DE112018007705T5 - Magnetisches Perlen-Nukleinsäure Aptamer-Multitargetmolekül-Simultan-Nachweisverfahren und Kit - Google Patents

Magnetisches Perlen-Nukleinsäure Aptamer-Multitargetmolekül-Simultan-Nachweisverfahren und Kit Download PDF

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Abstract

Die Erfindung gehört zum Bereich der Molekularbiologie, und basiert auf der molekularen Erkennung von molekularen Targetaptamere und Nukleinsäureaptamere, in Kombination mit magnetischer Trennung und Reinigung kann durch massenspektrometrische molekulare qualitative und quantitative Analyse die Vereinheitlichung der Detektion multimolekularer Sätze und multifunktionaler Gruppeninformationen ermöglichen, zudem kann diese die Korrelation zwischen den molekularen und funktionellen Sätze des Körpers oder Gewebes nachweisen. Die Erfindung verwendet eine magnetische Trennung, um die Trennung der Targetmolekülsätze einfach zu vervollständigen, mittels der Spezifität und hohe Affinität des Aptamers werden die Targetmolekülsätze effektiv erhalten, dabei kann mit Massenspektrometrie die Multimoleküle effektiv qualitative und quantitative bestimmen, den sekundären molekularen Nachweis realisieren und die Genauigkeit verbessern. Die Einheitlichkeit von qualitativer und Quantitativer Bestimmung von Multimolekülen kann die Wechselbeziehungen zwischen Molekülen besser widerspiegeln und auch die Wechselbeziehungen zwischen Körperfunktionen aufdecken, was der Proteomik- und Genomforschung sowie klinischen molekularen Tests förderlich ist.

Description

  • TECHNISCHES GEBIET
  • Diese Erfindung betrifft ein Magnetisches Perlen-Nukleinsäure Aptamer-Multitargetmolekül-Simultan-Nachweisverfahren und ein Kit, insbesondere ein Verfahren zum Einfangen der Markermoleküle in einer Probe anhand des Aptamers des Markers der Mehrmolekülprobe, und zum qualitativ und quantitativ Bestimmen des zu detektierenden Markers durch Laser Analysieren und Fliegen Massenspektrometrie, dann durch die Analyse und Verarbeitung der Datenplattform werden die Detektions- und Analyseergebnisse des integrierten Probensystems erhalten, diese Erfindung betrifft insbesondere den Nachweis der gesamten charakteristischen Moleküle der Probe und die Analyse des integrierten Systems.
  • STAND DER TECHNIK
  • Die frühere Proteindetektion basiert auf der niedrigen Dissoziationskonstante und der angegebenen Spezifität des Antikörpers gegen das zu testende spezifische Protein. Die Antikörper-Einfangmethode ist eine einfache und bequeme Screening-Methode. Bei dem Antikörper-Einfangverfahren wird das Antigen auf einen festen Träger aufgetragen, dann wird der Antikörper verwendet, um das Antigen zu binden, die Platte wird gewaschen, um den ungebundenen Antikörper zu entfernen, und schließlich wird ein vom bindenden Antikörper spezifisch erkanntes Markierungsmolekül verwendet, um den gebundenen Antikörper nachzuweisen. Viele Antikörper-Einfangverfahren verwenden Indirekte Methode zum Nachweis von Antikörpern. Beispielsweise ist der Nachweisantikörper ein Mausantikörper, das Nachweismolekül kann ein Kaninchen-Anti-Maus-Antikörper mit einer Nachweismarkierung sein. Herkömmliche Nachweismarkierungen umfassen Radioisotope, Farbstoffe und Enzyme, die auf das Substrat einwirken, um nachweisbare Moleküle wie Chromogen zu erzeugen.
  • Das Antigen-Einfang-Nachweisverfahren dient zum Nachweis des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins von Antigen in der Probe. Zuerst bindet der Antikörper an den Träger, dann wird das Antigen zugegeben und mit dem Antikörper reagiert zur Bildung eines Komplexes, und schließlich wird der Komplex nachgewiesen. Es ist auch möglich, dass das Antigen und der Antikörper zuerst zur Bildung eines Komplexes reagieren, dann an einen festen Träger binden und dann den Komplex nachweisen.
  • ELISA ist ein bekannter Immunoassay. Als er 1971 herauskam, begann eine Revolution in den diagnostischen Methoden. Die traditionelle ELISA-Technologie ähnelt einer Sandwich-Methode, d. h. zwei Antikörper werden zu einem bestimmten Antigen gebunden. Der Einfangantikörper ist mit den Antigenen in Probe gebunden, auch noch wird der Nachweisantikörper des Kopplungsenzyms zugegeben, das an das Antigen bindet, um nach Reaktion einen Einfangantikörper-Antigen-Nachweisantikörper „Sandwich“ - Komplex zu bilden. Schließlich wird die Aktivität des Kopplungsenzyms getestet, um das Nachweisergebnis anzuzeigen.
  • Das Antikörpernachweisverfahren hat einen großen Anwendungswert, aber sein Nachweisbereich ist durch den Kd-Wert des Einfangantikörpers und die Antigenreaktion eingeschränkt. In der Praxis beträgt die Untergrenze für Nachweis etwa 1% des Kd-Werts. Wenn die Konzentration des Analyten auf diesen möglichen Nachweisgrenze reduziert wird, der Anteil des eingefangenen Antiköperanalyten reicht nicht aus, um ein nachweisbares Signal im Verhältnis zum Signal-Rausch-Verhältnis zu erzeugen. Daher liegt die Nachweisgrenze des Antikörpernachweisverfahrens unter Verwendung eines Fluoreszenz- oder Chemilumineszenznachweissystems bei etwa 1 pg / ml (10-4 M für Protein mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 50.000 Dalton).
  • Die Wechselwirkung zwischen Nukleinsäure und Protein ist ein häufiges Phänomen in Zellen. Nukleinsäuren können sich unter Bildung von Sekundär- und Tertiärstrukturen falten, die für ihre Wechselwirkung für Abbindung mit Proteinen sehr wichtig sind. Durch Diversifizierung der Nukleotidsequenz ist das Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäure-Protein-Wechselwirkungen in vitro ausgereift. Die SELEX-Technologie wird verwendet, um die Nukleotidaptamere des ausgewählten Targets zu trennen. Diese Aptamere werden als Kultur oder Liganden bezeichnet. Dies bedeutet, dass Nukleinsäuren eine bestimmte Struktur bilden und in die Tasche des Targetmoleküls anpassen können. Die SELEX-Technologie ist eine Methode, bei der dieses Prinzip zum Screening von Targetmolekülaptamere verwendet.
  • Im Jahr 1995, die von Gold et al. durch SELEX gescreente RNA- und ssDNA-Aptamere spezifischer Antikörper auf systemischen Lupus erythematodes kann nicht nur zur Diagnose von systemischem Lupus erythematodes, sondern auch zur Krankheitsüberwachung und Wirksamkeitstests gesetzt (Gold L et al., Annu Rev. Biochem, 64: 763-797). Noch im Jahr 1999 untersuchten Gold et al. in der Aptamere-Microarray-Molekulardiagnostischen Anwendungsforschung die Auflösung von Aptamere-Microarrays und zeigten enorme Anwendungsaussichten von Nukleinsäure-Aptamerenachweis(Gold L, et al., Diagn Dec; 4 (4): 381-8). Der derzeitige Aptamerenachweis ist jedoch eine Methode, bei der direkte Amplifikationsnachweis des Aptamere durch PCR-Amplifikation durchgeführt wird. Dieses Verfahren ist kompliziert zu bedienen, und erfordert die Trennung des Aptamere und dem Kultur und weist eine geringe Empfindlichkeit (aufgrund der Reinheit des Aptamere und der Rekombination des verbleibenden Aptamere und Kultur zur Blockierung der DNA-Replikation nach der Trennung des Aptamere und dem Kultur) und eine geringe Genauigkeit auf.
