CN108351359A - 用于预测肝硬化患者的肝细胞癌发生风险和预后的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供用于准确地预测肝硬化患者的肝细胞癌发病风险和预后(生存率)的方法和试剂盒。根据本发明，提供：作为含有WFA/VVA结合性糖的CSF1R相对于体液(血清)中的总CSF1R的比例(WFA⁺‑CSF1R％)而算出用于预测肝硬化患者的肝细胞癌的发病风险和预后的“肝细胞癌发病风险判定指数”的方法；作为含有WFA/VVA结合性糖链的CSF1R量(WFA⁺‑CSF1Rng/ml)而算出“预后判定指数”的方法。进而确定了两者的最佳截止值，验证了如果受试者的“肝细胞癌发病风险判定指数”在该最佳截止值以上则肝细胞癌发病风险显著高，如果“预后判定指数”在该最佳截止值以上则预后显著不良。另外，提供对体液试样中的含有WFA/VVA结合性糖链的CSF1R等CSF1R的检测性优异的抗CSF1R抗体(CSR‑1～30)，发现可使用WFA凝集素以外的srWFA和VVA凝集素，进而验证了代替总CSF1R量的测定，测定与CSF1R特异性凝集素结合的CSF1R量即可。还提供作为构成要素含有这些抗CSF1R抗体和各凝集素的用于测定肝硬化患者的“肝细胞癌风险判定指数”和/或“预后判定指数”的试剂盒等。

Description

用于预测肝硬化患者的肝细胞癌发生风险和预后的方法

技术领域

本申请的发明涉及用于在作为重症肝病病情的肝硬化中准确地把握向肝细胞癌的发展、评价其预后和治疗后的复发的方法和试剂盒。更详细而言，提供用于判定肝硬化中的肝细胞癌发生风险和准确地判定治疗后的预后(生存率)的方法和试剂盒，其中利用在肝硬化(F4)中与肝细胞癌的发生相关性高的肝细胞癌糖链生物标志物将肝硬化或肝细胞癌的重症度以“肝细胞癌风险判定指数”和/或“肝硬化预后判定指数”定量化。

背景技术

肝癌可以大致分为在肝脏中发生的原发性肝癌和转移性肝癌，一般来说，原发性肝癌中的90％为肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma：HCC)。

作为基础疾病，肝细胞癌患者大多感染过丙型肝炎病毒或乙型肝炎病毒，在罹患病毒性肝炎后，随着病情从急性病毒性肝炎缓慢地发展为慢性病毒性肝炎、肝硬化，肝功能下降，随着肝炎病情的发展和持续而进入肝脏纤维化，直至肝硬化。癌变率也随着病情的发展而上升，就癌变率而言，在轻度(F1)或中度(F2)的慢性肝炎的阶段每年为0.8～0.9％左右，一旦发展为重度慢性肝炎(F3)则每年达到3.5％，由肝硬化(F4)发展为癌症的概率也上升为每年7％。或者，在重症情况下也存在引起肝衰竭而致死的情况。

在肝细胞癌的治疗中，癌症的早期发现极大地影响着治疗、术后预后，因此是至关重要的，在肝硬化患者的情况下，需要每3个月1次左右地接受检查以检测肝癌。为了进一步简化该检查，需要提供能够通过血液检查准确且简便地判定有无癌变的方法。

目前，作为血清中的肝癌标志物，有时使用AFP(甲胎蛋白)(专利文献1)和PIVKA-II(protein induced by Vitamin K absence or antagonist-II，维生素K缺乏或拮抗剂-II诱导的蛋白质)(专利文献2)等，任一者的特异性、灵敏度均不充分，尚不能准确判定。因此，在用于肝细胞癌的早期发现的诊查中，以超声波检查、电子计算机X射线断层扫描(CT)、核磁共振造影法(MRI)等造影检查为主，肝癌标志物的应用仅发挥辅助作用。

本发明人此前为了提供能够通过血液等体液的检查来检测癌变的能够区别肝疾病病情的糖链标志物和肝细胞癌标志物，一直着眼于存在于血清中的各种糖蛋白上的糖链结构的变化而进行研究开发。并且发现：在肝炎患者血清中，一直作为肝细胞癌标志物使用的CSF1R(非专利文献1等)蛋白的量虽然会随着等级从F1向F4的提高而逐渐增加，但如果着眼于CSF1R糖蛋白上的糖链结构，则WFA凝集素结合性糖链在F1～F3等级中几乎不表达、在F4等级的肝硬化患者中显著增加(专利文献3，非专利文献2)。部分数据暗示其可能反映了肝细胞癌的发生(专利文献3)，但是在肝硬化患者组中在是否罹患肝癌方面未见显著性差异(非专利文献2)。即，表明血清中的CSF1R上的WFA结合性糖链量对于肝脏病情的重症度判别和肝硬化检测而言为极其有效的标志物，与此相对地，未能验证对于所期待的肝细胞癌检测的有效性。

如此地，血清中的CSF1R糖蛋白量本身随着等级从F1提高到F4而增加，因此，其可能成为表示肝脏纤维化度的指标，即使血清中的CSF1R上的WFA结合性糖链量的数值增加为检测肝硬化发生的有效指标，也不能说都准确地预测了肝细胞癌的发生。特别是难以用于对肝硬化患者进行肝细胞癌的早期预测。

因此，当务之急是开发出如下技术：也能够应用于肝硬化患者的、用于仅通过由血液试样测定的数值准确地预测肝细胞癌发生的技术。

另外，在肝疾病的病情发展、进入纤维化至肝硬化(F4)的情况下，进行病变部的切除的肝切除治疗是常规方案，但是，肝切除治疗的5年生存率在F1阶段为80％，在肝硬化的情况下仅为38％。因此，为了肝硬化患者的随访，需要在早期阶段尽量准确地判定肝硬化患者的预后并确定术后方针。目前，如果血清中的白蛋白值为3.5以上则判定为未见肝脏整体功能下降，并进行预后的预测，但该数值未必能准确地反映肝硬化患者或处于肝疾病病情高等级的(F4)患者的预后，现实是最终还是凭借手术实施者(医师)的经验和直觉。

因此，对于成为肝硬化患者的预后判定的更准确指标的糖链标志物、数值等关系到有效的预后诊断的判定方法，仍然有着强烈的需求。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开平10-26622号。

专利文献2：日本特开平8-184594号。

专利文献3：国际公开2011-007764(WO2011/007764)。

专利文献4：国际公开2014-098112(WO2014/098112)。

非专利文献

非专利文献1：Kaji H等,J Proteome Res.2013Jun 7；12(6)：2630-40。

非专利文献2：Makoto Ocho等,Journal of Proteome research,2014,13,1428-1437。

发明内容

发明要解决的课题

本发明的课题在于，提供即使对于肝硬化患者也能够通过体液(血液)检查准确且简便地预测癌变的可能性的肝细胞癌风险判定方法，另外，提供提供用于准确且简便地判定肝硬化患者的预后的肝硬化预后判定方法。具体而言，想要提供准确地定量肝硬化患者的体液例如血清中的CSF1R上的糖链结构的变化中、向着直接反映肝细胞癌的发生和/或肝硬化的预后的WFA结合性糖链变化的比例的方法。

用于解决课题的手段

如上所述，本发明人发现：体液(血清)中的含有WFA结合性糖链的CSF1R量的增加与肝脏病情的重症化具有高相关性，进而还推定其可能反映着肝细胞癌的发生(专利文献3)，因此，首先构建了使用抗CSF1R抗体和WFA凝集素的测试体系，并使用该测定体系测定来自肝炎患者和来自肝癌患者的体液(血清)试样中的含有WFA结合性糖链的CSF1R量，研究是否罹患肝细胞癌是否会导致含有WFA结合性糖链的CSF1R量的差异。结果获知，其在肝炎患者整体中具有显著性差异，对肝细胞癌的检测有效。但是存在如下缺陷：含有WFA结合性糖链的CSF1R量的增加与肝炎病情的重症度、纤维化度的相关性也高，因此对于肝细胞癌风险原本就高、从而必然需要准确的诊断的肝硬化患者等重症患者不能准确地预测判定肝细胞癌的发生。

因此，本发明人着眼于已经罹患肝硬化但未罹患肝细胞癌的患者组(不具有HCC的LC患者)，对这些患者进行随访，并且详细地研究与此后的肝细胞癌发生率有相关性的标志物和计算式。

结果发现，在肝硬化患者中，体液(血清)中的、含有WFA结合性糖链的CSF1R相对于总CSF1R的比例(WFA⁺-CSF1R％)、同样地含有WFA结合性糖链的CSF1R相对于含有CSF1R特异性凝集素结合性糖链的CSF1R的比例，与肝细胞癌的发生具有高度相关关系。需要说明的是，其中，“CSF1R特异性凝集素”是指：在对健康人和患者的血清等体液中的CSF1R上的糖链的反应性方面没有差异的凝集素。也称为“对CSF1R所含糖链特异性凝集素”、“CSF1R特异性共同糖链结合性凝集素”、“总CSF1R共同糖链结合性凝集素”、“CSF1R恒定的糖链结构结合性凝集素”。即，意味着与体液中的总CSF1R蛋白上的糖链反应的凝集素，因此，作为含有WFA结合性糖链的CSF1R量相对于体液中的总CSF1R量的测定的替代，也可以改称为“WFA结合性糖链量”相对于“CSF1R特异性凝集素结合性糖链量”的比例。各凝集素结合性糖链量正比于对各凝集素的反应性强度，因此，这意味着肝硬化患者的肝细胞癌发生率能够仅通过对被检体液试样中的2种凝集素的反应性的比率来测定。作为CSF1R特异性凝集素，典型例子相当于非专利文献1的图3B所示的RCA120、DSA、PHA-E4、SNA、SSA、TJA-I、LEL、STL、ConA等凝集素。后者实质上与前者同样地表示含有WFA结合性糖链的CSF1R相对于体液中的总CSF1R的比例，因此将两者一并命名为“肝细胞癌风险判定指数(WFA⁺-CSF1R％)”。具体为“含有WFA结合性糖链的CSF1R量/总CSF1R量×100”的值或“含有WFA结合性糖链的CSF1R量/含有CSF1R特异性凝集素结合性糖链的CSF1R量×100”的值或“CSF1R分子上的WFA结合性糖链量/CSF1R特异性凝集素结合性糖链量×100”的值。将这些值和肝硬化患者的肝细胞癌癌变率利用通过对数秩检验确定的最小P值法求出最佳截止值，结果为35％。因此，将肝细胞癌尚未发病的肝硬化患者分成35％以上的高值组和小于35％的低值组并进行卡普兰-梅尔分析(Kaplan-Meier)，得到WFA⁺-CSF1R％高值组的5年累积癌变率显著高(P＝0.006或0.005)的结果。这表明，“WFA⁺-CSF1R％”的值为对肝硬化患者极其有效的“肝细胞癌风险判定指数”。

另一方面，在研究肝硬化患者的治疗后的生存率中，发现含有WFA结合性糖链的CSF1R量(WFA⁺-CSF1R值)的数值直接地与肝硬化患者生存率具有高度相关关系。具体而言，用最小P值法导出WFA⁺-CSF1R的最佳截止值为310ng/ml，通过时间依赖性ROC曲线研究生存率时，WFA⁺-CSF1R值为310ng/ml以上时HR为3.63(95％CI1.25-10.54，p＝0.011)，通过卡普兰-梅尔分析(Kaplan-Meier)研究肝硬化患者的累积生存率时，WFA⁺-CSF1R值高值组与低值组相比生存率显著低。这表明，WFA⁺-CSF1R值成为预测肝硬化患者的预后的有效指标，即成为“肝硬化的预后判定指数”。

进而，本发明人为了提高CSF1R上的WFA凝集素识别糖链量和总CSF1R量的测定值的精度和稳定性，尝试了阐明发生肝细胞癌时特异性增加的CSF1R上的WFA凝集素识别糖链结构以及制造高活性的抗CSF1R检测用抗体。

首先，克隆CSF1R基因并制造重组CSF1R，阐明CSF1R上的糖链结合位置和各个糖链结构，进行CSF1R上的WFA凝集素识别糖链结构的确定。

本发明人以前曾经克隆重组WFA基因并进行阻止C末端侧的S-S键的形成的改造而制造出单体化的重组WFA(以下，也称为srWFA)，发现该srWFA与LDN糖链(在非还原末端具有“GalNAcβ1-4GlcNAcβ1-R”的糖链)特异性地结合(专利文献4)。使该单链重组WFA(srWFA)与血清试样的抗CSF1R抗体免疫沉降物反应，结果显示了CSF1R上的WFA凝集素识别糖链结构是srWFA特异性地识别的LDN糖链的可能性，通过使用LDN缺损株的实验基本验证其为LDN糖链。

进而，对重组CSF1R应用Glyco-Ridge法(糖肽·糖链结构分析法)确定糖链的结合位置，结果阐明其结合于CSF1R的第1结构域(1-87aa)的第73位和第2结构域(88-209aa)的第153位的至少2个位置。并且，同时尝试调查市售的重组CSF1R(Fc融合型(NS0)；研发系统公司(R&D systems Corporation)制)上的糖链结构，则阐明市售的重组CSF1R(NS0)都丧失了LDN糖链。

构建了使用本发明人开发的srWFA凝集素代替天然WFA的WFA凝集素-抗CSF1R抗体的ELISA测试体系(酶联免疫吸附测定测试体系)，得到了与使用天然型WFA凝集素时相比灵敏度良好的结果。另外确认，识别LDN糖链的还原末端侧GalNAc的VVA凝集素也具有与WFA凝集素同样的结合活性。即，“WFA⁺-CSF1R量”也可以称为“含有WFA和/或VVA(以下，有时也记作WFA/VVA)结合性糖链的CSF1R量”，可称为“含LDN糖链的CSF1R量”的可能性极高。

然后，以CSF1R为免疫原按照常规方法制作了多种抗CSF1R单克隆抗体。从这些抗CSF1R单克隆抗体中选择对CSF1R的亲和性高的33个克隆，利用直接ELISA检验CSF1R结合活性，并且检验在与天然WFA凝集素或单体重组WFA(srWFA)凝集素的夹心测试体系中的CSF1R上的LDN糖链的检测性能，进一步选择出检测性能特别高的多个抗CSF1R单克隆抗体。需要说明的是，将这33个克隆的抗体产生杂交瘤分别称为杂交瘤CSR-1～CSR-33，将各杂交瘤所产生的单克隆抗体分别称为CSR-1～CSR-33抗体。

并且还获知，CSF1R上的LDN糖链的检测性能高的抗体的识别结构域大多集中在第2结构域或第3结构域。另外，在凝集素-抗体夹心测试体系中的检测能力与识别结构域的位置无关，(表5)中作为在WFA-CSF1R抗体夹心ELISA体系中能够检测的抗体而示出的抗体、具体为CSR-3、CSR-4、CSR-18、CSR-21、CSR-30、CSR-5、CSR-6、CSR-22、CSR-24、CSR-7、CSR-9、CSR-13、CSR-26、CSR-27、CSR-29抗体优异，特别是CSR-3、CSR-4、CSR-18、CSR-21、CSR-30抗体的检测能力高。需要说明的是，典型的抗CSF1R单克隆抗体产生杂交瘤已经在NPMD进行了保藏(杂交瘤CSR-3、CSR-4、CSR-18、CSR-21和CSR-30分别以保藏号：NITE AP-02117～NITEAP-02121进行了保藏。然后被赋予保藏号：NITE P-02117～NITE P-02121于2016年9月7日转为国际保藏，分别被赋予NITE BP-02117～NITE BP-02121。)。

以上表明，通过将这些抗CSF1R单克隆抗体用于CSF1R分子检测用测试体系和/或与天然WFA凝集素、重组WFA、单体重组凝集素(srWFA)或VVA凝集素一起用于夹心ELISA测试体系，能够更准确地测定受试者的体液(血清)中的CSF1R量以及含有WFA和/或VVA(WFA/VVA)结合性糖链的CSF1R量。已经实际确认，与健康人相比，在具有肝硬化背景的肝细胞癌患者的体液(血清)试样中利用CSR-3、CSR-4、CSR-18、CSR-21、CSR-30、CSR-5和CSR-6抗体能够检测到CSF1R信号的增强。即，通过使用将WFA/VVA结合性糖链结合性凝集素与CSR-3或CSR-4、CSR-18、CSR-21、CSR-30抗体等组合的夹心ELISA测试体系，能够测定准确的WFA⁺-CSF1R的数值。这意味着，不仅能够精度良好地进行本发明的肝硬化患者的肝细胞癌发生的风险预测和预后的预测，而且还能够广泛用于对肝疾病患者或疑似患者判定有无肝疾病或其重症度(纤维化度)的用途。

通过得到以上见解而完成了本申请发明。

即，本申请发明如下所述。

〔1〕肝硬化患者的肝细胞癌的发病风险值的算出方法，其中，其包括(1)～(4)的工序：

(1)测定采自肝硬化患者的受试者的一定体积的体液试样(以下，也简称为被检试样)中的总CSF1R量(A)的工序；

(2)测定被检试样中的含有WFA/VVA结合性糖链的CSF1R量(B)的工序；和

(3)将含有WFA/VVA结合性糖链的CSF1R量在总CSF1R中所占的比率(C)作为“C(％)＝(B)/(A)×100”而算出的工序；

(4)将工序(3)中得到的C％的值确定为受试者的肝细胞癌的发病风险值的工序。

其中，有时也将肝细胞癌癌变风险指数值(C％)记作(WFA⁺-CSF1R％)。

〔2〕根据前述〔1〕所述的方法，其特征在于，(1)的测定总CSF1R量的工序，利用使用至少2种抗CSF1R抗体的夹心测试体系进行测定，或者使用抗CSF1R抗体从被检试样中纯化CSF1R并测定纯化CSF1R量。

〔3〕根据前述〔1〕所述的方法，其特征在于，(1)的测定被检试样中的总CSF1R量(A)的工序是测定被检试样中的含有CSF1R特异性凝集素结合性糖链的CSF1R量的工序，在该工序中，利用至少含有CSF1R特异性凝集素和抗CSF1R抗体的夹心测试体系进行测定，或者使用抗CSF1R抗体从被检试样中纯化CSF1R并测定与CSF1R特异性凝集素结合的纯化CSF1R量。

〔4〕根据前述〔3〕所述的方法，其中，CSF1R特异性凝集素是从由RCA120、DSA、PHA-E4、SNA、SSA、TJA-I、LEL、STL和ConA组成的组中选出的至少1种凝集素。

〔5〕根据前述〔1〕～〔4〕中任一项所述的方法，其特征在于，(2)的测定含有WFA/VVA结合性糖链的CSF1R量(B)的工序，利用至少含有WFA/VVA结合性糖链特异性凝集素和抗CSF1R抗体的夹心测试体系进行测定，或者使用抗CSF1R抗体从被检试样中纯化CSF1R并测定与WFA/VVA凝集素结合的纯化CSF1R量。

〔6〕根据前述〔5〕所述的方法，其中，WFA/VVA凝集素是从天然WFA、重组WFA、单体重组WFA和VVA中的任一者中选出的至少1种凝集素。

〔7〕根据前述〔3〕～〔6〕中任一项所述的方法，其特征在于，工序(1)和工序(2)是至少使用CSF1R特异性凝集素和WFA/VVA凝集素以及抗CSF1R抗体并且同时进行的工序，在该工序中，使用含有这两种凝集素和抗CSF1R抗体的相同夹心测试体系进行测定，或者使用抗CSF1R抗体从被检试样中纯化CSF1R后、使用相同测试体系测定与各凝集素结合的CSF1R量。

〔8〕判定肝硬化患者的肝细胞癌的发病风险值的方法，其中，其包括(1)～(3)的工序：

(1)按照前述〔1〕～〔7〕中任一项所述的方法算出作为肝硬化患者的受试者的肝细胞癌的发病风险值(C％)的工序；

(2)对预先采自足够的参量的未罹患肝细胞癌的肝硬化患者的各体液试样，利用与工序(1)相同的算出工序，将各自的含有WFA/VVA结合性糖链的CSF1R量在总CSF1R中所占的比率(Cn)与随访各个患者而得到的肝细胞癌发病率数据进行对比，从而算出肝细胞癌发病的最佳截止值(M％)的工序；

