CN110835363A - 一种基于蛋白质巯基耦连金属的抗体标记方法 - Google Patents
一种基于蛋白质巯基耦连金属的抗体标记方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110835363A CN110835363A CN201911113279.3A CN201911113279A CN110835363A CN 110835363 A CN110835363 A CN 110835363A CN 201911113279 A CN201911113279 A CN 201911113279A CN 110835363 A CN110835363 A CN 110835363A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- antibody
- metal
- buffer solution
- polymer
- mixing
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 title claims abstract description 40
- 239000002184 metal Substances 0.000 title claims abstract description 40
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 title claims abstract description 36
- 238000002372 labelling Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 32
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 32
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims abstract description 27
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 25
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 23
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 20
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims abstract description 19
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims abstract description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 12
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 29
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 10
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical group OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 10
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 claims description 7
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 4
- 229910052692 Dysprosium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910052691 Erbium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910052693 Europium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910052688 Gadolinium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910052689 Holmium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910052765 Lutetium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910052779 Neodymium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910052777 Praseodymium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910052772 Samarium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910052771 Terbium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910052775 Thulium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910052769 Ytterbium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910052797 bismuth Inorganic materials 0.000 claims description 3
- JCXGWMGPZLAOME-UHFFFAOYSA-N bismuth atom Chemical compound [Bi] JCXGWMGPZLAOME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- KBQHZAAAGSGFKK-UHFFFAOYSA-N dysprosium atom Chemical compound [Dy] KBQHZAAAGSGFKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- UYAHIZSMUZPPFV-UHFFFAOYSA-N erbium Chemical compound [Er] UYAHIZSMUZPPFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N europium atom Chemical compound [Eu] OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- UIWYJDYFSGRHKR-UHFFFAOYSA-N gadolinium atom Chemical compound [Gd] UIWYJDYFSGRHKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 3
