CN112986573B - 外泌体多组学标志物的定量检测方法 - Google Patents

外泌体多组学标志物的定量检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种外泌体多组学标志物的定量检测方法，包括以下步骤：提供一包含外泌体的生物样本，所述外泌体包括位于表面的至少一种蛋白分子和位于内部的核酸分子；提供与每一种所述蛋白分子相应的特异性抗体；将每一种所述特异性抗体加入所述生物样本中，从而得到一混合液，其中，所述特异性抗体上标记有特定序列的DNA分子片段；去除所述混合液中游离的所述特异性抗体以及游离的所述DNA分子片段；提取标记有所述DNA分子片段的外泌体内的所述核酸分子以及所述DNA分子片段；以及对所提取的所述核酸分子以及所述DNA分子片段同时进行定量分析。本发明的定量检测方法能够同时检测外泌体表面的蛋白分子和内部的核酸分子。

Description

外泌体多组学标志物的定量检测方法
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及一种外泌体多组学标志物的定量检测方法。
背景技术
外泌体是由活的细胞持续大量分泌的一种30-150nm的双磷脂膜结构小囊泡，作为细胞间通信交流的载体携带来源于母细胞的蛋白、核酸、代谢小分子等特异性组分。鉴于外泌体的来源和作用，外泌体反映了所来源的细胞的内容物。由此可见，外泌体的内容物的提取和定量检测显得尤其重要。
然而，外泌体的准确定量仍然是一个重大挑战。目前对外泌体表面蛋白的检测主要是通过质谱和蛋白芯片(ELISA)的方法来进行定量分析。对外泌体携带的核酸分子如DNA、mRNA和miRNA，主要是通过测序、PCR和基因芯片等技术进行分析。然而，在这些方法中，如质谱、芯片和测序等技术不但成本昂贵，而且耗费大量时间和人力。
更进一步，对外泌体多组学标志物(如蛋白和核酸)的同时检测和分析，相比于单独检测蛋白质和核酸，可以获得更多维度的生物信息，这也正是外泌体相比于游离DNA的优势。目前，当需要对外泌体多组学标志物(如蛋白和核酸)进行检测时，对于同一份样本，通常必须分为几个组分，一部分用于分析表面蛋白，另一部分用于核酸检测。这种方法不仅成本高，时间长，而且对于样本量小的外泌体的多组学分析造成了很大的挑战。
发明内容
有鉴于此，有必要提供一种外泌体多组学标志物的定量检测方法，该定量检测方法能够同时检测外泌体表面的蛋白分子和内部的核酸分子。
本发明提供一种外泌体多组学标志物的定量检测方法，包括以下步骤：
提供一包含外泌体的生物样本，所述外泌体包括位于表面的至少一种蛋白分子和位于内部的核酸分子；
提供与每一种所述蛋白分子相应的特异性抗体；
将每一种所述特异性抗体加入所述生物样本中，使得所述外泌体表面的每一种所述蛋白分子与相应的所述特异性抗体结合，从而得到一混合液，其中，所述特异性抗体上标记有特定序列的DNA分子片段；
去除所述混合液中游离的所述特异性抗体以及游离的所述DNA分子片段，从而分离出标记有所述DNA分子片段的外泌体；
提取标记有所述DNA分子片段的外泌体内的所述核酸分子以及所述DNA分子片段；以及
对所提取的所述核酸分子以及所述DNA分子片段同时进行定量分析。
本发明的定量检测方法能够同时检测外泌体表面的蛋白分子和内部的核酸分子，该定量检测方法具有操作方便、成本低以及耗时短的优点。
附图说明
图1是本发明较佳实施例提供的外泌体多组学标志物的定量检测方法的流程图。
图2是本发明较佳实施例提供的外泌体的结构示意图。
图3是本发明较佳实施例提供的复合探针的合成示意图。
图4是图2中的外泌体与图3中的复合探针结合后的结构示意图。
图5是将图4中的标记有DNA分子片段的外泌体分离的过程以及原理示意图。
图6是对提取到的核酸分子以及DNA分子片段同时进行定量分析的的示意图。
主要元件符号说明
外泌体                          10
蛋白分子                        101
核酸分子                        102
特异性抗体                      20
DNA分子片段                     30
生物素                          40
生物素化分子                    41
链霉亲和素                      50
复合探针                        60
提纯芯片                        70
过滤膜                          701
如下具体实施方式将结合上述附图进一步说明本发明。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
请参阅图1，本发明较佳实施例提供一种外泌体多组学标志物的定量检测方法，包括以下步骤：
步骤S1，如图2所示，提供一包含外泌体10的生物样本(图未示)，所述外泌体10包括位于表面的至少一种蛋白分子101和位于内部的核酸分子102。
其中，所述蛋白分子101可为多种不同的膜蛋白(即抗原)，如CD9、CD63、CD81、Alix、TSG101、ANNEXIN(膜粘连蛋白)和EpCAM等，也可为与肿瘤相关的蛋白，如HER-2(人表皮生长因子受体-2)蛋白以及PSA(前列腺特异性抗原)蛋白等。所述核酸分子102可包括DNA和RNA。其中，所述RNA也可包括mRNA以及miRNA等。
步骤S2，如图3所示，提供与每一种所述蛋白分子101相应的特异性抗体20。