(3)将工序(1)中算出的肝细胞癌的发病风险值(C％)与(2)中算出的最佳截止值(M％)对比，超过时判定为受试者的肝细胞癌发病风险显著高，小于最佳截止值则判定为发病风险显著低。

其中，最佳截止值为基于预先随访足够的参量的未罹患肝细胞癌的肝硬化患者而得到的癌变率数据而算出的值，例如可以对癌变率数据应用通过对数秩检验确定的最小P值法将上下10％除外而求出。需要说明的是，足够的参量是指10～6000例、10～5000例、10～4000例、10～3000例、10～1000例，优选为30～3000例、30～2000例、30～1000例，更优选为40～2000例、40～1000例、50～2000例、50～1000例，进一步优选为50～500例、100～500例。

另外，本判定方法还可以表述为：用于预测肝硬化患者的肝细胞癌的发病风险的肝细胞癌发病风险指数(C％)的测定方法、或提供用于诊断肝细胞癌的发病风险的资料(信息)的方法等。

〔9〕根据前述〔8〕所述的方法，其中，前述最佳截止值是35.0±10.0％的值。

〔10〕肝硬化患者的预后判定指数值的算出方法，其中，其包括(1)和(2)的工序：

(1)测定采自作为肝硬化患者的受试者的一定体积的体液试样(被检试样)中的含有WFA/VVA结合性糖链的CSF1R量(B)的工序；

(2)将工序(1)中得到的B ng/ml的值确定为受试者的预后判定指数值的工序。

其中，预后判定指数值(B ng/ml)也记为(WFA⁺-CSF1R ng/ml)。

〔11〕根据前述〔10〕所述的方法，其特征在于，(1)的测定含有WFA/VVA结合性糖链的CSF1R量(B)的工序，利用至少含有WFA/VVA凝集素和抗CSF1R抗体的夹心测试体系进行测定，或者使用抗CSF1R抗体从被检试样中纯化CSF1R并测定与WFA/VVA凝集素结合的纯化CSF1R量。

〔12〕根据前述〔11〕所述的方法，其中，WFA/VVA凝集素是从天然WFA、重组WFA、单体重组WFA和VVA中的任一者中选出的至少1种凝集素。

〔13〕判定肝硬化患者的预后的方法，其中，其包括(1)～(3)的工序：

(1)按照前述〔10〕～〔12〕中任一项所述的方法算出作为肝硬化患者的受试者的预后判定指数值(B ng/ml)的工序，

(2)对预先采自足够的参量的未罹患肝细胞癌的肝硬化患者的各体液试样，利用与工序(1)相同的算出工序，将各自的含有WFA/VVA结合性糖链的CSF1R量(Bn)与随访各个患者而得到的累积生存率数据对比，从而算出肝细胞癌患者预后的最佳截止值(N ng/ml)的工序；

(3)将工序(1)中算出的预后判定指数值(B ng/ml)与(2)中算出的最佳截止值(Nng/ml)对比，超过时判定为受试者的受试者的预后显著不良，小于最佳截止值则判定为受试者的预后显著良好。

其中，最佳截止值为基于预先随访足够的参量的未罹患肝细胞癌的肝硬化患者而得到的累积生存率而算出的值，例如可以通过对5年累积生存率数据应用通过对数秩检验确定的最小P值法并将上下10％除外而求出。需要说明的是，足够的参量是指10～6000例、10～5000例、10～4000例、10～3000例、10～1000例，优选为30～3000例、30～2000例、30～1000例，更优选为40～2000例、40～1000例、50～2000例、50～1000例，进一步优选为50～500例、100～500例。另外，预后判定指数值(B ng/ml、WFA⁺-CSF1R ng/ml)的值也以COI形式算出并用于判定。

另外，本判定方法还可以表述为用于预测肝硬化患者的预后的预后判定指数(Bng/ml)的测定方法、或提供用于诊断肝硬化患者的预后的资料的方法。

〔14〕根据前述〔13〕所述的方法，其中，前述最佳截止值是310±100ng/ml的值。

〔15〕用于检测或定量含有WFA/VVA结合性糖链的CSF1R的凝集素-抗体夹心测试，其中，其使用：WFA/VVA凝集素和从由CSR-3、CSR-4、CSR-18、CSR-21、CSR-30、CSR-5、CSR-6、CSR-22、CSR-24、CSR-7、CSR-9、CSR-13、CSR-26、CSR-27和CSR-29抗体组成的组中选出的至少1种抗CSF1R抗体，并且含有(1)～(3)的工序：

(1)在液相中使前述凝集素或前述抗CSF1R抗体中的任一者与被检试样接触而形成与被检试样中的CSF1R的复合体的工序；

(2)分离(1)中得到的与凝集素或抗体的CSF1R复合体或不进行分离，在溶解或分散有另一者的检测用液相中使另一者与CSF1R复合体结合而得到被凝集素和抗体夹心的CSF1R复合体的工序；

(3)对(2)中得到的凝集素和抗体夹心CSF1R复合体量进行检测或定量的工序。

其中，典型的夹心测试为固相-液相夹心测试、特别是夹心ELISA，当然不限于夹心ELISA，也可以不是固相-液相而是液相-液相。在固相-液相夹心测试的情况下，将凝集素或抗体中的任一者设置于捕捉侧、使另一者溶解或分散于检测用液相侧。另外，在夹心ELISA的情况下，“捕捉侧”成为“固相面”。

〔16〕根据前述〔15〕所述的测试，其中，WFA/VVA凝集素是从由天然WFA、重组WFA、单体重组WFA和VVA组成的组中选出的至少1种凝集素。

〔17〕试剂盒，其为用于检测或定量含有WFA/VVA结合性糖链的CSF1R的凝集素-抗体夹心测试用试剂盒，并且包含(1)和(2)：

(1)WFA/VVA凝集素；

(2)从由CSR-3、CSR-4、CSR-18、CSR-21、CSR-30、CSR-5、CSR-6、CSR-22、CSR-24、CSR-7、CSR-9、CSR-13、CSR-26、CSR-27和CSR-29抗体组成的组中选出的至少1种抗CSF1R抗体。

〔18〕根据前述〔17〕所述的试剂盒，其中，其还含有以下的(3)：

(3)由含有WFA/VVA结合性糖链的CSF1R和/或不含WFA/VVA结合性糖链的CSF1R构成的标准物质。

〔19〕根据前述〔18〕或〔19〕所述的试剂盒，其中，WFA/VVA凝集素是从由天然WFA、重组WFA、单体重组WFA和VVA组成的组中选出的至少1种凝集素。

〔20〕根据前述〔17〕～〔19〕中任一项所述的试剂盒，其中，凝集素-抗体夹心测试为应用于来自受试者的体液试样并且用于检测或定量体液试样中的含有WFA/VVA结合性糖链的CSF1R的测试。

〔21〕抗CSF1R抗体或其抗体结合性片段，其中，其由从由CSR-3(国际保藏号：NITEBP-02117)、CSR-4(国际保藏号：NITE BP-02118)、CSR-18(国际保藏号：NITE BP-02119)、CSR-21(国际保藏号：NITE BP-02120)、CSR-30(国际保藏号：NITE BP-02121)组成的组中选出的任一杂交瘤产生。

〔22〕试剂盒，其特征在于，其为用于算出作为肝硬化患者的受试者的肝细胞癌发病风险值和/或预后判定值的试剂盒，并且包含(1)和(2)的凝集素：

(1)WFA/VVA凝集素；

(2)CSF1R特异性凝集素。

需要说明的是，该试剂盒还可以包含由含有WFA/VVA结合性糖链的CSF1R和/或不含WFA/VVA结合性糖链的CSF1R构成的标准物质。

〔23〕根据前述〔22〕所述的试剂盒，其特征在于，还包含(3)：

(3)抗CSF1R抗体或其抗体结合性片段。

〔24〕根据前述〔22〕或〔23〕所述的试剂盒，其中，

(1)的WFA/VVA凝集素是从由天然WFA、重组WFA、单体重组WFA和VVA组成的组中选出的至少1种凝集素；

(2)的CSF1R特异性凝集素是从由RCA120、DSA、PHA-E4、SNA、SSA、TJA-I、LEL、STL和ConA组成的组中选出的至少1种凝集素。

〔25〕根据前述〔22〕～〔24〕中任一项所述的试剂盒，其中，(1)或(2)的凝集素中的任一者结合于固相且另一者溶解或分散于检测用的液相，并且所述固相是用于捕捉含有WFA/VVA结合性糖链的CSF1R而设置的。

〔26〕根据前述〔22〕～〔24〕中任一项所述的试剂盒，其中，(1)和(2)的凝集素两者结合于相同或不同的凝集素阵列上。

〔27〕判定用试剂盒，其特征在于，其为用于判定作为肝硬化患者的受试者的肝细胞癌癌变风险和/或预后的试剂盒，并且含有(1)～(3)：

(1)WFA/VVA凝集素；

(2)CSF1R特异性凝集素；

(3)抗CSF1R抗体或其抗体结合性片段。

需要说明的是，该试剂盒中还可以含有由含有WFA/VVA结合性糖链的CSF1R和/或不含WFA/VVA结合性糖链的CSF1R构成的标准物质。

〔28〕根据权利要求27所述的判定用试剂盒，其中，

(1)的WFA/VVA凝集素是从由天然WFA、重组WFA、单体重组WFA和VVA组成的组中选出的至少1种凝集素；

(2)的CSF1R特异性凝集素是从由RCA120、DSA、PHA-E4、SNA、SSA、TJA-I、LEL、STL和ConA组成的组中选出的至少1种凝集素；以及

(3)的抗CSF1R抗体是从由CSR-3、CSR-4、CSR-18、CSR-21、CSR-30、CSR-5、CSR-6、CSR-22、CSR-24、CSR-7、CSR-9、CSR-13、CSR-26、CSR-27和CSR-29抗体组成的组中选出的至少1种抗CSF1R抗体。

〔29〕用于判定作为肝硬化患者的受试者的肝细胞癌发病风险和/或预后的方法，其特征在于，其包括(1)和(2)的工序：

(1)使用抗CSF1R抗体从来自受试者的体液试样中分离纯化CSF1R蛋白的工序；

(2)测定(1)中分离纯化出的CSF1R上的WFA/VVA结合性糖链含量和CSF1R特异性糖链含量的工序。

〔30〕用于判定作为肝硬化患者的受试者的肝细胞癌发病风险和/或预后的方法，其特征在于，其包括(1)和(2)的工序：

(1)使用从由天然WFA、重组WFA、单体重组WFA和VVA组成的组中选出的至少1种凝集素，从来自受试者的体液试样中分离含有WFA/VVA结合性糖链的糖蛋白的工序；

(2)使用抗CSF1R抗体从(1)中分离纯化出的含有WFA/VVA结合性糖链的糖蛋白中检测或定量CSF1R蛋白的工序，

其中，抗CSF1R抗体是从由CSR-3、CSR-4、CSR-18、CSR-21、CSR-30、CSR-5、CSR-6、CSR-22、CSR-24、CSR-7、CSR-9、CSR-13、CSR-26、CSR-27和CSR-29抗体组成的组中选出的至少1种抗CSF1R抗体。

〔31〕用于判定作为肝硬化患者的受试者的肝细胞癌发病风险和/或预后的方法，其特征在于，其包含对来自受试者的体液试样进行使用(1)和(2)的凝集素-抗体夹心测试的工序：

(1)WFA/VVA凝集素；

(2)从由CSR-3、CSR-4、CSR-18、CSR-21、CSR-30、CSR-5、CSR-6、CSR-22、CSR-24、CSR-7、CSR-9、CSR-13、CSR-26、CSR-27和CSR-29抗体组成的组中选出的至少1种抗CSF1R抗体。

〔32〕用于判定未罹患肝细胞癌的肝硬化患者的肝细胞癌发病风险的方法，其特征在于，其包含(1)和(2)的工序：

(1)测定采自作为未罹患肝细胞癌的肝硬化患者的受试者的体液试样中的含有WFA/VVA结合性糖链的CSF1R量和总CSF1R量的工序；

(2)以(1)中得到的测定值为基础算出具有WFA/VVA结合性糖链的CSF1R量在总CSF1R中所占的比率的工序；

(3)对预先采自足够的参量的未罹患肝细胞癌的肝硬化患者的体液试样，利用与前述(1)和(2)相同的工序对全部患者分别算出具有WFA/VVA结合性糖链的CSF1R量在总CSF1R中所占的比率的工序；

(4)基于随访(3)中使用的全部患者而得到的癌变率数据算出最佳截止值的工序；

(5)将(2)中算出的受试者的比率的值与(4)中算出的最佳截止值对比，超过时判定为肝细胞癌发病风险高。

发明的效果

本发明能够提供与肝硬化患者的肝细胞癌发生风险的相关性极高的“肝细胞癌风险判定指数(WFA⁺-CSF1R％)”，从而能够表示出与该判定指数对应的癌变风险比例。即，能够提供利用血液试样的肝硬化患者的肝细胞癌发生风险判定方法。通过使用该方法，对于肝硬化患者等重症肝疾病患者也能够通过简便的血液检查大体上准确地把握癌变风险，因此能够避免负担沉重的侵入性的繁杂检查或减少其次数。

另外，本发明首次发现了含有WFA结合性糖链的CSF1R量(WFA⁺-CSF1R值)为与肝硬化的预后的相关性极高的“肝硬化的预后判定指数”，能够表示出与该数值范围对应的生存率。即，能够提供利用血液试样的肝硬化患者预后的准确判定方法。

同时还发现，作为本发明的CSF1R上的WFA结合性糖链检测用凝集素，单体重组WFA凝集素试剂和VVA凝集素试剂均有效。能够一并提供作为含有WFA和/或VVA(WFA/VVA)结合性糖链的CSF1R检测用抗体的、具有高结合活性的多种抗CSF1R单克隆抗体。通过将这些抗体组合作为试剂盒，能够算出更准确的“肝细胞癌发病风险判定指数”或“肝硬化的预后判定指数”，能够提高肝硬化患者的肝细胞癌发病风险判定的精度和肝硬化的预后判定的精度。

附图说明

图1：免疫组织化学染色分析：在肝细胞癌组织中CSF1R和WFA表位的表达。

图2：免疫组织化学染色分析：使用HCC组织阵列的组织化学染色分析(抗CSF1R抗体和WFA)。

图3：分析过程流程图，示出了参加本组的214名起源于HCV的肝炎患者的详情。在本实施例中，选择肝细胞癌尚未发病的肝硬化患者(非HCC-LC患者、56名)，进而与作为验证组的另外随机选择的45名非HCC-LC患者组一起进行评价。

图4：利用通过对数秩检验求出的最小P值法得到的用于累积癌变率预测的WFA⁺-CSF1R％的最佳截止值。

图5：(a)对来自101名未罹患肝细胞癌的LC患者的血清试样制作WFA⁺-CSF1R值和WFA⁺-CSF1R(％)值的相关的二维散点图(scatter plot)。WFA⁺-CSF1R值和WFA⁺-CSF1R(％)值的相关性用回归曲线表示为Y＝7.9663X+18.735、R²＝0.6488。虽然显示出优选的相关性，但发现了几个严重偏离的情形。(b)WFA⁺-CSF1R(％)值和癌变天数的相关性；关于41名未罹患肝细胞癌的LC患者对数秩，WFA⁺-CSF1R(％)值和至癌变为止的天数的相关性用回归曲线表示为Y＝-0.8618X+59.681、R²＝0.1448。

图6：未罹患肝细胞癌的的慢性肝炎患者的WFA⁺-CSF1R(％)值与F1～F3的肝纤维化水平无关，统计学上没有显著性差异，肝硬化患者的WFA⁺-CSF1R(％)值与慢性肝炎患者有显著性差异。进而，肝细胞癌尚未发病的肝硬化患者和已经发病的肝硬化患者的WFA⁺-CSF1R(％)值也有显著性差异。

图7：在非HCC-LC患者的利用WFA⁺-CSF1R％值的癌变率(a)训练组中，高WFA⁺-CSF1R％值患者的HCC癌变率高于低值患者(P＝0.006)。5年累积癌变率在高WFA⁺-CSF1R％值LC患者中为75％，低WFA⁺-CSF1R％值LC患者为35％(p＝0.006)。在(b)验证组中，高WFA⁺-CSF1R％值患者的HCC癌变率高于低值患者(P＝0.005)。累积癌变率在高WFA⁺-CSF1R％值患者中为70％，低WFA⁺-CSF1R％值患者为42％。

图8：由WFA⁺-CSF1R％的最佳截止值，将利用通过对数秩检验求出的最小P值法的预测生存率的值确定为310ng/ml。

图9：在非HCC-LC患者的利用WFA⁺-CSF1R值的生存率的卡普兰-梅尔分析(Kaplan-Meier)(a)训练组中，高WFA⁺-CSF1R值LC患者(≥310ng/ml，8名)的1、3、5年生存率分别为88％、60％、45％，低WFA⁺-CSF1R值的患者(＜310ng/ml，48名)则为94％、89％、74％(p＝0.010)。在(b)验证组中，高WFA⁺-CSF1R值LC患者(≥310ng/ml，10名)的1、3、5年生存率分别为100％、71％、43％，低WFA⁺-CSF1R值的患者(＜310ng/ml，35名)为100％、100％、100％(p＜0.003)。

图10：CSF1R的糖链图谱；将本发明人合成的标准CSF1R(rCSF1R)(LDN+和LDN-)分别涂敷到含有各种凝集素的微阵列上，用抗CSF1R抗体进行测试。LDN(+)rCSF1R为在HEK293细胞中表达的rCSF1R，LDN(-)rCSF1R为在敲除细胞中表达的rCSF1R。

图11：CSF1R糖蛋白(来自小鼠骨髓瘤NS0细胞)中的、利用Glyco-Ridge法确认的糖肽和糖链的连接位置。利用IGOT(131120CSF-RTL-Am+GOT-dd10-35g-01)鉴定。

图12：CSF1R糖蛋白(标准CSF1R糖蛋白)中的、利用Glyco-Ridge法确认的糖肽和糖链连接位置。核心肽候补有时在预测的胰蛋白酶分解序列中含有预料之外的分解序列。

图13：利用Glyco-Ridge法进行的标准CSF1R糖蛋白的糖链结构(主要结构)的分析结果。

图14：利用蛋白质印迹进行的、抗CSF1R单克隆抗体(培养上清液)的生物化学评价。

图15：使各结构域缺损的标准CSF1R糖蛋白分子。

图16：利用蛋白质印迹进行的抗CSF1R单克隆抗体的抗原识别部位的分析。

图17：抗CSF1R单克隆抗体的推定抗原识别部位。

图18：利用抗体-抗体ELISA测定体系进行的总CSF1R分子(总CSF1R)的检测。

图19：利用抗体-WFA凝集素夹心ELISA测定体系进行的WFA⁺-CSF1R分子的检测。

图20：利用WFA凝集素-抗体夹心ELISA测定体系进行的WFA⁺-CSF1R分子的检测。

图21：利用使用抗体CSR-3的WFA凝集素-抗体夹心ELISA测定体系进行的、含有LacdiNAc糖链的CSF1R糖蛋白分子的检测(图中，LDN(+)rCSF1R为标准rCSF1R，LDN(-)rCSF1R为LDN缺损株产生的rCSF1R，NS0rCSF1R为市售rCSF1R(R&D Corporation，研发公司制))。

图22：利用抗体-WFA凝集素夹心ELISA测定体系进行的、含有LacdiNAc糖链的CSF1R糖蛋白分子的检测(图中，LDN(+)rCSF1R为标准rCSF1R，LDN(-)rCSF1R为LDN缺损株产生的rCSF1R、NS0rCSF1R为市售rCSF1R(R&D Corporation，研发公司制)，NHS为健康人血清试样)。

图23：使用抗体CSR-3的抗体-WFA凝集素夹心ELISA测定体系(上段)和使用抗体CSR-3的抗体-抗体夹心ELISA测定体系(下段)(图中，LDN(+)rCSF1R为标准rCSF1R，LDN(-)rCSF1R为LDN缺损株产生的rCSF1R，NHS为健康人血清试样)。

