CN113474655A - 目标物质的检测方法、用于目标物质的检测的试剂、及用于目标物质的检测的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明以提升使用多花紫藤(Wisteria floribunda)的凝集素的目标物质的检测系的检查精度作为课题。本发明由目标物质的检测方法解决所述课题，所述方法包括：通过将固定化于载体的多花紫藤(Wisteria floribunda)的凝集素(WFA)和含与WFA结合的糖链的目标物质在仅由碳原子、氢原子、及氧原子构成的碳原子数1～7的醇的存在下混合，在所述载体上形成含WFA和目标物质的复合体的工序、及通过检测所述复合体，检测目标物质的工序。

Description

目标物质的检测方法、用于目标物质的检测的试剂、及用于目 标物质的检测的试剂盒
【技术领域】
本发明涉及目标物质的检测方法、用于目标物质的检测的试剂、及用于目标物质的检测的试剂盒。
【背景技术】
在专利文献1中公开了用于使用标记化凝集素对受试体中的作为检测对象物质的糖蛋白质进行定量的夹心型测定，通过导入简便的处理，抑制来源于混杂物的影响的夹心型测定法。
【现有技术文献】
【专利文献】
【专利文献1】美国专利申请公开第2017/0122940号说明书
【发明的概要】
【发明要解决的课题】
在专利文献1中记载了使用硫代甘油等的还原剂抑制标记化凝集素的非特异结合的方法。但是，发明人发现，通过如后述的实施例所示专利文献1中记载的方法，检测精度的提升不充分。
本发明以提升使用多花紫藤(Wisteria floribunda)的凝集素的目标物质的检测精度作为课题。
【用于解决课题的手段】
本发明的有的实施方式涉及目标物质的检测方法，所述方法包括：通过将固定化于载体的多花紫藤(Wisteria floribunda)的凝集素(WFA)和含与WFA结合的糖链的目标物质在仅由碳原子、氢原子、及氧原子构成的碳原子数1～7的醇的存在下混合，在上述载体上形成含WFA和目标物质的复合体的工序及通过检测上述复合体检测目标物质的工序。
本发明的有的实施方式涉及目标物质的检测方法，所述方法包括：通过将固定化于载体的多花紫藤(Wisteria floribunda)的凝集素(WFA)和含与WFA结合的糖链的目标物质在碳原子数1～7的醇(但除硫代甘油之外)的存在下混合，在上述载体上形成含WFA和目标物质的复合体的工序、及通过检测上述复合体检测目标物质的工序。
本发明的有的实施方式涉及目标物质的检测方法，所述方法包括：通过将固定化于载体的多花紫藤(Wisteria floribunda)的凝集素(WFA)和含与WFA结合的糖链的目标物质在碳原子数1～7的醇(但除含巯基的醇之外)的存在下混合，在上述载体上形成含WFA和目标物质的复合体的工序、及通过检测上述复合体检测目标物质的工序。
本发明的有的实施方式涉及用于检测目标物质的试剂，所述试剂含：仅由碳原子、氢原子、及氧原子构成的碳原子数1～7的醇。其中，上述目标物质含与多花紫藤(Wisteriafloribunda)的凝集素(WFA)结合的糖链。
本发明的有的实施方式涉及用于检测目标物质的试剂，所述试剂含：碳原子数1～7的醇(但除硫代甘油之外)。其中，上述目标物质含与多花紫藤(Wisteria floribunda)的凝集素(WFA)结合的糖链。
本发明的有的实施方式涉及用于检测目标物质的试剂，所述试剂含：碳原子数1～7的醇(但除含巯基的醇之外)。上述目标物质含与多花紫藤(Wisteria floribunda)的凝集素(WFA)结合的糖链。
本发明的有的实施方式涉及用于检测目标物质的试剂盒，所述试剂盒含：目标物质的检测物质；多花紫藤(Wisteria floribunda)的凝集素(WFA)；及仅由碳原子、氢原子、及氧原子构成的碳原子数1～7的醇。其中，上述目标物质含与WFA结合的糖链。
本发明的有的实施方式涉及用于检测目标物质的试剂盒，所述试剂盒含：目标物质的检测物质；多花紫藤(Wisteria floribunda)的凝集素(WFA)；及碳原子数1～7的醇(但除硫代甘油之外)。其中，上述目标物质含与WFA结合的糖链。
