CN115902231A - 用于化学发光免疫检测的抗体检测液及外泌体检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于化学发光免疫检测的抗体检测液及外泌体检测试剂盒。所述抗体检测液包含亲和素、化学发光标记物标记的生物素、抗体标记的生物素，所述亲和素含有4个生物素结合位点，其中一个位点与抗体标记的生物素结合、其他三个位点与化学发光标记物标记的生物素结合，通过所述抗体与目标物免疫结合从而实现对目标物的化学发光检测。本发明提供的试剂盒是利用所述抗体检测液对外泌体进行检测的试剂盒，具体还包括磁珠悬液、发光激发液、标准品、稀释液、洗涤液。本发明利用链霉亲和素为四聚体分子的性质，使一个CD9抗体分子可以桥接三个吖啶酯分子，将发光信号扩大三倍，提高了试剂盒的灵敏度。
Description
技术领域
本发明属于生物免疫检测技术领域，具体涉及一种用于化学发光免疫检测的抗体检测液及外泌体检测试剂盒。
背景技术
外泌体(exosome)是活细胞释放到细胞外的微小囊泡，直径在30-160nm。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体，它们广泛存在于血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁等体液中，被视为特异性分泌的膜泡，参与细胞间通讯。研究表明，外泌体与免疫反应、病毒致病性、妊娠、心血管疾病、中枢神经系统相关疾病和癌症进展有关。外泌体具有细胞类似的拓扑结构，包含DNA，RNA，蛋白质，脂质和小分子代谢物等物质，这些蛋白，脂质，RNA，miRNA等组分可作为癌症诊断和预兆。通过对体液中外泌体的分离，使用组合的标志物反映疾病状态，可以增加疾病诊断的特异性和敏感性。外泌体膜表面具有标记物如CD9、CD63、CD81等，这些标记物有助于我们分离鉴定外泌体。
目前，市场上外泌体定量的试剂盒很少，且主要采用Westernblot、ELISA和流式细胞术的定量方法。
Westernblot的方法：将细胞裂解液与外泌体样本混合，按照4℃12000g离心力，离心5min，取上清，采用外泌体标志蛋白抗体杂交，杂交之后进行SDS-PAGE电泳分析。
ELISA的方法：外泌体被捕获于高蛋白结合的微量滴度板上，依次与外泌体标志性蛋白一抗和二抗孵育，辣根过氧化物酶连接的二抗用于信号扩增，使用底物进行显色，结果通过有特定波长吸光度的微量滴定板阅读器进行定量。
流式细胞术：使用外泌体特异性抗体包被的磁珠捕获外泌体，同时使用荧光素偶联的外泌体特异性抗体与外泌体结合，最后用流式细胞仪检测荧光信号，根据信号值定量外泌体。
当前的外泌体定量方法缺点如下：
Westernblot的方法：操作步骤繁琐、耗时长、灵敏度低且需要的样本量大，所用的个别试剂有毒，对操作人员身体和环境可能造成危害，只能对外泌体进行相对定量。
ELISA的方法：操作步骤繁琐、耗时长、灵敏度相对Western blot高，但信号值低，稳定性差，价格昂贵，不适合自动化操作。
流式细胞术：稳定性差，不仅试剂成本高，且需要昂贵的流式细胞仪，不利于常规实验室开展。
总而言之，不管采用哪种方法，外泌体定量一直存在灵敏度低，重复性差，价格昂贵等难题。
发明内容
本发明的目的是，提供一种用于化学发光免疫检测的抗体检测液及外泌体检测试剂盒，主要解决现有技术中外泌体检测灵敏度低，重复性差，成本高的技术问题。
本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
一种用于化学发光免疫检测的抗体检测液，所述抗体检测液包含亲和素、化学发光标记物标记的生物素、抗体标记的生物素，所述亲和素含有4个生物素结合位点，其中一个位点与抗体标记的生物素结合、其他三个位点与化学发光标记物标记的生物素结合，通过所述抗体与目标物免疫结合从而实现对目标物的化学发光检测。