  • Seit dem Start der SELEX-Technologie wurden viele Targetnukleotidaptamere gescreent, insbesondere viele Proteine, von denen bekannt ist, dass sie an Nukleinsäuren binden können, können als geeignetere Targets für die SELEX-Technologie verwendet werden, wie T4-DNA-Polymerase, Bakteriophagen-R17-Hüllprotein, E. coli Rho Faktoren, ribosomales E. coli-Protein S1, Phenylalanin-tRNA-Synthetase, Autoimmunantikörper, die RNA erkennen, E2F-Transkriptionsfaktor und verschiedene HIV-verwandte Proteine.
  • Die Tatsache, dass die SELEX-Technologie viele verschiedene Proteinaptamere screenen kann, hat zu einer Ausweitung der Anwendung von Aptamere geführt, die als Ersatz für monoklonale Antikörper und polyklonale Antikörper bei Diagnose und Behandlung verwendet werden können. Aptamere anstelle von Antikörpern haben ihren Wert in der Diagnose gezeigt. DNA-Polymerase-Aptamere wurden in der Hot-Start-PCR verwendet, um Replikons mit geringer Kopienzahl zu diagnostizieren und die PCR-Empfindlichkeit und -Treue zu verbessern. Aptamere werden auch verwendet, um experimentelle Methoden zu verbessern. Der Enzymligand von neutralem Elastin wird fluoreszenzmarkiert und für die Durchflusszytometrie zum Nachweis der Elastasekonzentration verwendet, und der neutrale Elastase-Ligand wird weiterhin für die In-vivo-Diagnose des Maus-Pneumonie-Diagnosemodells verwendet.
  • Bei der enzymgebundenen Oligonukleotidmethode (ELDNA) werden ein oder mehrere Antikörper durch Aptamere mit hoher Affinität und Spezifität gegenüber Antigen ersetzt. Solche Aptamere können durch In-vitro-Screening durch SELEX-Technologie erhalten werden. Siehe US-Patent WO 96 /40991 und WD 97/38134 für enzymgebundene Oligonukleotidverfahren, bei denen Nukleotidaptamere anstelle von Nachweisantikörpern oder Einfangantikörpern im Sandwichverfahren verwendet werden. Normalerweise verwendet das Sandwich-Verfahren den traditionellen enzymgebundenen Nachweisantikörper zum Nachweis des Einfangmolekül-Antigen-Komplexes, aber das Reporterenzymmolekül wird zur Markierung des Oligonukleotids verwendet, was chemische Syntheseschritte und zusätzliche Arbeit erfordert. Das obige Verfahren zur Verwendung von Antikörperreagenzien hat auch seine eigenen Schwierigkeiten.
  • Die letzten beiden Patente erwähnten auch ein PCR-Amplifikationsnachweissystem für Nukleinsäureaptamere im Einfangmolekül-Targetmolekül-Nachweismolekül-Komplex, mit PCR-Primer wie häufig verwendete Reportermoleküle z. B. Enzyme und Biotin werden zur Amplifikation der Amplikons verwendet. Es erhöht die Anzahl der Aptamere, bringt aber auch Nachteile mit sich: Es ist notwendig, den amplifizierten Aptamere weiter vom unreinen Nukleotidprimer-Dimer zu trennen. Die traditionelle Geltrennung erfordert viel Handarbeit. Sowohl DNA- als auch RNA-Aptamere haben solche Probleme. Die Verwendung von markierten Primern kann das Problem der Verunreinigung und der Amplifikation des Primerdimers nicht lösen und kann daher das Quantifizieren unmöglich ist.
  • Trotz der oben erwähnten bemerkenswerten Fortschritte müssen Diagnosemethoden die Empfindlichkeit verbessern, manuelle Operationen reduzieren und die dynamische Überwachung verbessern, um das Vorhandensein des Targets in Proben schnell zu analysieren und zu quantifizieren.
  • MALDI-TOF MS ist ein neuartiges organisches Massenspektrometer mit weicher Ionisation, das in den letzten Jahren entwickelt wurde. Es hat sich zu einem leistungsstarken Werkzeug zum Nachweis und zur Identifizierung von Peptiden, Proteinen, Polysacchariden, Nukleotiden, Glykoproteinen, Hochpolymeren und einer Vielzahl synthetischer Polymere entwickelt, dessen Prinzip lautet: Wenn eine bestimmte Intensität des Lasers auf einen von der Probe und der Matrix gebildeten Co-Kristallfilm bestrahlt, die Matrix absorbiert Energie vom Laser, und der Ladungstransfer zwischen der Matrix und der Probe bewirkt, dass die Probenmoleküle ionisieren. Die ionisierte Probe wird durch das elektrische Feld beschleunigt und fliegt durch die Flugleitung, sie wird gemäß der verschiedenen Flugzeit zum Detektor nachgewiesen, d. h. dadurch sind die Ionen detektiert, dass das Verhältnis von Masse zu Ladung proportional zur Flugzeit der Ionen ist. Die zentrale Technologie von MALDI-TOF-MS besteht darin, eine Detektion basierend auf dem Unterschied im Masse-Ladungs-Verhältnis (m / z) der Probe durchzuführen und das Molekulargewicht des Probenmoleküls zu messen.
  • Gemäß dem Prinzip der MALDI-TOF-MS weist die MALDI-TOF-MS die Eigenschaften einer hohen Empfindlichkeit, einer hohen Genauigkeit, einer hohen Auflösung, einer präzisen Karte, eines großen Qualitätsbereichs und einer hohen Geschwindigkeit auf, bei dem im Betrieb die Probe einfach vorbereitet werden kann, und die zu nachweisenden biologischen Proben miniaturisiert und in großem Maßstab, Parallelisierte und hochautomatisierte Verarbeitet werden kann, weiter weist die MALDI-TOF-MS besondere Vorteile bei Anwendung zur Bestimmung von biologischen Makromolekülen und synthetischen Hochpolymer auf. In den letzten Jahren hat es sich zu einem leistungsstarken Werkzeug zum Nachweis und zur Identifizierung von Polypeptiden, Proteinen, Polysacchariden, Nukleotiden, Glykoproteinen, Hochpolymeren und vielen synthetischen Polymeren entwickelt. Beispielsweise können unter Verwendung von MALDI-TOF-MS zur Bestimmung des Peptidmassenfingerabdrucksspektrum (PMF) und der Fragmentionenspektrum von Zerfall nach der Quelle (PSD) der enzymatischen Hydrolyse von Proteinen, in Kombination mit der Suche in der Massenspektrum-Netzwerkdatenbank kann die Peptide- und Proteinsequenzen erhalten werden. Mithilfe von MALDI-TOF-MS zur Analyse und zum Nachweis von Genom-Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) können verschiedene DNAs mit einer relativen Molekülmasse bis zu etwa 7.000 (mit mehr als 20 Basen) und nur einem Basendifferenz unterschieden und identifiziert werden. Es sei besonders darauf hingewiesen, dass MALDI-TOF-MS zu einer der unverzichtbaren und wichtigen Schlüsseltechnologien für die Erforschung der Proteomik im Bereich der Biowissenschaften geworden ist.
