/또는 다핵, 신시튬 형태의 상처 치유 메타카리오틱 줄기세포에서 유래된 진핵세포의 후속하는 유사분열적 분할에 관련될 수 있다는 것을 알고 있다.

일부 실시예에서 상처 치유 장애는 단클론(monoclonal)이다; 즉, 예를 들면 암이나 죽종 발생(atherogenesis)에서와 같이 이상 과잉 조직 성장을 형성하는 비대칭 분할과 비교하여 단일 메타카리오틱 세포로부터 선형 성장(linear growth)에 의해 생성되는 장애이다. 다른 실시형태에서, 상처 치유장애는 다클론(polyclonal), 즉 예를 들면 기관형성(organogenesis) 및 재협착에서와 같이 대칭 및 비대칭 분할 양자에 의해 두개 이상의 메타카리오틱 세포로부터 생기는 장애이다.

"혈관 상처 치유 장애(blood vessel wound healing disorder)"는 죽상동맥경화증을 제외한 혈관 조직에서의 상처 치유 장애이다. 임의의 실시형태에서 혈관벽 장애는 혈관조직, 특히 내막(intima)과 같은 관 표면(luminal surface)에서 메타카리오틱 세포의 증식 및/또는 이상 과잉 평활근 생성을 특징으로 한다. 예시적 혈관 상처 치유 장애는 예컨대 손상-유도 신생혈관내막비대(injury-induced neointimal hyperplasia) 및 재협착(예, 이식, 스텐트시술, 문합 또는 외상에 후속하는)을 포함한다. 더욱 구체적인 실시형태에서, 혈관벽 장애는 재협착이다. 일부 실시형태에서, 혈관 벽 장애는 수술, 감염 또는 급성 외상후 발생한다. 더욱 구체적인 실시형태에서, 혈관벽 장애는 수술후 장애이다.

"재협착"은 혈관형성, 스텐트시술 또는 이식과 같은 외과적 개입에 후속하여 내막 표면의 비후에 의해 통상 생기는, 동맥이 다시 좁아지는 것을 의미한다.

II . 대상 및 조직 샘플

본 발명에 의해 제공되는 방법에 의해 진단, 스크리닝 또는 치료될 대상(subject)은 척추동물과 같은 임의의 다세포 동물을 포함한다. 특정 실시형태에서, 대상은 영장류, 설치류, 개, 고양이, 돼지, 양, 소 및 토끼와 같은 포유동물일 수 있다. 더욱 더 구체적인 실시형태에서, 대상은 인간과 같은 영장류이다.

대상은 예컨대 태아, 신생아, 유아, 어린이, 청소년, 성인 또는 노인과 같이, 임의의 발달단계에 있을 수 있다. 특정 실시형태에서, 대상은 어린이, 청소년, 성인 또는 노인이다. 더욱 더 구체적인 실시형태에서, 대상은 성인 또는 노인이다. 임의의 실시형태에서, 대상은 최소한 약 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105 세 이상, 예를 들면 약 1~5, 5~10, 10~20, 18~25, 25~35, 35~45, 45~55, 55~65, 65~75, 75~110, 80~110, 90~110, 95~110, 또는 100~110 세, 또는 그 이상이며, 더욱 더 구체적인 실시형태에서, 100~104세이다. 임의의 실시형태에서, 대상은 사망자이며, 그 경우 본 발명은 사후 진단 방법이다(post-mortem diagnostic method).

일부 실시형태에서, 대상은 상처 치유 장애를 갖는 것으로 의심된다. 더욱 더 구체적인 실시형태에서, 대상은 혈관 상처 치유 장애를 갖는 것으로 의심된다.

임의의 실시형태에서, 대상은 이전에 수술을 받은 적이 있다. 더 구체적인 실시형태에서, 수술은 스텐트 시술 및/또는 풍선혈관성형술이다. 더욱 더 구체적인 실시형태에서, 대상은 이전에 두 번 이상의 스텐트 시술, 예컨대 최소한 2, 3, 4, 5, 또는 그 이상의 스텐트 시술을 받은 적이 있다. 이 실시형태에서 스텐트는 약물-방출(예, 그 유사체를 포함하여 시롤리무스 또는 파클리탁셀-방출; 그 아날로그를 포함하여 라파마이신-방출; 및 항-CD-34 또는 항-VEGF 항체-코팅된 스텐트), 비-약물 방출 또는 이들의 조합일 수 있다.

일부 실시형태에서, 대상은 이전에 동종이식, 자가 이식 또는 이종이식과 같은 이식을 받은 적이 있다. 특정 실시형태에서 대상은 전체 또는 부분 기관 이식(예, 심장, 간, 신장, 방광, 피부, 폐 또는 각막 이식), 판막 또는 혈관 이식을 받은 적이 있다. 이식된 혈관은 동맥 및/또는 정맥일 수 있다. 특정 실시형태에서, 대상은 수술에 따른 재협착을 갖는 것이 의심된다.