作为优选实施方案，所述亲和素为链霉亲和素，所述化学发光标记物为吖啶酯。
本发明还提供所述的抗体检测液的制备方法，包括如下步骤：
1)将生物素和抗体混合后孵育，透析过滤，得到抗体标记的生物素；
2)将抗体标记的生物素与链霉亲和素按(0.8-1.2)：1的摩尔比混合孵育，采用分子筛过滤掉链霉亲和素上连接多个抗体的复合分子，保留链霉亲和素上仅连接一个抗体的复合分子；
3)将吖啶酯与生物素混合孵育，获得吖啶酯标记的生物素；
4)将吖啶酯标记的生物素与步骤2)中的链霉亲和素连接一个抗体的复合分子按照(3-3.5)：1的摩尔比混合孵育，分子筛过滤，获得链霉亲和素上一个位点连接抗体、三个位点连接吖啶酯的抗体复合物；将该抗体复合物加入缓冲液中，即得到抗体检测液。
本发明还提供一种外泌体检测试剂盒，该试剂盒包含所述的抗体检测液。
作为优选实施方案，所述抗体检测液中的抗体为外泌体特异性蛋白CD9或CD81抗体，优选为CD9抗体。
作为优选实施方案，所述抗体检测液中的抗体与生物素、亲和素、化学发光标记物连接在一起组成化学发光物标记的抗体复合物，所述抗体复合物的浓度为0.01-0.05μg/mL。
作为优选实施方案，所述抗体检测液包括3-5g/L磷酸二氢钠、2-4g/L磷酸氢二钠、4-6g/L的氯化钠、4-6g/L的小牛血清蛋白、250-300mg/L鼠IgG、pH6.0-6.5，溶剂为水。
作为优选实施方案，所述试剂盒还包括：磁珠悬液、发光激发液、标准品、稀释液、洗涤液；所述磁珠悬液中的磁珠微球偶联有用以捕获外泌体的外泌体特异性蛋白。
作为优选实施方案，所述磁珠悬液的组成为：包被外泌体CD81/CD63抗体的磁珠微球，CD81/CD63抗体的浓度为4-8μg/mL，磁珠微球的浓度为0.5-1mg/mL，50-70mg/L嗜异性阻断剂HBR、8-9g/L氯化钠、5-7g/L Tris，质量体积比0.04-0.06％的叠氮化钠，pH 7.2-7.8，溶剂为水。
作为优选实施方案，所述发光激发液包括激发液A和激发液B，所述激发液A包含0.1～0.2M的HNO3和体积浓度为0.3～0.6％的H2O2，溶剂为水；所述激发液B包含0.25～0.5MNaOH，溶剂为水。
作为优选实施方案，所述标准品的组成为：2×1011～5×1011个外泌体/mL，0.0040～0.0045g/mL的NaH2PO4，0.020～0.023g/mL的Na2HPO4，0.174～0.180g/mL的NaCl，0.05-0.1g/mL的小牛血清蛋白，溶剂为水。
作为优选实施方案，所述稀释液包括0.0040～0.0045g/mL的NaH2PO4，0.020～0.023g/mL的Na2HPO4，0.174～0.180g/mL的NaCl，溶剂为水。
作为优选实施方案，所述洗涤液包括0.0040～0.0045g/mL的NaH2PO4，0.020～0.023g/mL的Na2HPO4，0.174～0.180g/mL的NaCl，体积百分比0.05％～0.07％的吐温-20，溶剂为水。
本发明采用化学发光免疫法定量检测外泌体的试剂盒，具体通过以下技术方案实现：
试剂包括：磁珠悬液、抗体检测液、激发液A、激发液B、标准品、稀释液、洗涤液。
所述磁珠悬液的制备方法包含以下步骤：
1)选择粒径为1～3μm的磁珠微球；
2)采用化学偶联法将外泌体特异性蛋白CD81/CD63抗体与磁珠微球偶联；其中，采用的化学偶联剂为N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐按摩尔比为1：1的混合物。
