CN111116701A - 一种用于蛋白金属标记的中间体及其制备方法、用途 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及蛋白标记技术领域，具体涉及一种用于蛋白金属标记的中间体及其制备方法、用途。所述方法包括如下步骤：(1)，使用L‑缓冲液，以溶解螯合剂；然后加入金属盐离子溶液，混匀后孵育；(2)，将孵育结束后的溶液转移至3KDa超滤管，离心，去上清，得到中间体；其中，所述L‑缓冲液为MAXPAR多金属标记试剂盒中的试剂。
Description
技术领域
本申请涉及蛋白标记技术领域，具体涉及一种蛋白金属标记的中间体及其 制备方法、用途。
背景技术
在对生物体各类检测的过程中，一些生物体特征分子如蛋白质的有无及含 量往往被转化为目前已有的方法学能够检测到的信号，如耦连荧光素、同位素、 生物素、酶等用于不同平台的检测。
镧系、铟、钇等金属元素，在正常人体内含量极少或检测不到，使用这类 金属对蛋白质进行标记，能够很好的避免生物体本身的背景信号干扰，并且能 够使用如质谱仪等设备进行检测，提升了检测的灵敏度，避免了不同通道之间 的干扰，为同一个细胞的高维度检测提供了可能。
发明内容
本申请提供一种蛋白金属标记的中间体及其制备方法、用途，可以所制备 的中间体通过官能团连接金属，另一端的官能团能够与还原的巯基进行耦连， 实现蛋白质的金属标记，从而通过检测金属，实现对于多个蛋白的同步检测， 且方法简便、经济、实用性强、效率和可靠性较高。
第一方面，本申请提供了一种用于蛋白金属标记的中间体的制备方法，所 述方法包括如下步骤：
(1)，使用L-缓冲液，以溶解螯合剂；然后加入金属盐离子溶液，混匀后 孵育；
(2)，将孵育结束后的溶液转移至3KDa超滤管，离心，去上清，得到中 间体；
其中，所述L-缓冲液为MAXPAR多金属标记试剂盒中的试剂。
在一些实施例中，在步骤(1)之前，所述方法还包括：在室温下，使所述 螯合剂复温15min。
在一些实施例中，所述金属为以下任一种：
镧La、钇Y、镨Pr、钕Nd、钐Sm、铕Eu、钆Gd、铽Tb、镝Dy、钬Ho、 铒Er、铥Tm、镱Yb、镥Lu、铟In、金Au、铂Pt、铋Bi。
在一些实施例中，所述螯合剂为以下任一种：
DOTA单体、DOTA多聚体、DPTA单体、DPTA多聚体。
在一些实施例中，所述金属盐离子溶液为金属的盐酸盐溶液，其中，金属 阳离子与螯合剂配位形成所述中间体。
在一些实施例中，使用马来酰亚胺修饰所述螯合剂中用于连接蛋白巯基的 官能团。
第二方面，本申请提供了一种用于蛋白金属标记的中间体，由第一方面所 述的方法制备得到。
第三方面，本申请提供了第二方面所述的中间体在标记蛋白中的用途。
在一些实施例中，在蛋白对应的超滤管中，将所述中间体和巯基已被还原 的蛋白混合，以进行耦连反应，得到金属标记的抗体。
在一些实施例中，所述巯基已被还原的抗体通过以下步骤制备得到：
(a)，在蛋白对应的超滤管中，使用R-缓冲液混合抗体；
(b)，在步骤(a)蛋白对应的超滤管中加入用R-缓冲液混合后巯基还原剂， 以还原抗体的巯基；其中，
所述R-缓冲液为MAXPAR多金属标记试剂盒中的试剂；所述巯基还原剂 为TCEP；所述蛋白为免疫球蛋白、配体、短肽中的任一种。
本申请提供的中间体适用于金属检测，如质谱流式细胞仪检测的金属标记 的中间体的有益效果为：可以简单高效地对带有巯基的蛋白质药物进行标记， 从而加大筛选工作的通量，提高了蛋白质检测的维度。
附图说明
图1为质谱流式细胞仪检测染色结果与流式检测结果的对比图。
具体实施方式
下列实施例仅用于说明本申请，而不应视为限制本申请的范围。实施例中 未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器 未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
在进一步描述本申请具体实施方式之前，应理解，本申请的保护范围不局 限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本申请实施例中使用的术语是为 了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本申请的保护范围；在本申请说 明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包 括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本申请另有说明，每个数值范围 的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本申请 中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除 实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有 技术的掌握及本申请的记载，还可以使用与本申请实施例中所述的方法、设备、 材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本申请。