本发明的有的实施方式涉及用于检测目标物质的试剂盒，所述试剂盒含：目标物质的检测物质；多花紫藤(Wisteria floribunda)的凝集素(WFA)；及碳原子数1～7的醇(但除硫代甘油之外)。其中，上述目标物质含与WFA结合的糖链。
通过在仅由碳原子、氢原子、及氧原子构成的碳原子数1～7的醇、除硫代甘油之外的碳原子数1～7的醇、或者除含巯基的醇之外的碳原子数1～7的醇的存在下混合WFA和目标物质，可提升目标物质的检测精度。
【发明的效果】
可提升目标物质的检测精度。
【附图的简单的说明】
【图1】(A)是显示含试剂的容器的外观例的图。(B)是显示试剂盒的概略的图。
【图2】显示向检测系添加甘油时的稀释直线性。
【图3】显示向检测系添加醇以外的物质时的稀释直线性。
【图4】显示向检测系添加具有各种各样的碳原子数的醇时的稀释直线性。
【图5】显示添加甘油时的WFA-M2BP检测系的受试体的稀释直线性。
【图6】显示添加甘油时的WFA-MUC1检测系的稀释直线性。
【图7】显示添加甘油时的LTL-结合珠蛋白检测系的稀释直线性。
【图8】显示向检测系添加甘油化合物时的稀释直线性。
【图9】显示向检测系添加各种各样的浓度的甘油时的稀释直线性。
【具体实施方式】
【1.检测方法】
显示在本说明书中公开的检测方法的实施方式的一例。本公开的有的实施方式涉及目标物质的检测方法，所述方法包括：通过将凝集素和含与上述凝集素结合的糖链的目标物质在醇的存在下混合，在上述载体上形成含WFA和目标物质的复合体的工序(形成工序)、及通过检测上述复合体，检测目标物质的工序(检测工序)。优选为上述检测可为定量。
目标物质是成为检测的对象的物质。优选为糖蛋白质，更优选具有与多花紫藤(Wisteria floribunda)的凝集素(WFA)结合的糖链。作为目标物质，可优选举Mac-2-结合蛋白(M2BP)、细胞表面相关的Mucin 1(MUC1)、α1酸性糖蛋白质(AGP)、神经细胞接附分子L1(L1CAM)、KL-6抗原等。
目标物质优选为从生物体采集的试样中所含的物质。试样可使用尿、血液。血液可为末梢血，也可为由该末梢血调制的血浆或血清。在这些之中，也优选血浆或血清。在本实施方式中，也可根据需要，将试样用适合的水性介质稀释。这样的水性介质只要是不妨碍目标物质的检测，就不特别限定，例如，可举出水、生理盐水、缓冲液等。缓冲液不特别限定，可使用中性附近的pH(例如6以上8以下的pH)的缓冲液。例如，可举出HEPES、MES、Tris、PIPES等的Good缓冲液、磷酸缓冲生理盐水(PBS)等。
凝集素优选可举WFA。作为WFA，可举例如，天然存在的WFA或重组体WFA。天然存在的WFA是由4个亚基构成的4聚体蛋白质。WFA被知为藤(Wisteria floribunda)的种子中所含的凝集素。从此4聚体的WFA可由使用还原剂等的指定的处理得到单体或2聚体的WFA。在本说明书中，只要未特别说明，“WFA”这样的表述是指单体的WFA及多聚体的WFA的两方。另外，在本说明书中，在表示由指定的数的亚基构成的WFA时如例如“单体WFA”、“2聚体WFA”、“4聚体WFA”一样明示表述亚基的数。
在本实施方式中，WFA可为4聚体WFA，也可为单体WFA或2聚体WFA。在它们之中，从反应性的高度来看，也优选2聚体WFA。
作为醇，可举例如，碳原子数1～7、优选碳原子数2～7的醇。醇的碳原子数的下限值可选自1、2或3。在一实施方式中，使用仅由碳原子、氢原子及氧原子构成的醇。优选地，在上述碳原子数1～7的醇中不含硫代甘油。更优选地，在上述碳原子数1～7的醇中不包括含巯基的醇。其中，“在碳原子数1～7的醇中不含硫代甘油”是指在后述的检测系、试剂、及试剂盒中，至少含硫代甘油以外的碳原子数1～7的醇即可，不完全排除添加硫代甘油的检测系、试剂、及试剂盒。即使对于“在碳原子数1～7的醇中不包括含巯基的醇”这样的表现是指，在后述的检测系、试剂、及试剂盒中，包括至少含巯基的醇以外的碳原子数1～7的醇即可，不完全排除添加含巯基的醇的检测系、试剂、及试剂盒。即，也可以不妨碍目标物质的检测的程度含硫代甘油。
醇可为一价，也可为多价。价数是指羟基的数。作为多元醇，可举例如二价、三价、四价的醇。
