KR20130081206A - 표식화 프로브-수용성 담체 복합체 - Google Patents

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Abstract

<과제> 피험물질을 고감도이고 또 안정적으로 검출·측정을 행하기 위하여 사용하는 표식화 프로브-담체 복합체를 높은 재현성으로 제조한다.
<해결수단> 표식물과 프로브 수용성 담체의 결합에, 애비딘, 스트렙토애비딘 등의 애비딘류와 비오틴의 특이적 결합을 이용하고, 또 당해 애비딘류와 프로브의 결합을, 담체와의 결합에 선행하여 실시한다. 즉, 피험물질과 결합하는 물질과 애비딘류를 결합시킨 후에, 이 결합체와 고분자의 수용성 담체를 결합시켜서 애비딘화 프로브 수용성 담체 복합체를 작제하고, 이 애비딘화 프로브 수용성 담체 복합체에 비오틴화 표식물을 혼합하는 것에 의해, 애비딘류와 비오틴의 특이적 결합을 통하여, 피험물질을 고감도로 검출·측정할 수 있는, 안정한 표식화 프로브-수용성 담체 복합체를 재현성 좋게 얻는다.

Description

표식화 프로브-수용성 담체 복합체{Complex of labeled probe and water-soluble carrier}
본 발명은, 수용성 담체에 복수의 프로브를 결합시키고, 또한 표식물을 결합시킨 표식화 프로브-수용성 담체 복합체의 제작방법, 당해 방법에 의해 작제되는 표식화 프로브-수용성 담체 복합체, 및 그의 사용방법에 관한 것이다. 이 표식화 프로브-수용성 담체 복합체를 사용하는 것에 의해, 고감도이고 안정한 검출·측정을 행하는 것이 가능하게 된다.
피험물질과 특이적으로 결합하는 프로브와 표식물과의 결합물을 사용하여, 프로브를 통한 피험물질과 표식물의 결합량을 지표로 하여 피험물질을 검출·측정하는 방법에 있어서, 그 감도는 일반적으로 프로브 및 표식물의 분자수에 의해 결정된다. 즉, 1 분자의 프로브에 대하여 결합하는 표식물의 분자수는 한정되며, 그 비율이 감도를 결정한다.
그래서, 프로브 자체를 중합화시켜서 중합체를 작제하는 것에 의해 분자량을 크게 하고, 그의 중합체에 결합하는 표식물의 분자수를 많게 하는 것에 의해 반응성을 향상시킨 고감도화가 실시되었다(특허문헌 1). 그러나, 프로브의 중합화를 제어하는 것이 용이하지 않아, 실용화에는 이르고 있지 않다.
또, 폴리리진, 아미노덱스트란 등의 담체에 효소 표식물 및 프로브를 개별적으로 공유결합시켜서 분자량을 크게 하고, 표식물의 결합수가 많은 표식물 프로브 복합체가 제안되었다(특허문헌 2). 그러나, 본 기술에 의해 반응성은 증가하였지만, 블랭크치에서의 반응도 증가하여, 검출·측정을 행할 때의 고감도화에는 이르지 않고 있다.
또한, 폴리리진 등의 담체에 효소 표식물을 결합시키고, 담체 상의 표식물을 통하여 프로브를 결합시킨 표식물-프로브 복합체(특허문헌 3), 덱스트란 등의 담체에 프로브를 결합시키고, 담체 상의 프로브를 통하여 표식물을 결합시킨 수용성 담체-프로브 복합체(특허문헌 4), 담체에 친수성의 중개물질을 결합시키고, 중개물질 에 프로브 및 검출 마커의 표식물을 결합시킨 프로브 복합체(특허문헌 5), 산소 표식물을 통하여 2분자 이상의 담체를 결합시킨 복합체에 프로브를 결합시킨 블록화 표식물 프로브(특허문헌 6)가 제안되었다.
그러나, 상기 선행기술도, 반응성의 증가와 함께 블랭크치에서의 반응도 증가한다는 기술적 과제를 내포하고 있고, 시그널/노이즈비로서 반응성을 평가하는 경우, 고감도이고 또 안정한 복합체를 얻는 것은 곤란하였다. 또, 복합체 형성에 있어서, 담체와 프로브 또는 표식물의 결합을 최초로 행하면, 담체의 다관능성에 기인하여, 소망하는 복합체를 재현성 좋게 작제하는 것은 곤란하였다.
특허문헌 1: 특개평 11-295313호 공보 특허문헌 2: 특개 2000-88850호 공보 특허문헌 3: 특개 2001-181299호 공보 특허문헌 4: 특개 2003-194821호 공보 특허문헌 5: 국제공개 2006/011543호 특허문헌 6: 국제공개 2006/070732호
피험물질과 특이적으로 결합하는 프로브와 표식물의 결합물을 사용하여, 프로브를 통한 피험물질과 표식물의 결합량을 지표로 하여, 고감도로 피험물질을 검출·측정하기 위해서는, 1 분자의 프로브와 표식물의 결합물에 다량의 표식물이 포함되어 있지 않으면 안된다. 그 때문에, 대분자의 프로브와 표식물의 결합물을 작제할 필요가 있다.
그러나, 대분자의 결합물을 형성하기 위하여 담체를 사용한 경우, 반응성은증가하지만, 블랭크치에서의 반응도 증가하여, 결과로서 고감도이고 또 안정한 복합체를 얻는 것은 곤란하다. 또, 담체와 프로브 또는 표식물의 결합을 복합체 형성의 최초 단계로서 실시하면, 담체의 다관능성에 기인하여, 소망하는 복합체를 재현성 좋게 작제하는 것은 곤란하다. 그래서, 상기 과제를 해결하는 결합물 및 당해 결합물을 안정적으로 작제하는 방법이 기대된다.
본 발명자들은, 표식화 프로브 담체 복합체의 작제에 있어서의 프로브와 표식물의 결합에 있어서, 애비딘류와 비오틴과의 특이적 결합을 이용하는 것에 착안하고, 또 애비딘류와 프로브의 결합을, 담체와의 결합에 앞서 실시하는 것으로, 극히 고감도이고 또 안정한 복합체를 재현성 좋게 작제할 수 있는 것을 발견하였다. 이에 더하여, 화학 결합을 위하여 프로브의 화학수식을 행할 때에, 프로브에 티올기를 도입하는 것이, 프로브의 결합능에 영향을 주지 않는 것을 발견하고, 또한 담체로서 수용성 담체를 사용하는 것으로, 고감도이고 안정한 검출·측정에 유용한 표식화 프로브-수용성 담체 복합체를 구축하였다.
즉, 본 발명은, 이하의 공정을 포함하는, 표식화 프로브-수용성 담체 복합체의 제작방법에 관한 것이다.
공정 1. 티올기를 갖고 피험물질에 대하여 결합 가능한 프로브와, 말레이미드기를 갖는 애비딘류를 결합시켜서 프로브 결합으로 하고,
공정 2. 이어서 티올기를 갖는 상기 프로브 결합체와, 말레이미드기를 갖는 고분자의 수용성 담체를 결합시켜 프로브 결합체-수용성 담체 복합체로 하며,
공정 3. 또한 상기 프로브 결합체-수용성 담체 복합체와 비오틴화 표식물을 혼합하여, 프로브 결합체-수용성 담체 복합체의 애비딘류와 비오틴화 표식물의 비오틴을 결합시시킨다.
