JPS628053A - 細胞核ｄｎａの損傷検出法 - Google Patents
細胞核ｄｎａの損傷検出法Info
- Publication number
- JPS628053A JPS628053A JP14568985A JP14568985A JPS628053A JP S628053 A JPS628053 A JP S628053A JP 14568985 A JP14568985 A JP 14568985A JP 14568985 A JP14568985 A JP 14568985A JP S628053 A JPS628053 A JP S628053A
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- JP
- Japan
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- dna
- specimen
- cell
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- hydrolyzed
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、細胞核ＤＮＡの損傷を検出する方法に関し、
この方法は細胞核ＤＮＡが老化や癌化に伴なう質的な変
化を検知して癌細胞のスクリーニングや癌の病理診断に
用いたり、化学的発癌物質の確認試験に使用したりする
ことができる。
この方法は細胞核ＤＮＡが老化や癌化に伴なう質的な変
化を検知して癌細胞のスクリーニングや癌の病理診断に
用いたり、化学的発癌物質の確認試験に使用したりする
ことができる。
従来の技術
老化や癌化によって細胞核ＤＮＡが量的に変化すること
は周知の通りであり、その検出方法も、既に確立されて
いる。しかしながら、細胞核ＤＮＡは、前記した明確な
量的変化を起す前に、１）ＤＮＡ塩基のアルキル化によ
る微小なひずみ、２）ＤＮＡ塩基の水和や脱落による小
さいひずみ、３）分子量の大きい化学物質がＤＮＡに共
有結合で働き（付加物）、ＤＮＡ塩基配列の間に挿入さ
れる大きなひずみ、４）２つの塩基が結合してできた２
量体、２本の鏡開での、あるいはＤＮＡ鎮とタンパク質
との交叉結合によって生ずる一本の鎖に生じた切断およ
び５）二本の鎖の切断などの細胞ＤＮＡの損傷を来すこ
とが知られており、かかる細胞核ＤＮＡの損傷の検出方
法の開発が当然のことながら強く望ま、れており、種々
の方法が提案されている。そのような方法としては、例
えば細胞核ＤＮＡが損傷された場合に生物が自己の機能
として損傷部位を自然の作用で修復する過程で放射性同
位元素でラベルした物質を細胞核ＤＮＡ中に取込ませて
こ、れを検出する方法や特定の抗原抗体反応を利用して
螢光物質を結合させた抗体を細胞核ＤＮＡの損傷部位に
結合させて検知する方法、更には、パパニコロウ染色法
として知られている方法によって細胞検体を２種類の色
素で染色し、その色調、濃淡或いは染色された細胞及び
核の大きさ等を顕微鏡にて肉眼観察して判別する方法な
どが知られている。
は周知の通りであり、その検出方法も、既に確立されて
いる。しかしながら、細胞核ＤＮＡは、前記した明確な
量的変化を起す前に、１）ＤＮＡ塩基のアルキル化によ
る微小なひずみ、２）ＤＮＡ塩基の水和や脱落による小
さいひずみ、３）分子量の大きい化学物質がＤＮＡに共
有結合で働き（付加物）、ＤＮＡ塩基配列の間に挿入さ
れる大きなひずみ、４）２つの塩基が結合してできた２
量体、２本の鏡開での、あるいはＤＮＡ鎮とタンパク質
との交叉結合によって生ずる一本の鎖に生じた切断およ
び５）二本の鎖の切断などの細胞ＤＮＡの損傷を来すこ
とが知られており、かかる細胞核ＤＮＡの損傷の検出方
法の開発が当然のことながら強く望ま、れており、種々