임의의 실시형태에서, 대상에서 유래된 조직 샘플은 예컨대 이식, 혈관성형 또는 스텐트 시술과 같은 수술 동안 또는 생검 과정에서 외과적으로 수득된다. 조직 샘플은 혈액, 혈관 조직, 지방조직, 림프조직, 연결조직(예, 근막, 인대, 힘줄), 외막, 장막, 건막, 내분비 조직, 점막 조직, 간, 폐, 신장, 비장, 위장, 췌장, 결장, 소장, 방광, 성선, 유선 조직, 중추신경 조직, 말초 신경 조직, 피부, 평활근, 심근 또는 골격근과 같은 조직을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서 조직 샘플은 상기 조직 중 1, 2, 3, 4, 5 가지 이상을 포함할 수 있다. 더 구체적인 실시형태에서 조직 샘플은 주로 하나의 조직을 포함하거나 본질적으로 하나의 조직으로 이루어질 수 있으며, 예컨대 조직 샘플은 단일 조직 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 또는 100 중량%이다. 더 구체적인 실시형태에서, 조직 샘플은 혈관 조직을 포함하며, 더욱 더 구체적인 실시형태에서 혈관벽 조직이다. 일부 실시형태에서, 조직 샘플은 본질적으로 혈관벽 조직으로 이루어진다. 어떤 실시형태에서 혈관 조직은 외막을 추가로 포함한다. 더 구체적인 실시형태에서, 혈관 조직은 본질적으로 외막 및 혈관 조직으로 이루어진다.

본 발명에서 제공되는 방법에 의해 분석될 조직 샘플은 신선한 상태(예, 어떠한 고정도 없는 상태) 또는 물리적 또는 화학적 고정후에 분석될 수 있다. 예시적인 물리적 고정은 동결을 포함한다. 화학적 고정은 알콜, 알데하이드, 유기산 및 이들의 조합을 포함하는 당업자에게 공지된 임의의 고정제를, 이들에 의한 화학적 고정이 메타카리오틱 세포를 보존하는 한, 사용할 수 있다. 예를 들면, 특정 실시형태에서, 화학적 고정제는 메탄올 및 빙초산을 포함하며, 더욱 구체적인 실시형태에서 메탄올 대 빙초산의 비율은 약 4:1, 3:1, 2:1, 1:1이다.

메타카리오틱 세포를 더욱 효율적으로 검출하기 위해, 조직 샘플은 메타카리오틱 세포에 관련되는 이종 핵 형태(예, 구조의 분해를 피하기 위해 환자로부터 분리된 후 즉시 고정 및/또는 가시화함으로써)를 보존하고, 이들을 효율적으로 가시화하도록(예, 통상적인 5 마이크론 조직학적 조각에 비교하여 비교적 더 두꺼운 조직학적 제제를 제공함으로써) 준비된다. 이를 위해 당업자는 용이하게 미국 특허 제7,427,502호(본원에 참조로 포함된)의 실시예 1 및 2의 교시를 적용할 수 있을 것이다. 또한 Gostjeva et al ., Organogenesis, 5:4, 191-200 (2009); Gostjeva et al., Cancer Genetics and Cytogenetics 14:16-24 (2006)를 참조한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 대상으로부터 취한 조직 샘플 세포는 대상으로부터 분리된 후 약 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 또는 60분 내에 본 발명의 방법에 따라 가시화 또는 고정된다.

임의의 실시형태에서, 본 발명의 진단 또는 예후적 방법은 평활근 세포의 특징인 불규칙 핵과 같은 특정 비-메타카리오틱 세포를 검출하는 단계를 포함하며, 예컨대 본 방법은 평활근 세포를 검출하는 단계를 포함할 수 있고, 더 구체적인 실시형태에서, 평활근 세포의 수 변화, 즉 이들 세포수의 증감을 검출하는 단계를 포함할 수 있다.

스크리닝 방법

본 발명은 혈관 상처 치유 장애와 같은 상처 치유 장애를 치료하는 물질(agent)를 스크리닝하는 인 비트로 및 인 비보 방법을 제공한다. 인 비트로 및 인 비보 양 방법에서, 후보 물질은 후보물질을 처리하지 않은 배양된 세포나 포유동물과 같은 적합한 대조에 대해 메타카리오틱 세포의 수, 증식하는 (대칭 또는 비대칭 무사분열에 의해) 메타카리오틱 세포의 수, 또는 메타카리오틱 세포의 이동을 조절하는 능력에 대해 평가된다. 후보물질은 소분자 의약 또는 단백질(예, 성장 인자, 항체 또는 압타머(aptamer)), 핵산(안티센스 분자 및 압타머를 포함), 지질, 탄수화물 또는 이들의 조합과 같은 생물학적 의약(biologic)을 포함하는 임의의 화학 엔티티를 포함 할 수 있다. 이들 물질은 통상적으로 배양물 또는 포유동물에서 메타카리오틱 세포, 특히 증식하는 메타카리오틱 세포의 수 및/또는 분포 및/또는 이동에 효과를 유발할 수 있는 용량, 또는 용량 범위, 예를 들면 2, 3, 4, 5, 6, 또는 그 이상의 용량으로 투여된다.