图24：使用抗体CSR-3的抗体-VVA凝集素夹心ELISA测定体系(图中，LDN(+)rCSF1R为标准rCSF1R，LDN(-)rCSF1R为LDN缺损株产生的rCSF1R，NHS为健康人血清试样)。

图25：示出使用实施例8中制作的抗CSF1R抗体(CSR-3、CSR-4、CSR-18、CSR-21和CSR-30抗体)的ELISA体系能够区分起源于HCV肝炎的肝细胞癌患者的混合血清与健康人的混合血清。

图26：示出其它抗CSF1R抗体(CSR-3、CSR-4、CSR-5、CSR-6、CSR-18抗体)也能够区分肝细胞癌患者血清的混合血清和健康人的混合血清。

图27：使用抗体CSR-18的抗体-VVA凝集素夹心ELISA测定体系。示出与WFA同样地、VVA也能够与抗CSF1R抗体一起通过ELISA体系区分肝细胞癌患者血清的混合血清(K1、K2、K3)和健康人的混合血清。

图28：使用制备为相同浓度(的稀释系列)的rCSF1R(LDN+)和rCSF1R(LDN-)，利用使用抗CSF1R抗体-抗CSF1R抗体的夹心ELISA进行总CSF1R测定。分别以缓冲体系(BSA稀释液：A)或血清体系(10％NHS稀释液：B)进行检测。其结果是，对于CSF1R(LDN+)和rCSF1R(LDN-)中的任一者，能够以量(反应性)几乎相同的方式进行检测。

图29：利用使用抗体-抗体的夹心ELISA进行总CSF1R测定(总)。使用制备为相同浓度(的稀释系列)的rCSF1R(LDN+)和rCSF1R(LDN-)，利用使用抗体-各共同糖链探针凝集素的夹心ELISA进行总CSF1R测定(以各凝集素名来示出)。另外，利用使用抗体-WFA凝集素的夹心ELISA或使用抗体-VVA凝集素的夹心ELISA测定疾病特异性的CSF1R分子(以WFA或VVA来示出)。算出总CSF1R中的WFA阳性分子相对于rCSF1R(LDN+)和rCSF1R(LDN-)的相对比率(WFA信号值/共同糖链结合凝集素信号值)，示出将其图表化的结果。

图30：利用使用抗体-抗体的夹心ELISA进行总CSF1R测定(总)。另外，使用制备为相同浓度(的稀释系列)的rCSF1R(LDN+)和rCSF1R(LDN-)，利用使用抗体-各共同糖链探针凝集素的夹心ELISA进行总CSF1R测定(以各凝集素名来示出)。另外，利用使用抗体-WFA凝集素的夹心ELISA或使用抗体-VVA凝集素的夹心ELISA测定疾病特异性的CSF1R分子(以WFA或VVA来示出)。然后，利用吸光度信号值校正为相对浓度值。使用该校正浓度值算出总CSF1R中的WFA阳性分子相对于rCSF1R(LDN+)和rCSF1R(LDN-)的相对比率(WFA-CSF1R浓度/共同糖链结合凝集素反应性CSF1R浓度)，示出将其图表化的结果。

图31：使用制备为相同浓度(的稀释系列)的rCSF1R(LDN+)和rCSF1R(LDN-)，利用使用抗体-VVA凝集素的夹心ELISA进行测定。分别以缓冲体系(BSA稀释液：A)或血清体系(10％NHS稀释液：B)进行检测。其结果是，与使用抗体-WFA凝集素的夹心ELISA时(图21)同样地，rCSF1R(LDN+)的反应性依赖于浓度而提高，与之相比，rCSF1R(LDN-)的反应性几乎没有提高。另外示出，该结果在缓冲体系中和血清体系中是同样的。

图32：使用制备为相同浓度(的稀释系列)的rCSF1R(LDN+)和rCSF1R(LDN-)，利用使用抗体-各共同糖链探针凝集素的夹心ELISA进行总CSF1R测定。使用LEL(A，B)、STL(C，D)、TJA-I(E，F)进行检测。分别以缓冲体系(BSA稀释液：A，C，E)或血清体系(10％NHS稀释液：B，D，F)进行检测。其结果是，几乎同样地检测了总CSF1R量。

具体实施方式

1.关于肝硬化的病情

据推测，日本的肝硬化患者数为20～25万人，成因中的近80％为肝炎病毒，特别是多数起因于由C型肝炎病毒(HCV)(62.3％)引起的病毒性慢性肝炎。就由慢性肝炎至肝硬化的病情而言，从病理形态学的角度捕捉到肝脏的格利森(Glisson)区域和肝小叶中出现的纤维性变化，并将其分类为轻度(F1)、中度(F2)、重度(F3)、肝硬化期(F4)(新犬山式分类方法)。

在本发明中，言及“肝硬化”时是指肝脏的纤维化程度处于相当于F4的状态的情况。作为病情，可列举肝细胞减少所致的肝功能衰竭和门脉压增大所致的食道胃静脉瘤形成等，当重症化时可见黄疸、肝性脑病、腹水积留、消化道出血等。并且会以每年7％左右的概率出现肝细胞癌。

本发明提供：用于使用这种作为重症肝疾病的肝硬化患者的体液(血清等)试样预测肝细胞癌发病风险的“肝细胞癌发病风险指数”和预测肝细胞癌尚未发病的肝硬化患者的预后(生存率)的“肝硬化预后预测指数”。

(定义)

在本说明书中，“受试者”是指供于检查的人、即后述的提供试样的人，为肝硬化患者、优选为尚未罹患肝细胞癌的肝硬化患者。另外，受试者也包括罹患肝疾病(急性肝炎、慢性肝炎、肝纤维化、肝硬化)的患者、肝细胞癌患者或健康人。

“试样”是指采自前述受试者且供于本实施方式的判定方法的体液，“体液”是指采自受试者的液体状的生物试样。可列举例如血液(包括血清、血浆和间质液)、胆汁、淋巴液、组织液(组织间液、细胞间液)、体腔液、各组织或细胞的提取液、胸水、痰、脊髓液、泪液、鼻涕、唾液、尿、阴道液、精液等。优选为，更优选为血清、血浆、胆汁。典型地为血清试样，因此在本说明书中主要对血清试样进行说明。关于体液，既可以将采自受试者的液体根据需要进行稀释或浓缩或者添加肝素之类抗凝剂等处理后使用，也可以不进行上述前处理而直接使用。体液的采集基于该领域的公知方法进行即可。例如，如果是血液、淋巴液，按照公知的采血方法即可。具体而言，如果为末梢血，可以对末梢部的静脉等进行注射而采集。体液既可以在采集后立即利用，也可以通过冷冻或冷藏保存一定时期后再根据需要进行解冻等处理而利用。在本实施方式中，在使用血清的情况下，使用10μL～100μL、20μL～80μL、30μL～70μL、40μL～60μL或45μL～55μL的体积即可测定足量的用于定量预测判定肝硬化患者的肝细胞癌发病风险或预后所需的、对WFA显示结合性的CSF1R分子(WFA⁺-CSF1R)的值和总CSF1R量。

2.关于肝硬化患者的肝细胞癌发病风险指数和预后预测指数

(2-1)肝硬化患者的肝细胞癌发病风险指数

在本发明的针对肝硬化患者的癌变风险或预后预测方法中，重要的是体液(血清)中的含有对WFA和/或VVA显示结合性的糖链的CSF1R分子的量(WFA⁺-CSF1R)的测定。但是，(WFA⁺-CSF1R)的值虽然如后所述也可以称为肝硬化患者的预后预测标志物，但是并不是预测肝硬化患者的肝细胞癌的癌变风险的数值。为了预测肝硬化患者的肝细胞癌的癌变风险，需要算出(WFA⁺-CSF1R)在总CSF1R中所占的比例(WFA⁺-CSF1R％)。

需要说明的是，在本发明中，用“％”来表示用于预测肝硬化患者的肝细胞癌的发病风险的“(WFA⁺-CSF1R)在总CSF1R中所占的比例”，但表示两者的比例的表示方法也可以是小数点表示、分数表示等。例如，也可以为将100％设为1并用小数或分数表示(或者，将总CSF1R量设为1并以相对比值形式表示含有WFA结合性糖链的CSF1R量相对于总CSF1R量的数值的表示)的值，或者为以千分率(‰)表示的值。

具体而言，在肝硬化患者的癌变风险的判定中，算出下述的肝细胞癌发病风险指数值(WFA⁺-CSF1R％)并进行判定。

肝硬化患者的肝细胞癌发病风险指数(WFA⁺-CSF1R％)

＝“含有WFA结合性糖链的CSF1R量/总CSF1R量×100(％)”或

＝“含有WFA结合性糖链的CSF1R量/含有CSF1R特异性凝集素结合性糖链的CSF1R量×100(％)”

需要说明的是，其中，“CSF1R特异性凝集素”是指：在对健康人和肝硬化患者的体液(血清)中的CSF1R上的糖链的反应性方面没有差异的凝集素。即，是指对体液(血清)中的总CSF1R蛋白上的糖链具有反应性的凝集素。典型地相当于非专利文献1的图3B所示的RCA120、DSA、PHA-E4、SNA、SSA、TJA-I、LEL、STL、ConA等凝集素。

如后所述，言及含有WFA结合性糖链的CSF1R量时的、含有“WFA结合性糖链”的CSF1R不仅与WFA、也与VVA凝集素特异性地结合，从而CSF1R很可能含有分别能被这些凝集素识别的多个糖链结构组中的、具有共同或相似表位结构部分的糖链结构。通常认为其包括几种结构，本发明的其它实验结果强烈暗示其中之一为“LDN糖链”。但是，也不能彻底否定WFA所结合的糖链与VVA所结合的糖链键合于同一CSF1R分子上的不同部位的可能性，基于此将作为“WFA结合性糖链”而关注的CSF1R上的糖链称为“WFA和/或VVA(以下记作“WFA/VVA”)结合性糖链”，将“含有WFA结合性糖链的CSF1R量”也表示为“含有WFA/VVA结合性糖链的CSF1R量”。

并且，本发明的肝硬化患者的肝细胞癌的发病风险值的算出方法为如下方法：测定来自肝硬化患者的采自受试者的一定体积的体液试样(也简称为被检试样)的总CSF1R量(A)和含有WFA/VVA结合性糖链的CSF1R量(B)，以“C(％)＝(B)/(A)×100”形式由两者的测定值算出含有WFA/VVA结合性糖链的CSF1R量在总CSF1R中所占的比率(C)。

本发明的肝细胞癌发病风险指数(WFA⁺-CSF1R％)可以如下地准确求出：预先测定足够的参量的未罹患肝细胞癌的肝硬化患者的WFA⁺-CSF1R％，随访患者，对肝细胞癌是否发病应用例如通过对数秩检验确定的最小P值法、并将上下10％除外而求出癌变率的最佳截止值。

需要说明的是，在言及足够的参量时，统计上总数越大则越准确，但考虑到用于确保总数的时间、劳动量则通常为数十例至数百例。更优选为数百至1000例以上。即，在本发明中，“足够的参量”是指10～6000例、10～5000例、10～4000例、10～3000例、10～1000例，优选为30～3000例、30～2000例、30～1000例，更优选为40～2000例、40～1000例、50～2000例、50～1000例，进一步优选为50～500例、100～500例。

对于肝硬化患者而言，如果为癌变风险指数(WFA⁺-CSF1R％)的最佳截止值以上则可以预测其癌变率极高。

实施例已经证明：以训练组和验证组合计为101名的参量数求出的结果为35.0％，高值组的5年累积发现率为75％，与低值组的30～42％相比显著高(P＝0.005～0.006)。

如果进一步增加参量，也许该35.0％的值会有一些变化，但从本实施例的结果来看，可以说肝硬化患者的肝细胞癌发病风险指数的最佳截止值在30.0～40.0％、至少25.0～45.0％的范围内。即，在肝硬化患者的肝细胞癌发病风险指数(WFA⁺-CSF1R％)为35.0±10.0％以上、优选为35.0±5.0％以上时，可以判定为肝细胞癌的发病显著。相反，如果小于35.0±10.0％、优选小于35.0±5.0％，则可以判定为肝细胞癌发病的概率显著低。

需要说明的是，对于定量检查，将区分检查的阳性、阴性的值称为截止值。截止值为区分罹患某种疾病的患者组(对象组A)和非患者组(对象组B)的值。通常认为这些会根据测定对象的总体规模(数量)而有一些变化，但可以根据作为统计学上的常规方法的计算方法自行设定最佳的截止值。在本发明的实施方式中，作为上述通用方法，应用通过对数秩检验确定的最小P值法并将上下10％除外而计算癌变率的最佳截止值，也可以使用后述的其它方法。通常，如果患者组和非患者组的检查值分布不重叠，则也可以将不包含在彼此的检查值分布范围内的中间值设为截止值。另一方面，如果检查值分布的范围重叠，则最佳的截止值也可以使用ROC曲线(Receiver Operator Characteristic Curve：受试者工作特征曲线)等来设定。ROC曲线是以灵敏度为纵轴、以假阳性率(＝1-特异度)为横轴、一边改变截止值一边作图而得到的曲线。作为ROC曲线上的截止值的确定方法，可列举如下。就灵敏度和特异度优异的独立变量的ROC曲线而言，可以根据逐渐靠近左上角的事实将与该左上角的距离最小的点设为截止值。另外，也可以通过使用约登指数(Youden index)(将“灵敏度+特异度-1”达到最大值的点称为约登指数(Youden index))的方法算出截止值。将最远离预测能力和诊断能力最低的独立变量的ROC曲线、即AUC＝0.500的斜点线的点设为截止值。即，可以计算出(灵敏度+特异度-1)并将达到其的最大值的点设为截止值。进而，还可以应用于通过Cox回归法确定的最小P值法并经上下10％除外而求出生存率的最佳截止值。

(2-2)肝硬化患者的预后(生存率)预测指数

本发明发现，含有WFA结合性糖链的CSF1R量(WFA⁺-CSF1R值)的数值直接与未罹患肝细胞癌的肝硬化患者的生存率具有高度相关关系，并验证了WFA⁺-CSF1R值为肝硬化患者的预后因子。

具体而言，肝硬化患者的预后(生存率)的预测可以算出下述的肝细胞癌预后判定指数(WFA⁺-CSF1R)并进行判定。

肝硬化患者的预后判定指数＝WFA⁺-CSF1R ng/ml

另外，本发明的肝硬化患者的预后判定指数值的算出方法为如下方法：将测定采自作为肝硬化患者的受试者的一定体积的体液试样(被检试样)中的含有WFA/VVA结合性糖链的CSF1R量(B)的工序中得到的“B ng/ml(WFA⁺-CSF1R ng/ml)”的值作为受试者的预后判定指数值。

本发明的预后判定指数(WFA⁺-CSF1R ng/ml)可以如下地准确求出：预先测定足够的参量的未罹患肝细胞癌的肝硬化患者的WFA⁺-CSF1R ng/ml，随访患者至少5年，对其是否生存的数据应用通过对数秩检验确定的最小P值法、并将上下10％除外而求出生存率的最佳截止值。

需要说明的是，在本发明中，用于预测肝硬化患者的预后的指数可以用“ng/ml”的单位来表示，由于其表示的是表示受试者的体液(血清)试样中所含的“含有WFA结合性糖链的CSF1R量”的典型数值，因此也可以以mg/ml、w/v％等其它单位来表示，另外也可以为对数表示方式，或者为利用特定的计算式(演算式)或系数换算后的演算值的值等其它表示方式。

另外，还可以由这些截止值算出截止系数(cut off index：C.O.I)。C.O.I以相对于截止值的比率形式求出，1.0为判定时的阳性和阴性的边界值。(通常认为在其基准范围内涵盖了95％的检查结果。)

在临床检查中，为了消除测定值所导致的值的抖动等，大多由实际值来计算截止指数并使用该截止指数。

在本实施例中，利用通过对数秩检验确定的最小P值法导出WFA⁺-CSF1R的最佳截止值为310ng/ml，在用时间依赖性ROC曲线研究生存率时，WFA⁺-CSF1R值为310ng/ml以上时HR为3.63(95％CI1.25-10.54，p＝0.011)，在用卡普兰-梅尔分析(Kaplan-Meier)研究肝硬化患者的累积生存率时，证明了WFA⁺-CSF1R值的高值组与低值组相比生存率显著低。

如果进一步增加参量，也许310ng/ml的值会有一些变化，但从本实施例的结果来看，可以说肝硬化患者的预后判定指数的最佳截止值在260～360ng/ml、至少在210～410ng/ml的范围内。即，在肝硬化患者的预后判定指数(WFA⁺-CSF1R ng/ml)为310±100ng/ml以上、优选为310±50ng/ml以上时，可以判定为预后(生存率)显著差。相反地，如果小于310±100ng/ml、优选小于310±50ng/ml，则可以判定为预后显著良好。

该最佳截止值也可以使用前述的其它截止值的算出方法来确定。

(2-3)CSF1R和体液(血清)中的总CSF1R量的测定

CSF1R是单核细胞的分化所必需的集落刺激因子1(colony stimulating factor1，CSF1)的受体(巨噬细胞刺激因子-1受体)，存在于细胞表面。已知在肝脏中其主要在包括库普弗细胞(Kupffer cell)在内的单核细胞、肝星形细胞、肝实质细胞中表达。已知CSF1R会随着细胞的活化而被(活化的)细胞外金属蛋白酶切除细胞外结构域，通常认为血中CSF1R即为被切除的细胞外结构域。其由972个氨基酸构成(序列号1，2)，一直以来被作为肝细胞癌标志物使用。

例如，有Fc融合型(NS0)(研发系统公司(R&D systems Corporation)制)等多种重组CSF1R在售。此次，为了确定CSF1R上的WFA结合性糖链的准确的糖链结构和糖链结合位置，利用已知的CSF1R碱基序列(序列号1)设计了引物，以来自人单核细胞白血病细胞株(THP-1)的cDNA为模板克隆了CSF1R基因，并以HEK293细胞为宿主制造了“标准重组CSF1R”。标准重组CSF1R上的糖链结构如下述(2-4)所示(图13)。

为了检测试样中的总CSF1R量，优选使用抗CSF1R单克隆抗体(以下也简称为“抗CSF1R抗体”)。抗CSF1R抗体可以使用市售的抗CSF1R抗体，例如作为固相化抗体的抗-CSF1RmAb Cat#MAB3292(研发系统公司(R&D systems Corporation)制)、作为检测抗体(总CSF1R用)的生物素化的抗-CSF1R pAb Cat#BAF329(研发系统公司(R&D systems Corporation)制)等，还可以以CSF1R为免疫原按照常规方法制造。

在本发明中，还重新制造了抗CSF1R单克隆抗体。以CSF1R为免疫原，按照常规方法制造了多种抗CSF1R单克隆抗体。选择这些抗CSF1R单克隆抗体中的、对CSF1R的亲和性高的33个克隆，利用直接ELISA检验CSF1R结合活性，并且检验在与天然WFA凝集素或srWFA凝集素的夹心测试体系中的CSF1R上的WFA/VVA结合性糖链的检测性能，特别进一步选择出检测性能高的多个抗CSF1R单克隆抗体。并且还获知，CSF1R上的WFA/VVA结合性糖链的检测性能高的抗体中，大部分的识别结构域集中于第2结构域或第3结构域。需要说明的是，关于典型的抗CSF1R单克隆抗体产生杂交瘤，已经保藏于NPMD(杂交瘤CSR-3、CSR-4、CSR-18、CSR-21和CSR-30分别以保藏号：NITE AP-02117～NITE AP-02121进行保藏。然后被赋予保藏号：NITE P-02117～NITE P-02121，于2016年9月7日转为国际保藏，分别被赋予NITE BP-02117～NITE BP-02121)。

如下述(表5)所示，在WFA/VVA-CSF1R抗体夹心ELISA体系中的检测优异的抗体与识别结构域无关，CSR-3、CSR-4、CSR-18、CSR-21、CSR-30、CSR-5、CSR-6、CSR-22、CSR-24、CSR-7、CSR-9、CSR-13、CSR-26、CSR-27、CSR-29的抗体优异，特别是CSR-3、CSR-4、CSR-18、CSR-21、CSR-30的含有WFA/VVA-结合性糖链的CSF1R分子的检测能力高。