の方法が提案されている。そのような方法としては、例
えば細胞核ＤＮＡが損傷された場合に生物が自己の機能
として損傷部位を自然の作用で修復する過程で放射性同
位元素でラベルした物質を細胞核ＤＮＡ中に取込ませて
こ、れを検出する方法や特定の抗原抗体反応を利用して
螢光物質を結合させた抗体を細胞核ＤＮＡの損傷部位に
結合させて検知する方法、更には、パパニコロウ染色法
として知られている方法によって細胞検体を２種類の色
素で染色し、その色調、濃淡或いは染色された細胞及び
核の大きさ等を顕微鏡にて肉眼観察して判別する方法な
どが知られている。
発明が解決しようとする問題点
しかしながら、前記した放射性同位元素でラベルした物
質を使用する方法や抗原抗体反応を利用する方法は、放
射性同位元素を利用するため特殊な設備が必要となった
り、特殊な抗体を利用するため検出法がコスト高になっ
たり、操作が繁雑になったり、或いはパパニコロウ染色
法では操作が繁雑である上にその判別に熟練を要すると
いう問題があり、しかもその処理量にも限度があるとい
った問題があった。本発明はかかる問題点を解決した細
胞核ＤＮＡの損傷検出法を提供することを目的とする。
質を使用する方法や抗原抗体反応を利用する方法は、放
射性同位元素を利用するため特殊な設備が必要となった
り、特殊な抗体を利用するため検出法がコスト高になっ
たり、操作が繁雑になったり、或いはパパニコロウ染色
法では操作が繁雑である上にその判別に熟練を要すると
いう問題があり、しかもその処理量にも限度があるとい
った問題があった。本発明はかかる問題点を解決した細
胞核ＤＮＡの損傷検出法を提供することを目的とする。
問題点を解決するための手段及びその作用効果本発明に
従えば、細胞検体を比較的緩やかな加水分解条件下に酸
を用いて加水分解して検体中に含まれる損傷のあるＤＮ
Ａを選択的に加水分解せしめ、次いでアクリジン色素で
染色して得られる螢光を測定することによって前記問題
点を解決した細胞核ＤＮＡの損傷検出法が提供される。
従えば、細胞検体を比較的緩やかな加水分解条件下に酸
を用いて加水分解して検体中に含まれる損傷のあるＤＮ
Ａを選択的に加水分解せしめ、次いでアクリジン色素で
染色して得られる螢光を測定することによって前記問題
点を解決した細胞核ＤＮＡの損傷検出法が提供される。
本発明者らは以下の実施例において説明するように、Ｄ
ＮＡの加水分解の動態はその存在様式、即ち、核蛋白と
の関係やＤＮＡ分子の傷害の有無等によって微妙に影響
されることを見出した。即ち、細胞核ＤＮＡを酸を用い
て加水分解した場合に、正常な細胞核ＤＮＡと損傷のあ
る細胞核ＤＮＡとで加水分解に対する挙動が異なり、適
当な条件を選べば損傷のある細胞核ＤＮＡを選択的に加
水分解してＤＮＡの二重鎖を単鎖にすることができ、こ
れをアクリジン色素で染色することによって損傷ＤＮＡ
と正常ＤＮＡを分離検出することに成功したのである。
ＮＡの加水分解の動態はその存在様式、即ち、核蛋白と
の関係やＤＮＡ分子の傷害の有無等によって微妙に影響
されることを見出した。即ち、細胞核ＤＮＡを酸を用い
て加水分解した場合に、正常な細胞核ＤＮＡと損傷のあ
る細胞核ＤＮＡとで加水分解に対する挙動が異なり、適
当な条件を選べば損傷のある細胞核ＤＮＡを選択的に加
水分解してＤＮＡの二重鎖を単鎖にすることができ、こ
れをアクリジン色素で染色することによって損傷ＤＮＡ
と正常ＤＮＡを分離検出することに成功したのである。
本発明方法に従えば、細胞検体を液中に浮遊状態のまま
又は適当な方法でプレパラート上に付着せしめた塗床標
本状態で固定し、例えばリン酸緩衝液でリンスした後、
損傷ＤＮＡを選択的に加水分解するような緩やかな条件
下に酸を用いて加水分解する。かかる加水分解条件は当
秦者であれば予じめ予備実験によって容易に定めること
ができる。一般的に述べれば、例えば塩酸、硫酸、リン