除非另外说明，本申请中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用 本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细 胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完 善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989 and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987 and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe， CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press， San Diego，1998；METHODSIN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin (P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999； 和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
本申请实施例提供的用于蛋白金属标记的中间体可以应用于对 anti-CD3(UCHT1),anti-CD4(RPA-T4),anti-CD8a(RPA-T8),anti-CD16(3G8), anti-CD19(HIB19),anti-CD45(HI30),anti-CD56(NCAM16.2)等七种抗体进行标 记。然后可使用质谱流式平台进行检测与流式细胞技术平台检测进行比较。
接下来，在具体实施例中，对本申请实施例提供的用于蛋白金属标记的中 间体进行举例介绍。其中，对anti-CD45(HI30)抗体进行标记；实验对象：人外 周血分离外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)；实验 试剂：Maxpar multimetallabeling Kit-40 Rnx；实验设备：质谱流式细胞仪Helios，流式细胞仪BD Canto II。
实施例1
本实施例提供了用于蛋白金属标记的中间体可通过以下步骤制备。
a.Polymer复温15min；
b.97.5ul L-buffer重悬polymer，再加入2.5ul 100mM 89Y金属溶液，孵 育30min，得到中间体；
c.300ul R-buffer加入50kDa超滤管(超滤管A)，加入100ug CD45抗体 (规格为0.5mg/ml)，12000g RT 10min(同步配置TCEP工作液1ul TCEP和 124ul R-buffer混合)，弃去离心下来的液体，加入100ul 4mM TCEP R-buffer 混匀，37度孵育30min；
d.200ul L-buffer加入3KDa管，加入中间体，12000g RT 25min，加入300ul C-buffer，12000g RT 30min，离心后弃掉离心下来的液体；
e.取出还原产物，加入300ul C-buffer，12000g RT 5min，弃去离心下来的 液体，加入400ul c-buffer，12000g RT 5min，离心后弃掉离心下来的液体；
f.30ul C-buffer重悬中间体(3KDa管)，将重悬后的液体转移至带有抗体 的超滤管A中，吹打混匀，37度孵育60min(最多2h)；
g.加入300ul W-buffer到超滤管A中，12000g RT 5min，弃掉离心下来的 液体，重复W-buffer wash步骤三次；
h.加入50ul W-buffer到50KDa管的滤膜上，吹打冲洗管壁和滤膜，将超 滤管A倒扣在一新的收集管中，1000g 2min，取出内管，用50ul W-buffer再 洗涤管壁和滤膜一次，倒扣在管子中，1000g离心2min；
i.测OD280，使用W-buffer作为blank，稀释抗体至0.5mg/ml,4度保存；
j.健康人外周血使用Ficoll分离PBMC；
k.取10^6细胞，使用金属标记CD45进行染色；
l.用质谱流式细胞仪检测染色结果；
m.与流式检测结果进行比对；
试验结果如图1所示，可知PBMC中CD45的分群效果与传统流式技术的 比对结果相同；
结论：使用本申请提供的技术，能够实现中间体与带巯基蛋白质的高效标 记，并且能达到与其他标记方法相同的效果。
实施例2
本实施例提供了一种用于蛋白金属标记的中间体的制备方法，所述方法包 括如下步骤：
(1)，使用L-缓冲液，以溶解螯合剂；然后加入金属盐离子溶液，混匀后 孵育；
(2)，将孵育结束后的溶液转移至3KDa超滤管，离心，去上清，得到中 间体；
其中，所述L-缓冲液为MAXPAR多金属标记试剂盒中的试剂。
在一些示例中，在步骤(1)之前，所述方法还包括：在室温下，使所述螯 合剂复温15min。
在一些示例中，所述金属为以下任一种：
镧La、钇Y、镨Pr、钕Nd、钐Sm、铕Eu、钆Gd、铽Tb、镝Dy、钬Ho、 铒Er、铥Tm、镱Yb、镥Lu)、铟In、金Au、铂Pt、铋Bi。
在一些示例中，所述螯合剂为以下任一种：
DOTA单体、DOTA多聚体、DPTA单体、DPTA多聚体。