(2-4)“CSF1R分子上的WFA和/或VVA(WFA/VVA)结合性糖链”

强烈暗示在肝硬化患者中检测到的体液(血清)中的“CSF1R分子上的WFA结合性糖链”为含有LacdiNAc结构的糖链(LDN糖链)。只要是识别该LDN糖链的化合物，则即便是凝集素、抗体等任意的化合物都很可能能够用于CSF1R分子上的WFA/VVA结合性糖链量的测定。优选为作为LDN糖链结合性凝集素的WFA/VVA凝集素，优选天然的WFA凝集素、重组WFA凝集素(序列号4)、单体重组WFA凝集素(也称为srWFA。需要说明的是，图中简单记作rWFA)、VVA凝集素，最优选与LDN糖链特异性地结合的单体重组WFA凝集素。

需要说明的是，作为强烈暗示在肝硬化患者的体液(血清)中增多的CSF1R上的WFA凝集素识别糖链结构为在非还原末端具有“GalNAcβ1-4GlcNAcβ1-R”的糖链(LDN糖链)的实验，对本发明中制造的标准rCSF1R上的糖链结构和糖链位置进行了确定，得到LDN糖链缺损株所产生的rCSF1R丧失与WFA凝集素的结合性的结果。

＜WFA凝集素＞

天然WFA是来自豆科的多花紫藤(Wisteria floribunda，ノダフジ)的凝集素，作为糖结合特异性，已知与含有(末端)N-乙酰半乳糖胺(N-acetylgalactosamine：GalNAc)糖链的结构、特别是LacdiNAc(LDN：GalNAc1-3GlcNAc-R)糖链结构结合。天然WFA具有如下结构：从由序列号4构成的WFA的全长中失去C末端侧的13个氨基酸而成的氨基酸序列进行二聚体化而成的结构(专利文献4)。

另外，通常的重组WFA(序列号4)以二聚体和单体的混合物形式得到，已知具有包括LDN糖链结合性在内的、与天然WFA相同的糖链结合活性(专利文献4)，因此重组WFA也可以与天然WFA同样地作为本发明的WFA凝集素使用。另外，专利文献4中记载的WFA还原体等WFA衍生物、其它WFA改造体也具有LDN结合活性，因此同样可以使用。

＜单体重组WFA凝集素(srWFA)：LDN特异性结合性凝集素＞

其为本发明人以前克隆重组WFA基因(序列号3)并进行阻止C末端侧的S-S键的形成的改造而单体化的WFA凝集素(srWFA)，与非还原末端具有“GalNAcβ1-4GlcNAcβ1-R”的糖链(LDN糖链)特异性地结合(专利文献4)。本实施例中实际使用的“srWFA”为：将其中位于序列号3的第272位的位置的Cys改造为Ala而单体化、进而将糖链结合活性所不需要的N结合型糖链连接部位第146位的Asn导入变异、即Gln而通过酵母大量生产的srWFA。

＜VVA凝集素＞

VVA凝集素为来自豆科的长柔毛野豌豆(Vicia villosa(Hairy Vetch))种子(箭筈豌豆(ケヤハズエンドウ)、光叶紫花苕(ビロードクサフジ)、毛叶苕子(Hairy Vetch))的凝集素，是分子量为102kDa～144kDa的糖蛋白。作为糖结合特异性，已知与(末端)N-乙酰半乳糖胺(N-acetylgalactosamine：GalNAc)结合。

(2-5)关于体液中的、能够替代“总CSF1R量”的“含有CSF1R特异性凝集素结合性糖链的CSF1R量”的测定

如前所述，“CSF1R特异性凝集素”也是“CSF1R恒定的糖链结构结合性凝集素”，无论是健康人还是肝硬化患者，均对体液(血清)中的全部CSF1R所恒定含有的糖链具有反应性。

因此，作为直接测定体液试样中的“总CSF1R量”的替代方式，可以通过测定体液试样中的CSF1R上的“CSF1R特异性凝集素”反应性糖链的量来测定“总CSF1R量”。即，通过求出体液试样中的CSF1R上的“WFA和/或VVA结合性糖链”和“CSF1R特异性凝集素结合性糖链”的含量比率，可以算出肝硬化患者的肝细胞癌发病风险(WFA⁺-CSF1R％)。

可以作为“CSF1R特异性凝集素”使用的典型的凝集素为非专利文献1的图3B中也曾示出的RCA120、DSA、PHA-E4、SNA、SSA、TJA-I、LEL、STL、ConA等凝集素。

已知RCA120(RCA I；蓖麻凝集素I；来自蓖麻籽(ヒママメ))是Gal或GalNAc特异性的，DSA(曼陀罗(Datura stramonium)；来自洋金花(チョウセンアサガオ))是GlcNAc或聚-N-乙酰乳糖胺(PolyLacNAc)特异性的，PHA-E4(菜豆(Phaseolus vulgaris)；来自隠元豆)是Gal、GalNAc或二等分N-聚糖(bisecting N-glycan)特异性的，SNA(EBL，欧洲接骨木凝集素(Elderberry Balk(Sambucus nigra)Lectin)，来自西洋接骨木)是Sialyl-Gal或Sialyl-GalNAc特异性的，SSA(无梗接骨木(Sambucus sieboldiana)；来自日本接骨木)是唾液酸特异性的，TJA-I(日本栝蒌(Trichosanthes japonica)；来自黄乌瓜)是α2-6结合唾液酸(Neu5Acα2-6Galβ1-3/4GlcNAc)或6位硫酸化糖链(HSO3(-)-6Galβ1-3/4GlcNAc)特异性的，LEL(番茄凝集素；来自番茄)是(GlcNAc)n或聚-N-乙酰乳糖胺(PolyLacNAc)特异性的，STL(马铃薯(Solanum tuberosum)；来自马铃薯)是(GlcNAc)n特异性或聚-N-乙酰乳糖胺(PolyLacNAc)特异性的，并且ConA(洋刀豆(Conavalia ensiformis)；伴刀豆球蛋白A；来自刀豆)是Man、Glc或三甘露糖基N-聚糖(核心)特异性的，任一者由日本制油公司(J-OILMILLS,INC)、船越公司、宇宙生物公司(COSMO BIO Co.Ltd.)(EY实验室公司(EY-Laboratories Corporation))、维百奥实验室公司(VECTOR Laboratories Corporation)等销售。

3.本发明中使用的测定方法和用于其的试剂盒

(3-1)本发明的测定方法和试剂盒的用途

将本发明新提供的抗CSF1R抗体和抗CSF1R抗体与WFA和/或VVA凝集素一起使用的CSF1R分子、WFA⁺-CSF1R分子的测定方法和试剂盒，可以用于本发明的肝硬化患者的肝细胞癌的发病风险指数(WFA⁺-CSF1R％)和预后判定指数(WFA⁺-CSF1R ng/ml)的测定用途，并判定肝硬化的预后、肝细胞癌发病风险。

另外，作为本发明的各试剂盒的构成要素，优选具备含有WFA/VVA结合性糖链的CSF1R和/或不含WFA/VVA结合性糖链的CSF1R标准物质，以用于阳性对照或阴性对照。各试剂盒的构成要素可以为粉末等固体状也可以为溶解或分散于缓冲液等的状态的溶液状，还可以为结合于测试用基板、珠子等的状态。进而，还可以在试剂盒的构成要素中增加溶解或分散用的缓冲液等。

并且，WFA⁺-CSF1R分子、即CSF1R上的WFA/VVA结合性糖链也可以广泛作为表示各种肝疾病的重症度的标志物(专利文献1)，因此本发明的WFA⁺-CSF1R分子测定方法和试剂盒也可以用于肝疾病的重症度判定用途等。

另一方面，CSF1R分子一直被作为肝疾病标志物、肝癌标志物等使用，因此本发明的CSF1R分子的测定方法和试剂盒也可以用于肝疾病诊断用途或肝细胞癌诊断用途等。

此时，试样中的CSF1R量也可以利用使用抗CSF1R抗体的ELISA等直接测定，也可以通过测定CSF1R上的CSF1R特异性凝集素结合性糖链量间接地测定。例如，通过利用使用抗CSF1R抗体和“CSF1R特异性凝集素”的抗体-凝集素夹心测试等测定试样中的具有“CSF1R特异性凝集素”反应性糖链的CSF1R量，可以实质上测定试样中的“总CSF1R量”。

应用抗CSF1R抗体亲和柱等常规蛋白质纯化法从体液试样中分离纯化CSF1R，同时或分别地测定对于该CSF1R的WFA和/或VVA凝集素反应量以及CSF1R特异性凝集素反应量，求出两测定值的比率，从而可以求出肝硬化患者的肝细胞癌的发病风险指数(WFA⁺-CSF1R％)。

(3-2)关于凝集素-抗体夹心免疫学的检测法

基本上，可以在用于使用2种抗体的夹心检测法的方案中仅将一种抗体替换为凝集素即可应用。因此，该方法除了可以应用于现有的ELISA法等以外，还可以应用于使用自动免疫检测装置的自动化。唯一必须考虑的一点是，用于夹心的抗体与凝集素间的反应。抗体具有至少2条N-结合型糖链。因此，在所使用的凝集素识别抗体上的糖链的情况下，在夹心检测时可能产生起因于二者的结合反应的背景噪声。为了抑制该噪声信号的产生，通常考虑在抗体上的糖链部分导入修饰的方法、仅使用不含糖链部分的Fab的方法，这些使用公知的方法即可。作为糖链部分的修饰方法，例如有Chen S等Nat Methods.4,437-44(2007)、Comunale MA等J Proteome Res.8,595-602(2009)等，作为使用Fab的方法，例如有Matsumoto H等Clin Chem Lab Med 48,505-512(2010)等。

(3-3)CSF1R上的WFA/VVA结合性结合性糖链检测用凝集素-抗体夹心ELISA测定体系

在利用具有WFA/VVA结合性糖链的CSF1R的夹心体系的检测中，主要使用凝集素‐抗体夹心ELISA、使用凝集素阵列的抗体覆盖·凝集素阵列法。

在将抗CSF1R抗体用于ELISA板固相化侧时，将凝集素用于液相侧，作为检测用途。抗体可以用于ELISA板固相化侧或检测侧(液相侧)中的任一侧，并且在另一侧使用凝集素(即，抗体在固相侧时，将凝集素用于液相侧)，利用夹心的检测体系来进行。通常利用灵敏度高、成为背景的噪声少的组合来进行检测体系的构建。

作为WFA/VVA凝集素，除了可以使用市售的WFA凝集素(天然WFA)、重组WFA、LDN糖链特异性的单体的srWFA以外，还可以使用VVA凝集素。

抗CSF1R抗体优选使用抗CSF1R单克隆抗体，可以使用从本发明中取得的30个克隆的杂交瘤中采集的CSR-1～30、优选CSR-3、CSR-4、CSR-18、CSR-21和CSR-30或者市售的抗CSF1R单克隆抗体。另外，不是必须使用全长的抗CSF1R单克隆抗体，只要具有抗原识别部位则可以是Fab、F(ab’)2等抗体片段，还可以为单链抗体、双特异性抗体、或将抗原识别部位的序列进行人工重组而进行其它种属抗体化(人源化抗体等)的抗体、或其抗体片段。进而，只要对抗原具有结合性则也可以为噬菌体展示抗体(phage display)之类的抗体。

(3-4)凝集素或抗体的标记法

在检测作为标志物分子的CSF1R或CSF1R上的糖链时，为了提高使用了凝集素和抗体的组合的夹心ELISA测定体系的灵敏度，还可以应用使用化学发光的检测体系(化学发光酶免疫测定法，Chemiluminescent Enzyme Immunoassay；CLEIA法)。

作为为了进行夹心测试而使用的第二抗体，在检测侧为抗体时，通过用以辣根过氧化物酶(HRP)等标签化的抗小鼠IgG抗体等进行检测、显色，但也可以利用使用生物素标记的抗体作为该第一抗体的生物素-亲和素反应的检测体系。另一方面，在检测侧为WFA凝集素、VVA凝集素等凝集素时，与使用凝集素检测用第二抗体相比，利用使用生物素标记的凝集素的生物素-亲和素反应的检测体系更为简便，因此是优选的。

具体而言，使生物素标记的WFA凝集素、VVA凝集素等反应后，将溶液废弃并进行洗涤后，使HRP标记链霉亲和素溶液反应，将反应液废弃并进行洗涤后，利用TMB基质液显色并观察该显色即可。

另外，对于上述检测用的抗体、凝集素，通过用荧光物质进行标记来代替生物素标记，还可以构建直接检测抗体和凝集素结合的体系(不依赖化学发光的体系)。

(3-5)试样中的CSF1R的检测体系

在测定体液(血清)试样中的总CSF1R量时，可以使用已知的蛋白质印迹法、ELISA法、夹心ELISA法，此外除了可以应用使用凝集素阵列的抗体覆盖·凝集素阵列法、定量性质谱法(LC-MS等)、免疫学测定法、酶活性测定法、毛细管电泳法、液相色谱(HPLC)法、薄层层析法、金胶体法、放射免疫测定法、胶乳凝集免疫测定法、荧光免疫测定法、蛋白质印迹法、免疫组织化学法、表面等离子体共振法(SPR法)或石英晶体微量天平(QCM)法等分离·检测方法以外，还可以应用使用微流体技术的分离·检测系统。优选抗体-抗体夹心ELISA法。

作为此时的抗CSF1R抗体，优选使用(3-3)中所述的抗CSF1R单克隆抗体，第二抗体也同样。

(3-6)对应于总CSF1R量的“含有CSF1R特异性凝集素结合性糖链的CSF1R量”的检测体系

用于算出WFA⁺-CSF1R％的代替总CSF1R量的“含有CSF1R特异性凝集素结合性糖链的CSF1R量”、即体液(血清)中的CSF1R上的“CSF1R特异性凝集素结合性糖链”的量可以使用如下值：使用“CSF1R特异性凝集素”和抗CSF1R抗体利用(3-2)中所述的凝集素-抗体夹心ELISA测定体系测定出的值。关于其它检测方法，也可以应用与上述相同的分离·检测方法。

其中，作为“CSF1R特异性凝集素”，RCA120、DSA、PHA-E4、SNA、SSA、TJA-I、LEL、STL、ConA等可为候补。

例如，作为用于测定“总CSF1R量”的使用2种抗CSF1R抗体的抗体-抗体夹心测试的代替方式，可以利用使用RCA120(和/或DSA、PHA-E4、SNA、SSA、TJA-I、LEL、STL、ConA)和抗CSF1R抗体的凝集素-抗体夹心测试。可以说，使用同时含有WFA(和/或VVA)和RCA120(和/或DSA、PHA-E4、SNA、SSA、TJA-I、LEL、STL、ConA)的凝集素阵列，优选预先覆盖抗CSF1R抗体抗CSF1R抗体则能够以一次测定对体液试样求出“WFA⁺-CSF1R％”。

(3-5)关于使用凝集素和抗CSF1R抗体的其它检测体系

如前述(3-2)中所述，具有与试样中的WFA和/或VVA(WFA/VVA)凝集素特异性地结合的糖链的CSF1R能够利用凝集素‐抗体夹心ELISA、使用凝集素阵列的抗体覆盖·凝集素阵列法简便地检测或定量，作为其它具体的方法，例如可列举以下方法。

(1)使用WFA和/或VVA凝集素分离由受试者得到的体液(血清)中的CSF1R分子。从而选择具有与WFA/VVA凝集素特异性地结合的糖链的蛋白质组。

(2)然后，使用特异性地识别与WFA/VVA凝集素特异性地结合的糖链以外的部分的抗CSF1R抗体进行检测。由此能够检测作为目标的具有与WFA/VVA凝集素特异性地结合的糖链的CSF1R标志物。

在检测具有与WFA/VVA凝集素特异性地反应的糖链的CSF1R的检测时，例如可以利用测定与WFA/VVA凝集素特异性地结合的CSF1R的方法、具体为利用固定有WFA/VVA凝集素的柱、阵列进行捕集、分离的方法进行；以及，利用测定CSF1R的手段、具体为利用CSF1R糖蛋白的质谱等的直接检测或使用针对该CSF1R(包括片段)的抗体来进行。还可以先进行凝集素和抗体的利用夹心的复合体形成，然后，通过后述方法进行分离，对其进行检测。利用蛋白质印迹法也能够对具有WFA/VVA结合性糖链的CSF1R糖蛋白(糖肽)进行检测、定量。

相反地，对预先分离纯化出的CSF1R糖蛋白用凝集素阵列等芯片/装置检测CSF1R糖蛋白与固相化的多个凝集素的结合量(多凝集素测试)的方式，也能够进行具有WFA/VVA结合性糖链的CSF1R分子的测定。例如，通过以下工序进行。

(1)使用针对CSF1R(包括片段)的抗体，从由受试者得到的体液(血清)试样中分离纯化CSF1R糖蛋白。

(2)然后，将分离纯化后的CSF1R糖蛋白供于凝集素阵列，添加荧光标记的抗CSF1R抗体使其形成复合体，用阵列扫描器测定各凝集素斑点的荧光强度(即，CSF1R糖蛋白与各凝集素的结合量)。由此能够测定作为目标的具有与WFA/VVA凝集素特异性地结合的糖链的CSF1R标志物以及与CSF1R特异性凝集素结合的CSF1R标志物、总CSF1R标志物。

另外，(1)中得到的CSF1R糖蛋白还可以利用使用WFA/VVA凝集素的凝集素印迹法来检测、定量。

(3-7)其它检测体系

作为其它检测体系，可列举定量性质谱法(LC-MS等)、免疫学测定法、酶活性测定法、毛细管电泳法、液相色谱(HPLC)法、薄层层析等。可以适宜使用：使用LC-MS、具有与WFA(VVA)凝集素特异性地反应的糖链的CSF1R糖蛋白或其片段的特异性单克隆抗体或多克隆抗体的、酶免疫测定法，双抗体夹心ELISA法，金胶体法，放射免疫测定法，胶乳凝集免疫测定法，荧光免疫测定法，蛋白质印迹法，免疫组织化学法，表面等离子体共振法(SPR法)或石英晶体微量天平(QCM)法等定性或定量的方法。

利用质谱的检测方法可以如下实施。就标志物糖肽和糖蛋白而言，对于使用与糖链结合的探针凝集素或制作的抗CSF1R抗体捕集后的试样，可以使用质谱仪作为检测器检测具有LacdiNAc(LDN)糖链的糖肽。标志物糖肽的检测可以如下检测：将所捕集的糖肽的糖链进行适当地切除处理后，用液相色谱(LC)分离，将洗脱出的肽依次地直接在线导入质谱仪(MS)进行检测。就质谱的收集而言，除了可以简单地取得质谱以外，还可以利用碰撞诱导裂解(CID)等裂解法取得MS/MS谱，进而在仅检测到预先选择的离子的情况下，可以通过CID等进行裂解并检测所生成的复数个碎片离子(被称为单反应监测或多反应监测的方法)。进而，还可以在分析试样中加入对象肽并对比各个信号强度而进行相对的或绝对的定量分析，其中，所述对象肽是合成肝癌标志物糖肽的核心肽部分并向其一部分中引入稳定同位素而使其产生质量差而得到的。简而言之，将检测到的离子的信号强度在复数个试样间进行对比或者与标准试样进行对比，可以进行简单定量。

另外，可以使WFA(VVA)凝集素作用于利用抗CSF1R抗体从临床被检试样中分离纯化出的CSF1R，应用毛细管电泳法(Kuroda Y.等,Pharm Res.,2001年3月；18(3)：389-93)、微流体技术(横山等“生物试料分析”Vol.33,No.3(2010)p.201-206)，从而以分子量差异测定WFA/VVA凝集素反应性CSF1R蛋白和非反应性CSF1R蛋白的量比、算出总CSF1R中的WFA/VVA结合性CSF1R的量。另外，可以使WFA/VVA凝集素和RCA120(或DSA、PHA-E4、SNA、SSA、TJA-I、LEL、STL、ConA)凝集素分别作用于来自被检体液试样的纯化CSF1R而形成2种凝集素-CSF1R蛋白复合体，应用微流体技术基于各凝集素的分子量的差异分别测定被检体液试样中的与WFA/VVA凝集素结合的CSF1R量和与CSF1R特异性凝集素结合的CSF1R量。并且通过求出两者的量比可以确定含有WFA/VVA结合性糖链的CSF1R相对于总CSF1R量的量比。作为具体的测定用装置，可以使用毛细管电泳装置、μTASWako i30(和光纯药工业(公司))之类的使用微流体技术·分离/检测技术的装置等。