醇中所含的碳链可为直链，也可为支链，优选为直链。
醇可使用仅一种，也可使用多种。
作为醇，优选可举选自甲醇、乙醇、甘油、戊醇、庚醇、二甘油、乙二醇、二乙二醇、丙二醇、二丙二醇、三乙二醇、及这些的混合物的至少一种醇。更优选选自甘油、二甘油、乙二醇、二乙二醇、丙二醇、二丙二醇、三乙二醇、及这些的混合物的至少一种醇，最优选甘油。
WFA和目标物质的复合体的形成，例如，通过将含目标物质的试样(或者将试样用水性介质稀释的稀释液等)和WFA混合，根据需要一定时间温育来达成。此时，WFA优选固定化于载体。
WFA向载体的固定的实施方式不特别限定。例如，可使WFA和载体直接结合，或者，也可将WFA和载体之间经别的物质间接结合。作为直接的结合，例如，可举出物理吸附等。作为间接的结合，可举出例如，经生物素和亲和素或链霉亲和素(以下，也称为“亲和素类”)的组合的结合。此时，通过将WFA预先用生物素修饰，使载体预先结合亲和素类，可经生物素和亲和素类的结合而使WFA和载体间接结合。
载体的原料不特别限定，例如，可选自有机高分子化合物、无机化合物、生物体高分子等。作为有机高分子化合物，可举出乳胶、聚苯乙烯、聚丙烯等。作为无机化合物，可举出磁性体(氧化铁、氧化铬及铁素体等)、氧化硅、氧化铝、玻璃等。作为生物体高分子，可举出不溶性琼脂糖、不溶性葡聚糖、明胶、纤维素等。也可将这些中的2种以上组合使用。载体的形状不特别限定，可举出例如，粒子、膜、微平板、微管、试管等。在它们之中，也优选粒子，特别优选磁性粒子。通过使用磁性粒子，可提升WFA和目标物质的反应性。
固定于磁性粒子的WFA优选2聚体WFA。2聚体WFA，例如，可使用巯基试剂或还原剂，使4聚体WFA的亚基解离而得到。另外，通过使交联剂和4聚体WFA接触，也可使4聚体WFA2聚体化。作为这样的交联剂，优选与4聚体WFA中的氨基形成交联的交联剂。例如，作为具有对于氨基的反应基的交联剂，可举出具有选自N-羟基琥珀酰亚胺酯基、异硫氰基、氯砜基、氯羰基、氧乙烯基、碳原子数1～4的氯烷基、醛基及羧基的至少一种官能团的交联剂。当使用这样的交联剂时，可使4聚体WFA有效2聚体化。
在将4聚体WFA和交联剂混合时的摩尔比(WFA/交联剂)优选1/10以下，更优选为1/20以下。一方面，摩尔比(WFA/交联剂)的下限可考虑与交联剂的使用量及生成的2聚体WFA的收率的平衡而设为1/100以上。
在经生物素和亲和素类的结合而将WFA固定于磁性粒子时，也可使用生物素化2聚体WFA。生物素化2聚体WFA，例如，可通过使用含生物素的交联剂，使4聚体WFA2聚体化而得到。含生物素的交联剂，例如，通过将生物素和交联剂的上述反应基经间隔物结合而得到。这样的间隔物不特别限定，可举出例如，具有氨基己酰基(氨基己酰基)的化合物等。
在目标物质和WFA的复合体的形成时，优选含2～20w/w％、优选4～10w/w％上述醇。在本公开中单位“w/w％”是指重量/重量换算的百分率(以下，相同的)。
在醇存在下与目标物质形成WFA的复合体时，可使含醇的试剂和含固定化于载体的WFA的试剂作为个别的试剂与试样(或者其稀释液)混合，也可使醇和固定化于载体的WFA的混合液与试样混合。将试剂和试样(或者其稀释液)混合的顺序不特别限定，可将这些实质上同时混合，也可依次混合。作为含醇的试剂的例，可举向Sysmex株式会社制HISCL(商标)R1试剂添加醇的试剂。此时，作为含固定化于载体的WFA的试剂，可举例如，Sysmex株式会社制HISCL(商标)M2BPGi(商标)R2试剂。
复合体的检测通过例如使WFA和目标物质的复合体还含检测物质，检测自检测物质的信号而成为可能。WFA、目标物质和检测物质的复合体可通过将WFA和目标物质的复合体和检测物质混合，根据必要反应一定时间而形成。另外，也可在形成WFA和目标物质的复合体时通过使检测物质共存，形成WFA、目标物质和检测物质的复合体。
检测物质是与目标物质特异性地结合的物质，只要是含标记物质的物质，就不限制。在目标物质是糖蛋白质时，与目标物质特异性地结合的物质优选与目标物质的蛋白质部分结合。作为与目标物质特异性地结合的物质，可举例如抗体。也可为单克隆抗体、多克隆抗体、及它们的片段(例如，Fab、F(ab')2等)之任一者。另外，也可使用市售的抗体。