또, 본 발명은, 당해 공정에 의해 제작하는 표식화 프로브-수용성 담체 복합체에 관한 것이다.
또한, 본 발명은, 상기 공정에 의해 작제한 표식화 프로브-수용성 담체 복합체를 사용하는 측정법, 면역측정법 또는 고감도 측정법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 「프로브」라는 것은, 피험물질과 상호작용하는 결합 파트너를 의미하며, 비제한적인 예로서, 항체 또는 항체단편, 프로테인 G, 프로테인 A, 프로테인 L, 렉틴 또는 수용체 등을 들 수 있다. 또, 항체 또는 항체단편의 비제한적인 예로서, Fab', F(ab')2, Fab 또는 IgG 등을 들 수 있다.
또, 당해 항체 또는 항체단편으로서, 2종류 이상의 항체 또는 항체단편을 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 「애비딘류」라는 것은, 저분자의 염기성 당단백질의 애비딘, 그것에 유사한 단백질 또는 그의 단편 등, 비오틴 화합물과 안정된 복합체를 형성하는 것을 의미하고, 당해 「애비딘류」의 비제한적인 예로서, 애비딘 또는 스트렙토애비딘 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 「수용성 담체」는, 분자량이 50만 이상인 것이 바람직하다. 본 발명의 수용성 담체의 비제한적인 예로서, 덱스트란, 아미노덱스트란, 덱스트린, 크러스트 덱스트린, 피콜 또는 푸르란 등을 들 수 있다.
본 발명에서는「비오틴화 표식물」을 사용한다. 여기서「비오틴」은, 비타민 B 복합체의 하나이고, 애비딘과 매우 강하게 결합하는 것이 알려져 있는 것이다. 본 발명에 있어서의「비오틴화 표식물」의 비제한적인 예로서, 비오틴화 루시페라제, 비오틴화 알칼리 포스포타제, 비오틴화 POD(peroixdase), 비오틴화 GOD(glucose oxidase), 비오틴화 FITC(fluorescein　isothiocyanate), 비오틴화 아크리디늄, 비오틴화 아크리디늄 유도체 또는 비오틴화 트리스(2,2' 비피리딜) 루테늄(II) 등을 들 수 있다. 당해 「비오틴화 표식물」에 있어서의 비오틴과 표식물의 결합에는, 화학 수식 등을 포함하는 이미 알려진 어떤 수단도 이용할 수 있지만, 특히 유전자조합을 이용하는 것이 바람직하다. 왜냐하면, 화학결합을 위한 화학수식을 하지 않는 점에서, 그의 표식물의 활성을 저하시키지 않기 때문이다.
본 발명에 관한 공정 1에 있어서는, 먼저 피험물질에 대하여 결합 가능한 프로브가 충분한 티올기를 갖고 있지 않은 경우, 당해 프로브에 티올기를 도입한다. 티올기의 도입에는 기존에 공지된 어떤 방법이라도 이용할 수 있지만, 프로브가 항체 또는 항체단편인 경우, 2-머캅토에탄올 등의 환원제를 사용하여, 내재하는 디술피드 결합을 환원하는 것에 의해 티올기를 도입하는 것은, 프로브의 결합능에 대한 영향을 최소한화 할 수 있기 때문에, 특히 유리하다.
이어서, 애비딘류로 말레이미드기를 도입한다. 말레이미드기의 도입에는, 기지의 어떤 방법도 이용할 수 있지만, 예컨대 Sulfo-KMUS(동인화학사 제조)라고 하는 기지의 말레이미드 시약을 사용할 수 있다.
티올기를 갖고 피험물질에 대하여 결합 가능한 프로브와 말레이미드기를 갖는 애비딘류와의 결합에는, 기지의 어떤 방법도 이용할 수 있다. 예컨대, 프로브 및 애비딘류를 각각 적절한 농도에 있어서 완충액에서 용해시키고, 당해 용해액을 반응시키는 것으로 결합 반응을 실시할 수 있다. 또, 이후의 공정에 있어서의 비특이 반응을 회피하기 위하여, 상기 결합 반응 종료 후, 2-머캅토에탄올 등의 티올 시약을 사용하여 미반응의 말레이미드기를 블록할 수 있다. 블록 후의 프로브 애비딘류결합체는, 겔 여과 등의 기지의 방법에 의해 정제할 수 있다.
본 발명에 관한 공정 2에 있어서는, 먼저 공정 1에 있어서 작제된 프로브 애비딘류 결합체에 티올기를 도입한다. 티올기의 도입에는, 예컨대, 2-이미노티올란을 사용한다고 하는, 기지의 어떤 방법도 이용할 수 있다.
수용성 담체로의 말레이미드기의 도입은, 기지의 어떤 방법도 이용할 수 있다. 예컨대, 수용성 담체를 산과 반응시키는 것에 의해, 카복실기를 도입하고, 당해 산을 투석 등에 의해 제거한 후, 에틸렌디아민 등의 기지의 아미노기 도입 시약을 사용하여, 카복실기를 아미노기로 치환한다. 치환 후, 투석 등에 의해 미반응의 아미노기 도입 시약을 제거하고, 기지의 말레이미드 시약을 부가 반응시키는 것에 의해, 말레이미드기를 갖는 수용성 담체를 얻을 수 있다.
티올기를 갖는 프로브 애비딘류 결합체와 말레이미드기를 갖는 수용성 담체와의 결합에는, 기지의 어떤 방법도 이용할 수 있다. 또, 이후의 공정에 있어서의 비특이 반응을 회피하기 위하여, 결합 반응 종료 후, 2-머캅토에탄올 등의 티올 시약을 사용하여 수용성 담체에 도입한 미반응의 말레이미드기를 블록하는 것이 바람직하다. 블록 후의 프로브 결합체-수용성 담체 복합체는, 겔 여과 등의 기지의 방법에 의해 정제할 수 있다.
본 발명에 관한 공정 3에 있어서는, 상기 프로브 결합체-수용성 담체 복합체를 비오틴화 표식물과 혼합하는 것에 의해, 프로브 결합체-수용성 담체 복합체의 애비딘류와 비오틴화 표식물의 비오틴을 결합시킨다. 상기와 같이, 애비딘류와 비오틴의 친화성은 매우 강하기 때문에, 예컨대, 프로브 결합체-수용성 담체 복합체및 비오틴화 표식물을 각각 적절한 농도로 제조하고, 당해 제조액을 혼합하는 것에 의해, 당해 애비딘류와 비오틴과의 결합 반응을 실시할 수 있다.
본 발명에 관한 공정에 의해 작제된 표식화 프로브-수용성 담체 복합체는, 당해 프로브가 표적으로 하는 피험물질과 고감도, 또 안정적으로 반응하기 때문에, 기지의 어떤 측정법에 있어서 이용할 수 있다. 또, 당해 프로브가 항체 또는 항체단편인 경우, 본 발명에 관한 표식화 프로브-수용성 담체 복합체는, 기지의 어떤 면역측정법에 있어서 이용할 수 있다.