实施例

以下利用实施例更具体地说明本发明，但本发明的范围不受下述实施例限定。

本发明中的其它术语、概念基于该领域中惯常使用的术语意思，为了实施本发明而使用的技术除了特别示出其出处的技术以外，本领域技术人员均可以基于公知的文献等容易且切实地实施。另外，各种分析等基于所使用的分析设备或试剂、试剂盒的操作说明书、商品目录等中记载的方法而进行。

需要说明的是，本说明书中引用的技术文献、专利公报和专利申请说明书中的记载内容作为本发明的记载内容而进行参照。

以下说明本实施例中使用的临床试验方法、测定法、分析方法。

(临床检查)

本实施例中使用的血清试样在-80℃冷冻保存直至用于试验，现用现解冻。关于本实施例中进行的临床检查，血小板计数、凝血酶原活性时间(PT)、血清天冬氨酸转氨酶浓度(AST)、血清丙氨酸氨基转移酶浓度(ALT)、血清白蛋白、血清总胆红素(T.bil)按照常规方法进行。血清甲胎蛋白(AFP)、AFP-LCA凝集素级分(AFP-L3，％)、维生素K依赖性凝固因子前体II(PIVKA-II)也在初诊时用相同试样进行测定。血清AFP使用HISCL-2000i(希森美康(シスメックス))测定，PIVKA-II使用LUMIPULSE PrestoII(富士生物(FUJIREBIO，富士レビオ))自动化学发光酶免疫测定装置(CLEIA)测定。以往的AFP-L3使用自动免疫测定装置μTASWako i30(和光纯药)通过凝集素亲和色谱和液相结合测试法测定。

(抗CSF1R抗体-WFA凝集素夹心ELISA和总CSF1R-ELISA)

WFA⁺-CSF1R和总CSF1R是对本发明人已经报道(非专利文献2)的方法进行部分改造后进行的。将Maxisorp(注册商标)免疫平板(热科学公司(Thermo Scientific)NUNC、449824)用4μg/mL抗CSF1R抗体(小鼠抗人M-CSFR、MAB3292、研发系统公司(R&D systemsCorporation)制)包被6小时，用封闭缓冲液(含有3％BSA的PBS缓冲液,pH 7.4)在4℃下封闭过夜。血清试样用封闭缓冲液稀释20倍，将2对涂敷在平板上2小时。然后将平板用洗涤缓冲液洗涤6次。使用生物素结合WFA(维百奥实验室公司(VECTOR LaboratoriesCorporation))作为检测探针。将平板与100μL/孔的50000倍稀释HRP结合链霉亲和素溶液一起孵育，用洗涤缓冲液洗涤6次。向各孔中加入基质溶液(100μL，赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))，用1M H₂SO₄终止反应。测定各孔在450nm处的吸光度。

(观察期和HCC的治疗)

关于患者的持续观察，至少从开始起每隔6个月进行肿瘤标志物AFP、PIVKA-II、AFP-L3、和超声波检查、CT、核磁共振影像法。关于HCC治疗后最初一年间的持续观察，每隔3个月通过图像诊断来进行，对该期间包括肺炎、败血症、HCC在内的与肝脏相关联的死亡和包括食道静脉瘤出血在内的肝衰竭所致死亡进行分析。

HCC按照日本的指南来进行治疗。首先评估患者的手术适应性，在拒绝外科治疗或不适合进行外科治疗时，进行基于经皮乙醇注入法的局部凝固疗法(LAT)，或者近年进行高频消融(RFA)。没有接受肝移植的患者。各HCC患者的随访期开始于1998年至2014年，持续至患者死亡或2014年8月为止。随访期为1个月至195个月(中值为60个月)。

(统计分析)

关于本实施例中使用的统计分析，患者的临床背景使用曼-惠特尼(Mann-Whitney)的U检验，累积生存率和癌变率通过卡普兰-迈耶(Kaplan-Meier)法算出，检验通过对数秩检验进行。WFA⁺-CSF1R、WFA⁺-CSF1R％使用最小P值法算出最佳截止值。为了确定变量的最佳截止值，在对数秩检验的10至90百分位数间选择显示最小的P值的截止值。还求出了风险比(HR)和95％置信区间(95％CI)。关于生存率和累积癌变的预测因子，对年龄、性别、白蛋白值、血小板数、Fib4、APRI、AFP、PIVKA-II、和AFP-L3进行了研究。利用时间依赖性ROC分析研究了WFA⁺-CSF1R、WFA⁺-CSF1R％的有用性。连续型变量间的相关性用斯皮尔曼(Spearman)等级相关系数进行了量化。另外，将P＜0.05设为统计学上显著。统计分析使用SPSS.20,R 2.14.0(survival ROC包)和Windows Excel 2010等统计分析用软件进行。

(实施例1)利用免疫组织化学染色法进行的CSF1R糖蛋白分析

可以使用由各种肝疾病、特别是肝硬化或肝癌患者的组织切出的标本(冷冻标本或石蜡包埋标本)，利用凝集素或抗体通过免疫组织化学染色进行表达研究。在此使用组织阵列玻片(由甲醛固定石蜡包埋块制作)进行肝癌组织中的WFA以及CSF1R表达的研究。

将组织阵列玻片脱石蜡后，用蒸馏水洗涤，在100mM柠檬酸缓冲液(pH9.0)中用微波炉(microwave oven)加热5分钟进行抗原活化。然后，进行内源性过氧化物酶抑制处理，用封闭缓冲液(PBS中的0.2％吐温-20、5％甘油、3％BSA)在室温封闭20分钟。在PBS中洗涤3次后，与被封闭缓冲液稀释的第一抗体(抗CSF1R抗体：C20克隆，圣克鲁斯生物技术有限公司(Santa Cruz Biotechnology Corporation)，以1μg/mL来使用。或者研发系统公司(R&Dsystems Corporation)AF329、抗hMCSFR抗体)或生物素化WFA凝集素(维百奥实验室公司(VECTOR Laboratories Corporation)，以20μg/mL来使用)进行反应。一次反应后，在PBS中洗涤3次，然后与作为第二抗体的、第二抗体(HRP化抗兔IgG抗体：生命技术公司(LifeTechnologies Corporation)，以10μg/mL来使用)或HRP标签化链霉亲和素(维百奥实验室公司(VECTOR Laboratories Corporation)，以20μg/mL来使用)进行反应。某些情况下也可以使用VECTASTAIN ABC ELITE试剂盒。显色通过DAB显色(和光纯药(WAKO Corporation))来进行。另外，用苏木精进行染色。

结果如图1所示，在肝细胞癌患者组织中，在癌组织的边缘部(浸润部)确认到CSF1R分子以及WFA表位的共表达。另外，如图2所示，在肝细胞癌患者组织阵列中确认到CSF1R分子表达的例子为78例/100例，确认到WFA表位的表达的例子为76例/100例。确认到CSF1R分子以及WFA表位的共表达的例子为70例/100例。

(实施例2)罹患肝硬化(LC)且未罹患肝细胞癌(HCC)的临床试验患者(LC(+)HCC (-))的选择

使用由1998年1月至2013年1月间在名古屋市立大学病院定期就诊的C型慢性肝疾病患者214名得到的血清。排除HBs抗原阳性患者和入选起3个月以内发生其它脏器恶性疾病的患者。观察期的中值为60个月(1～195个月)，Child-pugh分类(蔡尔德-皮尤分类)C的患者由于转院等而不能准确地评价癌变率、预后，因此从研究中排除。肝纤维化评价通过肝组织活检或超声波、CT来进行。肝细胞癌通过组织学检查或影像诊断基于美国肝脏病学会的基准来进行诊断。纤维化等级的评价使用美特威尔(METAVIR)由2名病理专科医生逐一进行判定，将肝硬化设为F4。本研究基于1975年的赫尔辛基宣言并得到名古屋市立大学病院伦理委员会许可，在取得书面上的同意的基础上实施。

将患者选择示于图3。214名(慢性肝炎[CH]99名、肝硬化[LC]115名)入选，115名LC中有59名(HCC-LC)合并有肝细胞癌。最终，排除了肝癌控制不良(23名)或具有3个以上3cm的肝细胞癌的27名。进而，将由长崎医疗中心、新松戸中央综合病院和久留米大学得到的45名未合并肝细胞癌的肝硬化患者被检体作为验证组研究。验证组中，年龄中值为62岁，20名(44.4％)男性，观察期的中值为60个月(1～180个月)。这2个组除了年龄和ALT值以外在基准特性方面没有显著不同(表1)。

[表1]

因此决定，在以下实施例中将这2组一起进行分析，特别对于入选时不具有肝细胞癌的101名LC患者(LC+HCC-)研究了生存率和累积癌变率(表2)。

[表2]

P值用于衍生物和验证组之间的比较。

(实施例3)用于预测肝硬化患者(LC)的肝细胞癌发病风险的指标

在本实施例中，对用于预测肝硬化患者(LC)中肝细胞癌发病风险的指标进行研究。

(3-1)全部患者血清中WFA⁺-CSF1R浓度和WFA⁺-CSF1R％

使用全部肝疾病患者(214名)的血清试样测定WFA⁺-CSF1R和总CSF1R浓度，结果是：与肝炎患者(CH)(99名)相比，肝硬化患者(LC)(115名)的血清WFA⁺-CSF1R浓度、总CSF1R浓度均显著高[WFA⁺-CSF1R：208.9(34.3-500.9)ng/ml对比82.3(5.0-241.0)ng/ml]、[总CSF1R：845.3(431.6-1487.5)ng/ml对比536.4(266.3-1357.2)ng/ml]。

在LC患者115名(HCC 59名、非HCC 56名)中为：血清WFA⁺-CSF1R浓度[208.9(85.4-500.9)ng/ml对比213.0(34.0-442.0)ng/ml]和总CSF1R浓度[820.9(431.6-1415.1)ng/ml对比866.0(516.0-1487.6)ng/ml]。

就LC患者而言，WFA⁺-CSF1R浓度在有无罹患肝细胞癌(HCC)方面未确认到显著性差异，但在肝硬化患者中，与非合并例相比，HCC合并例的总CSF1R浓度稍高(p＝0.035)。

WFA⁺-CSF1R％(总CSF1R中的WFA⁺-CSF1R的比例)在HCC组和非HCC组中分别为26.9％(11.3-77.7)和21.3％(6.3-64.1)(p＝0.0018)，HCC组的值显著高。

此外，与CH患者相比，LC患者的WFA⁺-CSF1R％的值显著高[23.3(6.3-77.7)对比15.6(0.9-55.8)](p＜0.0001)(表1)。

对于本发明中作为对象的、在入选时未确认到HCC的非HCC肝硬化患者(LC+HCC-)(56名)，研究了生存率和累积癌变率。WFA⁺-CSF1R值的中值为213.0(34.0～442.0)，WFA⁺-CSF1R％值为21.3(6.3～64.1)(表2)。

(3-2)全部患者中的基于WFA⁺-CSF1R％的癌变率

首先，测定了基于WFA⁺-CSF1R的累积癌变率，但没有显著性差异(数据未揭示)。

另一方面，通常认为CSF1R与恶性疾病有关，对WFA⁺-CSF1R％和癌变的相关性进行了研究。通过用时间依赖性ROC分析求出的AUC和用Cox回归分析求出的风险比(HR)评价临床因子和癌相关因子。在本组中，由于干扰素治疗史和SVR率不影响HCC的进展而未加考虑。累积发生率的诊断能力以总观察期内的95％置信区间的ROC曲线下面积(AUC)形式示出。连续型变量间的相关性通过斯皮尔曼(Spearman)等级相关系数进行了量化。将P＜0.05设为统计学上显著。

利用最小P值法(将上下10％的症例除外)，得到用于预测癌变的WFA⁺-CSF1R％的最佳截止值为35.0％(表1)、(图4)，其中，最小P值法基于通过对数秩检验对肝硬化患者的肝细胞癌的癌变率求出的P值。使用了本截止值的生存预测中的风险比为1.55(95％CI1.03-2.34,p＝0.034)。进而，使用另一样品组(验证组)研究WFA⁺-CSF1R％的有用性，结果是WFA⁺-CSF1R％有望作为预测因子(HR 4.06,95％CI 1.63-10.13,p＜0.001)。

综合其它数据利用时间依赖性ROC分析分析了与LC患者的累积癌变率有关的因子，结果WFA⁺-CSF1R％为AUC 0.760、HR 1.55(95％CI 1.03-2.34、p＝0.034)(表3)。因此，考虑到训练组和验证组的结果，将与LC患者的累积癌变率显示出相关性的WFA⁺-CSF1R％值35.0％设为最佳候补。进而，通过斯皮尔曼(Spearman)等级相关系数检验来分析WFA⁺-CSF1R％和其它连续型变量的相关性，结果确认到相关性(表3)、(图5，6)。

[表3]

*关于分类变量，P值基于对数秩检验

(3-3)关于无肝细胞癌的肝硬化患者(LC(+)HCC(-))的肝细胞癌(HCC)发生率

因此，进一步求出以上述研究而得的WFA⁺-CSF1R％截止值而分层次的患者的癌变率。为了明确LC患者的WFA⁺-CSF1R％和癌变率，将HCC患者分为两组(高值组≥35.0％、低值组＜35.0％。根据卡普兰-梅尔分析(Kaplan-Meier)，训练组的5年累积癌变率在WFA⁺-CSF1R％高值组(≥35.0％、6名)中为75％，在低值组(＜35.0％、50名)中为30％，WFA⁺-CSF1R％高值组的累积癌变率显著高(P＝0.006)(图7a)。同样地，在验证组中，5年累积癌变率在WFA⁺-CSF1R％高值组(10名)中为75％，与低值组(35名)的42％相比，累积癌变率显著高(P＝0.005)(图7b)。

这些结果暗示，WFA⁺-CSF1R％不仅与HCC有相关性，可能为LC患者的癌化风险预测标志物。并且，用最小P值法算出的WFA⁺-CSF1R％值，作为LC患者的HCC癌变风险指数发挥作用。

(实施例4)关于无肝细胞癌的肝硬化患者(LC(+)HCC(-))的预后(生存率)

(4-1)全部患者的基于WFA⁺-CSF1R值的生存率

WFA⁺-CSF1R值在纤维化的进展中是上升的，因此将WFA⁺-CSF1R作为LC患者的预测因子来进行评价。通过时间依赖性ROC曲线的AUC(总观察期内的95％置信区间的ROC曲线下面积)和用Cox回归分析计算的风险比来评价临床因子和癌相关因子。

首先，在训练组中求出在Cox回归分析中显示最少的P值的值，作为WFA⁺-CSF1R的最佳截止值(310ng/ml、图8)。用于预测生存的风险比在WFA⁺-CSF1R值(≥310)处为3.63(95％CI 1.25-10.54、p＝0.011)。进而，使用独立的样品组(设为验证组)研究WFA⁺-CSF1R值的有效性，结果是WFA⁺-CSF1R值(≥310)有望作为预测因子(HR 6.07,95％CI 1.62-22.77,p＝0.002)。

综合训练组和验证组(表2)，就连续因子而言，WFA⁺-CSF1R的AUC为0.691(HR1.80,95％CI 1.23-2.62,p＝0.002)，白蛋白的AUC为0.719(HR 0.29,95％CI 0.18-0.47,p＜0.001)，Fib4的AUC为0.706(HR 1.78,95％CI 1.25-2.52,p＝0.001)。因此可知WFA⁺-CSF1R为最佳的候补，在训练组和验证组的LC患者预后中显示出最强的相关性。WFA⁺-CSF1R与LC患者的预后的相关性类似于Fib4的相关性，但本组中，白蛋白也为可信赖的预测因子。

进而，我们使用斯皮尔曼(Spearman)等级相关系数检验调查了WFA⁺-CSF1R值和其它连续变量的相关性。如(表4右侧)所示，可见WFA⁺-CSF1R值与其它因子多重相关。

[表4]

*关于分类变量，P值基于对数秩检验

(4-2)基于WFA⁺-CSF1R值的生存率

WFA⁺-CSF1R值随着纤维化的进展而上升，因此对WFA⁺-CSF1R能否成为LC患者的预后预测因子进行了评价。利用最小P值法(将上下10％的症例除外)，用于预测预后的WFA⁺-CSF1R的最佳截止值为310ng/ml(表1)，所述最小P值法基于对LC患者的肝细胞癌的累积生存率通过对数秩检验求出的P值，用时间依赖性ROC曲线研究生存率的结果，在WFA⁺-CSF1R值(≥310)处，HR为3.63(95％CI 1.25-10.54，p＝0.011)。

综合训练组和验证组的结果，WFA⁺-CSF1R的AUC为0.691(HR 1.80，95％CI 1.23-2.62，p＝0.002)，得到WFA⁺-CSF1R对于LC患者的预后预测良好的结果(表4)。

通过卡普兰-梅尔分析(Kaplan-Meier)研究了LC患者的累积生存率，WFA⁺-CSF1R高值组(≥310ng/ml)的1、3、5年生存率在训练组(8名)中分别为88％、60％、45％，在验证组(10名)中为100％、71％、43％。另一方面，在WFA⁺-CSF1R低值组(＜310ng/ml)中，训练组(48名)中为94％、89％、74％(p＝0.010)，验证组(35名)中为100％、100％、100％(p＜0.003)(图9a，b)。WFA⁺-CSF1R值高值组与低值组相比生存率显著低。

以上的结果验证，WFA⁺-CSF1R值作为LC患者的预后(生存率)因子是优异的，用最小P值法算出的WFA⁺-CSF1R的值作为LC患者的预后预测指数发挥作用。

(实施例5)标准CSF1R糖蛋白的制作

(5-1)rCSF1R的表达系统的构建和纯化

在作为肝硬化的血清糖蛋白标志物开发的WFA⁺-CSF1R的微量迅速测定试剂盒的开发中，研究了成为测定校准品的糖蛋白标准品的生产系统的构建。测定试剂盒为抗体-凝集素夹心检测体系，因此糖蛋白标准品中需要分别与抗体和凝集素反应的表位。通常认为，在标准糖蛋白的制作中选择生产具有目标糖链的糖蛋白的细胞至关重要。在肝纤维化标志物WFA⁺-M2BP的表达中，已经建立了具有与WFA结合的糖链的糖蛋白的表达，此次也模仿其过程使用HEK293细胞作为蛋白质表达的宿主细胞。

CSF1R蛋白为由972个氨基酸构成的膜蛋白(序列号1，2)，1-19位氨基酸为信号序列，20-517位氨基酸为胞外区域，518-538位氨基酸为跨膜区域，539-972位氨基酸为细胞内区域。胞外区域存在11个连接N结合型糖链的一致性序列，通常认为这些中的全部或部分上结合有N结合型糖链。基于这些信息，关于重组CSF1R(rCSF1R)，用PCR扩增编码作为其自身的信号序列和胞外区域的1-489个氨基酸的区域并导入到表达载体中。

以来自人单核细胞白血病细胞株(THP-1)的cDNA为模板，用2条引物：

正向引物：5’-AGGCCATGGGCCCAGGAGTTCTGCTGCT-3’,(序列号5)

反向引物：5’-ggaattcGTTGTGGGCCCTGCACTCGTAG-3’(下划线为EcoRI位点)(序列号6)

进行PCR反应，将所扩增的1.5Kbp的DNA片段亚克隆到pCRII-Blunt载体(英杰生命公司(Invitrogen))中，用Genetic Analyzer 3130xl(应用生物系统公司(AppliedBiosystems Corporation))对扩增核酸序列进行确认。将用EcoRI切断的DNA片段插入到表达载体pcDNA3.1neo(+)DDDDK(对英杰生命公司(Invitrogen)的载体进行了改良)的DDDDK标签序列前的EcoRI位点，构建pcDNA3.1-CSF1R-tag。其结果是，由该载体表达的rCSF1R在C末端具有DDDDK标签序列。