- KJZYNXUDTRRSPN-UHFFFAOYSA-N holmium atom Chemical compound [Ho] KJZYNXUDTRRSPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910052738 indium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- APFVFJFRJDLVQX-UHFFFAOYSA-N indium atom Chemical compound [In] APFVFJFRJDLVQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910052746 lanthanum Inorganic materials 0.000 claims description 3
- FZLIPJUXYLNCLC-UHFFFAOYSA-N lanthanum atom Chemical compound [La] FZLIPJUXYLNCLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 3
- OHSVLFRHMCKCQY-UHFFFAOYSA-N lutetium atom Chemical compound [Lu] OHSVLFRHMCKCQY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- QEFYFXOXNSNQGX-UHFFFAOYSA-N neodymium atom Chemical compound [Nd] QEFYFXOXNSNQGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 claims description 3
- PUDIUYLPXJFUGB-UHFFFAOYSA-N praseodymium atom Chemical compound [Pr] PUDIUYLPXJFUGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 3
- KZUNJOHGWZRPMI-UHFFFAOYSA-N samarium atom Chemical compound [Sm] KZUNJOHGWZRPMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- GZCRRIHWUXGPOV-UHFFFAOYSA-N terbium atom Chemical compound [Tb] GZCRRIHWUXGPOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- FRNOGLGSGLTDKL-UHFFFAOYSA-N thulium atom Chemical compound [Tm] FRNOGLGSGLTDKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- NAWDYIZEMPQZHO-UHFFFAOYSA-N ytterbium Chemical compound [Yb] NAWDYIZEMPQZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910052727 yttrium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- VWQVUPCCIRVNHF-UHFFFAOYSA-N yttrium atom Chemical compound [Y] VWQVUPCCIRVNHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 21
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 9
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 210000000207 lymphocyte subset Anatomy 0.000 description 4
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 238000012083 mass cytometry Methods 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 101000797623 Homo sapiens Protein AMBP Proteins 0.000 description 1
- 102000010750 Metalloproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010063312 Metalloproteins Proteins 0.000 description 1
- 102100032859 Protein AMBP Human genes 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 229940127174 UCHT1 Drugs 0.000 description 1
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000006263 metalation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 229920002959 polymer blend Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/13—Labelling of peptides
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
- G01N15/1404—Handling flow, e.g. hydrodynamic focusing