  • Mit der rasanten Entwicklung von Wissenschaft und Technologie, insbesondere dem Fortschritt der Big-Data-Verarbeitungstechnologie, kann das tiefgreifende Verständnis und die Anwendung ähnlicher menschlicher molekularer Funktionen gefördert werden, solange genügend Dateninformationen vorhanden sind.
  • INHALT DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG
  • Der Nachweis von Serumtumor-Markern kann als nicht-invasive diagnostische Methode verwendet werden, die eine wichtige Rolle bei der Tumordiagnose spielt. Daher ist die Erstellung einer einfachen, schnellen, empfindlichen und leicht dynamisch nachweisbare diagnostische Methode für Serum-Tumor-Marker-Sätze der Schlüssel zur frühzeitigen Diagnose und Prävention von Tumoren. Der Zweck der vorliegenden Erfindung besteht darin, die Markersätze in einer Nachweislösung unter Verwendung von Nukleinsäureaptameresätzen eingefangen werden können, und die Markersätze durch Trennung zu erhalten, und dann die Markersätze durch MALDI-TOF MS und Bioinformatik qualitativ und quantitativ zu bestimmen und Proteomanalyse zu durchführen. Es kann zum Nachweis komplexer Proben wie Serum und Körperflüssigkeiten verwendet werden.
  • Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird durch die folgenden technischen Lösungen realisiert: ein Magnetisches Perlen-Nukleinsäure Aptamer-Multitargetmolekül-Simultan-Nachweisverfahren zur simultan Analyse mehrerer Marker, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
    • (1) Inkubation: Inkubieren der magnetischen Perlen-Liganden zusammen mit der Probe, um einen magnetischen Perlen-Aptamer-Targetmolekül-Komplex zu bilden;
    • (2) Säureelution: Zugeben des Elutionspuffers, Schütteln, Sammeln des Eluats und Neutralisieren durch sofort Zugeben von TrisHCL mit Standardpeptiden zum Nachweis von Targetmolekülen;
    • (3) Qualitativer und quantitativer Nachweis angegebener Targetmoleküle durch Massenspektrometrie;
    • (4) Analyse über das Datenplattform-Analysesystem.
  • Vorzugsweise enthält die Probe in Schritt (1) mindestens eines von Serum, Urin, Körperflüssigkeit und Zell- und Gewebesuspension.
  • Vorzugsweise ist das Aptamer in Schritt (1) ein spezifischer Aptamerssatz, der durch exponentielles Evolutionsscreening für die Probe erhalten wird.
  • Vorzugsweise liegt die Elutionseffizienz der Säureelution zur Trennung des Aptamers und des Targetmoleküls in Schritt (2) mehr als 98%.
  • Vorzugsweise bezieht sich das Standardpeptid in Schritt (2) auf das Referenzstandardpeptid, das in die Massenspektrumprobe gebracht wird, um das angegebene Proteinpeptid zum genau qualitativ und quantitativ bestimmen.
  • Vorzugsweise ist das Targetmolekül in Schritt (3) ein Targetmolekül mit einem spezifischen Marker, der durch experimentelles Screening erhalten wird.
  • Vorzugsweise leitet Schritt (4) den Funktionsmechanismus basierend auf der detektierten Dosis-Wirkungs-Beziehung des angegebenen Proteins ab und erstellt einen Analysebericht.
  • Vorzugsweise wird die Probe in Schritt (1) nach dem folgenden Verfahren vorbereitet:
    • Nehmen des erforderlichen Blutvolumen durch die Venenpunktionsmethode, sofort Entfernen der Nadel, Injizieren des Bluts in das Reagenzglas mit dem Antikoagulans und vorsichtig Schütteln, um das Blut und das Antikoagulans zu mischen und die Blutgerinnung zu vermeiden, Zentrifugieren bei 3000-6000 U / min, um das Serum abzutrennen.
  • Vorzugsweise wird in Schritt (1) der magnetische Perlen-Aptamer-Targetmolekül-Komplex durch das folgende Verfahren gebildet: 100 µl der Probe und 50 µl des magnetischen Perlen-Aptamers werden bei 37 °C für 30 Minuten zusammen inkubiert, einmal mit 3 × SSC waschen, dreimal mit 20-fachem Volumen 0,4 mM Bindungspuffer waschen und dann magnetisch trennen.
  • Vorzugsweise umfasst Schritt (2) die folgenden Schritte: Zugeben von 0,5 ml Elutionspuffer zu dem in Schritt (1) beschriebenen magnetischen Perlen-Aptamer-Targetmolekül-Komplex, 1 min schütteln, das Eluat sammeln und sofort zur Neutralisation 250 µl 1 M TrisHCL mit pH 8,0 zugeben, die Elution dreimal wiederholen und die Elutionsneutralisationslösung dreimal mischen, um die massenspektrometrische Targetmolekülnachweislösung zu erhalten.
  • Eine andere Ausführung der vorliegenden Erfindung wird durch die folgende technische Lösung realisiert: ein magnetisches Perlen-Aptamer-Multitargetmolekül-Simultan-Nachweiskit, umfassend:
    • Reagenz 1: 5-10 ml 0,01-0,1 M Phosphatpuffer mit pH 7,4, worin das 50% Streptavidin-Agar-Magnetischen Perlen mit einer Partikelgröße von 5-50 nm aufgelöst ist;
    • Reagenz 2: 5-10 ml, 0,4 mM des Puffers von 1 × Binding Buffer mit pH 7,4, worin die 0,003-0,3 µg / L biotinylierte spezifische Nukleinsäure-Liganden aufgelöst sind; und Reagenz 3: Elutionspuffer.
  • Vorzugsweise enthält der Elutionspuffer Glycin, Natriumchlorid und Tween 20. In einer weiteren Ausführung der vorliegenden Erfindung wird durch die folgenden technischen Lösungen realisiert: ein magnetisches Perlen-Nukleinsäure-Aptamer-Massenspektrometrie-Mehrmolekül-Nachweis- und Analysesystem, umfassend:
    • Mindestens ein erstes Reagenz, das einen magnetischen Perlen-Trennträger, der einen spezifische Nukleinsäure-Ligandenssatz auf der Oberfläche aufweist, enthält;
    • Mindestens ein zweites Reagenz, das ein molekulares Elutionsmittel enthält;
    • Mindestens eine Instrumentendetektionsplattform, die ein Massenspektrometer enthält;
    • Mindestens eine Datenplattform, die Datenanalysegeräte und entsprechende Software enthält;
  • Dabei ist der spezifische Nukleinsäure-Ligandensatz einer spezifische Nukleinsäure-Ligandensatz, der auf spezifische Moleküle der komplexen Probe gescreent wird, wobei der magnetische Perlen-Trennträger durch die Auftragung des spezifischen Nukleinsäure-Ligandensatzes auf das Magnetische Perlen gebildet wird und die Fähigkeit aufweist, spezifisch an den Marker zu binden;
  • Die Instrumentendetektionsplattform wird mittels Laseranalyse und Flugmassenspektrometrie für Probe von Waschen der Neutralisationslösung der gebundenen Magnetischen Perlen zum Detektieren des Gehalts spezifischer Moleküle verwendet;
  • Die Datenanalysesoftware wird verwendet, um die Dosis-Wirkungs-Beziehung von dem durch Massenspektrometrie erfassten spezifischen Targetmolekül zu analysieren, um die molekulare Beziehung und die funktionelle Korrelation zu bestimmen.