3)将10mg磁珠加入1mL含有2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物的缓冲液重悬，逐步添加60μL的10mg/mL N-羟基琥珀酰亚胺和10mg/mL1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐这两种交联剂，在混匀仪上反应30min。
4)向步骤3)加入220μg CD63，在混匀仪上反应2-3h，使磁珠和抗体在交联剂的作用下交联；
5)向步骤4)加入含有6g/L小牛血清蛋白、1.5g/L蔗糖、8g/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)和1％(v/v)吐温-20，pH7.3-7.8的缓冲液，封闭磁珠上未与抗体结合的位点。
6)向步骤5)加入含有50-70mg/L嗜异性阻断剂HBR、8-9g/L氯化钠、5-7g/L三羟甲基氨基甲烷Tris，0.05％的叠氮化钠，pH 7.2-7.8的磁珠稀释液洗涤磁珠，洗涤三遍，再采用磁珠稀释液重悬至磁珠的浓度为0.5mg-1mg/mL。
所述抗体检测液包含吖啶酯间接标记的CD9抗体，制备方法包含以下步骤：
1)将生物素和外泌体特异性蛋白CD9抗体按14：1的比例混合使之结合；
2)所述的生物素采用单臂生物素(LC-biotin)；
3)所述的生物素和外泌体特异性蛋白CD9抗体的孵育时间为30min-50min，之后采用透析法过滤掉未结合的生物素。
4)将生物素结合的CD9抗体与链霉亲和素按1：1混合，孵育时间为30min-50min；
5)采用特定的分子筛(PXC300C50 Millipore，300kDa)过滤掉链霉亲和素上连接多个CD9抗体的复合分子，只保留链霉亲和素上连接一个CD9抗体的复合分子。
6)将吖啶酯与生物素按照10：1的比例混合，孵育，过滤得到吖啶酯标记的生物素。
7)将步骤5)中得到的链霉亲和素上连接一个CD9抗体的复合分子与步骤6)得到的吖啶酯标记的生物素按1：3混合，混合孵育的缓冲液体系包含6g/L的Tris、8g/L氯化钠、15％的叠氮化钠。
8)步骤7)的混合连接产物(即吖啶酯标记的CD9抗体)采用含有3-5g/L磷酸二氢钠、2-4g/L磷酸氢二钠、4-6g/L的氯化钠、4-6g/L的小牛血清蛋白、250-300mg/L的鼠IgG、pH6.0-6.5的缓冲液稀释；
9)稀释后的吖啶酯标记的CD9抗体的浓度为0.01-0.05μg/mL。
所述激发液A包含浓度0.1～0.2M HNO3，浓度0.3～0.6％H2O2。
所述激发液B包含浓度0.25～0.5M NaOH。
所述标准品包含22R-V1细胞系培养上清液超速离心的获得的外泌体，采用NTA进行定量检测，标准品的终浓度选择2E+11～5E+11个外泌体/mL。
所述稀释液包括终浓度为0.0040～0.0045g/mL的NaH2PO4，0.020～0.023g/mL的Na2HPO4，0.174～0.180g/mL的NaCl；
所述洗涤液包括浓度为0.0040～0.0045g/mL的NaH2PO4，0.020～0.023g/mL的Na2HPO4，0.174～0.180g/mL的NaCl，0.05％～0.07％的吐温-20。吐温-20作为表面活性剂，可去除残留的蛋白及杂质。
一种利用上述试剂盒定量外泌体的方法，包括如下步骤：
1)将标准品，用稀释液稀释100倍，作为第一个浓度样品，然后从第一个浓度样品中取出400μL加入400μL稀释液作为第二个浓度样品，后续继续按2倍浓度梯度稀释，一共稀释7个。
2)向标准品和待测样本中加入磁珠悬液，充分混匀，37℃孵育30分钟；
3)将2)所得的混合液瞬离后置于磁力架上30s，弃掉上清；
4)将3)所得的混合物加入洗涤液充分混匀，瞬离后置于磁力架上30s，弃上清；
5)重复步骤4)两遍；