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
- G01N15/1468—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry with spatial resolution of the texture or inner structure of the particle
- G01N15/147—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry with spatial resolution of the texture or inner structure of the particle the analysis being performed on a sample stream
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/62—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating the ionisation of gases, e.g. aerosols; by investigating electric discharges, e.g. emission of cathode
- G01N27/64—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating the ionisation of gases, e.g. aerosols; by investigating electric discharges, e.g. emission of cathode using wave or particle radiation to ionise a gas, e.g. in an ionisation chamber
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
- G01N2001/302—Stain compositions
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
- G01N15/1468—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry with spatial resolution of the texture or inner structure of the particle
- G01N2015/1472—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry with spatial resolution of the texture or inner structure of the particle with colour
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Electrochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本申请涉及蛋白标记技术领域，具体涉及一种基于蛋白巯基耦连的抗体标记方法，所述方法包括如下步骤：(1)，在polymer管中，加入39‑195μl L‑缓冲液，以溶解聚合物polymer；然后加入1‑5μl 100mM金属盐离子溶液，混匀后孵育；(2)，将孵育结束后的溶液转移至3KDa超滤管，离心，去上清，得到中间体试剂；(3)，在抗体对应的超滤管中，将所述中间体试剂和巯基已被还原的抗体混合，以进行耦连反应，得到金属标记的抗体；其中，所述L‑缓冲液和所述polymer为MAXPAR多金属标记试剂盒中的试剂。
Description
技术领域
本申请涉及蛋白标记技术领域，具体涉及一种基于蛋白质巯基耦连金属的抗体标记方法。
背景技术
在监测生物过程、辅助检测(例如化合物的可靠定量、蛋白质修饰的特异性检测)或者纯化标记后的蛋白及其结合对象等都需要应用到蛋白质标记技术。高效的蛋白质标记技术能够提高检测灵敏度以及简化检测工作流程。
目前有多种蛋白质标记技术，如同位素标记、荧光标记、量子点标记、生物素标记、酶联标记等来帮助我们研究感兴趣的蛋白质的丰度、位置、相互作用、翻译后修饰、功能，乃至监测活细胞中的蛋白质运输等问题。使用金属对蛋白质进行标记，能够避免样本的自发荧光背景的干扰、无生物危害、极高的灵敏度、高通零等优势，具备极大的应用情景。随着质谱仪及质谱流式细胞技术的发展越来越迅速，发展越来越迅速，国内外对应用于该技术的金属蛋白试剂需求也越来越大，以满足高维度细胞检测的需求。
发明内容
本申请提供一种基于蛋白质巯基耦连金属的抗体标记方法，可以将不同的蛋白质和不同的金属耦连，通过检测金属，可实现多个蛋白的同步检测，方法简便、成本较低、实用性强、效率和可靠性较高。
本申请提供了一种基于蛋白巯基耦连的抗体标记方法，所述方法包括如下步骤：(1)，在polymer管中，加入39-195μl L-缓冲液，以溶解聚合物polymer；然后加入1-5μl100mM金属盐离子溶液，混匀后孵育；(2)，将孵育结束后的溶液转移至3KDa超滤管，离心，去上清，得到中间体试剂；(3)，在抗体对应的超滤管中，将所述中间体试剂和巯基已被还原的抗体混合，以进行耦连反应，得到金属标记的抗体；其中，所述L-缓冲液和所述polymer为MAXPAR多金属标记试剂盒中的试剂。
在一些实施例中，所述巯基已被还原的抗体通过以下步骤制备得到：
(a)，在抗体对应的超滤管中，使用R-缓冲液混合抗体；
(b)，在步骤(a)抗体对应的超滤管中加入用R-缓冲液混合后巯基还原剂，以还原抗体的巯基；其中，
所述R-缓冲液为MAXPAR多金属标记试剂盒中的试剂。
在一些实施例中，所述巯基还原剂为TCEP。
在一些实施例中，所述抗体为免疫球蛋白、配体、短肽中的任一种。
在一些实施例中，所述免疫球蛋白为lgG免疫球蛋白。
在一些实施例中，所述金属为以下任一种：
镧La、钇Y、镨Pr、钕Nd、钐Sm、铕Eu、钆Gd、铽Tb、镝Dy、钬Ho、铒Er、铥Tm、镱Yb、镥Lu、铟In、金Au、铂Pt、铋Bi。
在一些实施例中，在步骤(1)之前，所述方法还包括：在室温下，使所述polymer复温15min。
在一些实施例中，在步骤(3)中，所述巯基已被还原的抗体为将100μg抗体的巯基还原后得到。
在一些实施例中，在步骤(3)中，将所述中间体试剂和巯基已被还原的抗体混合后，在37℃孵育1-2小时，以进行耦连反应。
在一些实施例中，在步骤(3)之后，所述方法还包括：(4)，使用w-缓冲液洗脱被金属标记后的抗体，所述w-缓冲液为MAXPAR多金属标记试剂盒中的试剂。
本申请提供的抗体标记方法可以对细胞或者药物进行标记，从而加大筛选工作的通量，扩展了适用于质谱流式细胞技术的金属耦连蛋白质的金属通道。