  • Vorzugsweise wird der spezifische Nukleinsäure-Ligandenssatz durch Screening mit systematischer Evolution von Aptamere durch exponentielle Anreicherung erhalten.
  • Vorzugsweise wird das Massenspektrometer zum qualitativen und quantitativen Nachweis von Multitargetmolekülen, die an die spezifische Nukleinsäure-Ligandensatz gebunden sind, verwendet.
  • Vorzugsweise ist die Datenanalysesoftware auf dem molekularen Funktionsmechanismus der Pathogenese eines angegebenen Krankheitstests sowie der Art und dem Inhalt der spezifischen Marker gezielt. Die Datenanalysesoftware analysiert und beurteilt die Pathogenese-Wahrscheinlichkeit und das Referenzergebnis der Pathogenese.
  • Das oben erwähnte Verfahren zum simultanen Nachweis mehrerer Marker und zur Analyse der Ergebnisse hat die folgenden vorteilhaften Wirkungen:
    • Durch Verwenden des Magnetischen Perlen als Träger, Binden von spezifischer Nukleinsäure-Liganden auf dem Magnetischen Perlen und der Targetmoleküle (Nicht-Nukleinsäuremoleküle), und qualitative und quantitative Analysieren mittels Massenspektrometrie, und Dateninduktionsanalysieren zur Ergebnisse der Omics-Analyse, kann Nachweis vielfältiger Nicht-Nukleinsäureaptameresignale und / oder Bioinformatikanalyse durchgeführt werden, dabei sind die Eigenschaften einer schnellen, hohen Empfindlichkeit, starken Spezifität, einer vollständigen Microarray-Detektion mit mehreren Aptameresätze, einer induktiven Analyse und einer einfachen manuellen Bedienung vorhanden und kann während des gesamten Prozesses mechanisiert werden.
    • Durch Verwenden des Magnetischen Perlen(Agar-Magnetischen Perlen usw.) als Träger, der Träger ist mit anhaftenden Targetmoleküle versehen, die Detektionsmoleküle werden magnetisch getrennt und kann mechanisch geladen, getrennt, eluiert, inkubiert usw. werden und dann das charakteristische Spektrum verwandter Moleküle durch Massenspektrometrie qualitativ und quantitativ erhalten, unter Verwendung von der Verarbeitungsanalyse der Datenplattform werden die entsprechenden Ergebnisse erhalten.
  • Agar-Magnetischen Perlen haben die Vorteile von geringen Kosten, guter Biokompatibilität und können die räumliche Struktur von Bindungsmolekülen aufrechterhalten, beim Struktur sind die paramagnetischen Magneten (Eisentetroxid) von Agar umgeben, mit Magermilchpulver versiegelt, wobei die aktiven Gruppen, wie z Aktive Gruppen wie Carboxyl, Epoxy und Amino hinzugefügten werden, wobei eine gute Fähigkeit, Biomoleküle zu binden, vorhanden sind .
  • Das spezifische Nukleinsäure-Aptamer der vorliegenden Erfindung ist ein spezifisches Nukleinsäure-Aptamer-Molekül, das durch Screening auf verschiedene Proben nach Bedarf unter Verwendung der Technologie der Systematischen Evolution von Aptamere durch exponentielle Anreicherung (SELEX) erhalten wird, und das Nukleinsäure-Aptamer kann an die Probe binden, das spezifische Molekül in der Probe wird durch die abnormale Funktion des Organismus in der Probe gebildet, so dass durch das qualitative und quantitative Bestimmen des Moleküls die vom Organismus erzeugte abnormale Funktion (d.h. die Pathogenese) indirekt beurteilt werden kann.
  • Waschen mit Elutionsmittel, das ein starkes Ionensäure-Elutionsmittel ist (0,1 M Glycin, 0,5 M Natriumchlorid, pH 3,0, 0,05% Tween 20), Schütteln für 1 Minute, Sammeln Elutionsmittel mit dem magnetischen Bindung, sofort Zugeben 250 µl 1 M TrisHCL (pH 8,0) zur Neutralisierung, dreimal wiederholen und für die Massenspektrometrie miteinander mischen. In der Standardproben mit spezifischen Proteinpeptiden werden der sauren Neutralisationslösung zum qualitativen und quantitativen Bestimmen spezifischer Proteine hinzugegeben.
  • Massenspektrometer und Standardpeptide ist verwendet, um spezifische Proteine qualitativen und quantitativen zu bestimmen. Eine bestimmte Datenanalyseplattform ist für die Datenverarbeitung und -analyse und Erzeugung von Referenzergebnisse verwendet. Basiert auf den von SELEX gescreenten spezifischen Liganden, bei dem Datenplattform werden die spezifischen Moleküle anhand von den Liganden extrahiert und die Pathogenesefunktionen wie Krankheiten werden durch Forschung erhalten, und dann wird die spezifische Markerproteinsätze mit der Funktion ausgewählt, und durch die Eigenschaften und die Anzahl des Proteins in der markierten Proteinsätzen kann die Pathogenese und / oder den physiologischen Mechanismus bestimmt werden. Die Datenplattform ist eine Analyseplattform, die auf der Grundlage der Art und Menge jedes durch Massenspektrometrie gemessenen Moleküls und der Beziehung zwischen Pathogenese und / oder physiologischen Mechanismen erstellt wird.
  • Die verwendete Detektionsausrüstung kann alle mechanisierten Detektionsprozesse ausführen, einschließlich: automatisches Laden der Probe, Inkubation, Waschen, relative qualitative und quantitative Nachweisen mit Massenspektrometer, Datenverarbeiten mit Datenplattform, Versenden des Berichtes usw. Dabei kann das Zugeben von Proben, das Zugeben von Reagenzien, das Waschen, das Nachweisen von Massenspektrometrie und das Verarbeiten von Mehrmoleküldaten, das Ergebnisanalysieren usw. mit einem hohen Grad an Mechanisierung vollständig mechanisiert werden. Durch den Nachweis von Mehrmolekülen von Proben kann eine große Menge an Informationen gespeichert werden, wobei der Gesamtzustand des Körpers und die Grundfunktionen und Mechanismus umfassend widerspiegeln können.
  • Das spezifische Nukleinsäure-Aptamer der vorliegenden Erfindung ist ein spezifisches Nukleinsäure-Aptamer-Molekül, das durch Screening auf verschiedene Proben nach Bedarf unter Verwendung der Technologie der systematische Evolution von Aptamere durch exponentielle Anreicherung (SELEX) erhalten wird, und das Nukleinsäure-Aptamer kann an die Probe binden, das spezifische Molekül in der Probe wird durch die abnormale Funktion des Organismus in der Probe gebildet, so dass durch das qualitative und quantitative Bestimmen des Moleküls die vom Organismus erzeugte abnormale Funktion (dh die Pathogenese) indirekt beurteilt werden kann; die Massenspektrometrie ist sehr gute molekulare Detektionstechnologie, wobei die spezifischen Targetmoleküle der vom Aptamer eingefangenen Probe systematisch detektiert werden kann und die Dosis-Wirkungs-Beziehung zwischen den Molekülen aufrechterhalten, was sehr hilfreich ist, um die Funktionen des biologischen Körpers umfassend zu verstehen.
  • Die Erfindung weist eine hohe Empfindlichkeit und starke Spezifität auf und anhand von der spezifischen Bindung von Aptamere, ist die Spezifität des Nachweises verbessert. Der massenspektrometrische Nachweis erfasst eine große Datenmenge und verfügt über ein genaues Informationserfassungs- und -verarbeitungssystem. Da das Informationserfassungs- und -verarbeitungssystem des Instruments der vorliegenden Erfindung durch Massenspektrometrie-Nachweis vervollständigt wird, ist dabei einen genauen Datenbericht vorhanden.