在检测物质中使用的标记物质可在免疫学测定中使用通常在本领域中使用的物质。例如，可为其本身发生信号的物质(以下，也称为“信号发生物质”)，也可为催化其他物质的反应而发生信号的物质。作为信号发生物质，可举出例如，荧光物质、放射性同位素等。作为催化其他物质的反应而发生能检测的信号的物质，例如，可举出酶。作为酶，可举出碱性磷酸酶、过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶等。作为荧光物质，可举出异硫氰酸荧光素(FITC)、若丹明、Alexa Fluor(商标)等的荧光染料、GFP等的荧光蛋白质等。作为放射性同位素，可举出125I、14C、32P等。在它们之中，作为标记物质，也优选酶，特别优选碱性磷酸酶。作为标记物质，也可使用二硝基苯基(DNP)或生物素等的半抗原。通过使与半抗原结合并且具有信号发生物质或酶等的物质与检测物质结合，可取得自复合体的信号。
标记物质可由现有技术中公知的标记方法，和与目标物质特异性地结合的物质结合。另外，也可使用市售的标记试剂盒等进行标记。
在本实施方式中，复合体基于复合体中所含的检测物质的标记物质而检测。具体而言，通过检测由复合体中所含的检测物质的标记物质发生的信号，可取得反映试样中所含的标记物质的量或浓度的测定值。其中，“检测信号”含定性检测信号的有无，对信号强度进行定量，及，半定量检测信号的强度。半定量的检测是指将信号的强度如“不发生信号”、“弱”、“中”、“强”等一样阶段性地表示。在本实施方式中，优选定量或半定量检测信号的强度。
检测信号的方法本身是在现有技术领域中公知的。在本实施方式中，适宜选择对应于来源于上述的标记物质的信号的种类的测定方法即可。例如，在标记物质是酶时，可通过使用分光光度计等的公知的装置测定通过使对于该酶的底物反应而发生的光、色等的信号来进行。
酶的底物可对应于该酶的种类从公知的底物适宜选择。例如，在作为酶而使用碱性磷酸酶时，作为底物，可举出CDP-Star(商标)(4-氯-3-(甲氧基螺[1,2-二氧杂环丁烷-3,2'-(5'-氯)三环[3.3.1.13,7]癸烷]-4-基)苯基磷酸2钠)、CSPD(商标)(3-(4-甲氧基螺[1,2-二氧杂环丁烷-3,2-(5'-氯)三环[3.3.1.13,7]癸烷]-4-基)苯基磷酸2钠)等的化学发光底物、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸(BCIP)、5-溴-6-氯-吲哚基磷酸2钠、p-硝基苯基磷酸等的显色底物。
在标记物质是放射性同位素时，可使用闪烁计数器等的公知的装置测定作为信号的放射线。另外，在标记物质是荧光物质时，可使用荧光酶标仪等的公知的装置测定作为信号的荧光。再者，激发波长及荧光波长可对应于使用的荧光物质的种类适宜确定。
作为含检测物质的试剂的例，在例如目标物质是M2BP时，可举Sysmex株式会社制HISCL(商标)M2BPGi(商标)R3试剂。另外，在检测其他目标物质时，可根据使HISCL(商标)M2BPGi(商标)R3试剂中所含的抗M2BP抗体与目标物质特异性地结合的物质而变更。
在本实施方式中，在标记物质是酶时，将检测使底物与标记物质接触的工序及信号的工序称为“检测工序”。另外，在标记物质是荧光物质或放射性同位素时，将检测信号的工序称为“检测工序”。
在本实施方式中，也可在上述复合体的形成和检测工序之间进行除去未形成复合体的未反应的游离成分的Bound/Free(B/F)分离。未反应的游离成分是指不构成复合体的成分。例如，可举未反应的试样成分、WFA、检测物质等。B/F分离的手段不特别限定，当载体是粒子时，可通过由离心分离仅回收捕获复合体的载体来进行B/F分离。当载体是微平板或微管等的容器时，可通过除去含未反应的游离成分的液来进行B/F分离。另外，在载体是磁性粒子时，可通过在用磁铁将磁性粒子磁约束的状态下由管嘴吸除含未反应的游离成分的液来进行B/F分离，在自动化的观点优选的。在除去未反应的游离成分之后，也可将捕获复合体的载体用PBS等的适合的水性介质清洗。
信号的检测结果可作为目标物质的测定值使用。例如，在定量检测信号的强度时，可以信号强度的测定值本身或从该测定值算出的值作为目标物质的测定值使用。作为从信号强度的测定值算出的值，可举出例如，从该测定值减去阴性对照试样的测定值的值、该测定值除以阳性对照试样的测定值的值、及它们的组合等。
其中，目标物质的检测也可使用Sysmex株式会社制的全自动免疫测定装置HISCL(商标)系列进行进行。
【2.试剂及试剂盒】
(1)试剂
本公开的有的实施方式涉及在目标物质的检测中使用的试剂。优选地，本实施方式包括含在上述1中所述的方法的一部分的工序中使用的碳原子数1～7的醇的试剂。图1(A)显示试剂的容器51的外观。
试剂优选含3～30w/w％、优选以4～15w/w％碳原子数1～7的醇。另外试剂51优选含例如水性溶剂。水性溶剂只要是不妨碍上述1中所述的检测，就不特别限定，可举出例如，水、生理盐水、缓冲液等。缓冲液只要是在中性附近的pH(例如6以上8以下的pH)具有缓冲作用，就不特别限定。作为缓冲液，可举出例如，HEPES、MES、Tris、PIPES等的Good缓冲液、磷酸缓冲生理盐水(PBS)等。优选为HEPES。作为这样的缓冲液，可举例如，Sysmex株式会社制HISCL(商标)R1试剂。
另外，含碳原子数1～7的醇的试剂也可含上述1中所述的固定化于载体的WFA。在此时，试剂也优选含例如水性溶剂。水性溶剂只要是不妨碍上述1中所述的检测，就不特别限定，可举出例如，水、生理盐水、缓冲液等。缓冲液只要是在中性附近的pH(例如6以上8以下的pH)具有缓冲作用，就不特别限定。作为缓冲液，可举出例如，HEPES、MES、Tris、PIPES等的Good缓冲液、磷酸缓冲生理盐水(PBS)等。优选为HEPES。作为这样的缓冲液，可举例如，Sysmex株式会社制HISCL(商标)M2BPGi(商标)R2试剂。
再者，试剂也可含上述1中所述的检测物质。
试剂也可含选自β-巯基乙醇、DTT等的稳定化剂；白蛋白等的保护剂；聚氧乙烯山梨坦单油酸酯、聚氧乙烯(20)山梨坦单月桂酸酯、聚氧乙烯(10)辛基苯基醚等的表面活性剂；及叠氮化钠、牛血清白蛋白等的稳定化剂的至少一种添加剂。试剂也可含钠、钾、钙、锰等的金属盐(优选氯化物)。
(2)试剂盒
本公开的有的实施方式涉及在目标物质的检测中使用的试剂盒。试剂盒含至少碳原子数1～7的醇、WFA和检测物质。图1(B)显示试剂盒的概要的例。图1(B)中所示的，试剂盒50含外装箱55、储纳含上述2.(1)中所述的碳原子数1～7的醇的试剂的第1容器51，储纳含上述1中所述的固定化于载体的WFA的试剂的第2容器52、储纳含能与上述1中所述的目标物质结合的检测物质的试剂的第3容器53和试剂盒的附带文书54。在附带文书54中，可记载试剂盒的对待方法、储存条件、使用期限等。
在碳原子数1～7的醇含在第2容器52中所含的含固定化于载体的WFA的试剂时，在第1容器51中含有含上述2.(1)中所述的水性溶剂和根据需要选自添加物及金属盐的至少一种试剂。
在碳原子数1～7的醇含在第1容器51中所含的试剂时，第2容器52中所含的固定化于载体的WFA也可为干燥形态。另外，试剂盒中所含的WFA，在流通时不固定化于载体的情况中，也可各自个别地捆包用于在使用之前将WFA固定化于载体的试剂、WFA和载体。
作为第3容器53中所含的试剂的例，例如，在目标物质是M2BP时，可举Sysmex株式会社制HISCL(商标)M2BPGi(商标)R3试剂。另外，在检测其他目标物质时，可根据使HISCL(商标)M2BPGi(商标)R3试剂中所含的抗M2BP抗体与目标物质特异性地结合的物质而变更。
再者，在试剂盒中，也可向外装箱55同装含用于对试样进行稀释的稀释液的容器(例如，Sysmex株式会社制HISCL(商标)R4试剂)、含基质试剂(例如，Sysmex株式会社制HISCL(商标)用R5试剂)的容器、含清洗用的水性介质的容器等。再者，在上述1中记述的用语的说明援用于本项。
【实施例】
【1.试剂－受试体－测定】
(1-1)试样稀释用缓冲液(第1试剂)
使用Sysmex株式会社制的HISCL(商标)M2BPGi R1试剂。
(1-2)固定WFA凝集素的磁性粒子(第2试剂)