具体地，针对要检测的所述外泌体10表面的所述蛋白分子101，选择相应的特异性抗体20，如CD9抗体、CD63抗体、CD81抗体、Alix抗体、TSG101抗体、ANNEXIN抗体、EpCAM抗体、HER-2抗体和PSA抗体等。在本实施方式中，所述特异性抗体20为单克隆抗体。
步骤S3，如图4所示，将每一种所述特异性抗体20加入所述生物样本中，使得所述外泌体10表面的每一种所述蛋白分子101与相应的所述特异性抗体20结合，从而得到一混合液(图未示)，其中，所述特异性抗体20上标记有特定序列的DNA分子片段30。
其中，所述DNA分子片段30即为条形码DNA。所述条形码DNA的序列与所述特异性抗体20对应，即不同的所述特异性抗体20对应的所述条形码DNA的序列也不同，以便于在后续的检测中区别所述外泌体10表面不同的所述蛋白分子101。所述条形码DNA包括10-500个碱基对。
如图3所示，在本实施方式中，将每一种所述特异性抗体20加入所述生物样本中之前，先将所述特异性抗体20和所述DNA分子片段30相结合，具体为：分别在所述DNA分子片段30与所述特异性抗体20上标记生物素40，并分别将所述DNA分子片段30上的生物素40以及所述特异性抗体20上的生物素40转变成生物素化分子41。然后，通过链霉亲和素50将所述DNA分子片段30上的所述生物素化分子41以及所述特异性抗体20上的所述生物素化分子41进行结合，即在所述特异性抗体20上标记所述DNA分子片段30，从而得到一复合探针60。然后，再将所述复合探针60加入所述生物样本中，使得每一种所述蛋白分子101与相应的标记有所述DNA分子片段30的特异性抗体20结合。
在另一实施方式中，还可以先将生物素化后的所述特异性抗体20加入所述生物样本中，使得生物素化后的所述特异性抗体20与所述外泌体10表面的所述蛋白分子101结合。然后，将所述链霉亲和素50加入到所述生物样本中，使得每一所述特异性抗体20与所述链霉亲和素50结合。然后，再将生物素化后的所述DNA分子片段30加入到所述生物样本中，使得所述DNA分子片段30通过所述链霉亲和素50和所述特异性抗体20结合，从而使得每一种所述蛋白分子101与相应的标记有所述DNA分子片段30的特异性抗体20结合。其中，每一次加入新的分子，都需要先对所述外泌体10进行清洗，以去除游离的分子。
在其他实施方式中，所述DNA分子片段30与所述特异性抗体20可通过自身的共价键结合。其中，所述共价键包括二硫键。
为保证所述外泌体10表面的所述蛋白分子101与所述特异性抗体20混合均匀，在本实施方式中，混合的温度为4℃，混合的时间大于30min。其中，可利用试管混合器进行混合。
步骤S4，如图5所示，去除所述混合液中游离的所述特异性抗体20以及游离的所述DNA分子片段30，从而分离出标记有所述DNA分子片段30的外泌体10。
在本实施方式中，可通过一提纯芯片70去除所述混合液中游离的所述特异性抗体20以及游离的所述DNA分子片段30。具体地，可利用负压变频的方法对所述混合液进行分离提纯。如图5所述示，AP为大气压(air pressure)，NP为负压(negative pressure)。其中，所述提纯芯片70包括两个相对设置的过滤膜701，且每一所述过滤膜701包括至少一滤孔(图未标)。其中，所述滤孔的孔径小于标记有所述DNA分子片段的外泌体10，且大于游离的所述特异性抗体20以及游离的所述DNA分子片段30。具体地，所述滤孔的直径可为20nm。
步骤S5，如图6所示，提取标记有所述DNA分子片段30的外泌体10内的所述核酸分子102以及所述DNA分子片段30。
在本实施方式中，在提取标记有所述DNA分子片段30的外泌体10内的所述核酸分子102以及所述DNA分子片段30之前，需要对所述外泌体10进行裂解。其中，裂解所述外泌体10的方法包括TRIzol试剂法、硫氰酸胍/酚法、酚/SDS法、盐酸胍法以及硫氰酸胍法中的至少一种。
具体地，TRIzol试剂法为用TRIzol试剂裂解所述外泌体10后，加入氯仿并离心后得到一溶液，所述溶液分为水相、有机相以及中间层，其中，RNA在水相中，取出水相并用异丙醇沉淀可回收RNA，用乙醇沉淀中间层可回收DNA。
在其他实施方式中，所述外泌体10内的所述核酸分子102还可通过加热或者加入裂解液裂解释放的方式，也可以通过专业的核酸提取试剂盒来提取。
步骤S6，对所提取的所述核酸分子102以及所述DNA分子片段30同时进行定量分析。
其中，所述定量分析的方法包括荧光定量PCR、数字PCR、PCR结合电泳、基因测序以及基因芯片中的至少一种。
其中，定量分析所述RNA还包括逆转录PCR。在本实施方式中，逆转录PCR所用的引物需要根据所要检测的核酸片段事先设计，从而获得目标蛋白和基因的表达量。其中，所述DNA分子片段30的表达量直接表明了目标蛋白的表达量。
下面通过实施例对本发明作进一步的说明。
实施例
对尿液中的外泌体10进行检测，需要同时检测所述外泌体10表面的一个膜蛋白(PSA，前列腺特异性抗原)和三个所述外泌体10内部的RNA突变位点(PCA3，SPDEF，和ERG)的表达量。
具体地，将PSA抗体的复合探针60加入到生物样本中，标记所述外泌体10表面的PSA抗原，分离提纯之后，再提取出所述外泌体10的标记的DNA和内部的RNA分子，进行荧光定量PCR，从而同时快速准确地得到PSA抗原和三个RNA突变位点的表达量。
本发明的定量检测方法能够同时检测外泌体10表面的蛋白分子101和内部的核酸分子102，该定量检测方法具有操作方便、成本低以及耗时短的优点。
以上实施方式仅用以说明本发明实施例的技术方案而非限制，尽管参照以上较佳实施方式对本发明实施例进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明实施例的技术方案进行修改或等同替换都不应脱离本发明实施例的技术方案的精神和范围。