  • Die für den Nachweis verwendeten Utensilien sind einzeln, der Vorgang ist einfach und die Datenerfassung und -verarbeitung kann in einem vollständig geschlossenen Zustand durchgeführt werden, wodurch die Sicherheit und Sauberkeit der Umgebung effektiv gewährleistet wird. Da die Bindungsreaktion des Aptamere und der Kultur durch der Inkubation des Aptamere und der Kultur innerhalb von 45 Minuten bei Raumtemperatur schon erledigt werden kann, ist der Vorgang einfach und bequem für die Popularisierung und Anwendung in allgemeinen Laboratorien oder klinischen Laboratorien, wobei das nach der vorliegenden Erfindung zusammengestellte Kit oder ausgebildete Biochip in der Grundlagenforschung und in klinischen Tests weit verbreitet eingesetzt werden kann und bestimmte wirtschaftliche und soziale Vorteile bringt.
  • Zusammenfassend weist das magnetische Perlen-Nukleinsäure-Aptamer-Massenspektrometrie Mehrmolekül-Nachweisverfahren der vorliegenden Erfindung gleichzeitig Proteine (wie Nicht-Nukleinsäure-Targetmoleküle) und Gene nach, und das Kit bildet mittels der Bindung des Liganden von Nukleinsäure-Beacon-Aptameremolekülen (dieses Molekül ist von Anmeldung „New Ligand Detection Method‟ Patent CN1521272 geschützt) an den Proteinaptamere einen Aptamere-Nukleinsäure-Beacon-Aptamere-Molekülkomplex aus, dadurch der die Targetmolekül-Aptamereinformationen in Nukleinsäure-Beacon-Informationen umwandelt und die Targetmolekülinformationen stimmt mit Nukleinsäuregenensinformationen überein, dann Targetmoleküle und Nukleinsäuregene werden mittels quantitatives Echtzeit-PCR gleichzeitig nachgewiesen. Das Kit der vorliegenden Erfindung verwendet spezifische Aptamersätze und magnetische Separationstechnologie, um Targetmoleküle zu extrahieren und zu trennen. Der Unterschied besteht darin, dass Massenspektrometrie verwendet wird, um die Multitargetmolekulare Informationen zu erfassen, und durch die Erfassung von multimolekulare Informationen Komplex-Proben erreicht werden, um das qualitative und quantitative Bestimmen von Multitargetmolekülen zu vermöglichen und ferner vollständige Dateninformationen zum Verständnis der Funktionen von Organismen zu liefern. Das Kit verfügt nicht nur über eine einfache Bedienungsmethode und niedrige Kosten, sondern die Nachweistechnologie weist auch die Vorteile von Schnelligkeit, hohe Empfindlichkeit, starke Spezifität, große Menge molekularer Informationen und mechanisierte Vervollständigung auf. Das Kit ist für die Erforschung von Krankheitserregern, Genen und Proteomik von großer Bedeutung.
  • Figurenliste
  • Die vorliegende Erfindung wird nachstehend in Verbindung mit den Zeichnungen und spezifischen Ausführungsformen ausführlicher beschrieben.
    • 1 zeigt ein schematisches Diagramm der Ausführungsform 1 der vorliegenden Erfindung;
    • 2 zeigt ein schematisches Diagramm der Ausführungsform 2 der vorliegenden Erfindung ist; sowie
    • 3 zeigt ein schematisches Diagramm der Ausführungsform 3 der vorliegenden Erfindung.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
  • In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren zum Simultan-Nachweis mehrerer Marker die folgenden Schritte:
    • (1) Entfetten der Probe und Zentrifugieren bei 4 °C mit 3000 U / min für 20 Minuten, Verwerfen der oberen Fettschicht.
    • (2) Zugeben der verarbeiteten Probe zu 0,4 mM Binding Buffer mit spezifischen Magnetischen Perlen der Aptamersätze der Nukleinsäure zur Bindung;
    • (3) Waschen der gebundenen Magnetischen Perlen einmal mittels 3xSSC-Puffer mit pH von 7,4 und dann dreimal Waschen mit dem 10-fachen Volumen von BB;
    • (4) Zu dem gebundenen spezifischen Marker, der von den Magnetischen Perlen mit einem alkalischen Puffer eluiert wird, wird 1/2 Volumen saurer Puffer zur Neutralisierung zugegeben, um einen Targetmolekülextrakt zu bilden; (Die obigen Schritte (2) - (4) können durch einen Magnetischen Perlen Wasch-Extraktor usw. vollendet werden.)
    • (5) Erfassen des Gehalts spezifischer Proteinmoleküle in der Probe mit dem Targetmolekülextrakt mittels Laseranalyse und Flugmassenspektrometrie;
    • (6) Bestimmen der Pathogenese der Krankheit und Empfehlen der Behandlungsplan, indem der nachgewiesene Inhalt von spezifischen Proteinmoleküls durch Datenplattform analysiert wird.
  • In einer Ausführungsform das Kit enthält die folgenden Reagenzien:
    • Reagenz 1: 5-10 ml 0,01-0,1 M Phosphatpuffer mit einem pH von 7,4, worin das 50% Streptavidin-Agar-Magnetischen Perlen mit einer Partikelgröße von 5-50 nm aufgelöst ist;
    • Reagenz 2: 5-10 ml, 0,4 mM des Puffers von 1 × Binding Buffer mit pH 7,4, worin die 0,003-0,3 µg / 1 biotinylierte spezifische Nukleinsäure-Liganden aufgelöst sind; und Reagenz 3: Elutionspuffer.
  • Insbesondere werden die Agar-Magnetischen Perlen über eine Carboxylgruppe (oder Epoxygruppe) mit Streptavidin verbunden,und dann anhand der Verbindung mit dem biotinylierten Aptamer wird der mit dem Targetmolekül gebundene Träger ausgebildet (Konservierungsmittel von 0,01% Natriumazid enthält);
    0,4 mM Bindungspuffer mit einem pH von 7,4 ist ein Puffer zum Binden des Aptamers und des Targetmoleküls (Konservierungsmittel von 0,01% Natriumazid enthält): (1 L 1 × BB-Präparation: 138 mmol / 1 NaCl, 2,7 mmol / L KCl 8,1 mmol / L Na2HPO4, 1,1 mmol / 1 KH2PO4, 1 mmol / 1 MgCl2, den pH-Wert der Lösung mit HCl auf 7,4 einstellen, Wasser hinzufügen, um das Volumen auf 1 L zu bringen, 20 min autoklavieren, bei Raumtemperatur lagern).
  • Waschen mit pH 7,4 3 × SSC-Puffer;
  • Zugeben des doppelten Volums des Elutionspuffers (0,1 M Glycin, 0,5 M Natriumchlorid, pH 3,0, 0,05% Tween 20) zu dem alkalischen Elutionsmittel, 1 min Schütteln und Sammeln des Elutionsmittels;
  • Zugeben einer sauren Neutralisationslösung (Standardpeptidreagenzien enthält) zur Neutralisation in einem halben Volumen einer sauren Neutralisationslösung (250 µl; 1 1 M TrisHCL (pH 8,0)).