인 비트로 스크리닝 방법은 증식하는 메타카리오틱 세포 및 근육 세포를 포함하는 배양된 세포를 후보물질과 접촉시키는 단계를 포함한다. 더 구체적인 실시형태에서, 세포는 영장류, 설치류, 개, 고양이, 돼지, 양, 소 및 토끼와 같은 포유동물에서 수득한다. 더욱 더 구체적인 실시형태에서 세포는 사람으로부터 수득된다. 임의의 실시형태에서 배양된 세포는 제대(umbilical cord), 외막, 중간엽 조직 또는 대동맥궁에서 수득된다. 특정 실시형태에서, 배양된 세포는 본원에 참조로 포함된 미국 특허출원공개 제2010/0075366 A1호의 실시예 6 및 도 28 내지 도 30 및 그 기재에 기술된 바와 같이 HT29 인간 결장 선암종 세포이다. 특정 실시형태에서, 증식하는 메타카리오틱 세포와 근육 세포를 포함하는 배양된 세포는 일차 세포(primary cells)이다. 더 구체적인 실시형태에서, 일차 세포는 제대, 혈관 외막 또는 대동맥궁에서 수득한다.

인 비보 스크리닝 방법은 후보물질을 포유동물에 투여하는 것을 포함한다. 더 구체적인 실시형태에서, 포유동물은 비-인간 포유동물이다. 더욱 더 구체적인 실시형태에서, 포유동물은 비-인간 영장류, 설치류, 개, 고양이, 돼지, 양, 소 또는 토끼이다. 더욱 구체적인 실시형태에서 포유동물은 마우스, 랫트 또는 기니아 피그와 같은 설치류이다. 더욱 더 구체적인 실시형태에서, 포유동물은 기니아 피그이다. 일부 실시형태에서, 포유동물은 상처 치유 장애를 일으키기 쉬운 경향이 있다(예, 유전학적으로 또는 다이어트나 약물 투여). 임의의 실시형태에서, 상처 치유 장애는 이식, 혈관성형술, 스텐트 등의 외과적 손상과 같은 외과적 개입 또는 화학적 고정, 방사선, 지나친 열 또는 차가움, 경색, 자상, 절단 또는 둔상에 의한 직접적이고 고의적인 조직 손상으로부터 생긴다. 더 구체적인 실시형태에서, 포유동물은 상처 치유장애를 일으키기 쉬운 경향이 있으며 또한 외과적 개입에 노출된다. 임의의 실시형태에서, 상처 치유장애는 혈관 상처 치유장애이다. 더 구체적인 실시형태에서, 혈관 상처 치유장애는 재협착이다.

임의의 실시형태에서, 본 발명의 인 비트로 또는 인 비보 스크리닝 방법은 추가적으로, 불규칙한 핵 특징을 갖는 평활근 세포와 같은 특정 비-메타카리오틱 세포를 검출하는 단계를 포함할 수 있으며, 예컨대, 본 방법은 평활근 세포를 검출하는 단계, 더 구체적인 실시형태에서는 평활근 세포의 수의 증감과 같은 변화를 검출하는 단계를 포함할 수 있다.

치료방법

전술한 스크리닝 방법은 상처 치유 장애를 치료하는데 사용될 수 있는 물질을 제공한다. 따라서 본 방법은 또한 상처 치유 장애를 가진 대상을 치료하는 방법을 제공한다. 예를 들면 본원에 기재된 바와 같은 임의의 상처 치유 장애를 가진 대상에 예컨대 메타카리오틱 줄기세포의 수, 증식하는 메타카리오틱 줄기세포의 수 또는 메타카리오틱 줄기세포의 이동을 조절하는 유효량(및 충분한 시간 동안)의 물질을 투여할 수 있다. 예를 들면, 이상 과잉 조직 생성을 특징으로 하는 상처 치유 장애에서, 대상에 메타카리오틱 줄기세포의 수, 증식하는 메타카리오틱 줄기세포의 수 또는 메타카리오틱 줄기세포의 이동을 감소시키는 물질을 투여한다. 역으로 이상 부적합 조직 생성을 특정으로 하는 상처 치유 장애에서, 대상에 메타카리오틱 줄기세포의 수, 증식하는 메타카리오틱 줄기세포의 수 또는 메타카리오틱 줄기세포의 이동을 증가시키는 유효량의 물질을 투여한다.

본 발명에 의해 제공되는 치료적 방법에 사용될 수 있는 물질은 본 발명에 의해 제공되는 방법에 의해 확인된 임의의 물질을 포함한다. 메타카리오틱 줄기세포의 수, 증식하는 메타카리오틱 줄기세포의 수 또는 메타카리오틱 줄기세포의 이동을 저해하거나 저해하는 것으로 추정되는 다른 물질이 예컨대, 미국 특허 출원 공개 제2009/0304662호 및 국제 출원 WO 제2008/156629호에 개시되어 있으며, 그 전체 교시 내용이 본원에 참조로 포함된다. 대상에 투여되는 물질은 소분자 의약을 포함하는 임의의 화학적 물질 또는 단백질(예, 성장 인자, 항체 또는 압타머), 핵산(안티센스 분자 및 압타머를 포함), 지질, 탄수화물 또는 이들의 조합과 같은 생물학적 의약을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 분리된 메타카리오틱 줄기세포를 투여하여 이상 부적합 조직 생성을 특징으로 하는 상처 치유 장애를 갖는 대상을 치료하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상처 치유 메타카리오틱 줄기세포를 배양 또는 분리하고, 이를 대상에 직간접적으로 조직 생성을 자극/활성화시킬 수 있는 양으로 투여함으로써, 치료가 필요한 대상에서 부적합 조직 생성을 특징으로 하는 상처 치유 장애를 치료하는 방법을 포함한다. 예를 들면, 메타카리오틱 세포는 점착성 세포 시트내에 배양되어 조직 생성이 필요한 대상의 영역에 접촉될 수 있다.