用Lipofectamine LTX(英杰生命公司(Invitrogen))使该质粒转染来自人胎儿肾脏的细胞株HEK293细胞，将1mg/mL的G418(纳卡拉测试公司(NACALAI TESQUE))添加到培养基中，筛选稳定表达株。将所构建的稳定表达株用DMEM+10％FCS+PS培养基以铺满状态培养48小时后，重复进行3次回收培养上清操作，在3100rpm离心分离10分钟后回收上清。

用抗DDDDK抗体柱(MBL公司)从回收的培养上清中纯化rCSF1R蛋白。将用0.45μm过滤器过滤后的培养上清供于DDDDK抗体柱，将直接通过的上清再次供于柱子。用为抗体柱体积的10倍量的含有0.1％吐温的PBS缓冲液洗涤，进而用PBS缓冲液进行洗涤。用为抗体柱体积的5倍量的含有DDDDK肽的PBS缓冲液来洗脱结合于抗体柱的rCSF1R，进而用超滤膜(Amicon 10K)进行洗脱中所用的DDDDK肽的除去和蛋白质的浓缩。(以下也将本发明中得到的rCSF1R蛋白称为“标准CSF1R(蛋白)”。)

纯化后的rCSF1R在测定蛋白质浓度后保存于-30℃。

(5-2)标准CSF1R(rCSF1R)的糖链图谱

抗体覆盖·凝集素微阵列法

凝集素微阵列的平台基本如上所述，在检测时，不是对上述受试者直接用荧光等进行标记，而是介由抗体间接向受试者中导入荧光基团等，从而为能够简便、高速地一起对多个被检体进行分析的应用法(参照“Kuno A,Kato Y,Matsuda A,Kaneko MK,Ito H,AmanoK,Chiba Y,Narimatsu H,Hirabayashi J.Mol Cell Proteomics.8,99-108(2009)”、“平林淳、久野敦、内山升“レクチンマイクロアレイを用いた糖鎖プロファイリング応用技術の開発(使用凝集素微阵列的糖链图谱应用技术的开发)”、实验医学增刊“分子レベルから迫る癌診断研究～臨床応用への挑戦～(从分子水平逼近的癌诊断研究～对临床应用的挑战～)”、羊土社、Vol25(17)164-171(2007)”、久野敦、平林淳“レクチンマイクロアレイによる糖鎖プロファイリングシステムの糖鎖バイオマーカー探索への活用(利用凝集素微阵列得到的糖链图谱系统在糖链生物标志物探索中的活用)”、基因医学MOOK11号“臨床糖鎖バイオマーかーの開発と糖鎖機能の解明(临床糖链生物标志物的开发和糖链功能的阐明)”、pp.34-39、メデイカルドゥ(medicaldo)(2008))。

例如，如果糖蛋白为被检物质，则糖链部分被凝集素微阵列上的凝集素所识别，因此通过从其上被覆(覆盖)针对核心蛋白部分的抗体，从而即使不对被检糖蛋白进行标记或不进行高度纯化也能特异性地、高灵敏度地进行检测。

具体如下来进行。

为了分析重组CSF1R糖蛋白的糖链谱，利用抗体覆盖·凝集素微阵列法进行分析。

凝集素微阵列使用了将45种不同凝集素各固定化3个斑点的微阵列(LecChip^TM，糖技术有限公司(Glyco Technica Co.,Ltd.))。对上述阵列分别以200ng/孔涂敷用缓冲液稀释后的LDN阳性和LDN阴性的重组CSF1R，一边缓慢振荡一边在20℃进行12小时的与凝集素的结合反应。在反应后，以2μg/孔添加人IgG，进行30分钟的封闭。然后将阵列上的含有封闭剂的试样溶液除去，用专用的缓冲液洗涤3次后，添加用含有20ug/mL人IgG的缓冲液稀释100倍的生物素化抗CSF1R多克隆抗体(R&D Systems(研发系统公司)制)，一边缓慢振荡一边在20℃进行1小时的抗体结合反应。反应后除去抗体溶液，用专用缓冲液洗涤3次后，添加用缓冲液稀释为5000倍的Cy3结合链霉亲和素(GE医疗集团(GE healthcare))，一边缓慢振荡一边在20℃进行1小时的二次反应。反应后除去二次反应液，用专用缓冲液洗涤3次后，用糖技术有限公司(Glyco Technica Co.,Ltd.)制凝集素微阵列用扫描仪(GlycoStation^TMReader1200)测定信号强度。减去背景值而算出真值后，算出各凝集素的3个斑点间的平均值，将全部凝集素的最大信号强度设为基准值，求出相对值并进行数值化(图10)。

(5-3)rCSF1R的糖链结构分析

使用上述纯化后的rCSF1R，用IGOT法确定N结合型糖链连接部位，进而用GlycoRidge法对每一N结合型糖链连接部位进行糖链结构分析。

在此，GlycoRidge法为本发明人开发的重组蛋白的肽序列以及糖链结构的分析技术(Noro E等,J Proteome Res.2015Sep 4；14(9)：3823-34.)，大致按照以下工序来进行。

将重组糖蛋白用DTT和碘乙酰胺进行还原烷基化，将用胰蛋白酶消化后回收的糖蛋白在酸性条件下(pH2以下)下进行高温加热(例如80℃加热2小时)而切除唾液酸。用LC/MS法分析该糖肽，将各糖肽信号的精密质量列表。由含有糖链连接部位的肽的计算质量和观测到的糖肽的质量之差推测糖链部分的单糖组成，对含有所推定的糖链基序的连接部位进行鉴定。用MALDI-TOF MS分析从糖肽中游离出的糖链，如果从认为组成中含有推定糖链基序的糖链检测到与推定糖链基序对应的碎片离子，则可以确认推定糖链基序和其连接位置(肽序列)正确。

具体按照以下工序来进行。

将重组体CSF1R进行还原烷基化(用与蛋白质等重量的DTT和碘乙酰胺(蛋白质×2.5倍重量)进行反应，然后进行透析等常规方法)后，进行胰蛋白酶消化，用酰胺80柱(东曹株式会社：TOSOH)回收糖肽。将其在酸性条件下(pH～2)、80℃下加热2小时而切除唾液酸。用LC/MS法分析该糖肽，将各个糖肽信号的精密质量列表(误差为2ppm以下，热科学公司(Thermo Scientific Corporation)制LTQ-Orbitrap Velos)。

由含有糖链连接部位的肽的计算质量和观测到的糖肽的质量之差推测糖链部分的单糖组成(Hex)*i+(HexNAc)*j+(dHex)*k；Hex＝Man/Gal,HexNAc＝GlcNAc/GalNAc,dHex＝岩藻糖。由推测出的糖链组成(例如Hex4+HexNAc5+Fuc1)鉴定推测含有GalNAc-GlcNAc(＝LacDiNAc)基序的连接部位。用MALDI-TOF MS分析由糖肽游离出的糖链，如果从认为组成中含有LacDiNAc的糖链(以下也称为LDN糖链)中检测到HexNAc-HexNAc碎片离子则确认了其的存在。

结果鉴定了市售CSF1R蛋白(图11)和标准CSF1R糖蛋白(图12)中的糖肽并明确了糖链的连接位置(图13)。确认在标准CSF1R糖蛋白中在73Asn和153Asn的糖链上结合有WFA阳性(成为表位)的LacdiNAc结构(LDN糖链)。

(实施例6)使用LDN缺损株来确认重组CSF1R上的LDN糖链位置

(6-1)LDN缺损株的构建

对于(实施例5)的(5-1)中得到的产生rCSF1R的转化HEK293细胞，用CRISPR/Cas9系统(Jennifer A.Doudna等,Science 28Nov 2014：Vol.346,Issue6213,DOI：10.1126/science.1258096)向编码具有LDN糖链特异性转移活性的糖转移酶B4GALNT3和B4GALNT4的基因中导入失活型变异，从而制作LDN缺损株，使其产生缺失了LDN糖链(WFA所结合的糖链)的标准CSF1R糖蛋白。

具体而言，向表达LDN的HEK293细胞中，用英杰生命公司(Invitrogen)的GeneArtCRISPR核酸酶载体试剂盒对B4GALNT3、B4GALNT4基因连续导入变异。为了对B4GALNT3导入变异，构建将设计在exon2中的(序列号7)所示的靶序列克隆到GeneArt CRISPR核酸酶CD4载体中而成的质粒，用Lipofectamine LTX(英杰生命公司(Invitrogen))转染HEK293细胞。在24～48小时后，用CD4浓缩试剂盒(英杰生命公司(Invitrogen))筛选导入了质粒的细胞，利用有限稀释法将多个单一克隆分离。用由(序列号8)和(序列号9)所示的碱基序列构成的引物组通过PCR由分离后的单一克隆株的基因组DNA扩增靶位点周边的序列，进行碱基测序，确认在由3000bp构成的B4GALNT3基因的编码区的第209位导入了移码突变，所述移码突变由插入腺嘌呤而引起。

然后，为了对B4GALNT4导入变异，构建将设计在exon2中的(序列号10)所示的靶序列克隆到GeneArt CRISPR核酸酶CD4载体中的质粒，用Lipofectamine LTX转染B4GALNT3变异细胞。同样地分离CD4阳性的单一克隆后，用由(序列号11)和(序列号12)所示的碱基序列构成的引物组通过PCR扩增靶位点周边的序列并进行碱基测序，确认在由3120bp构成的B4GALNT4基因的编码区的第184位导入了移码突变，所述移码突变由胞嘧啶缺失而引起。

(6-2)通过与LDN缺损株产生的rCSF1R上的糖链结构对比来确认LDN结合位置

通过与(实施例3)的(3-3)同样的方法确定LDN缺损株所产生的变异rCSF1R上的糖链结构和其糖链位置(图13)，可确认到：在结合于rCSF1R的第73位和第153位的位置的糖链中，标准CSF1R中包含LDN糖链而市售CSF1R(NS0)中则缺失该糖链。

(实施例7)抗CSF1R抗体的制作

(7-1)对CSF1R蛋白的小鼠的免疫

用市售的重组CSF1R蛋白(R&D Systems Inc(研发系统公司)：329-MR-100)免疫小鼠(Balb/c小鼠、8周龄，雌性)。将溶解于生理盐水的CSF1R蛋白与弗氏完全佐剂混合，将其在第一天(Day 0)腹腔注射50μg、第14天腹腔注射25μg、第29天腹腔注射25μg、第42天腹腔注射25μg、第66天腹腔注射10μg进行免疫。定期进行小鼠的眼窝采血，一边监测血清中针对抗原的抗体效价的上升一边进行免疫。

从确认抗体效价充分上升的免疫小鼠中采集抗体产生细胞。采集优选在末次免疫日起2～5天后，因此在3天后进行采集。作为抗体产生细胞，可列举脾细胞、淋巴节细胞、末梢血细胞等，优选脾细胞或局部淋巴节细胞。由小鼠采集抗体产生细胞的方法可以按照该领域中的公知技术来进行。因此，采集脾细胞并进行了后述的融合操作。

(7-2)杂交瘤的制作

然后，进行抗体产生细胞和骨髓瘤(myeloma)细胞的细胞融合，从而可以制作产生抗CSF1R单克隆抗体的杂交瘤。

使用来自免疫小鼠的脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞(P3U1细胞)，按照常规方法(后述)将各细胞用RPMI培养基洗涤后进行混合，利用细胞融合促进剂(PEG1500)进行细胞融合操作。将脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞(P3U1)的混合比率设为8：1来进行。在细胞融合后，用作为选择培养基的HAT培养基(在RPMI1640培养基中添加有100单位/mL青霉素、100μg/mL链霉素和10％胎牛血清(FBS)、10^-4M次黄嘌呤、1.5×10^-5M胸苷和4×10^-7M氨基蝶呤的培养基)进行培养，按照仅融合细胞生存的方式进行选择培养。选择用选择培养基开始培养起约10天后存活下来的细胞作为杂交瘤，从而然后利用有限稀释法得到单克隆的细胞。具体而言，在96孔培养平板中按照从浓到稀薄地制作稀释系列的方式播种细胞溶液(浓度)，选择来自数量受限的细胞的杂交瘤细胞组并通过后述的筛选选择产生针对CSF1R的抗体的克隆(含有该克隆的96孔平板的阳性孔)。

筛选方法以下所述。

利用酶免疫测定法(ELISA法)来筛选增殖而得的杂交瘤的培养上清中是否含有作为目标的抗CSF1R单克隆抗体。采集培养杂交瘤后的孔中所含的培养上清的一部分，以对于作为免疫原使用的CSF1R重组蛋白的结合活性为指标。将CSF1R重组蛋白固相化于96孔平板(以1μg/mL，100μL/孔)，进行封闭后加入100μL培养上清，在37度反应1小时。利用ELISA筛选和有限稀释法(具体而言，按照每1孔中包含0.3个左右的细胞的浓度播种在96孔培养平板中)选择阳性的克隆。一次筛选时有205个阳性孔，将其展开后进一步缩小范围，二次筛选时选择了100个孔，然后最终选择了33个克隆的作为抗CSF1R单克隆抗体产生细胞的杂交瘤。

最终，将利用上述筛选法选出的33个克隆的抗CSF1R单克隆抗体产生杂交瘤分别命名为CSR-1～CSR-33(表5)。

为了进行抗体的纯化，将得到的杂交瘤细胞的培养上清调整为100mL～1L左右。通过使用固相化有蛋白G的柱的亲和色谱法对其进行纯化。

(7-3)杂交瘤的保藏

这些克隆中，产生典型类型的抗CSF1R单克隆抗体CSR-3、CSR-4、CSR-18、CSR-21和CSR-30的杂交瘤以CSR-3(保藏号：NITE BP-02117)、或CSR-4(保藏号：NITE BP-02118)、CSR-18(保藏号：NITE BP-02119)、CSR-21(保藏号：NITE BP-02120)、CSR-30(保藏号：NITEBP-02121)于2015年9月10日保藏于独立行政法人制品评价技术基盘机构(NITE)专利微生物保藏中心(NPMD)后，于2016年9月7日转为国际保藏。

这些杂交瘤细胞株可以用在RPMI1640中添加有10％FBS的培养基在37℃适宜地培养。

另外，抗CSF1R单克隆抗体能够用常用技术进行回收，在需要进行抗体纯化时，可以使用离子交换色谱法、利用蛋白A或蛋白G等的亲和色谱法、凝胶色谱法、硫酸铵盐析法等公知方法进行纯化。

(实施例8)各抗CSF1R抗体的性能评价

(8-1)利用蛋白质印迹法进行的生物化学分析

使用抗CSF1R抗体，利用蛋白质印迹法进行该分子的检测。蛋白质印迹法按照常规方法进行。首先，如(图14左)所示，对除CSF1R(M-CSFR)以外的样品在SDS-PAGE还原条件下用10％聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，转印到PVDF膜。用含有5％脱脂乳的PBS封闭后，与第一抗体(抗CSF1R抗体的各克隆)在室温下反应1小时。在洗涤PVDF膜后，与第二抗体(0.5μg/mL的HRP标签化抗小鼠IgG抗体)在室温下反应1小时。在洗涤这些PVDF膜后，利用蛋白质印迹检测试剂(珀金埃尔默公司(Perkin Elmer Corporation))通过化学发光进行检测。

(结果)

将结果示于图14右表。确认对作为样品的M-CSFR(CSF1R)和细胞株THP-1的培养上清、以及作为阴性对照的人IgG、His-Tag(组氨酸标签)融合蛋白、牛血清的反应性。其结果是，18个克隆确认到反应性，表明这些为针对CSF1R的单克隆抗体。另外，对于各克隆，将结果综合示于(表5)。

(8-2)各抗体克隆所识别的抗原表位区域的分析

在评价性能时，进一步扩充了标准糖蛋白的种类。如(图15)所示，这些糖蛋白是以削减结构域而缩短了的蛋白质形式制作的。利用蛋白质印迹法研究了对这些各标准糖蛋白的反应性。蛋白质印迹法按照常规方法进行。首先，将各标准糖蛋白样品在SDS-PAGE还原条件下用10％聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，转印到PVDF膜。用含有5％脱脂乳的PBS进行封闭后，与第一抗体(抗CSF1R抗体的各单克隆抗体克隆)在室温下反应1小时。洗涤PVDF膜后，与第二抗体(0.5μg/mL的HRP标签化抗小鼠IgG抗体)在室温下反应1小时。洗涤这些PVDF膜后利用蛋白质印迹检测试剂(珀金埃尔默公司(Perkin Elmer Corporation))通过化学发光进行检测(图16)。该分析的结果如(图17)所示，可知各克隆所产生的抗体与哪个蛋白质区域反应。

(实施例9)使用了本发明中得到的抗CSF1R抗体的抗体-抗体ELISA测定体系

(9-1)利用抗体-抗体ELISA测定体系检测总CSF1R分子

使用抗CSF1R单克隆抗体，利用该分子(总CSF1R分子)的抗体-抗体ELISA测定体系进行检测。将所建立的抗CSF1R单克隆抗体分别固相化于ELISA板，在检测侧使用市售的抗CSF1R多克隆抗体，对能否用于ELISA测定体系进行研究。抗体的组合通常可以用于ELISA板固相化侧和检测侧(液相侧)中的任一侧，利用灵敏度高的抗体组合进行检测体系的构建。通常利用灵敏度高、成为背景的噪声少的组合进行检测体系的构建。

首先，将各抗体用PBS稀释为4μg/mL，向ELISA用微孔板中各孔添加100uL/孔。在4℃、过夜条件下使各抗体吸附平板后，废弃溶液，将孔用PBS-T(PBS，0.05％吐温-20)洗涤。然后，以300μL/孔加入封闭液(含有3％BSA的PBS)进行封闭。废弃前述封闭液，洗涤后将样品(CSF1R蛋白：R&D重组人M-CSFR Fc Chimera Cat#329-MR-100)溶液100μL添加到各孔中。在37℃反应2小时后，废弃孔中的溶液，在用PBS-T洗涤后，将生物素标记抗CSF1R抗体(R&D生物素化的抗-CSF1R pAb Cat#BAF329)制备为2μg/mL，在室温下反应1小时。然后废弃溶液并洗涤后，向每孔中加入辣根过氧化物酶(HRP)标记链霉亲和素(杰克逊公司(JacksonCorporation))溶液100μL，在室温下反应1小时。废弃反应液并洗涤后，以450nm的吸光度测定利用1StepUltra TMB基质液(皮尔斯公司(Pierce Corporation))进行的显色。

结果如(图18)所示，能够确认多个阳性克隆。另外，同时确认这些在阴性对照的情况下均看不到反应性。确认了利用单克隆抗体-多克隆抗体ELISA体系时的反应性，作为另外的组合，除了多克隆抗体以外也可以使用单克隆抗体。这种情况下，期望利用能够检测的组合来进行并选择灵敏度更高的组合。

(实施例10)使用本发明中得到的抗CSF1R抗体的抗体-WFA凝集素夹心ELISA测定 体系

(10-1)方法

在此，使用抗CSF1R单克隆抗体，利用该分子的抗体-WFA凝集素夹心ELISA测定体系进行检测。研究能否用于将抗CSF1R单克隆抗体分别用于ELISA板固相化侧、另一方面将WFA凝集素用于检测侧的抗体-凝集素夹心ELISA测定体系。抗体可以用于ELISA板固相化侧或检测侧(液相侧)中的任一侧，另一侧使用凝集素(即，将抗体用于固相侧时，将凝集素用于液相侧)，利用夹心的检测体系来进行。通过利用灵敏度高、成为背景的噪声少的组合来进行检测体系的构建。另外，WFA凝集素既可以使用市售品，也可以使用重组WFA、特别是LDN特异性单体重组WFA(srWFA)。