  • Als ein weiteres Beispiel beim Magnetisches Perlen-Nukleinsäure Aptamer-Multitargetmolekül-Simultan-Nachweisverfahren wird die Targetmolekülgruppe durch Magnetischen Perlen , die mit spezifischen Liganden beschichtet sind, getrennt und extrahiert, und mittels Massenspektrometrie qualitative und quantitative bestimmt und mit Datenplattformanalyse die Ergebnisse erhalten. Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte:
    1. 1. Probenvorbereitung: Nehmen des erforderlichen Blutvolumen durch die Venenpunktionsmethode, sofort Entfernen der Nadel, Injizieren des Bluts in das Reagenzglas mit dem Antikoagulans und vorsichtig Schütteln, um das Blut und das Antikoagulans zu mischen und die Blutgerinnung zu vermeiden, Zentrifugieren bei 3000-6000 U / min, um das Serum abzutrennen und Proben zu gewinnen;
    2. 2. Bilden eines magnetischen Perlen-Aptamer-Targetmolekül-Komplexes: 100 µl Probe mit 50 µl magnetischem Perlen-Aptamer 30 Minuten bei 37 °Cinkubieren, einmal mit 3χSSC waschen und dreimal mit 20-fachem Volumen 0,4 mM Bindungspuffer waschen, Magnetische Trennung durchführen, um einen magnetischen Perlen-Aptamer-Ziel-Molekülkomplex zu erhalten;
    3. 3. Vorbereitung der Targetmolekülprobe: 0,5 ml Elutionspuffer (0,1 M Glycin, 0,5 M Natriumchlorid, pH 3,0, 0,05% Tween 20) zu dem magnetisch getrennten magnetischen Perlen-Aptamer-Targetmolekül-Komplex geben, 1 Minute schütteln, das Eluat sammeln, sofort 250 µl 1 M TrisHCL (pH 8,0) zur Neutralisation zugeben (Standardpeptidmoleküle für qualitative und quantitative Bestimmung erhält), die Elution dreimal wiederholen und die Elutionsneutralisationslösung dreimal mischen, wodurch ist Targetmoleküldetektionslösung für Massenspektrum erhalten.
    4. 4. Massenspektrometriedetektion: Qualitative und quantitative Bestimmung der Flüssigkeit des Targetmoleküls durch Massenspektrometrie, um Informationen über das Targetmolekül zu erhalten.
    5. 5. Erhalten der Datenplattformdatenanalyse und Analysebericht.
  • Die vorliegende Erfindung wird nachstehend in Verbindung mit spezifischen Ausführungsformen weiter beschrieben:
    • Beispiel 1: Verfahren zur Verkürzung der Fensterperiode zum gleichzeitigen Nachweis mehrerer Proteine und Gene
  • Siehe 1: Durch die qualitative und quantitative Analyse des Proteins und des Gens werden der Zustand der AIDS-Infektion erhalten, wie z. B.: Fensterperiode, Stilleperiode und Ausbruchsperiode.
  • (Serum-) Probenvorbereitung
  • Vorbereiten und Beschriften des Verbrauchsmaterials, nach Überprüfen das erforderliche Blutvolumen gemäß der Venenpunktionsmethode nehmen, die Nadel sofort entfernen, das Blut in das Reagenzglas mit dem Antikoagulans injizieren, und dann es vorsichtig schütteln, um Blut und Antikoagulans zu mischen und eine Blutgerinnung zu vermeiden. Zentrifugieren bei 3000-6000 U / min, nach Trennung wird das Serum als Probe erhalten und bei 4 °C gelagert.
  • Herstellung von P24-Antigen, P24-Antikörper, CD4 und Virushüllantikörper-Aptamer Verwenden des P24-Antigens, P24-Antikörpers, CD4 und Virushüllantikörpers als Targetmoleküle, durch die Systematische Evolution von Aptamere durch exponentielle Anreicherung wird die spezifischen Nukleinsäure-Liganden gescreent und erhalten.
  • Bilden von Sandwich-Komplexkomplex mit magnetischem Perlen-Aptamer-Polyprotein (P24-Antigen, P24-Antikörper, CD4- und Virushüllantikörper usw.)
  • Zuerst Nehmen der Streptavidin-Magnetischen Perlen, Zugeben der biotinylierten Liganden (umfassend P24-Antigen, P24-Antikörper, CD4 und Virushüllantikörper), Inkubieren für 30 Minuten und Waschen mit PBS mit 0,05% Tween20 3 mal (3 Minuten / mal), um einen magnetischen Perlen-Aptamer-Komplex zu bilden, 10-100 µl des obigen Agar-Magnetischen Perlen -Komplexes wird in 100-1000 µl Serum-Probe hinzugeben, 30 Minuten inkubieren und ein magnetischen Perlen-Aptamer-Polyprotein-Komplex bilden. Dann werden die Magnetischen Perlen vom elektromagnetischen Pol adsorbiert, um das ungebundene Serum abzutrennen und zu entfernen. Nach dem Absaugen des Serums, Waschen mit 0,01-0,1 M PBS mit Tween20 0,01-0,1 M von 400 µl für 3-12 mal (3-6 Minuten / mal).
  • Herstellung einer Massenspektrometrie-Detektionslösung
    Säureelution: Zugeben des 0,5 ml Elutionspuffers (0,1 M Glycin, 0,5 M Natriumchlorid, pH 3,0, 0,05% Tween 20), 1 Minute Schütteln, Sammeln des Eluat und sofort 250 µl 1 M TrisHCL (pH 8,0) zugeben. Wiederholen dieser Elution dreimal und Sammeln jeweils das Eluat.
  • Massenspektrometrie-Detektion: qualitative und quantitative Detektion von Polyproteinen (P24-Antigen, P24-Antikörper, CD4 und Virushüllantikörper) mit einem Massenspektrometer.
  • Gendetektion: Zugeben des Serums zu Nukleinsäureextraktions-Magnetischen Perlen, Lysieren mit Lyse-Lösung, Waschen und Eluieren der Magnetischen Perlen, dann Durchführen einer reverse Transkriptions-PCR-Amplifikation.
  • Datenerfassung, -verarbeitung und -analyse.
  • Drucken des Testberichts.
  • Die Nachweismethode kann gleichzeitig RNA-, p120- und p24-Antigene, CD4, Membranprotein-Antikörper und Antigenmoleküle nachweisen und analysieren, den Zustand des Patienten umfassend verstehen und dem Patienten einen angemessenen Behandlungsplan geben.
  • Beispiel 2: Molekularnachweisverfahren für Multitumormarker
  • Siehe 2: Anhand der Dosis-Wirkungs-Beziehung von Peptiden wird das Auftreten von Tumoren und Krebsarten wie Magenkrebs, Lungenkrebs und Leberkrebs bestimmt.
  • (Serum-) Probenvorbereitung
  • Vorbereiten und Beschriften des Verbrauchsmaterials, nach Überprüfen das erforderliche Blutvolumen gemäß der Venenpunktionsmethode nehmen, die Nadel sofort entfernen, das Blut in das Reagenzglas mit dem Antikoagulans injizieren, und dann es vorsichtig schütteln, um Blut und Antikoagulans zu mischen und eine Blutgerinnung zu vermeiden. Zentrifugieren bei 3000 U / min, nach Trennung wird das Serum als Probe erhalten und bei 4 °C gelagert.
  • Herstellung von Tumormarker-Liganden
  • Verwenden von Magenkrebs-, Leberkrebs- und Lungenkrebs-Seren als zusammengesetzte Targetmoleküle (Nicht-Magenkrebs-Seren als Kontrolle), die Liganden werden durch die Systematische Evolution von Aptamere durch exponentielle Anreicherung gescreent und erhalten, danach wird die gleichen Liganden von drei Tumoren als Tumormarker-Liganden ausgewählt.