또한, 본 발명에 관한 공정에 의해 작제된 표식화 프로브-수용성 담체 복합체는 장기간 보존 후에 있어서도 극히 안정하다. 37℃에서 1주간의 가속 안정성 시험하에 있어서도, 그의 경시적 안정성을 유지하고 있었다.
본 발명을, 일례로서 비오틴화 표식물에 비오틴화 루시페라제를, 프로브로서 Fab'를, 애비딘류로서 스트렙토애비딘을, 수용성 담체로서 덱스트란(T2000)을 각각 사용하여 설명하지만, 본예에 한정되는 것은 아니다.
IgG 항체를 펩신 소화시켜 얻은 F(ab')2에 2-머캅토에탄올을 가하여 환원처리한 후에 겔 여과에 의해 정제하여, 티올기를 갖는 Fab'를 얻는다.
한편, 스트렙토애비딘에 말레이미드기를 도입하는 시약을 가하여 처리한 후에 겔 여과에 의해 정제하여, 말레이미드기를 도입한 스트렙토애비딘을 얻는다.
상술한 방법으로 얻은 티올기를 도입한 Fab' 및 말레이미드기를 도입한 스트렙토애비딘을 혼합하여 반응시킨 후에 2-머캅토에탄올을 첨가하여 미반응의 말레이미드기를 블록하고, 겔 여과에 의해 정제하여 Fab'-스트렙토애비딘 결합체를 얻는다.
얻어진 Fab'-스트렙토애비딘 결합체에 2-이미노티올란을 가하여 반응시킨 후에 겔 여과에 의해 정제하여, 티올기를 도입한 Fab'-스트렙토애비딘 결합체를 얻는다.
덱스트란(T2000)에 아미노기를 도입한 아미노덱스트란을 작제하고, 또한 말레이미드 시약을 가하여 반응시킨 후에 겔 여과에 의해 정제하여, 말레이미드기를 도입한 덱스트란(T2000)을 얻는다.
상술한 방법으로 얻은 티올기를 도입한 Fab'-스트렙토애비딘 결합체 및 말레이미드기를 도입한 덱스트란(T2000)을 혼합하여 반응시킨 후에 2-머캅토에탄올을 첨가하여 미반응의 말레이미드기를 블록하고, 겔 여과에 의해 정제하여 Fab'-스트렙토애비딘 결합체-덱스트란 복합체를 얻는다.
얻어진 Fab'-스트렙토애비딘 결합체-덱스트란(T2000) 복합체와 비오틴화 루시페라제를 혼합하여 반응시켜, 루시페라제 표식 Fab'-덱스트란(T2000) 복합체를 얻는다.
얻어진 루시페라제 표식 Fab'-덱스트란(T2000) 복합체를 표식 항체로서 사용하고, 별도로 준비한 항체를 고정화한 고상과 조합하여 샌드위치 이뮤노 에세이를 실시하면, 고감도의 검출·측정법이 완성된다.
이론에 구속되는 것을 의도하는 것은 아니지만, 본 발명에 의해, 종래와 비교하여, 극히 고감도이고 또 안정한 표식화 프로브-수용성 담체 복합체가 재현성 좋게 얻어지는 것은, 프로브와 표식물의 결합을, 애비딘류와 비오틴과의 높은 친화성을 통하여 실시한 것, 또 당해 프로브와 애비딘류와의 결합을, 담체와의 결합에 선행하여 실시한 것에 주로 기인하는 것으로 추정된다. 프로브와 애비딘류과의 결합, 및 애비딘류와 비오틴과의 결합은, 그의 결합에 관한 분자수 비 등을 제어하기 쉽고, 따라서 동등의 구조를 갖는 표식화 프로브-수용성 담체 복합체를 재현성 좋게 안정적으로 작제할 수 있을 것이다. 또, 이와 같이 안정적으로 작제된 표식화 프로브-수용성 담체 복합체는, 노이즈를 구성하는 비특이적 반응을 상대적으로 억제하면서 시그널을 구성하는 특이적 반응만을 증가시키는 것에 극히 적합한 구조를 갖는 것으로 생각된다.
본 발명을 실시하는 것에 의해, 피험물질과 특이적으로 결합하는 고감도이고 또 안정한 표식화 프로브-수용성 담체 복합체가 재현성 좋게 얻어지며, 이 표식화 프로브-수용성 담체 복합체를 사용하는 것에 의해, 고감도이고 또 안정한 검출·측정이 가능하게 된다.
도 1은 IgG-스트렙토애비딘 결합체-덱스트란(T2000) 복합체의 용출 패턴이다.
도 2는 Fab'(c11-9＋c11-14)-스트렙토애비딘 결합체-덱스트란(T2000) 복합체의 용출 패턴이다.
도 3은 Fab'(c11-9)-스트렙토애비딘 결합체-덱스트란(T2000) 복합체의 용출 패턴이다.
도 4는 Fab'(c11-14)-스트렙토애비딘 결합체-덱스트란(T2000) 복합체의 용출 패턴이다.
도 5는 Fab'(c11-9＋c11-14)-스트렙토애비딘 결합체-덱스트란(T500) 복합체의 용출 패턴이다.
도 6은 FITC 표식 Fab'와 FITC 표식 Fab'-덱스트란 복합체의 반응성의 비교이다.
발명을 실시하기 위한 형태
피험물질과 특이적으로 결합하는 프로브를 고정화한 불용성 담체와 검체를 반응시킨 후에 검체를 제거 세정하고, 그 후에 표식화 프로브-수용성 담체 복합체를 가하여 반응시켜, 다시 제거 세정한 후에 불용성 담체 상의 표식물의 활성을 측정하는 것에 의해, 검체 중의 피험물질의 검출·측정을 실시한다.
실시예 1
환원처리에 의한 티올기를 갖는 IgG 의 제조
항HCV 코어 항원 마우스 모노클로날 IgG 항체 c11-9 및 c11-14를 0.1M 인산 완충액(pH 7.2)에 용해시켜, 각각 5 mg/mL의 용액을 제조하였다. 이들의 IgG 용액300μL에 0.2M의 2-머캅토에탄올(와코우쥰야꾸샤 제조) 30μL를 첨가하고, 37℃에서 1.5 시간 반응시켰다. 반응 후, PD-10(GE 헬쓰케어사 제조)으로 겔 여과 정제하여, 항체에 내재하는 디술피드 결합을 환원하여 얻을 수 있는 티올기를 갖는 IgG를얻었다. 각각의 티올기의 수를 정량한 결과, IgG 1개 분자당 8.0개의 티올기의 존재가 확인되었다.
실시예 2
환원처리에 의한 티올기를 갖는 Fab' 의 제조
항 HCV 코어 항원 마우스 모노클로날 IgG 항체 c11-9 및 c11-14를 0.1M 아세트산 소다 완충액(pH 4.5)에 10 mg/mL로 되도록 제조하였다. 이어서, 이들의 IgG 용액 1mL에 대하여 펩신 0.2mg을 첨가하고, 37℃에서 6시간 교반하는 것에 의해 IgG를 펩신 소화시켰다. 펩신 소화 후, 2N　NaOH에 의해 중화시키고, 또한 Superdex 200컬럼(GE 헬쓰케어사 제조)으로 정제하는 것에 의해 F(ab')2를 얻었다.