具体实施方式
下列实施例仅用于说明本申请，而不应视为限制本申请的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
在进一步描述本申请具体实施方式之前，应理解，本申请的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本申请实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本申请的保护范围；在本申请说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本申请另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本申请中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本申请的记载，还可以使用与本申请实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本申请。
除非另外说明，本申请中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
本申请实施例提供的基于蛋白质巯基耦连金属的抗体标记方法可以对anti-CD3(UCHT1),anti-CD4(RPA-T4),anti-CD8a(RPA-T8),anti-CD16(3G8),anti-CD19(HIB19),anti-CD45(HI30),anti-CD56(NCAM16.2)等七种抗体进行标记。然后可使用质谱流式平台对样本中的淋巴细胞亚群进行分析，检测结果与流式细胞技术平台检测进行比较后无显著差异。
接下来，在具体实施例中，对本申请实施例提供的抗体标记方法进行举例介绍。其中，实验对象包括：淋巴细胞亚群抗体的标记；实验试剂包括：Maxpar multimetallabeling Kit-40 Rnx；实验设备包括：质谱流式细胞仪Helios，流式细胞仪BD Canto II。
实施例1
本实施例提供了带巯基蛋白质的标记方法包括如下步骤。
步骤一、一管X8 polymer中加入39～195ul L buffer，吹打均匀使X8polymer充分溶解，后加入1～5μl 100mM金属盐离子溶液，混匀后孵育；
步骤二、孵育结束后，将全部溶液转移至3kd超滤管，离心；弃上清，收集超滤管内液体于离心管中，取40～200μl C buffer清洗超滤管并将液体全部收集至离心管中，充分混匀后即得到中间体试剂；
步骤三、根据蛋白质分子量使用特定的超滤管，使用R buffer混合抗体，离心纯化后，加入TCEP进行还原，加入300ul C buffer，过特定分子量的超滤管，抗体还原完成；
步骤四、将步骤二的中间体加入步骤三的超滤管中，和蛋白混匀后，进行耦连反应；
步骤五、使用50ul w buffer清洗后将超滤管倒置，使用适当体积的w buffer反向洗出耦连完成的蛋白；
在一个说明性示例中，标记蛋白质的巯基基团。
在一个说明性示例中，蛋白质的巯基基团使用硫醇类还原剂进行巯基还原，包括但不限于TCEP(Tris(2-carboxyethyl)phosphine，三(2-羧乙基)膦)。
在一个说明性示例中，将金属与polymer结合成为一种中间体。
在一个说明性示例中，使用超滤管纯化中间体和待标记蛋白，如IgG免疫球蛋白等。
在一个说明性示例中，步骤一中，X8 Polymer在使用前，在室温复温15min。
在一个说明性示例中，中间体加入巯基还原蛋白的体系为30ul，提升了中间体的浓度。
实施例2
本实施例提供了抗体标记方法包括如下步骤。
抗体标记方法包括以下步骤：
a.Polymer复温15min；
b.95ul L-buffer重悬polymer，再加入5ul 100mM金属，孵育30min；
c.300ul R-buffer加入到50kDa超滤管(超滤管A)，加入100ug抗体(若抗体为溶液，应选取体积不大于200ul的规格；若抗体为晶体粉末，应使用不大于200ul R-buffer溶解)，12000g RT 10min(同步配置TCEP工作液8ul TCEP和992ul R buffer混合)，弃去离心下来的液体，加入100ul 4mM TCEP R buffer混匀，37度孵育30min；
d.200ul L-buffer加入3KDa管，加入金属-polymer混合物，12000g RT25min，加入300ul C-buffer，12000g RT 30min，离心后弃掉离心下来的液体；
e.取出还原产物，加入300ul C-buffer，12000g RT 5min，弃去离心下来的液体，加入400ul C-buffer，12000g RT 5min，离心后弃掉离心下来的液体；
f.30ul C-buffer重悬金属polymer(3KDa管)，将重悬后的液体转移至带有蛋白的超滤管A中，吹打混匀，37度孵育60min(最多2h)；
g.加入300ul W-buffer到超滤管A中，12000g RT 5min，弃掉离心下来的液体，重复W-buffer wash步骤三次；
h.加入50ul w-buffer到50KDa管的滤膜上，吹打冲洗管壁和滤膜，将超滤管A倒扣在一新的收集管中，1000g 2min，取出内管，用50ul W-buffer再洗涤管壁和滤膜一次，倒扣在管子中，1000g离心2min；
i.测OD280，使用W-buffer作为blank，稀释蛋白至0.5mg/ml,4℃保存。
j.取10^6淋巴细胞，使用金属标记CD45进行染色；
k.用质谱流式细胞仪检测染色结果；
l.与流式检测结果进行比对。
试验结果：淋巴细胞亚群分析效果与传统流式技术的比对结果相同；
结论：使用本实施例中的技术，能够实现金属与带巯基蛋白质的高效标记，并且能对样本中的淋巴细胞亚群进行分群。
实施例3
本实施提供了一种基于蛋白巯基耦连的抗体标记方法，所述方法包括如下步骤：(1)，在polymer管中，加入39-195μl L-缓冲液，以溶解聚合物polymer；然后加入1-5μl100mM金属盐离子溶液，混匀后孵育；(2)，将孵育结束后的溶液转移至3KDa超滤管，离心，去上清，得到中间体试剂；(3)，在抗体对应的超滤管中，将所述中间体试剂和巯基已被还原的抗体混合，以进行耦连反应，得到金属标记的抗体；其中，所述L-缓冲液和所述polymer为MAXPAR多金属标记试剂盒中的试剂。
在一些实施例中，所述巯基已被还原的抗体通过以下步骤制备得到：
(a)，在抗体对应的超滤管中，使用R-缓冲液混合抗体；
(b)，在步骤(a)抗体对应的超滤管中加入用R-缓冲液混合后巯基还原剂，以还原抗体的巯基；其中，
所述R-缓冲液为MAXPAR多金属标记试剂盒中的试剂。
在一些实施例中，所述巯基还原剂为TCEP。