  • Herstellung des Aptamerkomplexes des magnetischen Perlen-Tumor-Markers Nehmen der Streptavidin-Magnetischen Perlen , Zugeben der biotinylierten Liganden, Inkubieren für 30 Minuten und Waschen mit PBS mit 0,05% Tween20 3 mal (3 Minuten / mal), um einen magnetischen Perlen-Aptamer-Komplex zu bilden;
  • Herstellung des magnetischen Perlen-Aptamer-Multitumormarker-Sandwich-Komplexes 10-100 µl des obigen Agar-Magnetischen Perlen -Komplexes wird in 100-1000 µl Serum-Probe hinzugeben, 30 Minuten inkubieren und ein magnetischen Perlen-Aptamer-Polyprotein-Komplex bilden. Dann werden die Magnetischen Perlen vom elektromagnetischen Pol adsorbiert, um das ungebundene Serum abzutrennen und zu entfernen. Nach dem Absaugen des Serums, Waschen mit 0,01-0,1 M PBS mit Tween20 0,01-0,1 M von 400 µl für 3-12 mal (3-6 Minuten / mal).
  • Herstellung des Multitumormarkers
  • Säureelution: Zugeben des 0,5 ml Elutionspuffers (0,1 M Glycin, 0,5 M Natriumchlorid, pH 3,0, 0,05% Tween 20), 1 Minute Schütteln, Sammeln des Eluat und sofort 250 µl 1 M TrisHCL (pH 8,0), welche das Standardpeptid zur Detektion des Targetmoleküls enthält, zur Neutralisation zugeben. Wiederholen dieser Elution dreimal und Sammeln jeweils das Eluat.
  • Massenspektrometrie-Detektion: qualitative und quantitative Detektion von Multi-TargetMolekülen mit einem Massenspektrometer und Standard-Peptidmolekülen in der Detektionslösung.
  • Datenerfassung, -verarbeitung und -analyse: Die aus den drei Tumor-Liganden extrahierten Marker-Targetmoleküle, die gemeinsame Marker-Moleküle sind, werden durch Massenspektrometrie als Tumormarker bestätigt, was das Auftreten des Tumors bestätigt; die speziellen Marker-Moleküle der drei Tumoren sind die Markierung für die Tumorklassifizierung.
  • Drucken des Testberichts.
  • Beispiel 3: Multimarker-Molekularnachweismethode der Magenkrebs-Pathogenese
  • Siehe 3: Anhand der Dosis-Wirkungs-Beziehung von Peptiden wird die Pathogenese von Magenkrebs bestimmt.
  • (Serum-) Probenvorbereitung
  • Vorbereiten und Beschriften des Verbrauchsmaterials, nach Überprüfen das erforderliche Blutvolumen gemäß der Venenpunktionsmethode nehmen, die Nadel sofort entfernen, das Blut in das Reagenzglas mit dem Antikoagulans injizieren, und dann es vorsichtig schütteln, um Blut und Antikoagulans zu mischen und eine Blutgerinnung zu vermeiden. Zentrifugieren bei 3000 U / min, nach Trennung wird das Serum als Probe erhalten und bei 4 °C gelagert.
  • Herstellung von molekularen Multimarker-Liganden zur Pathogenese von Magenkrebs Verwenden von Magenkrebs-Serum als zusammengesetztes Targetmolekül (nicht-Magenkrebs-Serum als Kontrolle), die Liganden werden durch die Systematische Evolution von Aptamere durch exponentielle Anreicherung gescreent und erhalten, welche sich um ein Magenkrebs-Marker-Aptamer handelt.
  • Herstellung des Aptamerkomplexes des Magnetischen Perlen -Magenkrebs-Markers Nehmen der Streptavidin-Magnetischen Perlen, Zugeben der biotinylierten Liganden des Magenkrebs-Markers, Inkubieren für 30 Minuten und Waschen mit PBS mit 0,05% Tween20 3 mal (3 Minuten / mal), um einen magnetischen Perlen-Aptamer-Komplex zu bilden;
  • Herstellung des magnetischen Perlen-Aptamer-Magenkrebs-Marker-Sandwich-Komplexes 10-100 µl des obigen Agar-Magnetischen Aptamerkomplexes des Magnetischen Perlen - Magenkrebs-Markers wird in 100-1000 µl Serum-Probe hinzugeben, 30 Minuten inkubieren und der Aptamerkomplexe des Magnetischen Perlen -Magenkrebs-Markers bilden. Dann werden die Magnetischen Perlen vom elektromagnetischen Pol adsorbiert, um das ungebundene Serum abzutrennen und zu entfernen. Nach dem Absaugen des Serums, Waschen mit 0,01-0,1 M PBS mit Tween20 0,01-0,1 M von 400 µl für 3-12 mal (3-6 Minuten / mal).
  • Herstellung mehrerer Magenkrebsmarker
  • Säureelution: Zugeben des 0,5 ml Elutionspuffers (0,1 M Glycin, 0,5 M Natriumchlorid, pH 3,0, 0,05% Tween 20), 1 Minute Schütteln, Sammeln des Eluat und sofort 250 µl 1 M TrisHCL (pH 8,0), welche das Standardpeptid zur Detektion des Targetmoleküls enthält, zur Neutralisation zugeben. Wiederholen dieser Elution dreimal und Sammeln jeweils das Eluat.
  • Massenspektrometrie-Detektion: qualitative und quantitative Detektion von Multi-TargetMolekülen mit einem Massenspektrometer und Standard-Peptidmolekülen in der Detektionslösung.
  • Die Datenerfassung, -verarbeitung und -analyse basiert auf der Extraktion der MarkerTargetmoleküle in der Pathogenese von Magentumor-Liganden als Referenz. Nach Bestätigung und Analyse durch Massenspektrometrie wird die Pathogenese von Magenkrebs zusammengefasst.
  • Drucken des Testberichts.
  • Industrielle Anwendbarkeit
  • Die Erfindung stellt Magnetisches Perlen-Nukleinsäure Aptamer-Multitargetmolekül-Simultan-Nachweisverfahren und ein Kit bereit und gehört zum Gebiet der Molekularbiologie. Es umfasst das Screening spezifischer Nukleinsäure-Liganden, den quantitativen und qualitativen Nachweis von Targetmolekülsätze durch Massenspektrometrie sowie den Datenverarbeitungs- und Analysebericht mittels Datenplattform, um den Nachweis verwandter MehrTargetmolekülsätze zu ermöglichen. Durch die Datenanalyse von Multitargetmolekülen kann eine relative klarere Reaktion oder die allgemeine Entwicklung einer bestimmten Funktion. Die Erfindung hat den Vorteil, dass eine spezifische Nukleinsäure verwendet wird, um die relevante Targetmolekülsätze einzufangen, und durch qualitative und quantitative Analyse mittels Massenspektrometrie können die funktionellen Veränderungen des Körpers oder Gewebes relativ vollständig reflektiert werden, die Datenmenge ist groß, was die Genauigkeit der Omics-Analyse erheblich verbessert. Daher ist diese Erfindung für die Proteomik- und Genomforschung sowie für klinische molekulare Tests von großer Bedeutung
  • Es versteht sich, dass der Durchschnittsfachmann Verbesserungen oder Transformationen basierend auf der obigen Beschreibung vornehmen kann, und alle diese Verbesserungen und Transformationen sollten in den Schutzbereich der beigefügten Ansprüche der vorliegenden Erfindung fallen.