将各抗体用PBS稀释为4μg/mL，向ELISA用微孔板中各孔添加100uL/孔。在4℃、过夜条件下使各抗体吸附于平板后，废弃溶液，将孔用PBS-T(PBS，0.05％吐温-20)洗涤。然后，以300μL/孔添加封闭液(含有3％BSA的PBS)进行封闭。废弃前述封闭液并洗涤后，向各孔中添加样品(CSF1R重组蛋白：R&D重组人M-CSFR Fc Chimera Cat#329-MR-100)溶液100μL。在37℃反应2小时后，废弃孔中的溶液，用PBS-T洗涤后，将生物素标记化的WFA凝集素(srWFA和nWFA)分别制备成2μg/mL，在室温下反应1小时。然后，废弃溶液并洗涤后，向每孔中加入辣根过氧化物酶(HRP)标记链霉亲和素(杰克逊公司(Jackson Corporation))溶液100μL，在室温下反应1小时。废弃反应液并洗涤后，以450nm的吸光度测定利用1StepUltraTMB基质液(皮尔斯公司(Pierce Corporation))进行的显色。

(10-2)结果

关于固相侧使用了抗CSF1R单克隆抗体、检测侧使用了WFA凝集素的检测体系的结果，将作为代表例的CSR-3、CSR-4、CSR-18、CSR-21、CSR-30克隆的抗体的结果示于(图19，上段为srWFA，下段为nWFA)中。相反，关于固相侧使用了WFA凝集素、检测侧使用了抗CSF1R单克隆抗体的检测体系的结果，将作为代表例的CSR-3、CSR-4、CSR-18、CSR-21、CSR-30克隆的抗体的结果示于(图20，上段为srWFA，下段为nWFA)。由这些结果可确认，对于多个克隆的抗体确认到抗原浓度依赖性的反应性。

图21(左为srWFA，右为nWFA)中，构建了将LDN糖链特异性单体重组WFA(srWFA)或市售的天然WFA(nWFA)与抗CSF1R抗体组合而成的夹心ELISA体系，并对比了对于(实施例5)用HEK293细胞制作的具有LDN糖链的重组CSF1R、(实施例6)用糖链基因敲除细胞制作的不具有LDN糖链的重组CSF1R、和市售CSF1R(R&D重组人M-CSFR Fc Chimera Cat#329-MR-100)的反应性。

结果获知，使用单体重组WFA时能够LDN糖链特异性地检测到CSF1R分子。

(10-3)抗CSF1R单克隆抗体的评价

关于各克隆所产生的抗CSF1R抗体，将结果汇总于下述(表5)。

[表5]

(实施例11)利用抗体-WFA凝集素夹心ELISA测定体系检测WFA⁺-CSF1R分子

使用(实施例8)中制作的抗CSF1R抗体，利用该分子的抗体-WFA凝集素夹心ELISA测定体系进行检测。将抗CSF1R抗体分别用于ELISA板固相化侧和检测侧，对夹心ELISA测定体系进行研究。抗体可以用于ELISA板固相化侧或检测侧(液相侧)中的任一侧，另一侧使用凝集素(即，将抗体用于固相侧时，将凝集素用于液相侧)，利用夹心的检测体系来进行。另外，作为WFA凝集素，使用了市售的天然WFA和单体重组WFA(srWFA)。

具体而言，将各抗体用PBS稀释为4μg/mL，向ELISA用微孔板各孔添加100uL/孔。在4℃、过夜的条件下使各抗体吸附于平板后，废弃溶液，将孔用PBS-T(PBS，0.05％吐温-20)洗涤。然后，以300μL/孔添加封闭液(含有3％BSA的PBS)进行封闭。废弃前述封闭液并洗涤后，向各孔中添加样品(实施例5)用HEK293细胞制作的具有LDN糖链的重组CSF1R、(实施例6)用糖链基因敲除细胞制作的不具有LDN糖链的重组CSF1R、市售CSF1R(R&D重组人M-CSFRFc Chimera Cat#329-MR-100)、和健康人混合血清(NHS))的溶液100μL。在37℃反应2小时后，废弃孔中的溶液，用PBS-T洗涤后，将生物素标记化的WFA凝集素(或单体重组WFA：srWFA)分别制备为2μg/mL，在室温下反应1小时。然后，废弃溶液并洗涤后，向每孔中加入辣根过氧化物酶(HRP)标记链霉亲和素(杰克逊公司(Jackson Corporation))溶液100μL，在室温下反应1小时。废弃反应液并洗涤后，以450nm的吸光度测定利用1StepUltra TMB基质液(皮尔斯公司(Pierce Corporation))进行的显色。

结果显示，(实施例8)中制作的抗CSF1R抗体CSR-3、CSR-4、CSR-18、CSR-21、CSR-30与单体srWFA、nWFA中的任一者组合都能够检测存在于CSF1R分子上的WFA/VVA结合性糖链(图22)。特别是，显示LDN特异性单体srWFA能够特异性地识别LDN糖链的有无(图22上段)。需要说明的是，nWFA的情况下，对不具有LDN糖链的rCSF1R也观察到微弱的反应性，可认为其与LDN以外的糖链也反应。

(实施例12)使用抗体CRS-3的抗体-WFA凝集素夹心、和利用抗体-抗体夹心ELISA 测定体系进行的CSF1R分子检测

使用(实施例8)中制作的抗CSF1R抗体(CSR-3)、WFA凝集素、和市售抗体(R&DSystems(研发系统公司))，利用CSR-3-WFA凝集素夹心ELISA和CSR-3-市售抗体夹心ELISA测定体系进行调整为相同浓度(的稀释系列)的rCSF1R(LDN+)和rCSF1R(LDN-)的检测。

具体而言，将各抗体用PBS稀释成4μg/mL，向ELISA用微孔板各孔添加100uL/孔。在4℃、过夜的条件下使各抗体吸附于平板后，废弃溶液并洗涤孔PBS-T(PBS，0.05％吐温-20)。然后，以300μL/孔添加封闭液(含有3％BSA的PBS)进行封闭。废弃前述封闭液并洗涤后，向各孔中添加调整为相同CSF1R浓度(的稀释系列)的(实施例5)用HEK293细胞制作的具有LDN糖链的重组CSF1R和(实施例6)用糖链基因敲除细胞制作的不具有LDN糖链的重组CSF1R、和健康人混合血清(NHS))的溶液100μL。在37℃反应2小时后，废弃孔中的溶液并用PBS-T洗涤后，将生物素标记化的WFA凝集素(或单体重组WFA：srWFA)或市售的生物素标记抗CSF1R抗体(R&D生物素化的抗-CSF1R pAb Cat#BAF329)分别制备为2μg/mL，在室温下反应1小时。然后废弃溶液并洗涤后，向每孔中加入辣根过氧化物酶(HRP)标记链霉亲和素(杰克逊公司(Jackson Corporation))溶液100μL，在室温下反应1小时。废弃反应液并洗涤后，以450nm的吸光度测定利用1StepUltra TMB基质液(皮尔斯公司(Pierce Corporation))进行的显色。

结果确认：(实施例8)中制作的抗CSF1R抗体(CSR-3)对于CSF1R(LDN+)和rCSF1R(LDN-)中的任一者能够几乎相同地进行检测(图23下段)。另一方面，用WFA凝集素进行检测时，能够高灵敏度地检测CSF1R(LDN+)，CSF1R(LDN-)的反应性低(图23上段)。另外确认，在使用srWFA时，能够更特异地检测含有LDN糖链的CSF1R。

(实施例13)利用抗体-VVA凝集素夹心ELISA测定体系进行的标志物分子检测

还可以使用VVA凝集素等LacdiNAc/GalNAc结合性凝集素代替WFA凝集素。因此，使用抗CSF1R抗体，进行利用该分子的抗体-VVA凝集素夹心ELISA测定体系的检测。将抗CSF1R抗体分别用于ELISA板固相化侧和检测侧，对夹心ELISA测定体系进行研究。抗体可以用于ELISA板固相化侧或检测侧(液相侧)中的任一侧，另一侧使用凝集素(即，将抗体用于固相侧时，将凝集素用于液相侧)，利用夹心的检测体系来进行。通常，利用灵敏度高、成为背景的噪声少的组合来进行检测体系的构建。

将各抗体用PBS稀释为4μg/mL，向ELISA用微孔板各孔添加100uL/孔。在4℃、过夜的条件下使各抗体吸附于平板后，废弃溶液，将孔用PBS-T(PBS，0.05％吐温-20)洗涤。然后，以300μL/孔添加封闭液(含有3％BSA的PBS)进行封闭。废弃前述封闭液并洗涤后，向各孔中添加样品：(实施例5)用HEK293细胞制作的具有LDN糖链的重组CSF1R、(实施例6)用糖链基因敲除细胞制作的不具有LDN糖链的重组CSF1R和健康人混合血清(NHS))的溶液100μL。在37℃反应2小时后，废弃孔中的溶液，用PBS-T洗涤后，将生物素标记VVA凝集素(维百奥实验室公司(VECTOR Laboratories Corporation))制备成2μg/mL，在室温下反应1小时。然后废弃溶液并洗涤后，向每孔中加入辣根过氧化物酶(HRP)标记链霉亲和素(杰克逊公司(Jackson Corporation))溶液100μL，在室温下反应1小时。废弃反应液并洗涤后，以450nm的吸光度测定利用1StepUltra TMB基质液(皮尔斯公司(Pierce Corporation))进行的显色。

将在固相侧使用抗CSF1R抗体(CSR-3)的结果示于(图24)。该结果表明，利用使用VVA凝集素的检测体系也能够检测·测定WFA⁺-CSF1R。

(实施例14)利用本发明的抗CSF1R抗体进行的WFA⁺-CSF1R检测

(14-1)利用WFA凝集素-抗CSF1R抗体夹心ELISA体系进行的检测

在本实施例中，为了确认(实施例8)中制作的抗CSF1R单克隆抗体能够用于肝疾病标志物分子WFA⁺-CSF1R的检测，按照非专利文献2中记载的方法，应用抗CSF1R抗体-WFA凝集素夹心ELISA法测定血清中的WFA⁺-CSF1R值。

具体而言，作为被检血清，使用健康人混合血清血清(17名的量、NHS)、HBV感染肝细胞癌患者混合血清(K1)、HCV感染肝癌患者混合血清(K2)、HCV感染肝细胞癌患者(脾已摘除)混合血清(K3)。使用(实施例8)中制作的抗CSF1R抗体中的CSR-3、CSR-4、CSR-18、CSR-21、CSR-30，在包被后的Maxisorp(注册商标)免疫平板上，使血清试样(用阻断缓冲液稀释为1：20)在37℃作用2小时。然后用缓冲液洗涤10分钟，将生物素化WFA(维百奥实验室公司(VECTOR Laboratories Corporation))作为检测用探针进行反应。然后，在洗涤后，使HRP-结合链霉亲和素的1/50000稀释液以100μ/孔进行反应。在反应后，用缓冲液洗涤6次，将基质溶液(100μL、赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))添加到各孔中使其反应合适的时间后，用1M硫酸溶液终止反应。利用吸光度体系测定450nm波长的吸光度。

其结果是，虽然在各抗体的克隆间确认到差异，但是与健康人相比，任一抗CSF1R抗体克隆(CSR-3、CSR-4、CSR-18、CSR-21、CSR-30)在肝细胞癌患者中均确认到信号的增强，确认能够用于检查系统(图25)。

需要说明的是，(表5)中记载的其它抗CSF1R抗体(CSR-5、CSR-6等)虽然没有像CSR-3、CSR-4、CSR-18的结果那样的差异，但能够用于血清试样的肝细胞癌检测用ELISA(图26)。

(14-2)利用VVA凝集素-抗CSF1R抗体夹心ELISA体系的检测

本实验为如下实验：用于确认即使使用VVA凝集素代替WFA、通过与抗CSF1R抗体的夹心ELISA能够与WFA同样地识别来自肝细胞癌患者的混合血清和来自健康人的混合血清实验。

具体而言，与(14-1)同样地，将健康人血清的混合血清(17名的量、NHS)、HBV感染肝细胞癌患者混合血清(K1)、HCV感染肝癌患者混合血清(K2)、HCV感染肝细胞癌患者(脾已摘除)混合血清(K3)作为被检血清，使用(实施例8)中制作的抗CSF1R抗体中的CSR-18，仿照(14-1)的方法将生物素化WFA(维百奥实验室公司(VECTOR Laboratories Corporation))和生物素化VVA(维百奥实验室公司(VECTOR Laboratories Corporation))作为检测用探针进行反应。

然后，在洗涤后，使HRP-结合链霉亲和素的1/20000稀释液以100μ/孔进行反应。在反应后，用缓冲液洗涤4次，将基质溶液(100μL、赛默飞世尔科技公司(Thermo FisherScientific))添加到各孔中使其反应合适的时间后，用1M硫酸溶液终止反应。利用吸光度系统测定450nm波长的吸光度。

其结果是，抗体CSR-18与VVA凝集素的夹心ELISA测定体系也和与WFA凝集素的夹心ELISA测定体系的情形同样地，与健康人相比在肝细胞癌患者中可确认到信号的增强，确认能够识别肝细胞癌患者血清的混合血清和健康人的混合血清(图27)。

这意味着：VVA凝集素在使用实际的临床体液试样时与WFA凝集素相比毫不逊色，通过发挥对肝细胞癌患者中特异性地增加的CSF1R上的糖链的结合性、即用于将VVA凝集素与抗CSF1R抗体组合而成的测试体系，能够测定临床体液试样中的“含有WFA/VVA凝集素结合性糖链的CSF1R量”。

(实施例15)能够作为“总CSF1R量”测定用的ELISA使用的“CSF1R特异性糖链结合 性凝集素-抗CSF1R抗体夹心ELISA”体系的构建

本实施例对如下情况进行验证：作为本发明的肝细胞癌发病风险指数的“WFA⁺-CSF1R％”的测定、即被检试样中的“具有WFA/VVA结合性糖链的CSF1R量”相对于“总CSF1R量”的比率，通过测定“具有WFA/VVA结合性糖链的CSF1R量”相对于“具有CSF1R特异性凝集素结合性糖链的CSF1R量”即可。

具体而言，作为“CSF1R特异性凝集素”，使用典型的“RCA120、DSA、PHA-E4、SNA、SSA、TJA-I、LEL、STL、ConA”来构建CSF1R特异性凝集素-抗CSF1R抗体夹心测定体系，验证该凝集素-抗体夹心测试体系能够代替用于测定总CSF1R的、使用2种抗CSF1R抗体的夹心测定体系。

需要说明的是，由于各凝集素的糖链反应性(结合性)各自不同，因此在对比本实施例中的测定值的判定工序中，以作为与WFA(或VVA)-CSF1R值的相对值的值(比率)形式算出。

(15-1)WFA⁺-CSF1R和总CSF1R测定中的稀释体系的研究(BSA稀释液、10％NHS稀释液)

＜方法＞

WFA⁺-CSF1R和总CSF1R是对本发明人已经报道(非专利文献2)的方法进行部分改造而进行的。将Nunc Immobilizer Amino平板(热科学公司(Thermo Scientific)、43613)用4μg/mL的(实施例8)中制作的抗CSF1R抗体(CSR-3)包被2小时，用洗涤缓冲液(含有0.05％吐温20的PBS缓冲液，pH 7.4)洗涤后，用TBS(50mM Tris-pH8.0,0.15M NaCl)在4℃封闭过夜。作为样品，使用(实施例5)的重组CSF1R(LDN+)和(实施例6)的重组CSF1R(LDN-)分别作为来自疾病被检体、正常被检体的CSF1R的替代。作为稀释缓冲液，准备pH7.4的含有3％BSA、0.1％吐温20的PBS缓冲液(BSA稀释液)或含有10％NHS的上述BSA稀释液(10％NHS稀释液)，制备上述重组CSF1R(rCSF1R)的稀释溶液(在1.11～810ng/ml的范围内设定多个级别)，将100μl涂敷于平板，在室温下振荡2小时。用洗涤缓冲液洗涤4次后，作为检测用探针，添加用洗涤缓冲液稀释的生物素结合的各凝集素(250～20000倍稀释)[WFA(维百奥实验室(Vector Laboratory)，B-1355，5000倍稀释)、VVA(维百奥实验室(VectorLaboratory)，B-1235，250倍稀释)、RCA120(维百奥实验室(Vector Laboratory)，B-1085，20000倍稀释)、DSA(维百奥实验室(Vector Laboratory)，B-1185，10000倍稀释)、PHA-E4(日本制油公司(J-OIL MILLS，INC)，J211，2000倍稀释)、SNA(维百奥实验室(VectorLaboratory)，B-1305，10000倍稀释)、SSA(日本制油公司(J-OIL MILLS，INC)，J218，3000倍稀释)、TJA-1(生化学工业，300443，500倍稀释)、LEL(维百奥实验室(Vector Laboratory)，B-1175，5000倍稀释)、STL(维百奥实验室(Vector Laboratory)，B-1165，1000倍稀释)、ConA(维百奥实验室(Vector Laboratory)，B-1005，20000倍稀释)]、或抗CSF1R抗体(R&DSystems(研发系统公司)，BAF329，2000倍稀释)，在室温下振荡1个半小时。再用洗涤缓冲液洗涤4次后，与20000倍稀释HRP结合链霉亲和素溶液一起孵育1小时，用洗涤缓冲液洗涤4次。向各孔中加入TMB基质溶液(1-Step Ultra，热科学公司(Thermo Scientific)，34028)，用1M H₂SO₄终止反应后，测定450nm处的吸光度，作为ELISA信号值。

＜结果＞

将上述ELISA中、使用抗CSF1R抗体作为检测用探针时的信号值作为总CSF1R测定值，按照重组CSF1R[LacdiNAc(LDN)糖链(+)]和[LDN糖链(-)]的值达到一致的方式来调整浓度。调整浓度后的总CSF1R测定值在使用BSA稀释液、10％NHS稀释液中的任一情况下均良好地保持一致(图28A，B)。这表明，BSA稀释液体系、10％NHS稀释液体系中的任一者都能够没有问题地用于本测定体系。

(15-2)作为总CSF1R值的替代的各种CFS1R特异性凝集素的评价

为了评价作为总CSF1R值的替代的各种凝集素，将使用生物素标记的各凝集素作为检测用探针时的信号值在具有浓度依赖性的范围内利用平均值进行标准化，并使用其作为相对信号值。算出WFA-CSF1R相对信号值相对于各凝集素-CSF1R相对信号值的比，对rCSF1R(LDN+)和rCSF1R(LDN-)各自2个点或3个点的CSF1R浓度的平均值与使用抗CSF1R抗体时的总CFS1R值进行比较(图29)。任一凝集素均与使用抗CSF1R抗体时同样地，rCSF1R(LDN+)的值高于rCSF1R(LDN-)，rCSF1R(LDN+)相对于rCSF1R(LDN-)的比在抗CSF1R抗体的情况下为2.2，而凝集素的情况下为2.0±0.25(1.7～2.6)。由此，RCA120、DSA、PHA-E4、SNA、SSA、TJA-1、LEL、STL、Con A中的任一凝集素均可以作为抗CSF1R抗体的替代用于总CSF1R值的测定。根据以上可以说：作为总CSF1R值的替代，能够利用作为“CSF1R特异性共同糖链结合性凝集素”的各种凝集素的数值进行评价。另外，作为疾病特异性的情况，将使用VVA-CSF1R代替WFA-CSF1R同样进行测定、计算的结果示于图29。

另外，各凝集素对所识别的糖链具有不同的结合力，因此ELISA信号值(450nm处的吸光度，图29)根据凝集素而有强有弱。其中，对测定对象CSF1R分子的浓度进行了校正和对比。校正的方法如下。

rCSF1R(LDN+)蛋白如前述图13所示那样具有LDN糖链，其LDN糖链的阳性率在全部蛋白质中为约60％。因此以系数0.6来计算rCSF1R(LDN+)浓度的校正，将其作为校正值。使用该rCSF1R(LDN+)校正值制作标准曲线，将rCSF1R(LDN-)信号值带入标准曲线中而算出校正值(校正后的相对浓度值)，作为能够相互对比的rCSF1R(LDN+)校正值、rCSF1R(LDN-)校正值并将其图表化(图30)。用该校正值的结果也同样地，任一凝集素均与使用抗CSF1R抗体时同样地rCSF1R(LDN+)的值高于rCSF1R(LDN-)，在WFA与各共同糖链探针凝集素的比率方面，相对于rCSF1R(LDN-)和rCSF1R(LDN+)的值的相对比为3.8±0.9(2.7～5.7)。如图30所示，平均值显示出任一凝集素时均为几乎相同的量的倾向，由此认为：RCA120、DSA、PHA-E4、SNA、SSA、TJA-1、LEL、STL、Con A中的任一凝集素均可以作为抗CSF1R抗体的替代而用于总CSF1R值的测定。根据以上可以说：作为总CSF1R值的替代，能够利用作为“CSF1R特异性共同糖链结合性凝集素”的各种凝集素的数值进行评价。