酸、硝酸、過塩素酸などの酸を希薄状態で（例えば塩酸
の場合には１〜５Ｎ塩酸の使用が適当である）使用し、
温度４０℃以下で５〜１２０分間、好ましくは２０〜３
５℃で１５〜３０分間程度の範囲内で加水分解すること
により、損傷のある細胞核ＤＮＡを優先的に加水分解せ
しめる。
又は適当な方法でプレパラート上に付着せしめた塗床標
本状態で固定し、例えばリン酸緩衝液でリンスした後、
損傷ＤＮＡを選択的に加水分解するような緩やかな条件
下に酸を用いて加水分解する。かかる加水分解条件は当
秦者であれば予じめ予備実験によって容易に定めること
ができる。一般的に述べれば、例えば塩酸、硫酸、リン
酸、硝酸、過塩素酸などの酸を希薄状態で（例えば塩酸
の場合には１〜５Ｎ塩酸の使用が適当である）使用し、
温度４０℃以下で５〜１２０分間、好ましくは２０〜３
５℃で１５〜３０分間程度の範囲内で加水分解すること
により、損傷のある細胞核ＤＮＡを優先的に加水分解せ
しめる。
なお、検体中に存在するＲＮＡは一般に酸による加水分
解速度が速いので損傷のあるＤＮＡより一段と速く加水
分解されて次の染色検出工程を妨害しないが、場合によ
っては染色検出測定のノイズとなるので、加水分解前に
適当なＲＮＡ分解酵素（ＲＮＡａｓｅ）を用いて処理し
、ＲＮＡを選択的に分解せしめるのが好ましい。
解速度が速いので損傷のあるＤＮＡより一段と速く加水
分解されて次の染色検出工程を妨害しないが、場合によ
っては染色検出測定のノイズとなるので、加水分解前に
適当なＲＮＡ分解酵素（ＲＮＡａｓｅ）を用いて処理し
、ＲＮＡを選択的に分解せしめるのが好ましい。
本発明に従えば、前記のようにして損傷のあるＤＮＡが
優先的に加水分解された検体をアクリジンオレンジのよ
うなアクリジン色素を用いて螢光染色させ、得られた螢
光を測定することにより損傷ＤＮＡの検出をすることが
できる。このアクリジン色素を用いる細胞の染色測定は
既に知られており、アクリジン色素はＤＮＡと強い結合
（インターカレイション結合）と弱い結合（スタック結
合）の二通りの様式で結′合して螢光発色する。即ち、
例えばＤＮＡの二重鎖はアクリジンオレンジとインター
カレイション結合様式で結合して緑色螢光を発するのに
対し、ＤＮＡの単鎖はアクリジンオレンジとスタック結
合して赤色螢光を発するので、この螢光色の差を利用し
て正常な細胞核ＤＮＡと損傷細胞核ＤＮＡとを分別検出
することができるのである。
優先的に加水分解された検体をアクリジンオレンジのよ
うなアクリジン色素を用いて螢光染色させ、得られた螢
光を測定することにより損傷ＤＮＡの検出をすることが
できる。このアクリジン色素を用いる細胞の染色測定は
既に知られており、アクリジン色素はＤＮＡと強い結合
（インターカレイション結合）と弱い結合（スタック結
合）の二通りの様式で結′合して螢光発色する。即ち、
例えばＤＮＡの二重鎖はアクリジンオレンジとインター
カレイション結合様式で結合して緑色螢光を発するのに
対し、ＤＮＡの単鎖はアクリジンオレンジとスタック結
合して赤色螢光を発するので、この螢光色の差を利用し
て正常な細胞核ＤＮＡと損傷細胞核ＤＮＡとを分別検出
することができるのである。
このように本発明に従えば、単に希酸を用いる緩やかな
加水分解と、既に細胞の染色測定法として確立されたア
クリジン色素を用いる簡単な染色測定を組合せることに
よって、損傷のある細胞核ＤＮＡを容易にかつ効果的に
判別することができる。
加水分解と、既に細胞の染色測定法として確立されたア
クリジン色素を用いる簡単な染色測定を組合せることに
よって、損傷のある細胞核ＤＮＡを容易にかつ効果的に
判別することができる。
実施例
以下、実施例に従って本発明を更に具体的に説明するが
、本発明の技術的範囲をこれらの実施例に限定するもの
でないことはいうまでもない。
、本発明の技術的範囲をこれらの実施例に限定するもの