  • Die vorliegende Erfindung ist in den obengenannten Beispielen beschrieben. Offensichtlich ist die Realisierung der vorliegende Erfindung nicht durch die obigen Verfahren beschränkt, solange die verschiedene Verbesserungen durch das Verfahrenskonzept und die technische Lösung dieser Erfindung vorgenommen werden, oder die Patentierte Konzepte und technische Lösungen der vorliegende Erfindung ohne Verbesserung unmittelbar auf andere Gelegenheiten angewendet werden, liegt es im Schutzbereich der vorliegenden Erfindung.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
  • Zitierte Patentliteratur
    • WO 9640991 [0010]
  • Zitierte Nicht-Patentliteratur
    • Gold L et al., Annu Rev. Biochem, 64: 763-797 [0007]
    • Gold L, et al., Diagn Dec; 4 (4): 381-8 [0007]

Claims (16)

  1. Magnetisches Perlen- Aptamer-Multitargetmolekül-Simultan-Nachweisverfahren, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren umfasst: (1) Inkubation: Inkubieren der magnetischen Perlen-Liganden zusammen mit der Probe, um einen magnetischen Perlen-Aptamer-Targetmolekül-Komplex zu bilden; (2) Säureelution: Zugeben des Elutionspuffers, Schütteln, Sammeln des Eluats und Neutralisieren durch sofort Zugeben von TrisHCL mit Standardpeptiden zum Nachweis von Targetmolekülen; (3) Qualitativer und quantitativer Nachweis angegebener Targetmoleküle durch Massenspektrometrie; (4) Analyse über das Datenplattform-Analysesystem.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe in Schritt (1) mindestens eines von Serum, Urin, Körperflüssigkeit und Zell- und Gewebesuspension enthält.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Aptamer in Schritt (1) ein spezifischer Aptamerssatz, der durch Screening mittels der systematischen Evolution von Aptamere durch exponentielle Anreicherung für die Probe erhalten wird.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Elutionseffizienz der Säureelution zur Trennung des Aptamers und des Targetmoleküls in Schritt (2) über 98% liegt.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei sich die Standardpeptide in Schritt (2) auf Referenzstandardpeptide beziehen, die in die Massenspektrumprobe gebracht wurden, das angegebene Proteinpeptid zum genau qualitativ und quantitativ bestimmen.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Targetmolekül in Schritt (3) ein Targetmolekül mit einem spezifischen Marker ist, der durch experimentelles Screening erhalten wird.
  7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Schritt (4) den Funktionsmechanismus basierend auf der detektierten Dosis-Wirkungs-Beziehung des angegebenen Proteins ableitet und einen Analysebericht erstellt.
  8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe in Schritt (1) durch das folgende Verfahren hergestellt wird: Nehmen des erforderlichen Blutvolumen durch die Venenpunktionsmethode, sofort Entfernen der Nadel, Injizieren des Bluts in das Reagenzglas mit dem Antikoagulans und vorsichtig Schütteln, um das Blut und das Antikoagulans zu mischen und die Blutgerinnung zu vermeiden, Zentrifugieren bei 3000-6000 U / min, um das Serum abzutrennen.
  9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (1) der magnetische Perlen-Aptamer-Targetmolekülkomplex durch das folgende Verfahren gebildet wird: 100 µl der Probe und 50 µl des magnetischen Perlen-Aptamers werden bei 37 °Cfür 30 Minuten zusammen inkubiert, einmal mit 3χSSC waschen, dreimal mit 20-fachem Volumen 0,4 mM Bindungspuffer waschen und dann magnetisch trennen.
  10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es in Schritt (2) die folgenden Schritte umfasst: Zugeben von 0,5 ml Elutionspuffer zu dem in Schritt (1) beschriebenen magnetischen Perlen-Aptamer-Targetmolekül-Komplex, 1 min Schütteln, Sammeln des Eluats und sofort Zugeben zur Neutralisation 250 µl 1 M TrisHCL mit pH 8,0, Wiederholen der Elution dreimal und Vermischen der Elutionsneutralisationslösung dreimal, um die massenspektrometrische Targetmolekülnachweislösung zu erhalten.
  11. Magnetisches Perlen-Aptamer-Multitargetmolekül-Simultan-Nachweiskit, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst: Reagenz 1: 5-10 ml 0,01-0,1 M Phosphatpuffer mit pH 7,4, worin das 50% Streptavidin-Agar-Magnetischen Perlen mit einer Partikelgröße von 5-50 nm aufgelöst ist; Reagenz 2: 5-10 ml, 0,4 mM des Puffers von 1 × Binding Buffer mit pH 7,4, worin die 0,003-0,3 µg / 1 biotinylierte spezifische Nukleinsäure-Liganden aufgelöst sind; Reagenz 3: Elutionspuffer.
  12. Kit nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Elutionspuffer Glycin, Natriumchlorid und Tween 20 umfasst.
  13. Magnetisches Perlen-Nukleinsäure-Aptamer-Massenspektrometrie-Mehrmolekül-Nachweis- und Analysesystem, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst: Mindestens ein erstes Reagenz, das einen magnetischen Perlen-Trennträger, der einen spezifische Nukleinsäure-Ligandenssatz auf der Oberfläche aufweist, enthält; Mindestens ein zweites Reagenz, das ein molekulares Elutionsmittel enthält; Mindestens eine Instrumentendetektionsplattform, die ein Massenspektrometer enthält; Mindestens eine Datenplattform, die Datenanalysegeräte und entsprechende Software enthält; wobei der spezifische Nukleinsäure-Ligandensatz einer spezifische Nukleinsäure-Ligandensatz ist, der auf spezifische Moleküle der komplexen Probe gescreent wird, , wobei der magnetische Perlen-Trennträger durch die Auftragung des spezifischen Nukleinsäure-Ligandensatzes auf das Magnetische Perlen gebildet wird und die Fähigkeit aufweist, spezifisch an den Marker zu binden; wobei die Instrumentendetektionsplattform mittels Laseranalyse und Flugmassenspektrometrie für Probe von Waschen der Neutralisationslösung der gebundenen Magnetischen Perlen zum Detektieren des Gehalts spezifischer Moleküle verwendet wird, wobei die Datenanalysesoftware verwendet wird, um die Dosis-Wirkungs-Beziehung von dem durch Massenspektrometrie erfassten spezifischen Targetmolekül zu analysieren, um die molekulare Beziehung und die funktionelle Korrelation zu bestimmen.
  14. Magnetisches Perlen-Nukleinsäure-Aptamer-Massenspektrometrie-Mehrmolekül-Nachweis- und Analysesystem nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass der spezifische Nukleinsäure- Ligandenssatz Screening mit systematischer Evolution von Aptamere durch exponentielle Anreicherung erhalten wird.
  15. Magnetisches Perlen-Nukleinsäure-Aptamer-Massenspektrometrie-Mehrmolekül-Nachweis- und Analysesystem nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Massenspektrometer qualitativen und quantitativen Nachweis von Multitargetmolekülen, die an die spezifische Nukleinsäure-Ligandensatz gebunden sind, verwendet wird.
  16. Magnetisches Perlen-Nukleinsäure-Aptamer-Massenspektrometrie-Mehrmolekül-Nachweis- und Analysesystem nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Nachweis- und Analysesystem zum qualitativen und quantitativen Nachweis einer bestimmten Krankheit und biologischen Funktion gemäß dem Dosis-Effekt-Beziehung charakteristischer Moleküle verwendet wird, und wobei einer Analysenbericht durch ein automatisches Analysesystem angegeben wird.
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