其中，DOTA单体的分子式如下。
DPTA多聚体的分子式如下。
在一些示例中，所述金属盐离子溶液为金属的盐酸盐溶液，其中，金属阳 离子与螯合剂配位形成所述中间体。
在一些示例中，使用马来酰亚胺修饰所述螯合剂中用于连接蛋白巯基的官 能团。
本实施例还提供了一种用于蛋白金属标记的中间体，由上述的方法制备得 到。
本实施例提供了通过上述方法制备的中间体在标记蛋白中的用途。
在一些示例中，在蛋白对应的超滤管中，将所述中间体和巯基已被还原的 蛋白混合，以进行耦连反应，得到金属标记的抗体。
在一些示例中，所述巯基已被还原的抗体通过以下步骤制备得到：
(a)，在蛋白对应的超滤管中，使用R-缓冲液混合抗体；
(b)，在步骤(a)蛋白对应的超滤管中加入用R-缓冲液混合后巯基还原剂， 以还原抗体的巯基；其中，
所述R-缓冲液为MAXPAR多金属标记试剂盒中的试剂；所述巯基还原剂 为TCEP；所述蛋白为免疫球蛋白、配体、短肽中的任一种。
实施例3
本实施提供了一种用于金属标记的中间体的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、一管X8 polymer中加入39～195μl L-buffer，吹打均匀使X8 polymer充分溶解，后加入1～5μL 100mM金属盐离子溶液，混匀后孵育；
步骤二、孵育结束后，将全部溶液转移至3kd超滤管，离心，弃上清，收 集超滤管内液体于离心管中，取40～200μl C-buffer清洗超滤管并将液体全部 收集至离心管中，充分混匀后即得到中间体试剂。
进一步的，该用于金属标记的中间体的制备方法，其特征在于使用镧系， 铟，钇等金属同位素。
进一步的，该用于金属标记的中间体的制备方法，其特征在于使用镧系， 铟，钇等金属同位素的氯化物，参与中间体形成的是金属阳离子。
进一步的，该用于金属标记的中间体的制备方法，其特征在于使用一种能 够耦连金属及蛋白质巯基的双官能团polymer。
进一步的，该用于金属标记的中间体的制备方法，其特征在于polymer连 接金属部分可以为单体如DOTA，DPTA等，只连接一个金属阳离子，也可以为DPTA多聚体，连接多个金属阳离子，用于信号的放大，提升检测灵敏度；
进一步的，该用于金属标记的中间体的制备方法，其特征在于polymer连 接抗体巯基的部分为马来酰亚胺修饰。
以上所述的具体实施方式，对本申请的目的、技术方案和有益效果进行了 进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本申请的具体实施方式而已， 并不用于限定本申请的保护范围，凡在本申请的精神和原则之内，所做的任何 修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于蛋白金属标记的中间体的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)，使用L-缓冲液，以溶解螯合剂；然后加入金属盐离子溶液，混匀后孵育；
(2)，将孵育结束后的溶液转移至3KDa超滤管，离心，去上清，得到中间体；其中，所述L-缓冲液为MAXPAR多金属标记试剂盒中的试剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)之前，所述方法还包括：在室温下，使所述螯合剂复温15min。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述金属为以下任一种：
镧La、钇Y、镨Pr、钕Nd、钐Sm、铕Eu、钆Gd、铽Tb、镝Dy、钬Ho、铒Er、铥Tm、镱Yb、镥Lu、铟In、金Au、铂Pt、铋Bi。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述螯合剂为以下任一种：
DOTA单体、DOTA多聚体、DPTA单体、DPTA多聚体。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述金属盐离子溶液为金属的盐酸盐溶液，其中，金属阳离子形成所述中间体中的金属阳离子。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使用马来酰亚胺修饰所述螯合剂中用于连接蛋白巯基的官能团。
7.一种用于蛋白金属标记的中间体，其特征在于，由权利要求1-6任一项所述的方法制备得到。
8.如权利要求7所述的中间体在标记蛋白中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，在蛋白对应的超滤管中，将所述中间体和巯基已被还原的蛋白混合，以进行耦连反应，得到金属标记的抗体。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述巯基已被还原的抗体通过以下步骤制备得到：
(a)，在蛋白对应的超滤管中，使用R-缓冲液混合抗体；
(b)，在步骤(a)蛋白对应的超滤管中加入用R-缓冲液混合后巯基还原剂，以还原抗体的巯基；其中，
所述R-缓冲液为MAXPAR多金属标记试剂盒中的试剂；所述巯基还原剂为TCEP；所述蛋白为免疫球蛋白、配体、短肽中的任一种。
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