당업자는 이들 방법에 대한 세포 공급원(예컨대, 세포 배양 또는 조직 샘플)이 메타카리오틱 줄기세포를 포함함을 이해할 것이다. 본 방법은 일부 실시형태에서, 예컨대, 배양, 본원에 기술되며 과도한 부담없이 당업자가 쉽게 이해하고 실행할 수 있는 방법에 의해 메타카리오틱 줄기세포를 분리 및/또는 팽창시키는 하나 이상의 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 예시적 실시형태를 후술한다.

실시예

하기 실시예들은 혈관 상처 치유 장애와 같은 상처 치유 장애의 진단, 치료 및 스크리닝하는 방법에 관한 본 발명을 뒷받침한다. 예시적 혈관 상처 치유 장애는 손상-유도 신생혈관내막비대 및 재협착이다. 더 구체적인 실시형태에서 혈관벽 장애는 재협착이다.

물질 및 방법

현미경 슬라이드 상에 조직이 질서 있게 도말 될 수 있는 정도로 세포 부착이 화학적 또는 효소적으로 파괴(해리 또는 침연)된 3 내지 5 mm 두께의 고정 및 염색된 포유동물 조직 섹션이 과정에 사용되었다(Gostjeva et al. 2009). 염색된 핵과 같은 작은 모양의 구조와 결장 크립트와 혈관과 같은 큰 구조가, 조직 도말로 인해 약간 찌그러진 모양으로 관찰되었다.

외과적 조직 폐기물(discards)은 절제 후 30분 이내, 바람직하게 15분 이내에 제공되었다(Gostjeva et al., 2006]. 조직의 벗겨낸 상피층 시트(1 cm² 까지), 3 내지 5 mm의 재협착 플라크 조직 및 인접한 정상 중간엽 영역을 바로 제조한 4℃ 카노이(Carnoy's) 고정제(3:1, 에탄올 : 빙초산)에 해체하면서 넣었다. 고정제 부피는 조직 샘플 부피의 최소 3배였다. 신선한 고정제를 45분 마다 총 3시간의 고정 시간 동안 3번 교체하였다. 카노이 고정제는 이후 4℃ 70% 에탄올로 교체하였다. 이후 샘플은 4℃ 내지 -20℃ 에서 1년까지 보관될 수 있다.

도말 및 DNA 염색을 위해 전체 고정된 조직 샘플에서 약 1mm² 조각을 잘라내었다. 각 조각을 증류수로 세척한 후 37℃로 미리 데운 증류수내 2 ml의 콜라게나제를 함유한 시험관에 넣었다(실온에서 콜라게나제 분말에 물을 가하였다). 시험관을 37℃ 진탕 열 베쓰에 약 10분간 위치시켰다(콜라게나제 타입 II, 100 mg, Calbochem Inc ., 273 U/mg ). 콜라게나제 조직 해리 지속 시간은 하기와 같다: 상피 조직의 경우 3시간, 플라크 조직의 경우 4시간, 동맥의 정상 평활근 조직 또는 심근 조직의 경우 6시간까지. 콜라게나제로 소화시킨 약 1mm 절단 조직 섹션은 이후 물에 세척하고 15분 동안 2ml 시험관내 45% 아세트산에 넣었다. 조직 도말 과정은 현미경 슬라이드상에서 45% 아세트산 방울내 수행되었다. 각각의 약 1mm² 효소 분해 섹션을 양분하여 두 개의 약 0.5 x 1mm 조각의 고정, 침윤 조직을 형성하였다. 각 조각을 깨끗한 현미경 슬라이드상에서 약 5 ?의 아세트산에 넣고 22 x 22 mm 커버 슬립으로 덮었다. 커버슬립을 가장자리로 쥐면서 조직 샘플이 슬라이드 중간에 위치하도록 약간의 압력을 가하였다.

도말의 질은 각 샘플에 대해 20x 위상차 대물렌즈(20x phase-contrast objective)를 사용하여 확인하였다. 양호한 조직 도말의 지표는 전체 조직 도말 가장자리에 손상된 핵이 없고 3D 조직 구조(혈관, 크립트)는 형태학적 통합성을 보존하는 본질적으로 단층으로 압착된 것이다. 각 잘 도말된 샘플 슬라이드를 바로 드라이아이스 표면에 두었다. 2분후 도말 조직 샘플이 완전히 동결되었을 때, 면도칼을 커버 슬립의 가장자리아래에 넣고 부드럽게 들어올렸다. 슬라이드는 먼지가 없는 환경에서 최소한 1시간 동안 건조하도록 하였다.