でないことはいうまでもない。
実施例１
生後４週と４５週のラット小脳内顆粒細胞および大脳運
動ニューロンで各パラメータを比較して加令による細胞
核ＤＮＡの変化を以下のようにして求めた。
動ニューロンで各パラメータを比較して加令による細胞
核ＤＮＡの変化を以下のようにして求めた。
試験方法
ａ、塗抹標本あるいは浮遊細胞をエタノール：アセト７
−１７１ （Ｖ／Ｖ）で４℃、１６時間固定する。
−１７１ （Ｖ／Ｖ）で４℃、１６時間固定する。
ｂ、ダルベツコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）のリン酸＠衝液（
ＰＢＳ） （ＮａＣ１８，ＯｇＳＸＣＩ Ｏ，２ｇ、
Ｎａ２ＨＰＯ４： ７Ｈ２０２，１６ｇ及びＫｕ２ｐ
ｏ、ｏ、 ２ ｇを蒸留水１．０００−に熔かす）で４
℃、２回リンスする。− Ｃ，２Ｎ−ＨＣＩで３０℃、０〜２４０分（適当な間隔
でサンプリングを行うが、予測されるピーク時間近くを
多くとるようにする）の加水分解を行う。
ＰＢＳ） （ＮａＣ１８，ＯｇＳＸＣＩ Ｏ，２ｇ、
Ｎａ２ＨＰＯ４： ７Ｈ２０２，１６ｇ及びＫｕ２ｐ
ｏ、ｏ、 ２ ｇを蒸留水１．０００−に熔かす）で４
℃、２回リンスする。− Ｃ，２Ｎ−ＨＣＩで３０℃、０〜２４０分（適当な間隔
でサンプリングを行うが、予測されるピーク時間近くを
多くとるようにする）の加水分解を行う。
ｄ、 ０． Ｉ Ｎ ＨＣＩ、０℃で反応をとめ、ＰＢ
Ｓで４℃、２回リンスする。
Ｓで４℃、２回リンスする。
ｅ、０．０２％アゾカーミンＧ液（ヘキスト）１００ｍ
ｆ２に０．１−の氷酢酸を加えた液２５℃、３分間染色
し非特異的色素吸着も予防する。
ｆ２に０．１−の氷酢酸を加えた液２５℃、３分間染色
し非特異的色素吸着も予防する。
ｆ、ｐＨ６，５の７７クバイン（Ｍｃｌｌｖａｉｎｅ
）緩衝液（Ｎａ２ＨＰ４２８．３９５ｇ ／ ｌのＡ液
とクエン酸２１．００８ｇ／ｌのＢ液を７１：２９に混
合）で４℃、３回リンスする。
）緩衝液（Ｎａ２ＨＰ４２８．３９５ｇ ／ ｌのＡ液
とクエン酸２１．００８ｇ／ｌのＢ液を７１：２９に混
合）で４℃、３回リンスする。
ｇ、アクリジンオレンジ（ＡＯ）を１０ｇｇ／−の割に
前記緩衝液に熔かした液で、４℃で３０分間染色する。
前記緩衝液に熔かした液で、４℃で３０分間染色する。
ｈ、前記緩衝液を用いて４℃で３回リンスし、塗抹標本
は同じ緩衝液で封入して顕微螢光測光を行った。
は同じ緩衝液で封入して顕微螢光測光を行った。
ｔ、ＡＯの励起は顕微螢光測光で４０５ ｒｖの紫色光
を用いて行なう。
を用いて行なう。
ｊ、加水分解のｔ−Ｑにおける値はｐＨ７，０の０．２
Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７，０，０，２Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈ
ＣＩに等量の０．２ Ｍ ＮａＣ１を混合）に２００〜
６００ユニット／−の割にＲＮ Ａ ａｓｅを溶かした
液で３７℃で６０分間の処理を行ってからＡＯ染色した
試料で求める。
Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７，０，０，２Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈ
ＣＩに等量の０．２ Ｍ ＮａＣ１を混合）に２００〜
６００ユニット／−の割にＲＮ Ａ ａｓｅを溶かした
液で３７℃で６０分間の処理を行ってからＡＯ染色した
試料で求める。
ｋ、加水分解の各時間で得られた値からｔ＝Ｑでの値を
差引いて、加水分解時間ｔに対してプロットして加水分
解カーブを得る（２ Ｎ−ＨＣｌ 、３０℃の加水分解
では５分までにＲＮＡは完全に溶出するため、ｔ−Ｑ以