각각 3.0 mg/mL의 F(ab')2 1300μL에 0.2M의 2-머캅토에탄올(와코우쥰야꾸사 제조) 130μL를 첨가하고, 37℃에서 1.5시간 반응시켰다. 반응 후, PD-10(GE 헬쓰케어사 제조)으로 겔 여과 정제하여, 항체에 내재하는 디술피드 결합을 환원하여 얻을 수 있는 티올기를 갖는 Fab'를 얻었다. 각각의 티올기의 수를 정량한 결과, c11-9에서는 Fab' 1개 분자당 3.3개, c11-14에서는 Fab' 1개 분자당 3.4개의 티올기의 존재가 확인되었다.
실시예 3
스트렙토애비딘으로의 말레이미드기의 도입
20mg의 스트렙토애비딘(MP Bio사 제조)을 0.1M 인산 완충액(pH 7.2) 2mL에 용해시키고, 디메틸포름아미드에 6 mg/mL로 되도록 용해시킨 말레이미드 시약 Sulfo-KMUS(동인화학사 제조) 133μL를 가하였다. 30℃에서 1시간 반응시킨 후, PD-10(GE 헬쓰케어사 제조)으로 겔 여과 정제하여, 말레이미드기를 도입한 스트렙토애비딘을 얻었다. 말레이미드기의 수를 정량한 결과, 스트렙토애비딘 1개 분자당 3.7개의 말레이미드기의 존재가 확인되었다.
실시예 4
IgG - 스트렙토애비딘 결합체의 작제
실시예 1에서 작제된 c11-9 및 c11-14의 티올기를 도입한 IgG를 0.1M 인산 완충액(pH 7.2)에 용해시켜, 각각 2.5 mg/mL의 티올기를 도입한 IgG 용액을 제조하였다. 한편, 실시예 3에서 작제된 말레이미드기를 도입한 스트렙토애비딘을 0.1M인산 완충액(pH 7.2)에 용해시키고, 13.0 mg/mL의 말레이미드기를 도입한 스트렙토애비딘 용액을 제조하였다.
이어서, 각각의 티올기를 도입한 IgG 용액 500μL에 대하여, 말레이미드기를 도입한 스트렙토애비딘 용액 38 μL를 첨가하고, 30℃에서 1시간 반응시켰다. 반응 후, 0.2M의 2-머캅토에탄올(와코우쥰야꾸사 제조) 54μL를 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 반응시켜, 미반응의 말레이미드기를 블록하였다. 반응 후, Superdex 200 컬럼 (GE 헬쓰케어사 제조)으로 겔 여과 정제하여, IgG-스트렙토애비딘 결합체를 얻었다.
실시예 5
루시페라제 표식 IgG 의 작제
실시예 4에서 작제된 10μM의 c11-9 및 c11-14의 IgG-스트렙토애비딘 결합체50μL에 대하여, 61μM의 비오틴화 루시페라제(키코만사 제조) 8.2μL 가하여, 25℃에서 1시간 반응시키는 것에 의해 루시페라제 표식 IgG를 작제하였다.
실시예 6
Fab' - 스트렙토애비딘 결합체의 작제
실시예 2에서 작제한 c11-9 및 c11-14의 티올기를 도입한 Fab'를 0.1M 인산 완충액(pH 7.2)에 용해시켜, 각각 2.6 mg/mL의 티올기를 도입한 Fab' 용액을 제조하였다. 한편, 실시예 3에서 작제된 말레이미드기를 도입한 스트렙토애비딘을 0.1M 인산 완충액(pH 7.2)에 용해시키고, 13.0 mg/mL의 말레이미드기를 도입한 스트렙토애비딘 용액을 제조하였다.
이어서, 각각의 티올기를 도입한 Fab' 용액 1400μL에 대하여, 말레이미드기를 도입한 스트렙토애비딘 용액 365μL를 첨가하고, 30℃에서 1시간 반응시켰다. 반응 후, 0.2M의 2-머캅토에탄올(와코우쥰야꾸사 제조) 177μL를 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 반응시켜, 미반응의 말레이미드기를 블록하였다. 반응 후, Superdex 200컬럼(GE 헬쓰케어사 제조)으로 겔 여과 정제하여, Fab'-스트렙토애비딘 결합체를 얻었다.
실시예 7
루시페라제 표식 Fab' 의 작제
실시예 6에서 작제한 26.4μM의 c11-9 및 c11-14의 Fab'-스트렙토애비딘 결합체 10μL에 대하여, 61μM의 비오틴화 루시페라제(키코만사 제조) 4.3μL 부가하고, 25℃에서 1시간 반응시키는 것에 의해, 루시페라제 표식 Fab'를 작제하였다.
실시예 8
아미노기를 도입한 덱스트란으로의 말레이미드기의 도입
덱스트란(T2000) 및 덱스트란(T500) 각각 2ｇ과 모노클로로아세트산 4.7ｇ을 50mL의 3N　NaOH 용액에 용해시키고, 실온에서 70분간 교반하는 것에 의해 덱스트란(T2000) 및 덱스트란(T500)에 카복실기를 도입하였다. 이어서, 인산 이수소 나트륨 0.2ｇ을 첨가하고, 6N　HCl로 혼합액을 중화하는 것에 의해 반응을 정지시키고, 투석에 의해 미반응의 모노클로로아세트산을 제거하였다.
투석 후, 16.4ｇ의 에틸렌디아민과 1.2ｇ의 1-에틸-3-(3-디메틸아미노 프로필)카보디이미드를 첨가하고, 실온에서 4시간 교반하는 것에 의해 덱스트란(T2000)및 덱스트란(T500)에 도입한 카복실기를 아미노기로 변환하였다. 이어서, 투석에 의해 미반응의 에틸렌디아민과 카보디이미드를 제거하고, 동결건조하는 것에 의해 아미노덱스트란(T2000) 및 아미노덱스트란(T500)을 회수하였다.
아미노덱스트란(T2000) 및 아미노덱스트란(T500) 각각 1.5mg을 0.1M 인산 완충액(pH 7.2) 3mL에 용해시키고, 디메틸포름아미드 중에 12 mg/mL로 용해시킨 말레이미드 시약 Sulfo-KMUS(동인화학사 제조)를 30μL 첨가하고, 37℃에서 30분간 반응시켰다. 반응 후, PD-10(GE 헬쓰케어사 제조)으로 겔 여과 정제하여, 말레이미드기를 도입한 아미노덱스트란(T2000) 및 아미노덱스트란(T500)을 얻었다. 말레이미드기 수를 정량한 결과, 덱스트란(T2000) 1개 분자당 294개, 덱스트란(T500) 1개 분자당 65개의 말레이미드기의 존재가 확인되었다.
실시예 9
IgG - 스트렙토애비딘 결합체- 덱스트란 복합체의 작제
실시예 4에서 작제한 c11-9 및 c11-14의 IgG-스트렙토애비딘 결합체 각각을 0.1M 인산 완충액(pH 7.2)에서 용해시켜 2.5 mg/mL의 용액으로 하고, 등량 혼합하여 IgG-스트렙토애비딘 결합체 용액을 제조하였다.