포일겐 시약을 사용한 본원에 사용된 시프 시약으로 핵을 염색하기 위해서는, 현미경 슬라이드상의 조직 도말에 뜨거운 산 가수분해를 시행하는 것이 필요하다. 슬라이드를 코푸린 자(Coplin jar) 내에 위치시키고, 미리 데운 (60℃) 1N 염산 용액으로 8분간 덮고, 이후 신속하게 증류수로 세척하였다. 물방울을 털어내고 슬라이드를 먼지가 없는 환경에서 3시간 동안 건조하였다. 슬라이드는 포일겐 염색을 할 준비가 되었다.

염색 과정은 실온에서 시행되었다. 슬라이드를 쿨핀 자에 위치시키고 시프 시약(Art. 9033, Merck)을 채워 핵의 부분적으로 탈퓨린된(depurinated) DNA와 반응시켰다. 슬라이드를 염색약에 한 시간 동안 담그고, 동일한 쿨핀 자에서 한번은 30초간 다시 한번 신속히 2회 2xSSC(trisodium citrate 8.8 g/L, sodium chloride 17.5 g/L)로 세척하였다. 이후 슬라이드를 증류수로 세척하였다. 이 단계의 슬라이드는 핵내 DNA 분포 관찰에 적합한데, 예컨대 핵내 포일겐 DNA 양이나 유사분열의 진핵 세포의 응축된 크로모좀을 정량 이미지 분석에 의해 측정하는데 적합하다(Greilhuber and Temsch, Genome 44:826-30 (2001); Hardie, Gregory and Hebert, J. Histochem Cytochem 50:735-49 (2002)).

간기핵(interphase nuclei)의 해상도 및 이미지를 높이기 위해, 일부 슬라이드는 추가적으로 김사로 염색하였다. 2xSSC로 세척한 후 즉시 슬라이드를 1% 김사용액(Giemsa, Art. 9204, Merck)에 5분간 넣고, 이후 먼저 소렌센 버퍼(디소듐 하이드로겐 포스페이트 디하이드레이트 11.87 g/L, 포타슘 디하이드로겐 포스페이트 9.07 g/L)에서 신속히 세척하고, 이후 증류수로 세척하였다. 염색의 부식을 피하기 위해 구식 온도계를 흔들듯이 슬라이드에서 물방울을 털어내었다. 이후 슬라이드를 먼지가 없는 환경에 실온에서 1시간 동안 두어 건조시켰다. 이후 자일렌으로 채운 쿨핀 자에 적어도 3시간 동안 두어 지방을 제거하였다. 높은 해상도에서 스캐닝할 수 있도록 3시간 동안 건조하기 위해 DePex 마운팅 매질로 슬라이드와 커버슬립을 접착시켰다.

실시예 1: 태아 신장 동맥에서의 메타카리오틱 세포의 가시화

메타카리오틱 줄기세포를 가시화하기 위해 실질적으로 전술한 대로 도 2 내지 도 4에 도시한 조직을 준비하였다. 조직은 인간 태아 신장 동맥에서 수득하였다.

실시예 2: 이식후 재협착을 나타낸 환자에서 메타카리오틱 세포의 가시화

최근 이식을 받은 2세 어린이가 거부 반응을 보이고, 1개월에 걸쳐 광범위 관상 죽상동맥경화증(diffuse coronary atherosclerosis)이 급속히 진행되었다. 이 어린이는 급속히 진행되는 관상 질환으로 인해 심정지(cardiac arrest)를 경험하였다. 이 어린이는 심장이 제대로 기능할 때까지 6일간 응급 심폐 바이패스의 도움으로 안정화되었다. 이 어린이의 병든 심장은 체외이식되고 새로운 심장이 제공되었다. 도 6 및 도 7은 이 대상에서 준비된 신선하게-고정된 조직의 현미경사진을 포함한다. 도 6의 C 내지 D는 돼지의 주 혈관을 보인 현미경사진이다.

실시예 3: 혈관생성( Vasculogenesis ) 및 방광 폴립 카테터 손상( bladder polyp catheter injury ).

도 2 내지 도 4는 혈관생성을 도시한 것이다. 도 17의 B는 방광 폴립 손상의 현미경사진을 포함한다.

실시예 4: 6개월된 인간 어린이 피부에서의 상처 치유

도 18 내지 도 21는 6개월된 인간 어린이의 피부에서의 상처 치유 현미경사진이다.

실시예 5: 수술후 "질주 죽상동맥경화증 " 즉, 2세 어린이의 심장 이식 거부 및 폐정맥에서의 재협착

도 6 내지 도 16, 도 10 내지 도 13 및 도 16 내지 도 18의 현미경사진이 전술한 대로 준비되었다.

실시예 6: 추가적 관찰

도 22 및 이하는 특히 재협착 정맥(stenotic veins), 문합의 합류(confluence of anastomosis) 및 정상 성체 마우스 결장의 현미경사진을 포함한다.