外のＲＮ Ａ ａｓｅ処理は不要で、赤色螢光は全て単
鎖ＤＮＡによるとみなせる）。
差引いて、加水分解時間ｔに対してプロットして加水分
解カーブを得る（２ Ｎ−ＨＣｌ 、３０℃の加水分解
では５分までにＲＮＡは完全に溶出するため、ｔ−Ｑ以
外のＲＮ Ａ ａｓｅ処理は不要で、赤色螢光は全て単
鎖ＤＮＡによるとみなせる）。
１、加水分解カーブからコンピューターを用いて次式に
従って細胞核ＤＮＡの質的特性を表わす各パラメータを
求める。
従って細胞核ＤＮＡの質的特性を表わす各パラメータを
求める。
ｏＫ１
−に＋ｔｌ−ＫｘｔＩ
Ｙ（ｔ）＝ （ｅ −ｅ ）Ｋ２−Ｋ
。
。
Ｙ（ｔ）：加水分解時間ｔにおける単鎖ＤＮＡ（アブリ
ン酸）の量。
ン酸）の量。
Ｋ１ ：単鎖ＤＮＡの生成速度定数に２ ：単鎖
ＤＮＡの崩壊速度定数 ｙｏ：ｔ−０における単鎖ＤＮＡの存在量結果は表１に
示す通りであった。
ＤＮＡの崩壊速度定数 ｙｏ：ｔ−０における単鎖ＤＮＡの存在量結果は表１に
示す通りであった。
表１
小 脳
４週令 ４５５週
令 ３．８４９ １．４６２ｙ ｏ
３．９８３ ４．１４３Ｋ １２．０６
７Ｘ ＬＯ１，４５５Ｘ １０−２に２ ７．５２
３Ｘ １０’ １．４５５Ｘ １０−’ｔ ｐ
７６．８８ ６６．６７ｉ ｐ １．
９３４ １．５２７（以下余白） 表 １（続） 大 脳 ４週令 ４５週令 Ｖ Ｂ、１７６ ２９．８７ｙ ｏ
１７．３１ ２４．９２Ｋ ｉ ’ ６
．４７７Ｘ １０ ３．３５２Ｘ １０−２Ｋ ２
４．８６７ｘ １０ １．００７Ｘ １Ｏ−
２ｔ ｐ ４３．２１ ５１．２８ｉ ｐ
１４．０３ １４．８６ｔｐ：ピーク時
間 表１の結果から、小脳大脳とも加令とともにｌ／ Ｋ
１が大きくなり神経細胞核クロマチンの濃縮が進み、Ｋ
２が大きくなってＤＮＡの不安定性が増すとともに潜在
単鎖ＤＮＡ量ｙｏも増すことが分かる。
３．９８３ ４．１４３Ｋ １２．０６
７Ｘ ＬＯ１，４５５Ｘ １０−２に２ ７．５２
３Ｘ １０’ １．４５５Ｘ １０−’ｔ ｐ
７６．８８ ６６．６７ｉ ｐ １．
９３４ １．５２７（以下余白） 表 １（続） 大 脳 ４週令 ４５週令 Ｖ Ｂ、１７６ ２９．８７ｙ ｏ
１７．３１ ２４．９２Ｋ ｉ ’ ６
．４７７Ｘ １０ ３．３５２Ｘ １０−２Ｋ ２
４．８６７ｘ １０ １．００７Ｘ １Ｏ−
２ｔ ｐ ４３．２１ ５１．２８ｉ ｐ
１４．０３ １４．８６ｔｐ：ピーク時
間 表１の結果から、小脳大脳とも加令とともにｌ／ Ｋ
１が大きくなり神経細胞核クロマチンの濃縮が進み、Ｋ
２が大きくなってＤＮＡの不安定性が増すとともに潜在
単鎖ＤＮＡ量ｙｏも増すことが分かる。
実施例２
細胞の種類が異なるとＤＮＡの質的な違いがあると考え
られるので１１週令のマウス肝細胞、好中球および小脳
内顆細胞について実施例１と同様にして調べた結果、表
２に示すように、肝細胞では多倍体化に伴ってクロマチ
ン濃縮が進み、ＤＮＡの不安定性が増すとともに潜在単
鎖ＤＮＡ量が増加し、加令神経細胞でみられたと同じ＜
ＤＮＡ損傷が進行していることが示された。また、形
態的特徴と一致して、好中球でクロマチン濃縮度が最も
大きくでており、内顆粒細胞のそれが肝２Ｃ細胞より大
きくでている事はこの方法の正確さを裏付けているとい
えよう、ＤＮＡ損傷を示すもう一つのパラメターである
潜在単鎖ＤＮＡ量ｙｏは、８Ｃの多倍体肝細胞で格段に
大きく、好中球、内顆粒細胞では２Ｃ肝細胞に比して大
きくなっている。
られるので１１週令のマウス肝細胞、好中球および小脳
内顆細胞について実施例１と同様にして調べた結果、表
２に示すように、肝細胞では多倍体化に伴ってクロマチ
ン濃縮が進み、ＤＮＡの不安定性が増すとともに潜在単
鎖ＤＮＡ量が増加し、加令神経細胞でみられたと同じ＜
ＤＮＡ損傷が進行していることが示された。また、形
態的特徴と一致して、好中球でクロマチン濃縮度が最も