이 IgG-스트렙토애비딘 결합체 용액 264μL 에 대하여, 디메틸포름아미드에 1 mg/mL로 되도록 용해시킨 2-이미노티올란(PIERCE사 제조)을 2μL 첨가하고, 30℃에서 30분간 반응시켰다. 반응 후, PD-10(GE 헬쓰케어사 제조)으로 겔 여과 정제하여, 티올기를 도입한 IgG-스트렙토애비딘 결합체를 얻었다. 티올기의 수를 정량한 결과, IgG-스트렙토애비딘 결합체 1개 분자당 4.8개의 티올기의 존재가 확인되었다.
이어서, 실시예 8에서 작제된 0.625μM의 말레이미드기를 도입한 아미노덱스트란(T2000) 용액 40μL에 8.6μM의 티올기를 도입한 IgG-스트렙토애비딘 결합체290μL를 혼합하고, 30℃에서 1시간 정치하였다. 그 후, 0.2M의 2-머캅토에탄올(와코우쥰야꾸사 제조) 33 μL를 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 반응시켜, 미반응의 말레이미드기를 블록하였다. 반응 후, Superdex 200 컬럼(GE 헬쓰케어사 제조)으로 겔 여과 정제하여, 도 1에 도시하는 보이드 피크 분획으로부터 IgG-스트렙토애비딘 결합체-덱스트란(T2000) 복합체를 얻었다.
실시예 10
IgG - 스트렙토애비딘 결합체- 덱스트란 복합체로의 비오틴화 루시페라제의 도입
실시예 9에서 작제한 IgG-스트렙토애비딘 결합체-덱스트란(T2000) 복합체를, IgG-스트렙토애비딘 결합체 농도로서 570 nM으로 되도록 0.1M 인산 완충액(pH 7.2)을 사용하여 제조하였다. 이 IgG-스트렙토애비딘 결합체-덱스트란(T2000) 복합체 용액 300μL에 대하여, 61μM의 비오틴화 루시페라제(키코만사 제조) 용액 3.0μL를 가하고, 25℃에서 1시간 반응시키는 것에 의해, 루시페라제 표식 IgG-덱스트란(T2000) 복합체를 얻었다.
실시예 11
Fab' - 스트렙토애비딘 결합체- 덱스트란 복합체의 작제
실시예 6에서 작제한 4.0 mg/mL의 c11-9Fab'-스트렙토애비딘 결합체 420 μL및 2.6 mg/mL의 c11-14Fab'-스트렙토애비딘 결합체 646 μL에 대하여, 디메틸포름아미드에 1 mg/mL로 되도록 용해시킨 2-이미노티올란(PIERCE사 제조)을 2 μL 첨가하고, 30℃에서 30분간 반응시켰다.
반응 후, PD-10(GE 헬쓰케어사 제조)에 의해 겔 여과 정제하여, 티올기를 도입한 각각의 Fab'-스트렙토애비딘 결합체를 얻었다. 티올기의 수를 정량한 결과, c11-9Fab'-스트렙토애비딘 결합체 1개 분자당 4.6개, c11-14Fab'-스트렙토애비딘 결합체 1개 분자당 3.0개의 티올기의 존재가 확인되었다.
이어서, 실시예 8에서 작제한 말레이미드기를 도입한 아미노덱스트란(T2000)및 (T500)과 티올기를 도입한 Fab'-스트렙토애비딘 결합체를 혼합하고, 30℃에서 1시간 정치하였다. 말레이미드기를 도입한 각각의 아미노덱스트란과 티올기를 도입한 각각의 Fab'-스트렙토애비딘 결합체는 이하에 나타낸 바와 같은 농도, 액량으로 조합하여, 합계 4 종류의 중합체를 작제하였다.
1) c11 -9 및 c11 -14를 혼합한 Fab' - 스트렙토애비딘 결합체- 덱스트란 ( T2000 ) 복합체
21μM의 티올기를 도입한 c11-9Fab'-스트렙토애비딘 결합체 200μL, 18μM의 티올기를 도입한 c11-14Fab'-스트렙토애비딘 결합체 240μL, 및 0.625μM의 말레이미드기를 도입한 아미노덱스트란(T2000) 142 μL를 혼합하였다.
2) c11 -9 Fab' - 스트렙토애비딘 결합체- 덱스트란 ( T2000 ) 복합체
21μM의 티올기를 도입한 c11-9Fab'-스트렙토애비딘 결합체 200μL 및 0.625μM의 말레이미드기를 도입한 아미노덱스트란(T2000) 71 μL를 혼합하였다.
3) c11 -14 Fab' - 스트렙토애비딘 결합체- 덱스트란 ( T2000 ) 복합체
18μM의 티올기를 도입한 c11-14Fab'-스트렙토애비딘 결합체 240 μL 및 0.625μM의 말레이미드기를 도입한 아미노덱스트란(T2000) 71 μL를 혼합하였다.
4) c11 -9 및 c11 -14를 혼합한 Fab' - 스트렙토애비딘 결합체- 덱스트란 ( T500 ) 복합체
21μM의 티올기를 도입한 c11-9Fab'-스트렙토애비딘 결합체 200μL, 18μM의 티올기를 도입한 c11-14Fab'-스트렙토애비딘 결합체 240μL, 및 2.5μM의 말레이미드기를 도입한 아미노덱스트란(T500) 116μL를 혼합하였다.
반응 후, 0.2M의 2-머캅토에탄올(와코우쥰야꾸사 제조)을 각각의 복합체 용액의 1/10량 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 반응시켜, 미반응의 말레이미드기를 블록하였다. 다음날, Superdex 200 컬럼(GE 헬쓰케어사 제조)으로 겔 여과 정제하여, 도 2~5에 도시하는 각 샘플의 보이드 피크 분획으로부터 Fab'-스트렙토애비딘 결합체-덱스트란 복합체를 얻었다.
실시예 12
Fab' - 스트렙토애비딘 결합체- 덱스트란 복합체로의 비오틴화 루시페라제의 도입
실시예 11에서 작제한 4종류의 Fab'-스트렙토애비딘 결합체-덱스트란 복합체를, Fab'-스트렙토애비딘 결합체 농도로서 1.8μM으로 되도록 0.1M 인산 완충액(pH 7.2)에서 제조하였다. 이들의 Fab'-스트렙토애비딘 결합체-덱스트란 복합체 용액 100μL에 대하여, 61μM의 비오틴화 루시페라제(키코만사 제조) 3.0μL를 첨가하고, 25℃에서 1시간 반응시키는 것에 의해, 이하에 나타내는 4종류의 루시페라제 표식 Fab'-덱스트란 복합체를 작제하였다.
1) 루시페라제 표식 c11-9·c11-14Fab'-덱스트란(T2000) 복합체
2) 루시페라제 표식 c11-9Fab'-덱스트란(T2000) 복합체
3) 루시페라제 표식 c11-14Fab'-덱스트란(T2000) 복합체
4) 루시페라제 표식 c11-9·c11-14Fab'-덱스트란(T500) 복합체
실시예 13
루시페라제 표식 항체를 사용한 산소 면역측정
WSC를 사용한 카보디이미드법에 의해, 항 HCV 코어 항원 마우스 모노클로날 항체 c11-3, c11-7, 및 AOT3을 자성입자에 고정화하여, 0.2% 항체 고상화 자성입자를 작제하였다. 한편, 정상 인간 혈청 및 PCR로 확인된 2종류의 HCV 양성 혈청 100μL와 검체 처리액(6M 염산 구아니딘, 0.5N HCl, 12.5% TritonX 100, 0.75% Tween 20) 100μL를 혼합하고, 37℃에서 15분간 방치하는 것에 의해 검체의 전처리를 실시한 후, 반응액(0.1M 인산 나트륨, 0.15M　NaCl, 1% BSA, 0.5% 카제인, 0.05% Tween 20, pH 7.3) 140μL와 1M 트리스 완충액 20μL를 혼합하고, 이 혼합액 160μL에 전처리 검체 80 μL를 가하는 것에 의해, 전처리 검체를 중화시켰다.