실시예 7: 상처 치유 장애를 치료하는 물질을 확인하기 위한 인 비보( In vivo) 스크리닝

동물들은 올바른 윤리 및 실험 가이드라인에 따른 인가된 시설에 유지하였다.

대조 및 실험 기니아 피그는 처치전에 혈관 손상(vascular insult)을 가하였다. 실험 동물에 후보 물질을 0.01 내지 100 mg/kg/day 용량으로 투여하였다. 대조 동물은 모의-처리(mock-treated)되었다. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 일후, 동물들을 희생하고 메타카리오틱 줄기세포를 보존하는 방법을 사용하여, 혈관 조직 및 부속 외막을 제거하고, 조직을 고정 및 염색함으로써 혈관 손상을 받은 영역을 조직학적으로 평가하였다. 대조 및 실험 동물에서 기손상된 혈관 조직을 포함하는 조직 샘플을 메타카리오틱 줄기세포의 총수, 증식하는 메타카리오틱 줄기세포의 총수 및 메타카리오틱 줄기세포의 위치(예를 들면, 손상된 혈관의 외막에서 내막 표면까지 메타카리오트의 이동에 대한 효과를 결정하기 위해, 손상된 혈관의 내막 표면 및 부속하는 외막에 대하여)를 평가한다. 메타카리오틱 줄기세포의 총수, 증식하는 메타카리오틱 줄기세포의 총수 또는 메타카리오틱 줄기세포의 이동을 감소시키는 물질은 혈관 상처 치유 장애와 같은 상처 치유 장애의 치료에 효과적일 것으로 예측된다.

"약", "최소한", "보다 적은" 및 "보다 많은"과 같은 본원에서 일부 파라미터를 기술하는 모든 수적 경계에 대해, 상기 기재는 기재된 값에 의해 경계지어지는 모든 범위를 반드시 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 예컨대 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5의 기재는, 특히 1~2, 1~3, 1~4, 1~5, 2~3, 2~4, 2~5, 3~4, 3~5, 및 4~5 등의 범위를 기술한 것이다.

본원에서 인용된 모든 특허, 공개 출원 및 참조의 교시는 본원에 그 전체가 참고로 포함된다.

본 발명은 특히 예시적인 실시형태를 참조하여 기술되고 보여졌지만, 본 기술분야의 당업자는 부속되는 청구범위에 포함되는 발명의 범위에 벗어남 없이 그 안에서 형태 및 자세한 사항에 있어 다양한 변경이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다.