大きくでており、内顆粒細胞のそれが肝２Ｃ細胞より大
きくでている事はこの方法の正確さを裏付けているとい
えよう、ＤＮＡ損傷を示すもう一つのパラメターである
潜在単鎖ＤＮＡ量ｙｏは、８Ｃの多倍体肝細胞で格段に
大きく、好中球、内顆粒細胞では２Ｃ肝細胞に比して大
きくなっている。
（以下余白）
表２
に、 Ｋ２ ）’０
肝細胞
（２Ｃ） ５．４６２ｘ１０′２０．５０４１ｘ１０
．２．２５４（１，００）（４Ｃ） ５．２２７
ｘ １０−２０．４９５２ｘ １０−” ４．９２
９ （２，１９）（８Ｃ） ３．２８７ ｘ １０−
０．６０７９ｘ １０− １２．４５ （５，５２
）好中球 １．３４７ Ｘ １０−２１．３４６
Ｘ １０−２４．７２８神経細胞 ４．８００ ｘ
１０−” １．２８５ ｘ １０−’ ３．８１５
に朧九走 対数増殖期のエーリッヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ ）腹水癌細
胞を用いて各パラメータが細胞周期によってどう変化す
るかを実施例１と同様にして調べたところ、表３に示す
ように、Ｇ１期に比べてクロマチン濃縮が進むＧ２ ＋
Ｍ期で濃縮度を表わすパラメータ１ ／ Ｋ ｔは大き
くなり、ＤＮＡの不安定性度に２も大きくなることが示
された。
．２．２５４（１，００）（４Ｃ） ５．２２７
ｘ １０−２０．４９５２ｘ １０−” ４．９２
９ （２，１９）（８Ｃ） ３．２８７ ｘ １０−
０．６０７９ｘ １０− １２．４５ （５，５２
）好中球 １．３４７ Ｘ １０−２１．３４６
Ｘ １０−２４．７２８神経細胞 ４．８００ ｘ
１０−” １．２８５ ｘ １０−’ ３．８１５
に朧九走 対数増殖期のエーリッヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ ）腹水癌細
胞を用いて各パラメータが細胞周期によってどう変化す
るかを実施例１と同様にして調べたところ、表３に示す
ように、Ｇ１期に比べてクロマチン濃縮が進むＧ２ ＋
Ｍ期で濃縮度を表わすパラメータ１ ／ Ｋ ｔは大き
くなり、ＤＮＡの不安定性度に２も大きくなることが示
された。
表３
細胞周期
Ｑ１Ｇ２ ＋Ｍ
Ｙ ｏ １．９６０８ １．３２８８Ｋ １２．４
０３Ｘ １０ ２．０６６Ｘ １０−’Ｋ ２
１．２１４Ｘ １０− ２．０６６Ｘ １０−”
ｔ ｐ ５７．４ ｓｉｎ ４Ｂ、４ ａｋｉｎ
Ｉ ｐ Ｏ，９７６５２，３２８９ 実施例４ はとんど全ての化学発癌物質はＤＮＡに損傷を与えるこ
とが知られている。そこで、１４週令マウスにマイトマ
イシンＣを１０〜５０μｇ／ｇで静脈内関与し、３時間
後に肝細胞を塗抹して実施例１と司様にして試験したと
ころ、潜在単鎖ＤＮＡ量ｙＯと投与量との間に２相性の
用量依存性が認められた。
０３Ｘ １０ ２．０６６Ｘ １０−’Ｋ ２
１．２１４Ｘ １０− ２．０６６Ｘ １０−”
ｔ ｐ ５７．４ ｓｉｎ ４Ｂ、４ ａｋｉｎ
Ｉ ｐ Ｏ，９７６５２，３２８９ 実施例４ はとんど全ての化学発癌物質はＤＮＡに損傷を与えるこ
とが知られている。そこで、１４週令マウスにマイトマ
イシンＣを１０〜５０μｇ／ｇで静脈内関与し、３時間
後に肝細胞を塗抹して実施例１と司様にして試験したと
ころ、潜在単鎖ＤＮＡ量ｙＯと投与量との間に２相性の
用量依存性が認められた。
（以下余白）
実施例５
対数増殖期エーリソヒ腹水癌細１Ｉ８Ｉ（１×１０５ｃ
ｅｌｌｓ ／Ｊ）にＸ線を照射して直後に固定した試料
を用いて実施例１と同様にして試験したところ、潜在単
鎖Ｄ Ｎ Ａ Ｍｙ ｏと照射線量の間に直線関係が成
立することが認められ、しかもこの直線の傾きはＧ１期
よりもＧ２＋Ｍ期で大きく、Ｘ線により損傷されやすい
ことが確認された。
ｅｌｌｓ ／Ｊ）にＸ線を照射して直後に固定した試料
を用いて実施例１と同様にして試験したところ、潜在単