이어서, 중화된 전처리 검체 240μL에 0.2% 항체 고상화 자성입자를 20 μL첨가하고, 37℃에서 15분간 방치하는 것에 의해 1차 반응을 일으켰다. 반응 후, 자성입자를 세정액에 의해 3회 세정하고, 실시예 5에서 작제한 루시페라제 표식 IgG및 실시예 10에서 작제한 루시페라제 표식 IgG-덱스트란(T2000) 복합체를 첨가하였다. 표식 항체의 양은, 루시페라제 농도로서 18nM로 희석한 것을 120 μL 가하고, 교반 후 또한 37℃에서 15분간 반응시켰다. 반응 후, 자성입자를 세정액으로 3회 세정하고, 50mM 트리스 완충액(pH 8.5) 100μL에 재현탁시켰다.
자성입자를 재현탁시킨 튜브에 기질 용액(루시페린) 100μL를 가하고, 루맛트 LB 9507(베루토루드사 제조)을 사용하여 루시페라제의 발광을 측정하였다. 발광측정은, 루시페린 첨가 0.5초 후부터 5초간의 발광을 적산하였다. 그 결과, 표 1에 나타내는 바와 같이, 루시페라제 표식 IgG 보다도 루시페라제 표식 IgG-덱스트란(T2000) 복합체 쪽이 높은 발광치를 나타내었다. 패널 검체 M의 S/N비로부터 어림잡으면, 약 50~100배 정도, 반응성이 향상하고 있는 것으로 추측되었다.
Figure pct00001
실시예 14
루시페라제 표식 항체 단편을 사용한 산소 면역측정
표식 항체로서 실시예 7 및 실시예 12에서 작제한 것을 사용한 이외는, 실시예 13과 동일한 방법으로 실시하였다. 그 결과, 표 2에 나타내는 바와 같이, 루시페라제 Fab' 표식 보다도 루시페라제 표식 Fab'-덱스트란(T2000) 복합체 또는 루시페라제 표식 Fab'-덱스트란(T500) 복합체 쪽이 높은 발광치를 나타내고, IgG의 경우와 동일하게 중합화하는 것에 의해 50~100배 정도 반응성이 향상하고 있는 것이 확인되었다. 또, c11-9 또는 c11-14 항체 단편을 개별적으로 중합화한 경우도 반응성의 향상은 보였지만, 양자를 조합하는 것에 의해 또한 반응성이 향상하는 것이 확인되었다.
Figure pct00002
실시예 15
기존의 프로브 복합체 작제 방법을 응용하여 작제한 중합화 표식 항체와의 성능 비교
기존의 프로브 복합체 작제 방법을 응용한 중합화 표식 항체의 작제
국제공개 2006/011543에 기재된 방법을 응용하여 프로브 복합체를 작제하였다. 먼저, 덱스트란(T2000) 44mg을 칭량하고, 0.1M 인산 완충액(pH 7.0) 0.8mL에 용해시키고, 과요오드산나트륨 용액을 0.4mL 첨가 혼합하였다. 실온에서 2시간 반응시킨 후, 겔 여과 (PD-10；GE 헬쓰케어사 제조)에 의해 서서히 과요오드산 나트륨을 제거하고, 스트렙토애비딘(SA) 용액과 CAPS 용액(10%)을 첨가하여 실온에서 5시간 반응시키는 것에 의해, 덱스트란에 스트렙토애비딘을 도입하였다. 또한, 반응산물의 안정화를 위하여, 디메틸아민 보레이트(DMBA: 생화학공업사 제조) 1mg과 1M 트리스 용액 0.4mL를 첨가 혼합하여 실온에서 하룻밤 반응시켰다. 그 후, 겔 여과(Sephacryl　S-300HR　1.6ｘ30; GE 헬쓰케어사 제조)에 의해 반응 산물을 정제하여, 덱스트란-SA 결합물을 얻었다. 이어서, 0.1M 인산 완충액(pH 7.0)을 사용하여 덱스트란-SA 결합물을 2 mg/mL으로 되도록 제조하고, 이 덱스트란-SA 결합물 용액0.5mL에 대하여, 디메틸포름아미드에서 10 mg/mL으로 되도록 용해시킨 말레이미드시약 EMCS(동인화학사 제조) 5 μL를 가하고, 실온에서 1.5시간 반응시켰다. 이 반응 산물을 PD-10(GE 헬쓰케어사 제조)으로 겔 여과 정제하여, 미반응의 EMCS를 제거하는 것에 의해 말레이미드기를 도입한 덱스트란-SA 결합물을 얻었다. 한편, 실시예 2에 기재한 방법에 의해 c11-9와 c11-14의 Fab'를 작제하고, 각 Fab'를 등량 혼합하는 것에 의해 0.5 mg/mL의 Fab' 용액을 제조하였다. 이어서, 2 mg/mL의 말레이미드기를 도입한 덱스트란-SA 결합물 0.5mL에 대하여, 0.5 mg/mL　Fab' 용액을1mL 첨가하여 4℃에서 하룻밤 반응시켰다. 그 후, 종 농도가 15mM으로 되도록 2-머캅토에틸아민을 첨가하고, 실온에서 1시간 반응시키는 것에 의해 미반응의 말레이미드기를 블록하였다. 반응 후, Sephacryl　S-300HR 컬럼(GE 헬쓰케어사 제조)으로 겔 여과 정제하여, 덱스트란-SA-Fab' 복합체를 얻었다. 정제한 덱스트란-SA-Fab' 복합체에 포함되는 SA는, 농도 기지의 SA 용액을 표준으로 하여, HABA 시약에 의한 발색을 지표로서 정량하였다. 작제한 덱스트란 T2000-SA-Fab' 중합체를, SA 농도로서 570ｎM으로 되도록 0.1M 인산 완충액에서 제조하였다. 이 덱스트란 T2000-SA-Fab' 중합체 용액　300μL에 대하여, 비오틴화 루시페라제(키코만사 제조) 61μM를 3.0μL 첨가하고, 25℃에서 1시간 반응시키는 것에 의해, 기존의 방법을 응용한 중합화 표식항체를 작제하였다.
루시페라제 표식 항체를 사용한 산소 면역측정
WSC를 사용한 카보디이미드법에 의해, 항 HCV 코어 항원 마우스 모노클로날 항체 c11-3, c11-7, 및 AOT3을 자성입자에 고정화하고, 0.2% 항체 고상화 자성입자를 작제하였다. 한편, 정상 인간 혈청 및 2종류의 HCV 코어 항원 양성 혈청 100μL와 검체 처리액(6M 염산 구아니딘, 0.5N HCl, 12.5% TritonX 100, 0.75% Tween 20) 100μL를 혼합하고, 37℃에서 15분간 방치하는 것에 의해 검체의 전처리를 실시한 후, 반응액(0.1M 인산 나트륨, 0.15M NaCl, 1% BSA, 0.5% 카제인, 0.05% Tween 20, pH 7.3) 140μL와 1M 트리스 완충액 20μL를 혼합하고, 이 혼합액 160μL에 전처리 검체 80μL를 첨가하는 것에 의해, 전처리 검체를 중화시켰다.