Claims

메타카리오틱 줄기 세포의 증식 및/또는 이동을 조절하는 하나 이상의 물질을 확인하는 인 비트로 방법으로서,
메타카리오틱 줄기 세포를 포함하는 배양된 조직 세포를 하나 이상의 후보 물질과 접촉시키는 단계 및 배양된 세포의 핵 형태를 평가하는 단계를 포함하고,
여기에서, 후보물질과 미접촉된 대조 세포와 비교되는 증식하는 메타카리오틱 줄기 세포의 수 또는 이동하는 메타카리오틱 줄기 세포의 수의 변화가 그 물질이 메타카리오틱 줄기 세포를 증식 및/또는 이동을 조절하는 효능의 지표인 방법.
제1항에 있어서,
배양 세포가 담배-형태의 핵, 총알-형태의 핵, 소시지-형태의 핵, 신장-형태의 핵, 불규칙한 방추-형태의 핵 및 이들의 조합을 포함하는 핵 형태를 갖는 세포를 추가적으로 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서,
배양세포가 포유동물에서 수득되는 것인 방법.
제3항에 있어서,
포유동물이 상처 치유 장애를 갖는 것인 방법.
제4항에 있어서,
상처 치유 장애가 혈관 상처 치유 장애인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
배양세포가 일차 세포인 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
배양세포가 제대, 혈관 외막, 중간엽 조직, 대동맥궁, 척수 및 신경조직에서 선택되는 조직으로부터 수득되는 것인 방법.
제2항에 있어서,
배양세포가 적절한 염색 조건하에서 형광성을 갖는 것인 방법.
제8항에 있어서,
배양물이 비대칭 무사분열하는 메타카리오틱 줄기 세포를 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
배양물이 평활근 또는 골격근 세포에서 선택되는 근육 세포를 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
배양물이 심근 세포를 포함하는 것인 방법.
제4항 또는 제5항에 있어서,
상처 치유 장애가 이상 과잉 조직 생성을 특징으로 하는 다클론 장애인 방법.
제4항 또는 제5항에 있어서,
상처 치유 장애가 이상 부적합 조직 생성을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 방법이 메타카리오틱 줄기 세포의 증식 및/또는 이동을 증강하는 물질을 확인하는 것인 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 방법이 메타카리오틱 줄기 세포의 증식 및/또는 이동을 저해하는 물질을 확인하는 것인 방법.
상처 치유 장애를 치료하는 하나 이상의 물질을 확인하는 방법으로서,
a) 후보 물질로 처리된 포유동물 유래 분리된 조직 샘플 내에 함유된 세포의 핵 형태를 결정하는 단계로서, 여기에서 조직 샘플은 약 50 마이크론까지의 최대 직경을 갖는 핵 내 핵구조의 통합성을 실질적으로 보존하는 방법에 의해 제조되는 것인 단계; 및
b) 후보 물질로 처리된 포유동물 유래 조직 샘플 내에 함유된 세포의 핵 형태와 후보 물질로 처리하지 않은 대조 포유동물 유래 분리된 조직 샘플 내에 함유된 세포의 핵 형태를 비교하는 단계를 포함하고,
여기에서, 후보 물질로 처리하지 않은 대조 포유동물의 조직 샘플과 비교된 후보 물질로 처리된 포유동물의
i) 조직 샘플내 메타카리오틱 줄기 세포의 수 변화;
ii) 조직 샘플내 증식하는 메타카리오틱 줄기 세포의 수 변화; 또는
iii) 조직 샘플내 메타카리오틱 줄기 세포의 이동 변화가
후보 물질의 상처 치유 장애를 치료하는 효능의 지표인 방법.
제16항에 있어서,
조직 샘플이 담배-형태의 핵, 총알-형태의 핵, 소시지-형태의 핵, 신장-형태의 핵, 불규칙한 방추-형태의 핵 및 이들의 조합을 포함하는 이형 핵 형태를 갖는 세포를 추가적으로 포함하는 것인 방법.
제16항에 있어서,
포유동물이 돼지인 방법.
제16항에 있어서,
포유동물이 설치류이고 이 설치류는 랫트, 마우스 및 기니아 피그인 방법.
제17항에 있어서,
세포가 적절한 염색 조건하에서 형광성을 갖는 것인 방법.
제16항에 있어서,
상처 치유 장애가 혈관 상처 치유 장애인 방법.
제16항에 있어서,
상처 치유 장애가 이상 과잉 조직 생성을 특징으로 하는 다클론 장애인 방법.
제16항에 있어서,
상처 치유 장애가 이상 부적합 조직 생성을 특징으로 하는 방법.
제16항에 있어서,
증식하는 메타카리오틱 줄기 세포의 수 감소가 세포의 비대칭 무사분열의 감소에 관련된 것인 방법.
제24항에 있어서,
비대칭 유사분열이 평활근 세포의 특징인 불규칙 핵을 포함하는 세포의 생산에 관련된 것인 방법.
제16항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 방법이 메타카리오틱 줄기 세포의 수, 증식하는 메타카리오틱 줄기 세포의 수 또는 메타카리오틱 줄기 세포의 이동을 증가시키는 하나 이상의 물질을 확인하는 것인 방법.
제16항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 방법이 메타카리오틱 줄기 세포의 수, 증식하는 메타카리오틱 줄기 세포의 수 또는 메타카리오틱 줄기 세포의 이동을 감소시키는 하나 이상의 물질을 확인하는 것인 방법.
증식하는 메타카리오틱 줄기 세포에 관련된 상처 치유 장애를 진단하는 방법으로서,
a) 중간엽 조직을 포함하는 분리된 조직 샘플내 세포의 핵을 가시화하는 단계로서, 여기에서 조직 샘플은 약 50 마이크론까지의 최대 직경을 갖는 핵 내 핵구조의 통합성을 실질적으로 보존하는 방법에 의해 제조되는 것인 단계; 및
b) 조직 샘플내 증식하는 메타카리오틱 줄기 세포의 존재 및/또는 부재를 결정하는 단계를 포함하며,
여기에서, 조직 샘플내 증식하는 메타카리오틱 줄기 세포의 존재가 상처 치유 장애의 지표인 방법.
제28항에 있어서,
조직 샘플이 혈관 조직을 포함하는 것인 방법.
제28항 또는 제29항에 있어서,
상처 치유 장애가 혈관 상처 치유 장애인 방법.
제30항에 있어서,
혈관 상처 치유 장애가 손상-유도 신생혈관내막비대 및 재협착으로 구성되는 군에서 선택되는 것인 방법.
제31항에 있어서,
혈관 상처 치유 장애가 재협착인 방법.
제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세포가 물리적 또는 화학적으로 고정된 것인 방법.
제33항에 있어서,
조직 샘플이 동결된 것인 방법.
제33항에 있어서,
조직 샘플이 알콜, 알데하이드, 유기산 및 이들의 조합으로 구성된 군에서선택된 하나 이상의 화학적 고정제로 처리된 것인 방법.