6)将5)所得的混合物加入抗体检测液，37℃孵育10分钟；
7)将6)所得的混合液瞬离后置于磁力架上30s，弃掉上清；
8)将7)所得的混合物加入洗涤液充分混匀，瞬离后置于磁力架上30s，弃上清；
9)重复步骤8)两遍；
10)向9)所得的混合物加入稀释液重悬；
11)向10)所得的混合液依次加入激发液A和激发液B；
12)将11)所得的混合液上化学发光仪检测。
本发明涉及的英文缩写注释如下：
NTA：纳米颗粒跟踪分析(Nanoparticle Tracking Analysis，NTA)
LC-Biotin：单臂生物素
Exosomes：外泌体
Tris三羟甲基氨基甲烷
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1，本发明所采用的方法为化学发光免疫夹心法，流程检单，可实现自动化操作。
2，本发明利用链霉亲和素为四聚体分子的性质，使一个CD9抗体分子可以桥接三个吖啶酯分子，将发光信号扩大三倍，提高了试剂盒的灵敏度。
3，本发明试剂盒采用外泌体特异性的CD81/CD63抗体捕获外泌体，CD9抗体检测外泌体，捕获效率高，降低了化学发光的本底效应，提高了试剂盒的灵敏度。
附图说明
图1是本发明实施例1中采用本发明检测方法的标准曲线。
图2是本发明实施例1中采用商业化ELISA试剂盒检测的标准曲线。
图3是本发明实施例2中采用本发明检测方法的标准曲线。
图4是本发明实施例2中采用NTA定量检测方法的标准曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。
实施例1本发明化学发光免疫定量试剂盒与商业化ELISA试剂盒的对比效果验证
设计对比试验，比较市面上外泌体定量ELISA试剂盒与本发明外泌体定量试剂盒对定量外泌体的稳定性，线性关系等。
取经超速离心获得的细胞系上清外泌体，均分为20份，各100μL；随机分为两组，每组10份，作为两种试剂盒的稳定性评估样本。
本发明外泌体定量试剂盒操作方法如下：
标准品包含22R-V1细胞系培养上清液超速离心的获得的外泌体，采用NTA进行定量检测，标准品的终浓度选择3×1011个外泌体/mL。
步骤一：将标准品用稀释液稀释100倍作为第一个浓度样品，稀释液中含有0.0040g/mL的磷酸二氢钠，0.023g/mL的磷酸氢二钠，0.180g/mL的氯化钠，PH7.5，溶剂为水。
然后从第一个浓度样品中取出400μL加入400μL稀释液作为第二个浓度样品，后续继续按2倍浓度梯度稀释，一共稀释7个，具体如表1所示。
表1
| Tube | 外泌体浓度 | 稀释倍数 | 标准品 | 稀释液 |
| 0 | 0 | Blank | - | 400 |
| 1 | 3E+09 | 100 | 10μL | 990μL |
| 2 | 1.5E+09 | 1:2 | 400μL(Tube1) | 400μL |
| 3 | 7.5E+08 | 1:4 | 400μL(Tube2) | 400μL |
| 4 | 3.75E+08 | 1:8 | 400μL(Tube3) | 400μL |
| 5 | 1.88E+08 | 1:16 | 400μL(Tube4) | 400μL |
| 6 | 9.38E+07 | 1:32 | 400μL(Tube5) | 400μL |
| 7 | 4.69E+07 | 1:64 | 400μL(Tube6) | 400μL |
步骤二：分别取100μL标准品和外泌体样本转至1.5mL离心管中，加入50μL磁珠，磁珠悬液中含有0.5mg/mL CD63抗体包被的磁珠微球、70mg/L嗜异性阻断剂HBR、8g/L氯化钠、5g/L三羟甲基氨基甲烷Tris，0.05％的叠氮化钠，pH 7.5；