在一些实施例中，所述抗体为免疫球蛋白、配体、短肽中的任一种。
在一些实施例中，所述免疫球蛋白为lgG免疫球蛋白。
在一些实施例中，所述金属为以下任一种：
镧La、钇Y、镨Pr、钕Nd、钐Sm、铕Eu、钆Gd、铽Tb、镝Dy、钬Ho、铒Er、铥Tm、镱Yb、镥Lu、铟In、金Au、铂Pt、铋Bi。
在一些实施例中，在步骤(1)之前，所述方法还包括：在室温下，使所述polymer复温15min。
在一些实施例中，在步骤(3)中，所述巯基已被还原的抗体为将100μg抗体的巯基还原后得到。
在一些实施例中，在步骤(3)中，将所述中间体试剂和巯基已被还原的抗体混合后，在37℃孵育1-2小时，以进行耦连反应。
在一些实施例中，在步骤(3)之后，所述方法还包括：(4)，使用w-缓冲液洗脱被金属标记后的抗体，所述w-缓冲液为MAXPAR多金属标记试剂盒中的试剂。
以上所述的具体实施方式，对本申请的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本申请的具体实施方式而已，并不用于限定本申请的保护范围，凡在本申请的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种基于蛋白巯基耦连的抗体标记方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)，在polymer管中，加入39-195μl L-缓冲液，以溶解聚合物polymer；然后加入1-5μl100mM金属盐离子溶液，混匀后孵育；
(2)，将孵育结束后的溶液转移至3KDa超滤管，离心，去上清，得到中间体试剂；
(3)，在抗体对应的超滤管中，将所述中间体试剂和巯基已被还原的抗体混合，以进行耦连反应，得到金属标记的抗体；其中，
所述L-缓冲液和所述polymer为MAXPAR多金属标记试剂盒中的试剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述巯基已被还原的抗体通过以下步骤制备得到：
(a)，在抗体对应的超滤管中，使用R-缓冲液混合抗体；
(b)，在步骤(a)抗体对应的超滤管中加入用R-缓冲液混合后的巯基还原剂，以还原抗体的巯基；其中，
所述R-缓冲液为MAXPAR多金属标记试剂盒中的试剂。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述巯基还原剂为TCEP。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗体为免疫球蛋白、配体、短肽中的任一种。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述免疫球蛋白为lgG免疫球蛋白。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述金属元素为以下任一种：
镧La、钇Y、镨Pr、钕Nd、钐Sm、铕Eu、钆Gd、铽Tb、镝Dy、钬Ho、铒Er、铥Tm、镱Yb、镥Lu、铟In、金Au、铂Pt、铋Bi。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)之前，所述方法还包括：在室温下，使所述polymer复温15min。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述巯基已被还原的抗体为将100μg抗体的巯基还原后得到。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，将所述中间体试剂和巯基已被还原的抗体混合后，在37℃孵育1-2小时，以进行耦连反应。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(3)之后，所述方法还包括：
(4)，使用w-缓冲液洗脱被金属标记后的抗体，所述w-缓冲液为MAXPAR多金属标记试剂盒中的试剂。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911113279.3A CN110835363A (zh) | 2019-11-14 | 2019-11-14 | 一种基于蛋白质巯基耦连金属的抗体标记方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911113279.3A CN110835363A (zh) | 2019-11-14 | 2019-11-14 | 一种基于蛋白质巯基耦连金属的抗体标记方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110835363A true CN110835363A (zh) | 2020-02-25 |
Family
ID=69576467
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201911113279.3A Pending CN110835363A (zh) | 2019-11-14 | 2019-11-14 | 一种基于蛋白质巯基耦连金属的抗体标记方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110835363A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117466980A (zh) * | 2023-11-02 | 2024-01-30 | 浙江普罗亭健康科技有限公司 | 基于多肽链骨架应用于金属抗体标记的负载金属缀合物及其应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20140235480A1 (en) * | 2013-02-11 | 2014-08-21 | Craig David Shimasaki | Ultra-sensitive Detection of Analytes |
| AU2018204709A1 (en) * | 2015-07-09 | 2018-07-19 | Atomic Oncology Pty Ltd | Atomic therapeutic indicator |
| CN108845120A (zh) * | 2018-04-27 | 2018-11-20 | 天津华科泰生物技术有限公司 | 一种金属离子标记的免疫反应单脉冲检测方法 |
| CN110412286A (zh) * | 2019-07-11 | 2019-11-05 | 上海宸安生物科技有限公司 | 一种利用质谱流式系统对肿瘤样本进行单细胞检测的方法 |
-
2019