제35항에 있어서,
고정제가 메탄올 및 아세트산을 포함하는 것인 방법.
제16항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
조직 샘플내 세포가 핵의 세포 분해 전에 고정되는 것인 방법.
제16항 내지 제32항 및 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
조직 샘플의 세포가 조직 침연 및 도말에 의해 부분적으로 해리되는 것인 방법.
제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서,
세포가 염색되어 핵이 가시화되는 것인 방법.
제39항에 있어서,
DNA가 염색되어 핵이 가시화되는 것인 방법.
제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,
세포가 분리후 30분 이내에 고정되는 것인 방법.
제16항 내지 제32항 및 제37항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서,
조직 샘플이 다세포 동물에서 수득되는 것인 방법.
제42항에 있어서,
다세포 동물이 척추동물인 방법.
제43항에 있어서,
척추동물이 포유동물인 방법.
제44항에 있어서,
포유동물이 영장류, 설치류, 개, 고양이, 돼지, 양, 소 및 토끼로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
제45항에 있어서,
포유동물이 인간인 방법.
제16항 내지 제32항, 제37항 내지 제38항, 제42항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서,
조직 샘플은 담배-형태의 핵, 총알-형태의 핵, 소시지-형태의 핵, 신장-형태의 핵, 불규칙한 방추-형태의 핵 및 이들의 조합을 포함하는 이형 핵 형태를 갖는 세포를 추가적으로 포함하는 것인 방법.
제47항에 있어서,
조직 샘플이 외막을 포함하는 것인 방법.
제16항 내지 제32항, 제37항 내지 제38항, 제42항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서,
c) 조직 샘플내 증식하는 메타카리오틱 줄기 세포의 공간적 및/또는 수적 분포를 결정하는 단계를 추가로 포함하고, 여기에서 증식하는 메타카리오틱 줄기 세포의 공간적 및/또는 수적 분포가 추가적으로 조직 샘플을 특징화하는 것인 방법.
제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서,
메타카리오틱 세포가 무사분열적 대칭 핵분할을 나타내는 구조에 관련된 것인 방법.
제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서,
메타카리오틱 줄기 세포가 비대칭 무사분열로 불규칙한 방추-형태의 핵을 생성하는 것인 방법.
제16항 내지 제32항, 제37항 내지 38항, 제42항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서,
대상이 사망한 것인 방법.
제16항 내지 제32항, 제37항 내지 38항, 제42항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서,
조직 샘플이 본질적으로 혈관 조직 및 외막으로 이루어진 것인 방법.
제45항에 있어서,
조직 샘플이 본질적으로 혈관 조직으로 이루어진 것인 방법.
상처 치유 메타카리오틱 줄기 세포를 확인하는 방법으로서,
a) 중간엽 조직을 포함하는 분리된 성체 조직 샘플내 세포의 핵을 가시화하는 단계로서, 여기에서 조직 샘플은 약 50 마이크론까지의 최대 직경을 갖는 핵 내 핵구조의 통합성을 실질적으로 보존하는 방법에 의해 제조되는 것인 단계; 및
b) 조직 샘플내 메타카리오틱 줄기 세포를 확인하는 단계를 포함하며,
여기에서 조직 샘플내 메타카리오틱 줄기 세포가 상처 치유 메타카리오틱 줄기 세포인 방법.
제55항에 있어서,
조직 샘플이 기관 조직을 포함하는 것인 방법.
제55항에 있어서,
조직 샘플이 외막을 포함하는 것인 방법.
제55항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서,
조직 샘플이 혈관을 포함하는 것인 방법.
제55항에 있어서,
조직 샘플이 담배-형태의 핵, 총알-형태의 핵, 소시지-형태의 핵, 신장-형태의 핵, 불규칙한 방추-형태의 핵 및 이들의 조합을 포함하는 핵 형태를 갖는 세포를 포함하는 것인 방법.
치료가 필요한 대상에서 상처 또는 상처 치유 장애를 치료하는 방법으로서,
대상에서 메타카리오틱 줄기 세포의 수, 증식하는 메타카리오틱 줄기 세포의 수 또는 메타카리오틱 줄기세포의 이동을 조절하는 물질의 유효량을 환자에 투여하여 상처 치유 장애를 치료하는 방법.
제60항에 있어서,
상처 치유 장애가 이상 과잉 조직 생성을 특징으로 하는 다클론 장애인 방법.
제60항 또는 제61항에 있어서,
물질이 대상내 메타카리오틱 줄기 세포의 수, 증식하는 메타카리오틱 줄기 세포의 수 또는 메타카리오틱 줄기세포의 이동을 감소시키는 것인 방법.
제60항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서,
물질이 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 방법에 의해 확인되는 것인 방법.
제60항에 있어서,
상처 치유 장애가 이상 부적합 조직 생성을 특징으로 하는 방법.
제60항 또는 제64항에 있어서,
물질이 대상내 메타카리오틱 줄기 세포의 수, 증식하는 메타카리오틱 줄기 세포의 수 또는 메타카리오틱 줄기세포의 이동을 증가시키는 것인 방법.
제65항에 있어서,
물질이 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 방법에 의해 확인되는 것인 방법.
필요로 하는 대상에서 이상 부적합 조직 생성을 특징으로 하는 상처 치유 장애를 치료하는, 환자에 유효량의 분리된 메타카리오틱 줄기 세포를 투여하는 것을 포함하는 방법.
제67항에 있어서,
분리된 메타카리오틱 줄기 세포가 대상내 조직 생성을 필요로 하는 부위에 직접 투여되는 것인 방법.
제67항 또는 68항에 있어서,
메타카리오틱 줄기 세포가 대상에 또는 대상내 조직 생성을 필요로 하는 부위에 투여되기 전에, 인 비트로 또는 엑스 비보로 배양되는 것인 방법.
제67항 내지 69항 중 어느 한 항에 따른 상처 또는 상처 치유 장애치료용 분리된 메타카리오틱 줄기 세포.