Claims (8)

1.一种外泌体多组学标志物的定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
提供一包含外泌体的生物样本，所述外泌体包括位于表面的至少一种蛋白分子和位于内部的核酸分子；
提供复合探针，所述复合探针包括DNA分子片段和与所述蛋白分子相应的特异性抗体，所述DNA分子片段的序列与所述特异性抗体对应；
将所述复合探针加入所述生物样本中，使得所述外泌体表面的每一种所述蛋白分子与相应的所述特异性抗体结合，从而得到一混合液；
去除所述混合液中游离的所述特异性抗体以及游离的所述DNA分子片段，从而分离出标记有所述DNA分子片段的外泌体；
提取标记有所述DNA分子片段的外泌体内的所述核酸分子以及所述DNA分子片段；以及
对所提取的所述核酸分子以及所述DNA分子片段同时进行定量分析；
其中，所述复合探针的制备方法包括如下步骤：
分别在所述DNA分子片段与所述特异性抗体上标记生物素；
分别将所述DNA分子片段上的生物素以及所述特异性抗体上的生物素转变成生物素化分子；以及
通过链霉亲和素将所述DNA分子片段上的所述生物素化分子以及所述特异性抗体上的所述生物素化分子进行结合，从而得到所述复合探针。
2.如权利要求1所述的外泌体多组学标志物的定量检测方法，其特征在于，对所述核酸分子以及所述DNA分子片段同时进行定量分析的方法包括荧光定量PCR、数字PCR、PCR结合电泳、基因测序以及基因芯片中的至少一种。
3.如权利要求1所述的外泌体多组学标志物的定量检测方法，其特征在于，通过一提纯芯片去除所述混合液中游离的所述特异性抗体以及游离的所述DNA分子片段，所述提纯芯片包括两个相对设置的过滤膜，每一所述过滤膜包括至少一滤孔，所述滤孔的孔径小于标记有所述DNA分子片段的外泌体。
4.如权利要求1所述的外泌体多组学标志物的定量检测方法，其特征在于，在提取标记有所述DNA分子片段的外泌体内的所述核酸分子以及所述DNA分子片段之前，还包括：
对所述外泌体进行裂解；
其中，裂解所述外泌体的方法包括TRIzol试剂法、硫氰酸胍/酚法、酚/SDS法、盐酸胍法以及硫氰酸胍法中的至少一种。
5.如权利要求1所述的外泌体多组学标志物的定量检测方法，其特征在于，所述蛋白分子包括CD9、CD63、CD81、Alix、TSG101、膜粘连蛋白、EpCAM、人表皮生长因子受体-2蛋白以及前列腺特异性抗原蛋白中的至少一种。
6.如权利要求1所述的外泌体多组学标志物的定量检测方法，其特征在于，所述DNA分子片段包括10-500个碱基对。
7.如权利要求1所述的外泌体多组学标志物的定量检测方法，其特征在于，所述核酸分子包括DNA和RNA，定量分析所述RNA还包括逆转录PCR。
8.如权利要求1所述的外泌体多组学标志物的定量检测方法，其特征在于，将每一种所述特异性抗体加入所述生物样本中后混合的时间大于30min。
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