充分混匀，37℃孵育30分钟；
步骤三：瞬离后置于磁力架上30s，弃掉上清；
步骤四：加入1mL洗涤液充分混匀，瞬离后置于磁力架上30s，弃上清，洗涤液中含有0.0042g/mL的磷酸二氢钠，0.021g/mL的磷酸氢二钠，0.174g/mL的氯化钠，0.05％％的吐温-20，PH7.4，溶剂为水，；
步骤五：重复步骤四2遍；
步骤六：加入50μL 0.05μg/mL的抗体检测液37℃孵育10分钟，抗体检测液中含有0.02μg/mL吖啶酯标记的CD9抗体、3g/L磷酸二氢钠、2g/L磷酸氢二钠、6g/L的氯化钠、6g/L的小牛血清蛋白、300mg/L的鼠IgG，pH6.5步骤七：瞬离后置于磁力架上30s，弃掉上清；
步骤八：加入1mL洗涤液充分混匀，瞬离后置于磁力架上30s，弃上清；
步骤九：重复步骤八2遍；
步骤十：加入400μL稀释液重悬；
步骤十一：所得的混合液依次加入100μL激发液A和激发液B，激发液A包含浓度0.1M HNO3，浓度0.3％H2O2；激发液B包含终浓度0.5M NaOH；
步骤十二：上SMART 6500化学发光仪检测吖啶酯发光值。
选择SBI的ExoELISA-ULTRA CD63 Kit(货号：EXEL-ULTRA-CD63-定量外泌体作为对比试验。
步骤一：先将ExoELISA-ULTRA蛋白标准品按1:1000稀释至离心管中(例如在1mLCoating Buffer中加入1uL standard)，旋涡混合均匀。作为标准曲线的第一个标准品样本。
步骤二：在离心管中连续稀释第一个标准品样本，每次稀释后，旋涡搅拌均匀，一共稀释7个，具体如表2所示。
表2
| Tube | 外泌体浓度 | 稀释倍数 | 标准品 | 稀释液 |
| 0 | 0 | Blank | - | 60μL |
| 1 | 4.56E+10 | 1 | 1000μL | - |
| 2 | 2.28E+10 | 1:2 | 60μL(Tube1) | 60μL |
| 3 | 1.14E+10 | 1:4 | 60μL(Tube2) | 60μL |
| 4 | 5.7E+09 | 1:8 | 60μL(Tube3) | 60μL |
| 5 | 2.9E+09 | 1:16 | 60μL(Tube4) | 60μL |
| 6 | 1.4E+09 | 1:32 | 60μL(Tube5) | 60μL |
| 7 | 7E+08 | 1:64 | 60μL(Tube6) | 60μL |
步骤三：向微量滴定板依次加入50μL新鲜制备的蛋白标准品(见上述方案)和外泌体样品；
步骤四：将微量滴定板用膜密封；
步骤五：37℃震荡孵育1小时；
步骤六：将微量滴定板翻转弃去液体；
步骤七：用100μl洗涤液清洗微量滴定板3次，每次5分钟。
步骤八：将CD63一抗用blocking buffer按1:100的比例稀释，各加入50μl；
步骤九：室温震荡孵育1小时；
步骤十：将微量滴定板翻转弃去液体；用100μl洗涤液清洗微量滴定板3次，每次5分钟。
步骤十一：将二抗用blocking buffer按1:5000的比例稀释，各加入50μl；
步骤十二：室温震荡孵育1小时；
步骤十三：将微量滴定板翻转弃去液体；用100μl洗涤液清洗微量滴定板3次，每次5分钟。
步骤十四：加入50μl超敏感TMB ELISA底物，室温震荡孵育15分钟；
步骤十五：加入50μl的stop buffer并立即于酶标仪上读取数值。
汇总上述两种方法对定量外泌体稳定性和线性关系进行比较。测试数据结果如表3所示。
表3
本发明检测方法的标准曲线如图1所示，商业化ELISA试剂盒检测的标准曲线如图2所示。由图1和图2可以看到，本发明方法定量外泌体的重复性和线性关系明显优于ExoELISA-ULTRA CD63 Kit，而且操作检单，可适用于自动化检测。
实施例2本发明的外泌体定量方法与NTA检测的对比效果验证
设计对比试验，比较外泌体经典定量方法NTA与本发明外泌体定量的差异。
取细胞系上清超速离心获得的外泌体，取8份不同浓度的外泌体样本，每个样本均分两份，一组(8个样本)采用本发明方法定量，另一组采用NanoSight NS300纳米颗粒跟踪分析仪定量。
本发明外泌体定量试剂盒操作方法如下：
步骤一：将标准品用稀释液稀释100倍作为第一个浓度样品，标准品中的外泌体浓度为5×1011个外泌体/mL，稀释液中含有0.0040g/mL的磷酸二氢钠，0.023g/mL的磷酸氢二钠，0.180g/mL的氯化钠，溶剂为水。
然后从第一个浓度样品中取出400ul加入400μL稀释液作为第二个浓度样品，后续继续按2倍浓度梯度稀释，一共稀释7个，具体如实施例1中的表1所示。
步骤二：取100μL标准品和外泌体样本转至1.5ml离心管中，加入50μL磁珠悬液，磁珠悬液中含有0.5mg/mL CD63抗体包被的磁珠微球、60mg/L嗜异性阻断剂HBR、6g/L氯化钠、5g/L三羟甲基氨基甲烷Tris，0.05％的叠氮化钠，pH 7.5；
充分混匀，37℃孵育30分钟；
步骤三：瞬离后置于磁力架上30s，弃掉上清；
步骤四：加入1mL洗涤液充分混匀，瞬离后置于磁力架上30s，弃上清，洗涤液中含有0.0042g/mL的NaH2PO4，0.021g/mL的Na2HPO4，0.174g/mL的NaCl，0.05％％的吐温-20，PH7.4，溶剂为水；
步骤五：重复步骤四，2遍；
步骤六：加入50μL 0.05μg/mL的抗体检测液，抗体检测液中含有0.05μg/mL吖啶酯标记的CD9抗体、3g/L磷酸二氢钠、2g/L磷酸氢二钠、6g/L的氯化钠、6g/L的小牛血清蛋白、300mg/L的鼠IgG，pH6.5，37℃孵育10分钟；
步骤七：瞬离后置于磁力架上30s，弃掉上清；
步骤八：加入1mL洗涤液充分混匀，瞬离后置于磁力架上30s，弃上清；
步骤九：重复步骤八，2遍；
步骤十：加入400μL稀释液重悬；
步骤十一：所得的混合液依次加入100μL激发液A和激发液B，激发液A包含浓度0.1M HNO3，浓度0.3％H2O2；激发液B包含终浓度0.5M NaOH；；
步骤十二：上SMART 6500化学发光仪检测吖啶酯发光值。
选择马尔文帕纳科NanoSight NS300纳米颗粒跟踪分析(NTA)仪的方法检测外泌体作为对比实验，方法如下：
步骤一：将准备好的8个不同浓度的外泌体样本各稀释至1mL，用0.2μm的滤膜过滤。
步骤二：将过滤好的外泌体悬液上机检测。测试数据结果如表4所示。
表4
本发明检测方法的标准曲线如图3所示，NTA定量检测的标准曲线如图4所示。由图3和图4可见，本发明方法的定量外泌体与外泌体定量的经典方法NTA的一致率非常高，且本发明的方法操作检单，不需要昂贵的仪器设备，适应于普通实验室。
上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。
Claims (13)
1.一种用于化学发光免疫检测的抗体检测液，其特征在于：所述抗体检测液包含亲和素、化学发光标记物标记的生物素、抗体标记的生物素，所述亲和素含有4个生物素结合位点，其中一个位点与抗体标记的生物素结合、其他三个位点与化学发光标记物标记的生物素结合，通过所述抗体与目标物免疫结合从而实现对目标物的化学发光检测。
2.如权利要求1所述的用于化学发光免疫检测的抗体检测液，其特征在于：所述亲和素为链霉亲和素，所述化学发光标记物为吖啶酯。
3.权利要求2所述的抗体检测液的制备方法，包括如下步骤：
1)将生物素和抗体混合后孵育，透析过滤，得到抗体标记的生物素；