鎖Ｄ Ｎ Ａ Ｍｙ ｏと照射線量の間に直線関係が成
立することが認められ、しかもこの直線の傾きはＧ１期
よりもＧ２＋Ｍ期で大きく、Ｘ線により損傷されやすい
ことが確認された。
実施例６
肺癌患者の喀痰をプレパラート上に塗末し、次いでエタ
ノール：アセトン＝１ ： １ （Ｖ／Ｖ）混合液を
用いて４℃で１６時間固定した。これをＰＢＳを用いて
２５℃で１０分間リンスした。次に、ＰＢＳ中にてＲＮ
Ａ ａｓｅを用いて、３７℃で１時間処理し、ＲＮＡ
を分解した。これをＰＢＳを用いて２５℃で１０分間リ
ンスした後、２ Ｎ −ＨＣＩを用いて３０℃で２２分
間加水分解した。０．ｌＮ−ＨＣｌを添加して反応を停
止し、更に、ＰＢＳを用いて２５℃で１０分間リンスし
た後アクリジンオレンジを濃度が３０μｇ／−になるよ
うにＰＢＳに溶解した液を用いて染色した。これを更に
ＰＢＳにて２〜３回リンスした後、ＰＢＳに封入し螢光
顕微鏡にて観察した。励起を４０５ ｎｍのバイオレッ
ト光にて行ったところ、黄緑色に染色した正常細胞と、
赤色に染った癌細胞が確認できた。
ノール：アセトン＝１ ： １ （Ｖ／Ｖ）混合液を
用いて４℃で１６時間固定した。これをＰＢＳを用いて
２５℃で１０分間リンスした。次に、ＰＢＳ中にてＲＮ
Ａ ａｓｅを用いて、３７℃で１時間処理し、ＲＮＡ
を分解した。これをＰＢＳを用いて２５℃で１０分間リ
ンスした後、２ Ｎ −ＨＣＩを用いて３０℃で２２分
間加水分解した。０．ｌＮ−ＨＣｌを添加して反応を停
止し、更に、ＰＢＳを用いて２５℃で１０分間リンスし
た後アクリジンオレンジを濃度が３０μｇ／−になるよ
うにＰＢＳに溶解した液を用いて染色した。これを更に
ＰＢＳにて２〜３回リンスした後、ＰＢＳに封入し螢光
顕微鏡にて観察した。励起を４０５ ｎｍのバイオレッ
ト光にて行ったところ、黄緑色に染色した正常細胞と、
赤色に染った癌細胞が確認できた。
Claims (1)
- １、細胞検体を比較的緩やかな加水分解条件下に酸を用
いて加水分解して検体中に含まれる損傷のあるＤＮＡを
選択的に加水分解せしめ、次いでこの加水分解生成物を
アクリジン色素で染色して得られる螢光を測定すること
を特徴とする細胞核ＤＮＡの損傷検出法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14568985A JPS628053A (ja) | 1985-07-04 | 1985-07-04 | 細胞核ｄｎａの損傷検出法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14568985A JPS628053A (ja) | 1985-07-04 | 1985-07-04 | 細胞核ｄｎａの損傷検出法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS628053A true JPS628053A (ja) | 1987-01-16 |
| JPH054029B2 JPH054029B2 (ja) | 1993-01-19 |
Family
ID=15390816
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14568985A Granted JPS628053A (ja) | 1985-07-04 | 1985-07-04 | 細胞核ｄｎａの損傷検出法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS628053A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5006460A (en) * | 1988-05-26 | 1991-04-09 | Pantox Corporation | Method for measuring DNA damage in single cells |