이어서, 중화된 전처리 검체 240μL에 0.2% 항체 고상화 자성입자를 20μL 첨가하고, 37℃에서 15분간 방치하는 것에 의해 1차 반응을 일으켰다. 반응 후, 자성입자를 세정액으로 3회 세정하고, 실시예 5에서 작제한 루시페라제 표식 IgG, 실시예 10에서 작제한 루시페라제 표식 IgG-덱스트란(T2000) 복합체, 기존의 방법을 응용하여 작제한 중합화 표식 항체를 첨가하였다. 표식 항체의 양은, 루시페라제 농도로서 18ｎM로 희석한 것을 120μL 첨가하고, 교반 후 또한 37℃에서 15분간 반응시켰다. 반응 후, 자성입자를 세정액으로 3회 세정하고, 50mM 트리스 완충액(pH 8.5) 100μL에 재현탁시켰다.
자성입자를 재현탁시킨 튜브에 기질 용액(루시페린) 100μL를 가하고, 루맛트 LB 9507(베루토루드사 제조)를 사용하여 루시페라제의 발광을 측정하였다. 발광 측정은, 루시페린 첨가 0.5초 후부터 5초간의 발광을 적산하였다. 그 결과, 표 3에 나타내는 바와 같이 루시페라제 표식 IgG-덱스트란(T2000) 복합체는 기존의 방법을 응용하여 작제한 중합화 표식 항체보다도 높은 반응성을 나타내었다. 패널 검체 Ｌ및 M의 S/N비로부터 어림잡아보면, 루시페라제 표식 IgG-덱스트란(T2000) 복합체는 기존의 방법을 응용하여 작제한 중합화 표식항체보다도 약 3~5배 정도, 반응성이 향상하고 있었다. 기존의 방법을 응용하여 작제한 중합화 표식항체의 경우, 사용하는 항체량을 많게 하여도, 그 S/N비에 큰 개선은 보이지 않았다.
Figure pct00003
실시예 16
비오틴화 POD 로의 응용
POD 표식 Fab' 의 작제
실시예 6에서 작제한 15.4μM의 c11-9 및 c11-14의 Fab'-스트렙토애비딘 결합체 30μL에 대하여, 56.8μM의 비오틴화 POD(인비트로젠사 제조) 8.1μL를 가하여, 4℃에서 하룻밤 방치하는 것에 의해 POD 표식 Fab'를 작제하였다.
Fab' - 스트렙토애비딘 결합체- 덱스트란 ( T2000 ) 복합체로 비오틴화 POD 의 도입
실시예 11에서 작제한 c11-9 및 c11-14를 혼합한 Fab'-스트렙토애비딘 결합체-덱스트란(T2000) 복합체를, Fab'-스트렙토애비딘 결합체 농도로서 1.4μM으로 되도록 0.1M 인산 완충액(pH 7.2)에서 제조하였다. 이 복합체 용액 50μL에 대하여, 56.8μM의 비오틴화 POD(인비트로젠사 제조) 1.2μL를 가하고, 4℃에서 하룻밤 방치하는 것에 의해 POD 표식 Fab'-덱스트란(T2000) 복합체를 작제하였다.
POD 표식 항체를 사용한 산소 면역측정
WSC를 사용한 카보디이미드법에 의해, 항 HCV 코어 항원 마우스 모노클로날 항체 c11-3, c11-7, 및 AOT3를 자성입자에 고정화하고, 0.2% 항체 고상화 자성입자를 작제하였다. 한편, 재조합체 HCV 코어 항원(c11)을 0ｎM, 0.12ｎM, 1.2ｎM으로 되도록 정상 인간 혈청으로 희석하고, 이들 샘플 100μL와 검체 처리액(6M 염산 구아니딘, 0.5N HCl, 12.5% TritonX 100, 0.75% Tween 20) 100μL를 혼합하고, 37℃에서 15분간 방치하는 것에 의해 샘플의 전처리를 실시하였다. 또한, 반응액(0.1M인산 나트륨, 0.15M NaCl, 1% BSA, 0.5% 카제인, 0.05% Tween 20, pH 7.3) 140μL와 1M 트리스 완충액 20μL를 혼합하고, 이 혼합물 160μL에 전처리 검체 80μL를가하는 것에 의해, 전처리 검체를 중화시켰다.
이어서, 중화된 전처리 검체 240μL에 0.2% 항체 고상화 자성입자를 20μL 가하고, 37℃에서 15분간 방치하는 것에 의해 1차 반응을 일으켰다. 반응 후, 자성입자를 세정액에 의해 3회 세정하고, 상기 방법에 의해 작제된 POD 표식 Fab' 및 POD 표식 Fab'-덱스트란(T2000) 복합체를 첨가하였다. 표식 항체의 양은, POD 농도로서 18ｎM로 희석한 것을 120μL 가하고, 교반 후 또한 37℃에서 15분간 반응시켰다. 반응 후, 자성입자를 세정액에 의해 3회 세정하였다.
이어서, 자성입자의 튜브에 기질 용액(루미놀) 200μL를 가하고, 루맛트 LB 9507(베루토루드사 제조)을 사용하여 POD의 발광을 측정하였다. 발광측정은, 루미놀 첨가 12초 후부터 3초간의 발광을 적산하였다. 그 결과, 표 4에 나타낸 바와 같이 POD 표식 Fab'보다도 POD 표식 Fab'-덱스트란(T2000) 복합체의 쪽이 높은 발광치를 나타내고, 루시페라제의 경우와 동일하게 본 발명에 의한 시그널의 증폭이 확인되었다. 이상의 결과로부터 본 발명은 루시페라제 이외의 산소를 사용하여 실시가능한 것이 밝혀졌다.
Figure pct00004
실시예 17
비오틴화 FITC 로의 응용
FITC 표식 Fab' 의 작제
실시예 6에서 작제한 15.4μM의 c11-9 및 c11-14의 Fab'-스트렙토애비딘 결합체 30μL에 대하여, 160μM의 비오틴화 FITC(인비트로젠사 제조) 2.9μL를 가하고, 4℃에서 하룻밤 방치하는 것에 의해 FITC 표식 Fab'를 작제하였다.
Fab' - 스트렙토애비딘 결합체- 덱스트란 ( T2000 ) 복합체로의 비오틴화 FITC 의 도입
실시예 11에서 작제한 c11-9 및 c11-14를 혼합한 Fab'-스트렙토애비딘 결합체-덱스트란(T2000) 복합체를, Fab'-스트렙토애비딘 결합체 농도로서 6.3μM으로 되도록 0.1M 인산 완충액(pH 7.2)에서 제조하였다. 이 복합체 용액 20μL에 대하여, 160μM의 비오틴화 FITC(인비트로젠사 제조) 1.0μL를 가하고, 4℃에서 하룻밤 방치하는 것에 의해 FITC 표식 Fab'-덱스트란(T2000) 복합체를 작제하였다.
FITC 표식 항체를 사용한 형광면역측정
WSC를 사용한 카보디이미드법에 의해, 항 HCV 코어 항원 마우스 모노클로날 항체 c11-3, c11-7, 및 AOT3을 자성입자에 고정화하고, 0.2% 항체 고상화 자성입자를 작제하였다. 한편, 재조합체 HCV 코어 항원(c11)을 0ｎM, 0.12ｎM, 1.2ｎM으로 되도록 정상 인간 혈청으로 희석하고, 이들 샘플 100μL와 검체 처리액(6M 염산 구아니딘, 0.5N HCl, 12.5% TritonX 100, 0.75% Tween 20) 100μL를 혼합하고, 37℃에서 15분간 방치하는 것에 의해 샘플의 전처리를 행하였다. 또한, 반응액(0.1M 인산 나트륨, 0.15M NaCl, 1% BSA, 0.5% 카제인, 0.05% Tween 20, pH 7.3) 140μL와 1M 트리스 완충액 20μL를 혼합하여, 이 혼합액 160μL에 전처리 검체 80μL를 가하는 것에 의해, 전처리 검체를 중화시켰다.
이어서, 중화된 전처리 검체 240μL에 0.2% 항체 고상화 자성입자를 20μL 가하고, 37℃에서 15분간 방치하는 것에 의해 1차 반응을 일으켰다. 반응 후, 자성입자를 세정액에 의해 3회 세정하고, 상기 방법에 의해 작제된 FITC 표식 Fab' 및 FITC 표식 Fab'-덱스트란(T2000) 복합체를 첨가하였다. 표식 항체의 양은, FITC 농도로서 65ｎM로 희석한 것을 200μL 가하고, 교반 후 또한 4℃에서 하룻밤 반응시켰다. 반응 후, 자성입자를 세정액에 의해 3회 세정하였다.
이어서, 자성입자의 튜브에 10mM PBS(pH 7.4)를 200μL 가하고, 자성입자를 현탁하며, 현탁액을 96웰 백색 플레이트(써모피셔사 제조)에 분주하였다. 그 후, 형광 플레이트 리더 infinite 200(테칸사 제조)을 사용한 FITC의 형광을 측정하였다. 형광측정의 조건은, 485ｎｍ의 파장에서 여기되고, 535ｎｍ의 형광을 측정하였다. 그 결과, 표 5 및 도 6에 나타낸 바와 같이 FITC 표식 Fab'보다도 FITC 표식 Fab'-덱스트란(T2000) 복합체 쪽이 높은 형광 활성을 나타내고, 루시페라제나 POD의 경우와 동일하게 본 발명에 의한 시그널의 증폭이 확인되었다. 이상의 결과로부터 본 발명은 산소 이외의 저분자 표식물을 사용하여도 실시가능한 것이 밝혀졌다.
Figure pct00005
실시예 18
표식화 프로브 -수용성 담체 복합체의 가속안정성
본 발명에 관한 표식화 프로브-수용성 담체 복합체의 가속안정성을 시험하였다. 상세하게는, 실시예 12에서 작제한 루시페라제 표식 c11-9·c11-14Fab'-덱스트란(T2000) 복합체에 관하여, 4℃ 보존 조건하에서의 활성과, 37℃, 1주간에서의 가속조건 후의 잔존 활성을 측정하고, 비교검토하였다. 활성의 측정은 실시예 13과 동일한 방법으로 실시하였다. 결과는 표 6에 나타낸 바와 같았다.
Figure pct00006
상기 결과로부터, 본 발명에 관한 표식화 프로브-수용성 담체 복합체가 우수한 가속안정성을 나타내는 것이 실증되었다. 즉, 본 발명에 관한 표식화 프로브-수용성 담체 복합체는, 37℃에서 1주간 보존하여도, 약 90% 정도 내지 그 이상의 잔존 활성을 유지한 것이 관찰되었다. 또, 당해 가속조건에 따른 백그라운드의 상승은 관찰되지 않았다.
이들 결과로부터, 본 발명에 의해, 피험물질과 특이적으로 결합하는 고감도이고 또 안정한 표식화 프로브-수용성 담체 복합체가 얻어지며, 이 표식화 프로브-수용성 담체 복합체를 사용하는 것에 의해, 종래와 비교하여, 더욱 고감도이고 또 안정적인 검출·측정이 가능하게 되는 것이 실증되었다. 또, 본원발명이 산소 이외의 저분자 표식물에 대하여도 유효한 것이 실증되었다.
산업상의 이용가능성
피험물질과 프로브가 특이적으로 결합하는 것을 이용하여, 검체 중의 피험물질을 검출·측정하는 방법에 있어서, 본 발명의 표식화 프로브-수용성 담체 복합물을 사용하는 것에 의해, 종래와 비교하여, 더욱 고감도이고 또 안정한 검출·측정 이 가능하게 된다.

Claims (14)

  1. 이하의 공정을 포함하는, 표식화 프로브-수용성 담체 복합체의 제작방법:
    공정 1. 티올기를 갖고 피험물질에 대하여 결합 가능한 프로브와 말레이미드기를 갖는 애비딘류를 결합시켜 프로브 결합체로 하고,
    공정 2. 이어서 티올기를 갖는 상기 프로브 결합체와 말레이미드기를 갖는 고분자의 수용성 담체를 결합시켜서 프로브 결합체-수용성 담체 복합체로 하며,
    공정 3. 또한 상기 프로브 결합체-수용성 담체 복합체와 비오틴화 표식물을 혼합하여, 프로브 결합체-수용성 담체 복합체의 애비딘류와 비오틴화 표식물의 비오틴을 결합시킨다.
  2. 제1항에 있어서, 애비딘류가 애비딘 또는 스트렙토애비딘인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 수용성 담체의 분자량이 50만 이상인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 수용성 담체가, 덱스트란, 아미노덱스트란, 덱스트린, 크러스트 덱스트린, 피콜 또는 푸르란으로부터 선택되는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 피험물질에 대하여 결합 가능한 프로브가 항체 또는 항체 단편인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 2종류 이상의 항체 또는 항체 단편을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 항체 또는 항체 단편이 Fab', F(ab')2, Fab 또는 IgG로부터 선택되는 방법.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 피험물질에 대하여 결합 가능한 프로브가 프로테인 G, 프로테인 A, 프로테인 L, 렉틴 또는 수용체로부터 선택되는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 비오틴화 표식물이 비오틴화 루시페라제, 비오틴화 알칼리 포스포타제, 비오틴화 POD, 비오틴화 GOD, 비오틴화FITC, 비오틴화 아크리디늄, 비오틴화 아크리디늄 유도체 또는 비오틴화 트리스(2,2' 비피리딜) 루테늄(II)으로부터 선택되는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 비오틴화 루시페라제가 유전자 조합에 의해 작제된 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 작제된 표식화 프로브-수용성 담체 복합체.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 작제된 표식화 프로브-수용성 담체 복합체를 사용하는 측정법.
  13. 제1항 내지 제7항 또는 제9항 또는 제10항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 작제된 표식화 프로브-수용성 담체 복합체를 사용하는 면역측정법.
  14. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 작제된 표식화 프로브-수용성 담체 복합체를 사용하는 고감도 측정법.

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