2)将抗体标记的生物素与链霉亲和素按(0.8-1.2)：1的摩尔比混合孵育，采用分子筛过滤掉链霉亲和素上连接多个抗体的复合分子，保留链霉亲和素上仅连接一个抗体的复合分子；
3)将吖啶酯与生物素混合孵育，获得吖啶酯标记的生物素；
4)将吖啶酯标记的生物素与步骤2)中的链霉亲和素连接一个抗体的复合分子按照(3-3.5)：1的摩尔比混合孵育，分子筛过滤，获得链霉亲和素上一个位点连接抗体、三个位点连接吖啶酯的抗体复合物；将该抗体复合物加入缓冲液中，即得到抗体检测液。
4.一种外泌体检测试剂盒，其特征在于：包含权利要求1-2任一项所述的抗体检测液。
5.如权利要求4所述的一种外泌体检测试剂盒，其特征在于：所述抗体检测液中的抗体为外泌体特异性蛋白CD9或CD81抗体，优选为CD9抗体。
6.如权利要求4所述的一种外泌体检测试剂盒，其特征在于：所述抗体检测液中的抗体与生物素、亲和素、化学发光标记物连接在一起组成化学发光物标记的抗体复合物，所述抗体复合物的浓度为0.01-0.05μg/mL。
7.如权利要求6所述的一种外泌体检测试剂盒，其特征在于：所述抗体检测液包括3-5g/L磷酸二氢钠、2-4g/L磷酸氢二钠、4-6g/L的氯化钠、4-6g/L的小牛血清蛋白、250-300mg/L鼠IgG、pH6.0-6.5，溶剂为水。
8.如权利要求4所述的一种外泌体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：磁珠悬液、发光激发液、标准品、稀释液、洗涤液；所述磁珠悬液中的磁珠微球偶联有用以捕获外泌体的外泌体特异性蛋白。
9.如权利要求8所述的一种外泌体检测试剂盒，其特征在于，所述磁珠悬液的组成为：包被外泌体CD81/CD63抗体的磁珠微球，CD81/CD63抗体的浓度为4-8μg/mL，磁珠微球的浓度为0.5-1mg/mL，50-70mg/L嗜异性阻断剂HBR、8-9g/L氯化钠、5-7g/LTris，质量体积比0.04-0.06％的叠氮化钠，pH7.2-7.8，溶剂为水。
10.如权利要求8所述的一种外泌体检测试剂盒，其特征在于，所述发光激发液包括激发液A和激发液B，所述激发液A包含0.1～0.2M的HNO3和体积浓度为0.3～0.6％的H2O2，溶剂为水；所述激发液B包含0.25～0.5MNaOH，溶剂为水。
11.如权利要求8所述的一种外泌体检测试剂盒，其特征在于，所述标准品的组成为：2×1011～5×1011个外泌体/mL，0.0040～0.0045g/mL的NaH2PO4，0.020～0.023g/mL的Na2HPO4，0.174～0.180g/mL的NaCl，0.05-0.1g/mL的小牛血清蛋白，溶剂为水。
12.如权利要求8所述的一种外泌体检测试剂盒，其特征在于，所述稀释液包括0.0040～0.0045g/mL的NaH2PO4，0.020～0.023g/mL的Na2HPO4，0.174～0.180g/mL的NaCl，溶剂为水。
13.如权利要求8所述的一种外泌体检测试剂盒，其特征在于，所述洗涤液包括0.0040～0.0045g/mL的NaH2PO4，0.020～0.023g/mL的Na2HPO4，0.174～0.180g/mL的NaCl，体积百分比0.05％～0.07％的吐温-20，溶剂为水。
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|---|---|---|---|---|
| CN116718536A (zh) * | 2023-04-27 | 2023-09-08 | 河北意和医学检验实验室有限公司 | 一种活性外泌体定量检测方法及试剂盒 |
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