作为目标物质，在使用M2BP及MUC1的系中使用Sysmex株式会社制的HISCL(商标)M2BPGi R2试剂。
(1-2')固定LTL凝集素的磁性粒子(第2试剂)
(1-2'-1)LTL凝集素的生物素化
向20mM磷酸缓冲液(pH 7.5)添加LTL〔VECTOR Laboratories公司制、商品名：Lotus tetragonolobus Lectin〕至所述LTL的浓度成2.5mg/mL，得到含有LTL的溶液。
向得到的含有LTL的溶液添加作为含生物素的交联剂的5-(N-琥珀酰亚胺基氧基羰基)戊基D-生物素酰胺〔(株)同仁化学研究所制、商品名：Biotin-AC5-Osu〕至LTL/交联剂(摩尔比)成1/100。通过将得到的溶液于25℃温育90分钟，使上述LTL和含上述生物素的交联剂反应，得到反应产物。
(1-2'-2)生物素化LTL的纯化
由高效液相层析，在以下的条件下纯化在(1-2'-1)中得到的反应产物，得到纯化生物素化LTL。
·溶出溶剂：磷酸缓冲液(pH6.5)
·分离柱：凝胶过滤柱
含有(1-2'-3)链霉亲和素结合粒子的液的调制
将链霉亲和素(STA)固定化于磁性粒子(平均粒径2μm)的表面的复合体(磁性粒子每1g的链霉亲和素的量：2.9～3.5mg，以下，也称为“STA结合磁性粒子”)用0.01M HEPES缓冲液(pH7.5)清洗3次。以STA浓度成为18～22μg/mL(STA结合磁性粒子的浓度是0.48～0.52mg/mL)的方式向0.01M HEPES缓冲液(pH7.5)添加清洗后的STA结合磁性粒子，得到含有STA结合粒子的液。
(1-2'-4)LTL固定化载体的调制
以生物素化LTL的浓度成为20μg/mL的方式向得到的含有STA结合粒子的液添加所述生物素化LTL，使STA结合磁性粒子的链霉亲和素和生物素LTL的生物素结合。将得到的产物用0.1M MES缓冲液(pH6.5)清洗3次，得到LTL固定化载体。将得到的LTL固定化载体悬浮于MES缓冲液，得到含有LTL固定化载体的液。
(1-3)含标记M2BP抗体的溶液(第3试剂)
作为目标物质，在使用M2BP的系中使用Sysmex株式会社制的HISCL(商标)M2BPGi(商标)R3试剂。
(1-3')含标记MUC1抗体的溶液(第3试剂)
作为MUC1抗体，使用MY.1E12(Journal of Immunological Methods Volume 270,Issue 2,15December 2002,Pages 199-209)。向磷酸缓冲液溶解MUC1抗体，将得到的溶液的EDTA浓度调整到1mM。向抗体溶液适量添加2-巯基乙基胺盐酸盐溶液，于37℃反应指定时间。其后，使用PD-10柱(GE Healthcare日本)使抗体溶液脱盐，调整到指定浓度。
向N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解作为ALP标记剂的马来酰亚胺交联剂，调制马来酰亚胺交联剂溶液。向ALP溶液适量添加上述的马来酰亚胺交联剂溶液，置于37℃指定时间，导入马来酰亚胺基。其后，使用PD-10柱(GE Healthcare日本)使溶液脱盐，调整到指定浓度。
将上述的抗体溶液和上述的ALP溶液以指定比例混合，放入到冰箱，使发生偶联反应。其后，添加2-巯基乙基胺盐酸盐溶液，停止反应。对ALP抗体溶液进行凝胶过滤，回收期望的级分。
得到的期望的级分用含BSA的缓冲液溶解至指定的浓度，作为标记MUC1抗体的第3试剂使用。
(1-3")含标记结合珠蛋白抗体的溶液(第3试剂)
从ABCAM公司(厂商货号：AB13429)入手标记结合珠蛋白抗体，用与1-3'同样的方法标记化而作为标记结合珠蛋白抗体的第3试剂使用。
(1-4)测定用缓冲液(第4试剂)
使用Sysmex株式会社制的HISCL(商标)R4试剂。
(1-5)基质(第5试剂)
以作为碱性磷酸酶的化学发光底物而使用CDP-Star(商标)(Applied Biosystems公司)的HISCL(商标)R5试剂(Sysmex株式会社制)作为第5试剂使用。
(1-6)受试体
作为测定受试体，使用人血清的原液和将上述人血清使用HISCL(商标)受试体稀释液稀释2倍、4倍、8倍的稀释血清。
【2.实施例1】
探讨甘油的添加对稀释直线性的影响。使用上述的第1至第5试剂，由全自动免疫测定装置HISCL(商标)5000(Sysmex株式会社制)测定M2BP。在测定时，以成为15w/w％的方式向HISCL(商标)M2BPGi(商标)的R1试剂添加甘油。将R1试剂100μl、R2试剂30μl和测定受试体10μl混合，在根据装置的设定温育之后进行B/F分离，添加R3试剂而取得测定值(发光强度)。
基于测定结果而求出从稀释倍数得到的理论上的回归直线和实测结果的相关系数(R2值)。
如图2所示，与参照(未添加)相比，添加甘油的检测系也可显示良R2值，显示受试体稀释直线性的明显提升。
【3.实施例2】
探讨甘油及其他物质的添加对稀释直线性的影响。以成为15w/w％的方式向HISCL(商标)M2BPGi(商标)的R1试剂添加tween80、NaCl、牛血清白蛋白(BSA)或甘油，与实施例1同样地探讨M2BP测定的稀释直线性。如图3所示表明，与参照(未添加)相比，仅甘油，与添加其他物质时比较，显示良好的R2值的受试体稀释直线性的明显提升。
【4.实施例3】
接下来，以成为15w/w％的方式向HISCL(商标)M2BPGi(商标)的R1试剂添加碳原子数不同的甲醇(C1)、乙醇(C2)、甘油(C3)、戊醇(C5)、庚醇(C7)、辛醇(C8)，确认M2BP测定对受试体稀释直线性的影响。测定与实施例1同样地进行。如图4所示，在碳原子数1～7、特别碳原子数2～7的醇中，显示受试体稀释直线性的提升。一方面，即使添加碳原子数8的辛醇，也确认不到受试体稀释直线性的提升。
【5.实施例4】
改变凝集素及目标物质而确认受试体的稀释直线性。作为凝集素，使用WFA或Lotus tetragonolobus Lectin(LTL)。作为目标物质，使用M2BP、MUC1或结合珠蛋白。在使用LTL的系中，作为第2试剂，使用(1-2')中所述的固定LTL凝集素的磁性粒子。在对MUC1进行测定时，作为第3试剂，使用(1-3')中所述的含标记MUC1抗体的溶液。在对结合珠蛋白进行测定时作为第3试剂，使用(1-3")中所述的标记结合珠蛋白抗体。在全部检测系，作为第1试剂，使用HISCL(商标)M2BPGi(商标)的R1试剂，向第1试剂与实施例1同样地添加甘油。测定与实施例1同样地进行。
结果示于图5至图7。作为凝集素，使用WFA的检测系(图5及图6)，无论目标物质(M2BP及MUC1)，显示由甘油添加而受试体稀释直线性的提升。一方面，作为凝集素，使用LTL的结合珠蛋白的检测系(图7)由甘油的添加，受试体稀释直线性降低。
从而表明，醇的添加尽管不选目标物质，对于使用WFA的检测系有用。
【6.实施例5】
为了确认其他醇的效果，甘油之外，添加二甘油、乙二醇、二乙二醇、二丙二醇、PEG6000，以目标物质作为M2BP来探讨受试体稀释直线性。再者，添加在专利文献1中在抑制标记化凝集素的非特异结合的处理中使用的还原剂(硫代甘油)，进行与甘油的性能比较。各添加剂向第1试剂添加，测定与实施例1同样地进行。如图8所示，由二甘油、乙二醇、二乙二醇、二丙二醇，受试体稀释直线性也提升。一方面，在添加作为高分子甘油类的PEG6000时，相反受试体稀释直线性显著地降低。另外，在添加硫代甘油时，也发生受试体稀释直线性的显著的性能降低。
从以上的结果可知，即使作为碳原子数3～6的醇，添加其他甘油化合物，也确认到受试体稀释直线性的提升。
【7.实施例6】
接下来，将添加到R1试剂中的甘油浓度改变为0w/w％、5.0w/w％、12.5w/w％、15.0w/w％、20.0w/w％，探讨以目标物质作为M2BP之时的受试体稀释直线性。各添加剂向第1试剂添加，测定与实施例1同样地进行。如图9所示，以5.0w/w％、12.5w/w％、15.0w/w％、20.0w/w％之任一者的浓度，受试体稀释直线性提升。
从以上的结果确认到，向使用WFA的检测系添加碳原子数1～7的醇提升受试体的稀释直线性。另外，由于提升受试体的稀释直线性，认为还可期待检查精度的提升。

Claims (19)

1.目标物质的检测方法，其包括：