- 2019-11-14 CN CN201911113279.3A patent/CN110835363A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20140235480A1 (en) * | 2013-02-11 | 2014-08-21 | Craig David Shimasaki | Ultra-sensitive Detection of Analytes |
| AU2018204709A1 (en) * | 2015-07-09 | 2018-07-19 | Atomic Oncology Pty Ltd | Atomic therapeutic indicator |
| CN108845120A (zh) * | 2018-04-27 | 2018-11-20 | 天津华科泰生物技术有限公司 | 一种金属离子标记的免疫反应单脉冲检测方法 |
| CN110412286A (zh) * | 2019-07-11 | 2019-11-05 | 上海宸安生物科技有限公司 | 一种利用质谱流式系统对肿瘤样本进行单细胞检测的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| DVS SCIENCES: "MAXPAR®-PL KIT Lanthanide Labeling of Antibodies: Pre-Load Method", 《MAXPAR®-PL KIT LANTHANIDE LABELING OF ANTIBODIES: PRE-LOAD METHOD》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117466980A (zh) * | 2023-11-02 | 2024-01-30 | 浙江普罗亭健康科技有限公司 | 基于多肽链骨架应用于金属抗体标记的负载金属缀合物及其应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10444125B2 (en) | Devices and methods for separating magnetically labeled moieties in a sample | |
| Lv et al. | Reverse capture for selectively and sensitively revealing the N-glycome of serum exosomes | |
| US8017332B2 (en) | Magnetic method for recovering nucleic acid from a mixed cell suspension | |
| EP2914960B1 (en) | Detecting cells secreting a protein of interest | |
| WO2019232797A1 (zh) | 磁珠-核酸适配体-多靶分子同时检测的方法及试剂盒 | |
| EP2972359B1 (en) | Enrichment of circulating tumor cells by depleting white blood cells | |
| CN110835363A (zh) | 一种基于蛋白质巯基耦连金属的抗体标记方法 | |
| KR101928333B1 (ko) | 복수개의 금속 나노 태그를 이용한 복수개의 타겟의 동시 분석 방법 | |
| CN111116701A (zh) | 一种用于蛋白金属标记的中间体及其制备方法、用途 | |
| US20070161120A1 (en) | Ceruloplasmin Assay | |
| CN113234163B (zh) | 分离胎儿滋养层细胞的方法及试剂盒 | |
| US20110212432A1 (en) | Separation of blood cells from a blood sample | |
| US20170354972A1 (en) | Systems and Methods for Determining Probative Samples and Isolation and Quantitation of Cells | |
| Spicer et al. | Isolation of ribosomal protein-RNA complexes by nitrocellulose membrane filtration: equilibrium binding studies | |
| CN111116746A (zh) | 一种基于纳米金颗粒的蛋白标记方法 | |
| KR20230114327A (ko) | 태아 세포의 단리, 검출 및 분석을 위한 조성물 및방법 | |
| CN112986573B (zh) | 外泌体多组学标志物的定量检测方法 | |
| CN111855861B (zh) | 伴随蛋白/肽在提高蛋白质组实验效率中的应用 | |
| Strohmeier et al. | Magnetic bead based DNA purification on a disposable centrifugal microfluidic foil cartridge | |
| Niles | Improving semen identification and quantitation using protein mass spectrometry | |
| Ooi et al. | Capture and genetic analysis of circulating tumor cells using a magnetic separation device (Magnetic Sifter) | |
| WO2022248979A1 (en) | Enzyme-conjugated magnetic beads suspended in internal standard buffer | |
| Pure | FROM TRASH TO TREASURE | |
| US20140242724A1 (en) | Methods and Compositions for the Efficient Reuse of Multiply Dyed Particles | |
| Sugishita et al. | A centrifugation-based method for high-throughput biomaterial separation using magnetic microbeads |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200225 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |