CN105018590B - 蛋白配体和基因同时检测试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开蛋白配体和基因同时检测试剂盒及应用，属于蛋白和核酸检测领域。本发明通过核酸信标配基与靶分子结合将靶分子信号转换成核酸信号，完成蛋白信号与核酸信号的统一，再利用实时定量‑PCR进行定量检测。该检测方法能够使多种非核酸配体的信号通过核酸信标配基转换成核酸信号，能够具有快速、灵敏度高、特异性强等特点,实现了多配体微阵检测，机械化程度高。
Description
技术领域
本发明涉及一种核酸和蛋白同时检测方法和检测试剂盒的应用方法，尤其是涉及一种通过核酸信标配基将蛋白信号转换成核酸信号完成蛋白和基因检测统一，再利用实时定量-PCR进行同时检测的方法，属于蛋白核酸检测领域，具体的说是蛋白配体和基因同时检测试剂盒及应用。
背景技术
早期蛋白质检测是以抗体同特定待检物蛋白质的低解离常数和一定的特异性为基础实现的检测技术，该检测技术中抗体捕捉方法是简易、方便的筛选方法。以抗体捕捉法为例，是用抗原包被于固相支持物，然后用抗体去结合抗原，洗板去掉未结合的抗体，最后用和结合抗体特异识别的标记分子去检测结合抗体，许多抗体捕捉法是利用间接法来检测抗体。例如，检测抗体是鼠抗体，检测分子可能是带检测标记的兔抗鼠抗体。传统的检测标记包括放射性同位素，染料和作用于底物产生可检测分子如色原的酶。
随着基因技术应用的快速发展，在抗原抗体检测方面已有较多的基因检测技术。抗原捕捉检测法是检测样品中有无抗原。首先抗体先结合到支持物上，然后抗原加入和抗体反应形成复合物，最后检测复合物，也可以抗原抗体先反应形成复合物后，再结合到固相支持物上，然后检测复合物。检测方法中ELISA是广为人知的免疫检测法，还有抗体检测法等。
实时定量PCR是更先进的PCR技术，已用于核酸分析。在实时PCR中，PCR扩增DNA是在非线性标记双荧光杂交探针存在条件下进行，其中一种荧光染料用作报告分子，它的发射光谱被第二种荧光染料淬灭。实时PCR在链延伸时，利用Taq多聚酶5’核酸活性切割杂交探针，结果使报告荧光染料从淬灭染料中释放出来，致报告分子发射峰值增加。整个反应实时监控。逆转录 –PCR也可应用。系列检测系统用96孔热循环仪可连续检测每孔中PCR反应时的荧光谱，因此，可排除复制子试验室污染。
核酸与蛋白质在细胞内相互作用是普遍现象。核酸能折叠形成二级结构和三级结构，这对其与蛋白质相互结合作用非常重要。通过使核苷酸序列多样化而使体外检测核酸蛋白质相互作用方法成熟。SELEX技术被用来分离所选靶目标的核苷酸配体，这些配体被称为配基或适配体，意即核酸可以形成一定结构并适配入靶分子的口袋，SELEX技术就是利用该原理筛选靶分子配基的方法。
尽管上述进步显著，但诊断方法仍需提高灵敏度，减少人工操作，改进动态监测以快速分析样品中靶标的存在与否及对其定量。
发明内容
本发明提出一种通过实时定量-PCR扩增核酸信标和基因核酸分子，实施对配体和基因同时检测的技术方法，对细胞、微生物、基因和蛋白质等组学的研究具有重要意义。
为实现上述目的，本发明所述的蛋白配体和基因同时检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中主要包括：所述试剂盒中主要包括：待测样品、捕捉琼脂磁珠试剂、洗涤液、检测试剂、核酸提取试剂、检测体系；
所述待测样品含有被检测蛋白配体和基因；
所述捕捉琼脂磁珠试剂是琼脂磁珠-捕捉靶分子抗体复合物；
所述洗涤液是0.01M PBS+0.05M MgCl2+0.01Tween-20；
所述检测试剂是0.01M核酸信标配基检测分子+0.01M PBS+0.05M MgCl2的混合溶液；
所述核酸提取试剂是体积比为含饱和酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）；
所述检测体系为含有靶分子核酸信标配基和基因的Taqman探针和引物的常规检测试剂。
本发明所述的蛋白配体和基因同时检测试剂盒的应用，其特征在于：包括下述步骤：
(1)将捕捉琼脂磁珠试剂加入到待测样品；在37℃，45min孵育，使琼脂磁珠-捕捉靶分子抗体复合物与待测样品中的靶分子结合，然后利用磁性分离分离出磁珠与清液并分别吸出，然后用洗涤液洗涤磁珠3次，3min/次，形成待测复合物待用；
(2)再在上述步骤(1)中形成的待测复合物中加入检测试剂，该检测试剂中的核酸信标配基与靶分子结合形成捕捉琼脂磁珠-靶分子-核酸信标配基结构，将未结合形成捕捉琼脂磁珠-靶分子-核酸信标配基结构的分子洗掉，用洗涤液洗涤3次，3min/次，得到磁珠液待用；
(3)将完成上述步骤的磁珠液中加入步骤(1)分离吸出的清液，再利用核酸提取试剂提取核酸；
(4)将步骤（3）提取出的核酸进行扩增基因常规检测；
(5)进行常规检测。
所述待测样品为血清、尿液、细胞液、菌液或内分泌液需靶分子和基因同时检测的生物样本中的一种。
所述待测样品中的蛋白配体为病原体、细菌、病毒、细胞生物体分子，以及蛋白质以外的任何配体分子的任意一种；基因是病原体、细菌、病毒、细胞生物体内的基因序列。
所述捕捉琼脂磁珠试剂指在琼脂磁珠上链接抗体、抗原和核酸配基，具有捕捉靶分子，将靶分子结合形成磁珠复合物；在多靶分子和基因检测时，捕捉琼脂磁珠可以是多种特异性靶分子捕捉磁珠的混合，也可以是具有多种靶分子捕捉能力的单一磁珠；被检测基因可以是某一生物体单一基因，也可以是多种生物体的多基因。
所述核酸信标配基序列由蛋白配基、人为标记序列组成；核酸信标配基是在《新型配体检测方法》 CN1521272专利中已获保护，是单链配基和双链信标组成；所述的核酸信标配基连接在靶分子上，其中的信标序列是人为修饰DNA或RNA序列作为信号分子，通过对信号修饰序列的PCR扩增，实现对靶分子的检测；该修饰DNA或RNA序列具有一对引物和中间的人为标记序列，针对被检测的靶分子和检测目的的要求这一对引物可以相同也可以不相同，中间的标记序列是靶分子的标记；如：在多种样品同时检测时一对相同引物可以使多种样品检测数据更切合实际，标记序列则是和检测靶分子一一对应。
所述扩增基因常规检测为：实时定量-PCR检测、恒温基因扩增检测和微阵列检测中的一种。
所述琼脂磁珠是顺磁Fe3O4微粒外包裹琼脂的球形微粒，捕捉琼脂磁珠是琼脂磁珠上的琼脂活化带有羧基连接捕捉抗体，形成琼脂磁珠-抗体复合物，经过封闭形成的琼脂磁珠。
所述实时定量-PCR检测是单一和多重实时定量PCR，是对靶分子复合物的检测方法；检测方法还可以采用标记在检测分子上的自化学发光物质、光量子、酶、荧光和同位素中的一种或多种进行检测。
所述通过对DNA或RNA修饰序列的变换来达到数据的效正和有效的消除污染。
所述通过用实时定量-PCR仪进行扩增产物检测或寡核苷酸芯片检测来数据采集和处理。
所述通过用实时定量-PCR仪进行扩增产物检测来数据采集和处理，其整个过程都在PCR管内一次性完成，无须将产物转换地方，进行提纯、检测等步骤，并且PCR产物可在PCR管封闭销毁，避免逸出产物造成环境污染。
所述寡核苷酸芯片检测来数据采集和处理，其过程是将PCR产物通过移液器转入寡核苷酸芯片检测体系内全自动化完成，其过程是全封闭的，无须进行人工提纯、分离、检测等步骤。
所述全部检测过程，包括：加样、孵育、洗管、实时定量-PCR仪（或微阵芯片）的数据检测和数据处理、发报告等。
本发明所述蛋白配体和基因同时检测试剂盒及应用，其有益效果在于：本发明的检测试剂盒是通过核酸信标配基与靶分子结合将靶分子信号转换成核酸信号，完成蛋白信号与核酸信号的统一，再利用实时定量-PCR进行定量检测；该检测方法可使多种非核酸配体的信号通过核酸信标配基转换成核酸信号，具有快速、灵敏度高、特异性强、多配体微阵检测和可机械化完成等特点；本发明的检测方法，检测时使用器皿单一，即一次性PCR管；操作过程简单，数据采集及处理可在全封闭的情况下完成，扩增产物可封闭销毁，有效保证环境的洁净；本发明的操作简单，易于普及应用；利用本发明组装的检测试剂盒或构建的生物芯片能够广泛应用于基础研究与临床检测，具有较高的经济效益与社会效益。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的其中一个实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为HIV核酸蛋白-PCR检测方法一示意图；
图2为HIV核酸蛋白-PCR检测方法二示意图；
图3为HBV核酸蛋白免疫-PCR检测方法示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的其中一个实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
HIV核酸蛋白-PCR检测方法（见图1）；
1.血清样本制备：采血液，常规方法制备为抗凝固血液；离心3000r/min 分离血清为血清标本，4℃存放；
2.P24抗原抗体核酸信标配基磁珠夹心复合物的形成：包被P24抗体的琼脂磁珠微粒10uL加入100uL血清标本，结合形成磁珠-抗体-P24抗原复合物，吸出血清，用洗涤液0.01M PBS，含吐温-20 0.01M 400uL，洗涤3次，3min/次后，加入核酸信标配基液孵育形成抗体-P24抗原核酸信标配基磁珠夹心复合物；再利用电磁极吸附磁珠，分离除去未结合的核酸信标配基，加入洗涤液0.01M PBS，含吐温-20 0.01M 400uL，洗涤3次，3min/次，然后再将吸出的血清加入磁珠中；
3.提取核酸：加入裂解液，氯仿酚抽提，乙醇沉淀；
4.反转录-PCR扩增：加入反转录多重实时定量-PCR反应液，含P24核酸信标配和gp120基因的两对引物和两个探针进行实时定量-PCR；
5.通过计算机数据采集、分析和处理，得到蛋白靶分子和基因102～108的分子拷贝数。
实施例2
HIV核酸蛋白-PCR检测方法（见图2）；
1.血清样本制备：采血液，常规方法制备为抗凝固血液；离心3000r/min 分离血清为血清标本，4℃存放；
2.P24抗体-抗原-核酸信标配基和gp120抗体-艾滋病病毒-病毒表面靶分子核酸信标配基夹心复合物的形成：取10uL标本、20uL生物素化的P24单克隆抗体、20uL生物素化的gp120单克隆抗体、20uL P24和HIV病毒核酸信标配基一起孵育，形成生物素P24抗体-抗原-核酸信标配基夹心复合物和生物素gp120抗体-艾滋病病毒-病毒表面靶分子核酸信标配基夹心复合物；
3.利用磁珠分离夹心复合物：添加包被链霉亲和素的琼脂磁珠微粒10uL进行孵育，复合物与磁珠通过生物素和链霉亲和素的作用结合；
4.洗涤：利用电磁极吸附磁珠，分离除去未结合的生物素化的单克隆抗体和核酸信标配基等，加入洗涤液0.01M PBS，含吐温-20 0.01M 400uL，洗涤3次，3min/次；
5.提取核酸：弃去洗涤液，加入P24和病毒表位核酸信标配基探针和两对引物、探针和HIV 基因检测引物和探针，反转录PCR体系；
6.反转录-PCR扩增：进行反转录多重实时定量-PCR实时定量；
7.通过计算机数据采集、分析和处理，得到蛋白靶分子和基因102～108的分子拷贝数。
实施例3
HBV核酸蛋白免疫-PCR检测方法（见图3）；
1.血清样本制备：采血液，常规方法制备为抗凝固血液；离心3000r/min 分离血清为血清标本，4℃存放；
2.抗体病毒检测抗体核酸信标配基复合物的形成：包被HBV抗体的琼脂磁珠微粒10uL加入100uL血清标本，结合形成磁珠-抗体-病毒复合物，吸出血清，用洗涤液0.01MPBS，含吐温-20 0.01M 400uL，洗涤3次，3min/次后，加入检测抗体核酸信标配基复合检测液孵育形成抗体-病毒-检测抗体核酸信标配基磁珠夹心复合物；再利用电磁极吸附磁珠，分离除去未结合的检测抗体核酸信标配基复合物等，加入洗涤液0.01M PBS，含吐温-200.01M 400uL，洗涤3次，3min/次；
3.实时定量-PCR扩增：弃去洗涤液，加入实时定量-PCR反应液，含HBV基因和信标的两种探针和两对引物，进行实时定量-PCR；
4.通过计算机数据采集、分析和处理，得到蛋白靶分子和基因102～108的分子拷贝数。
Claims (1)
1.蛋白配体和基因同时检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中主要包括：①待测样品、②捕捉琼脂磁珠试剂、③洗涤液、④检测试剂、⑤核酸提取试剂、⑥检测体系；
所述①待测样品含有被检测蛋白配体和基因；
所述②捕捉琼脂磁珠试剂是琼脂磁珠-捕捉靶分子抗体复合物；
所述③洗涤液是0.01M PBS+0.05M MgCl2+0.01MTween-20；
所述④检测试剂是0.01M核酸信标配基检测分子+0.01M PBS+0.05M MgCl2的混合溶液；
所述⑤核酸提取试剂为体积比为25：24：1的饱和酚：氯仿：异戊醇；
所述⑥检测体系为含有靶分子核酸信标配基和基因的Taqman探针和引物的常规检测试剂。
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