| US5369002A (en) * | 1992-04-01 | 1994-11-29 | Maruzen Petrochemical Co., Ltd. | Method of detecting injured nuclear DNA |
| JP2010530524A (ja) * | 2007-06-13 | 2010-09-09 | マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー | 腫瘍増殖を阻害する方法および薬剤 |
| JP2014516551A (ja) * | 2011-06-02 | 2014-07-17 | マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー | メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞のｄｓＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドゲノム複製中間体 |
| US9499851B2 (en) | 2010-10-25 | 2016-11-22 | Massachusetts Institute Of Technology | Wound healing metakaryotic stem cells and methods of use thereof |
-
1985
- 1985-07-04 JP JP14568985A patent/JPS628053A/ja active Granted
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5006460A (en) * | 1988-05-26 | 1991-04-09 | Pantox Corporation | Method for measuring DNA damage in single cells |
| US5369002A (en) * | 1992-04-01 | 1994-11-29 | Maruzen Petrochemical Co., Ltd. | Method of detecting injured nuclear DNA |
| JP2010530524A (ja) * | 2007-06-13 | 2010-09-09 | マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー | 腫瘍増殖を阻害する方法および薬剤 |
| US9499851B2 (en) | 2010-10-25 | 2016-11-22 | Massachusetts Institute Of Technology | Wound healing metakaryotic stem cells and methods of use thereof |
| JP2014516551A (ja) * | 2011-06-02 | 2014-07-17 | マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー | メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞のｄｓＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドゲノム複製中間体 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH054029B2 (ja) | 1993-01-19 |
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