通过将固定化于载体的多花紫藤(Wisteria floribunda)的凝集素(WFA)和含与WFA结合的糖链的目标物质在仅由碳原子、氢原子、及氧原子构成的碳原子数1～7的醇的存在下混合，在所述载体上形成含WFA和目标物质的复合体的工序、及
通过检测所述复合体，检测目标物质的工序。
2.权利要求1所述的检测方法，其中
在所述形成工序中，在所述醇的存在下混合所述WFA、所述目标物质和与所述目标物质结合并且具有标记物质的检测物质，形成含所述WFA、所述目标物质和所述检测物质的复合体，
在所述检测工序中，基于所述复合体的标记物质来检测所述复合体。
3.权利要求1或2所述的检测方法，其中所述醇的碳原子数是2～7。
4.权利要求1～3之任一项所述的检测方法，其中所述醇是选自下列的至少1种醇：甲醇、乙醇、甘油、戊醇、庚醇、二甘油、乙二醇、二乙二醇、丙二醇、二丙二醇、三乙二醇及这些的混合物。
5.权利要求1～4所述的检测方法，其中在所述形成工序中，在2～20w/w％的浓度的醇的存在下形成所述复合体。
6.权利要求1～5所述的检测方法，其中目标物质是糖蛋白质。
7.权利要求6所述的检测方法，其中目标物质是Mac-2-结合蛋白(M2BP)、细胞表面相关的Mucin 1(MUC1)、α1酸性糖蛋白质(AGP)、神经细胞接附分子L1(L1CAM)、或者KL-6抗原。
8.权利要求1～7之任一项所述的检测方法，其中所述检测物质是与所述目标物质特异性地结合的抗体。
9.权利要求1～8之任一项所述的检测方法，其中所述标记物质是选自下列的至少1种：半抗原、酶及荧光物质。
10.权利要求1～9之任一项所述的检测方法，其中所述载体是粒子。
11.权利要求1～10之任一项所述的检测方法，其中在所述检测工序中，对目标物质进行定量。
12.目标物质的检测方法，其包括：
通过将固定化于载体的多花紫藤(Wisteria floribunda)的凝集素(WFA)和含与WFA结合的糖链的目标物质在碳原子数1～7的醇的存在下混合，在所述载体上形成含WFA和目标物质的复合体的工序，其中所述醇不包括硫代甘油，及
通过检测所述复合体，检测目标物质的工序。
13.目标物质的检测方法，其包括：
通过将固定化于载体的多花紫藤(Wisteria floribunda)的凝集素(WFA)和含与WFA结合的糖链的目标物质在碳原子数1～7的醇的存在下混合，在所述载体上形成含WFA和目标物质的复合体的工序，其中所述醇不包括含巯基的醇，及
通过检测所述复合体，检测目标物质的工序。
14.用于检测目标物质的试剂，其中
所述试剂含仅由碳原子、氢原子、及氧原子构成的碳原子数1～7的醇，
所述目标物质含与多花紫藤(Wisteria floribunda)的凝集素(WFA)结合的糖链。
15.用于检测目标物质的试剂，其中
所述试剂含碳原子数1～7的醇，其中所述醇不包括硫代甘油，
所述目标物质含与多花紫藤(Wisteria floribunda)的凝集素(WFA)结合的糖链。
16.用于检测目标物质的试剂，其中
所述试剂含碳原子数1～7的醇，其中所述醇不包括含巯基的醇，
所述目标物质含与多花紫藤(Wisteria floribunda)的凝集素(WFA)结合的糖链。
17.用于检测目标物质的试剂盒，其中所述试剂盒含：
目标物质的检测物质；
多花紫藤(Wisteria floribunda)的凝集素(WFA)；及
仅由碳原子、氢原子、及氧原子构成的碳原子数1～7的醇，
其中所述目标物质含与WFA结合的糖链。
18.用于检测目标物质的试剂盒，其中所述试剂盒含：
目标物质的检测物质；
多花紫藤(Wisteria floribunda)的凝集素(WFA)；及
碳原子数1～7的醇，其中所述醇不包括硫代甘油，
其中所述目标物质含与WFA结合的糖链。
19.用于检测目标物质的试剂盒，其中所述试剂盒含：
目标物质的检测物质；
多花紫藤(Wisteria floribunda)的凝集素(WFA)；及
碳原子数1～7的醇，其中所述醇不包括硫代甘油，
其中所述目标物质含与WFA结合的糖链。
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