(15-3)将VVA作为检测用探针时的稀释体系的研究

然后，使用VVA作为检测用探针来测定(15-1)中记载的样品，结果重组CSF1R(LDN+)的信号值呈浓度依赖性增大，与此相对地，(LDN-)的情况下信号值几乎不增大，此外该结果在使用10％NHS稀释液时也保持不变，因此表明VVA是能够鉴别来自疾病的CSF1R和正常CSF1R(图31A，B)。另外，这表明：缓冲液(BSA稀释液)体系、血清(10％NHS稀释液)体系中的任一体系，本申请的测定体系均能够没有问题地使用。

(15-4)抗体-各CSF1R特异性凝集素测定体系中的稀释体系的研究

另外，使用调整为相同浓度(的稀释系列)的rCSF1R(LDN+)和rCSF1R(LDN-)，利用使用抗体-各CSF1R特异性共同糖链探针凝集素的夹心(ELISA)检测进行总CSF1R测定。其中，随机选择几种作为各共同糖链探针凝集素选择(LEL、STL、TJA-I)来进行体系的确认。其结果是，浓度调整后的总CSF1R测定值在使用BSA稀释液、10％NHS稀释液中任一者的情况下均良好地保持一致(图32A～F)。这表明：缓冲液(BSA稀释液)体系、血清(10％NHS稀释液)体系中的任一者，本申请的测定体系都能够没有问题地使用。

(15-5)

以上表明：前述(15-1)～(15-4)所构建的检测体系(抗体-凝集素夹心ELISA体系)即使对于血清也能够没有问题地进行测定。

另外，由此也验证了：例如利用将WFA、VVA等疾病特异性探针(凝集素)和对CSF1R共同糖链具有结合性的探针(凝集素)组合而成的多重凝集素测试来测定具有疾病特异性糖链的分子量，能够判定是否罹患该疾病。

通过测定利用液相色谱、使用抗体的免疫沉降法·磁珠分离等分离纯化方法从样品分离纯化出的作为靶标的分子(CSF1R蛋白)对多个凝集素的结合量，也同样能够判定疾病。这种利用多重凝集素测试的测定方法可以如下进行：使从临床试样分离纯化出的CSF1R蛋白被1或2种以上凝集素夹心而形成复合体，对该复合体进行检测(定量)。关于CSF1R蛋白和凝集素的复合体的检测，可以通过本申请中进行的夹心ELISA体系来进行检测。代替本实施例中使用的“抗体-凝集素夹心ELISA”，可以制作将疾病特异性探针(即WFA或VVA凝集素)或与CSF1R特异性共同糖链具有结合性的探针(RCA120、DSA、PHA-E4、SNA、SSA、TJA-1、LEL、STL或Con A凝集素)中的任一者固相化后加入从临床试样中分离纯化出的CSF1R蛋白而使其反应、进而将另一者作为液相侧(检测侧)而进行夹心的ELISA体系，形成(多重)凝集素-蛋白质复合体，并对该复合体的量进行检测；或者，也可以为利用凝集素-凝集素夹心检测体系的体系。

此外，也可以利用毛细管电泳法、使用微流体技术的分离·检测系统来检测CSF1R蛋白和凝集素的复合体。进而，还可以同样地利用通过酶免疫测定法、双抗体夹心ELISA法、金胶体法、放射免疫测定法、胶乳凝集免疫测定法、荧光免疫测定法、蛋白质印迹法、免疫组织化学法、表面等离子体共振法(SPR法)或石英晶体微量天平(QCM)法等进行定性或定量的方法等进行测定。

保藏号

1.小鼠-小鼠杂交瘤“CSR-3”

保藏号：NITE BP-02117

保藏日：2015年9月10日(2016年9月7日转为国际保藏)

保藏机构：独立行政法人制品评价技术基盘机构、专利微生物保藏中心(NPMD)

2.小鼠-小鼠杂交瘤“CSR-4”

保藏号：NITE BP-02118

保藏日：2015年9月10日(2016年9月7日转为国际保藏)

保藏机构：独立行政法人制品评价技术基盘机构、专利微生物保藏中心(NPMD)

3.小鼠-小鼠杂交瘤“CSR-18”

保藏号：NITE BP-02119

保藏日：2015年9月10日(2016年9月7日转为国际保藏)

保藏机构：独立行政法人制品评价技术基盘机构、专利微生物保藏中心(NPMD)

4.小鼠-小鼠杂交瘤“CSR-21”

保藏号：NITE BP-02120

保藏日：2015年9月10日(2016年9月7日转为国际保藏)

保藏机构：独立行政法人制品评价技术基盘机构、专利微生物保藏中心(NPMD)

5.小鼠-小鼠杂交瘤“CSR-30”

保藏号：NITE BP-02121

保藏日：2015年9月10日(2016年9月7日转为国际保藏)

保藏机构：独立行政法人制品评价技术基盘机构、专利微生物保藏中心(NPMD)

序列表

<110> 国立研究开发法人产业技术综合研究所（NATIONAL INSTITUTE OF ADVANCEDINDUSTRIAL SCIENCE AND

TECHNOLOGY）

公立大学法人名古屋市立大学（PUBLIC UNIVERSITY CORPORATION NAGOYA CITYUNIVERSITY）

<120> 用于预测肝硬化患者的肝细胞癌发生风险和预后的方法

<130> SJU5168535WO

<150> JP 2015-186067

<151> 2015-09-18

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2919

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CSF1R

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(2919)

<400> 1

atg ggc cca gga gtt ctg ctg ctc ctg ctg gtg gcc aca gct tgg cat 48

Met Gly Pro Gly Val Leu Leu Leu Leu Leu Val Ala Thr Ala Trp His

1 5 10 15

ggt cag gga atc cca gtg ata gag ccc agt gtc ccc gag ctg gtc gtg 96

Gly Gln Gly Ile Pro Val Ile Glu Pro Ser Val Pro Glu Leu Val Val

20 25 30

aag cca gga gca acg gtg acc ttg cga tgt gtg ggc aat ggc agc gtg 144

Lys Pro Gly Ala Thr Val Thr Leu Arg Cys Val Gly Asn Gly Ser Val

35 40 45

gaa tgg gat ggc ccc cca tca cct cac tgg acc ctg tac tct gat ggc 192

Glu Trp Asp Gly Pro Pro Ser Pro His Trp Thr Leu Tyr Ser Asp Gly

50 55 60

tcc agc agc atc ctc agc acc aac aac gct acc ttc caa aac acg ggg 240

Ser Ser Ser Ile Leu Ser Thr Asn Asn Ala Thr Phe Gln Asn Thr Gly

65 70 75 80

acc tat cgc tgc act gag cct gga gac ccc ctg gga ggc agc gcc gcc 288

Thr Tyr Arg Cys Thr Glu Pro Gly Asp Pro Leu Gly Gly Ser Ala Ala

85 90 95

atc cac ctc tat gtc aaa gac cct gcc cgg ccc tgg aac gtg cta gca 336

Ile His Leu Tyr Val Lys Asp Pro Ala Arg Pro Trp Asn Val Leu Ala

100 105 110

cag gag gtg gtc gtg ttc gag gac cag gac gca cta ctg ccc tgt ctg 384

Gln Glu Val Val Val Phe Glu Asp Gln Asp Ala Leu Leu Pro Cys Leu

115 120 125

ctc aca gac ccg gtg ctg gaa gca ggc gtc tcg ctg gtg cgt gtg cgt 432

Leu Thr Asp Pro Val Leu Glu Ala Gly Val Ser Leu Val Arg Val Arg

130 135 140

ggc cgg ccc ctc atg cgc cac acc aac tac tcc ttc tcg ccc tgg cat 480

Gly Arg Pro Leu Met Arg His Thr Asn Tyr Ser Phe Ser Pro Trp His

145 150 155 160

ggc ttc acc atc cac agg gcc aag ttc att cag agc cag gac tat caa 528

Gly Phe Thr Ile His Arg Ala Lys Phe Ile Gln Ser Gln Asp Tyr Gln

165 170 175

tgc agt gcc ctg atg ggt ggc agg aag gtg atg tcc atc agc atc cgg 576

Cys Ser Ala Leu Met Gly Gly Arg Lys Val Met Ser Ile Ser Ile Arg

180 185 190

ctg aaa gtg cag aaa gtc atc cca ggg ccc cca gcc ttg aca ctg gtg 624

Leu Lys Val Gln Lys Val Ile Pro Gly Pro Pro Ala Leu Thr Leu Val

195 200 205

cct gca gag ctg gtg cgg att cga ggg gag gct gcc cag atc gtg tgc 672

Pro Ala Glu Leu Val Arg Ile Arg Gly Glu Ala Ala Gln Ile Val Cys

210 215 220

tca gcc agc agc gtt gat gtt aac ttt gat gtc ttc ctc caa cac aac 720

Ser Ala Ser Ser Val Asp Val Asn Phe Asp Val Phe Leu Gln His Asn

225 230 235 240

aac acc aag ctc gca atc cat caa caa tct gac ttt cat aat aac cgt 768

Asn Thr Lys Leu Ala Ile His Gln Gln Ser Asp Phe His Asn Asn Arg

245 250 255

tac caa aaa gtc ctg acc ctc aac ctc gat caa gta gat ttc caa cat 816

Tyr Gln Lys Val Leu Thr Leu Asn Leu Asp Gln Val Asp Phe Gln His

260 265 270

gcc ggc aac tac tcc tgc gtg gcc agc aac gtg cag ggc aag cac tcc 864

Ala Gly Asn Tyr Ser Cys Val Ala Ser Asn Val Gln Gly Lys His Ser

275 280 285

acc tcc atg ttc ttc cgg gtg gta gag agt gcc tac ttg aac ttg agc 912

Thr Ser Met Phe Phe Arg Val Val Glu Ser Ala Tyr Leu Asn Leu Ser

290 295 300

tct gag cag aac ctc atc cag gag gtg acc gtg ggg gag ggg ctc aac 960

Ser Glu Gln Asn Leu Ile Gln Glu Val Thr Val Gly Glu Gly Leu Asn

305 310 315 320

ctc aaa gtc atg gtg gag gcc tac cca ggc ctg caa ggt ttt aac tgg 1008

Leu Lys Val Met Val Glu Ala Tyr Pro Gly Leu Gln Gly Phe Asn Trp

325 330 335

acc tac ctg gga ccc ttt tct gac cac cag cct gag ccc aag ctt gct 1056

Thr Tyr Leu Gly Pro Phe Ser Asp His Gln Pro Glu Pro Lys Leu Ala

340 345 350

aat gtt acc acc aag gac aca tac agg cac acc ttc acc ctc tct ctg 1104

Asn Val Thr Thr Lys Asp Thr Tyr Arg His Thr Phe Thr Leu Ser Leu

355 360 365

ccc cgc ctg aag ccc tct gag gct ggc cgc tac tcc ttc ctg gcc aga 1152

Pro Arg Leu Lys Pro Ser Glu Ala Gly Arg Tyr Ser Phe Leu Ala Arg

370 375 380

aac cca gga ggc tgg aga gct ctg acg ttt gag ctc acc ctt cga tac 1200

Asn Pro Gly Gly Trp Arg Ala Leu Thr Phe Glu Leu Thr Leu Arg Tyr

385 390 395 400

ccc cca gag gta agc gtc ata tgg aca ttc atc aac ggc tct ggc acc 1248

Pro Pro Glu Val Ser Val Ile Trp Thr Phe Ile Asn Gly Ser Gly Thr

405 410 415

ctt ttg tgt gct gcc tct ggg tac ccc cag ccc aac gtg aca tgg ctg 1296

Leu Leu Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Pro Gln Pro Asn Val Thr Trp Leu

420 425 430

cag tgc agt ggc cac act gat agg tgt gat gag gcc caa gtg ctg cag 1344

Gln Cys Ser Gly His Thr Asp Arg Cys Asp Glu Ala Gln Val Leu Gln

435 440 445

gtc tgg gat gac cca tac cct gag gtc ctg agc cag gag ccc ttc cac 1392

Val Trp Asp Asp Pro Tyr Pro Glu Val Leu Ser Gln Glu Pro Phe His

450 455 460

aag gtg acg gtg cag agc ctg ctg act gtt gag acc tta gag cac aac 1440

Lys Val Thr Val Gln Ser Leu Leu Thr Val Glu Thr Leu Glu His Asn

465 470 475 480

caa acc tac gag tgc agg gcc cac aac agc gtg ggg agt ggc tcc tgg 1488

Gln Thr Tyr Glu Cys Arg Ala His Asn Ser Val Gly Ser Gly Ser Trp

485 490 495

gcc ttc ata ccc atc tct gca gga gcc cac acg cat ccc ccg gat gag 1536

Ala Phe Ile Pro Ile Ser Ala Gly Ala His Thr His Pro Pro Asp Glu

500 505 510

ttc ctc ttc aca cca gtg gtg gtc gcc tgc atg tcc atc atg gcc ttg 1584

Phe Leu Phe Thr Pro Val Val Val Ala Cys Met Ser Ile Met Ala Leu

515 520 525

ctg ctg ctg ctg ctc ctg ctg cta ttg tac aag tat aag cag aag ccc 1632

Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Tyr Lys Tyr Lys Gln Lys Pro

530 535 540

aag tac cag gtc cgc tgg aag atc atc gag agc tat gag ggc aac agt 1680

Lys Tyr Gln Val Arg Trp Lys Ile Ile Glu Ser Tyr Glu Gly Asn Ser

545 550 555 560

tat act ttc atc gac ccc acg cag ctg cct tac aac gag aag tgg gag 1728

Tyr Thr Phe Ile Asp Pro Thr Gln Leu Pro Tyr Asn Glu Lys Trp Glu

565 570 575

ttc ccc cgg aac aac ctg cag ttt ggt aag acc ctc gga gct gga gcc 1776

Phe Pro Arg Asn Asn Leu Gln Phe Gly Lys Thr Leu Gly Ala Gly Ala

580 585 590

ttt ggg aag gtg gtg gag gcc acg gcc ttt ggt ctg ggc aag gag gat 1824

Phe Gly Lys Val Val Glu Ala Thr Ala Phe Gly Leu Gly Lys Glu Asp

595 600 605

gct gtc ctg aag gtg gct gtg aag atg ctg aag tcc acg gcc cat gct 1872

Ala Val Leu Lys Val Ala Val Lys Met Leu Lys Ser Thr Ala His Ala

610 615 620

gat gag aag gag tcc ctc atg tcc gag ctg aag atc atg agc cac ctg 1920

Asp Glu Lys Glu Ser Leu Met Ser Glu Leu Lys Ile Met Ser His Leu

625 630 635 640

ggc cag cac gag aac atc gtc aac ctt ctg gga gcc tgt acc cat gga 1968

Gly Gln His Glu Asn Ile Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr His Gly

645 650 655

ggc cct gta ctg gtc atc acg gag tac tgt tgc tat ggc gac ctg ctc 2016

Gly Pro Val Leu Val Ile Thr Glu Tyr Cys Cys Tyr Gly Asp Leu Leu

660 665 670

aac ttt ctg cga agg aag gct gag gcc atg ctg gga ccc agc ctg agc 2064

Asn Phe Leu Arg Arg Lys Ala Glu Ala Met Leu Gly Pro Ser Leu Ser

675 680 685

ccc ggc cag gac ccc gag gga ggc gtc gac tat aag aac atc cac ctc 2112

Pro Gly Gln Asp Pro Glu Gly Gly Val Asp Tyr Lys Asn Ile His Leu

690 695 700

gag aag aaa tat gtc cgc agg gac agt ggc ttc tcc agc cag ggt gtg 2160

Glu Lys Lys Tyr Val Arg Arg Asp Ser Gly Phe Ser Ser Gln Gly Val

705 710 715 720

gac acc tat gtg gag atg agg cct gtc tcc act tct tca aat gac tcc 2208

Asp Thr Tyr Val Glu Met Arg Pro Val Ser Thr Ser Ser Asn Asp Ser

725 730 735

ttc tct gag caa gac ctg gac aag gag gat gga cgg ccc ctg gag ctc 2256

Phe Ser Glu Gln Asp Leu Asp Lys Glu Asp Gly Arg Pro Leu Glu Leu

740 745 750

cgg gac ctg ctt cac ttc tcc agc caa gta gcc cag ggc atg gcc ttc 2304

Arg Asp Leu Leu His Phe Ser Ser Gln Val Ala Gln Gly Met Ala Phe

755 760 765

ctc gct tcc aag aat tgc atc cac cgg gac gtg gca gcg cgt aac gtg 2352

Leu Ala Ser Lys Asn Cys Ile His Arg Asp Val Ala Ala Arg Asn Val

770 775 780

ctg ttg acc aat ggt cat gtg gcc aag att ggg gac ttc ggg ctg gct 2400

Leu Leu Thr Asn Gly His Val Ala Lys Ile Gly Asp Phe Gly Leu Ala

785 790 795 800

agg gac atc atg aat gac tcc aac tac att gtc aag ggc aat gcc cgc 2448

Arg Asp Ile Met Asn Asp Ser Asn Tyr Ile Val Lys Gly Asn Ala Arg

805 810 815

ctg cct gtg aag tgg atg gcc cca gag agc atc ttt gac tgt gtc tac 2496

Leu Pro Val Lys Trp Met Ala Pro Glu Ser Ile Phe Asp Cys Val Tyr

820 825 830

acg gtt cag agc gac gtc tgg tcc tat ggc atc ctc ctc tgg gag atc 2544

Thr Val Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Ile Leu Leu Trp Glu Ile

835 840 845

ttc tca ctt ggg ctg aat ccc tac cct ggc atc ctg gtg aac agc aag 2592

Phe Ser Leu Gly Leu Asn Pro Tyr Pro Gly Ile Leu Val Asn Ser Lys

850 855 860

ttc tat aaa ctg gtg aag gat gga tac caa atg gcc cag cct gca ttt 2640

Phe Tyr Lys Leu Val Lys Asp Gly Tyr Gln Met Ala Gln Pro Ala Phe

865 870 875 880

gcc cca aag aat ata tac agc atc atg cag gcc tgc tgg gcc ttg gag 2688

Ala Pro Lys Asn Ile Tyr Ser Ile Met Gln Ala Cys Trp Ala Leu Glu

885 890 895

ccc acc cac aga ccc acc ttc cag cag atc tgc tcc ttc ctt cag gag 2736

Pro Thr His Arg Pro Thr Phe Gln Gln Ile Cys Ser Phe Leu Gln Glu

900 905 910

cag gcc caa gag gac agg aga gag cgg gac tat acc aat ctg ccg agc 2784

Gln Ala Gln Glu Asp Arg Arg Glu Arg Asp Tyr Thr Asn Leu Pro Ser

915 920 925

agc agc aga agc ggt ggc agc ggc agc agc agc agt gag ctg gag gag 2832

Ser Ser Arg Ser Gly Gly Ser Gly Ser Ser Ser Ser Glu Leu Glu Glu

930 935 940

gag agc tct agt gag cac ctg acc tgc tgc gag caa ggg gat atc gcc 2880

Glu Ser Ser Ser Glu His Leu Thr Cys Cys Glu Gln Gly Asp Ile Ala

945 950 955 960

cag ccc ttg ctg cag ccc aac aac tat cag ttc tgc tga 2919

Gln Pro Leu Leu Gln Pro Asn Asn Tyr Gln Phe Cys

965 970

<210> 2

<211> 972

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体（Synthetic Construct）

<400> 2

Met Gly Pro Gly Val Leu Leu Leu Leu Leu Val Ala Thr Ala Trp His

1 5 10 15

Gly Gln Gly Ile Pro Val Ile Glu Pro Ser Val Pro Glu Leu Val Val

20 25 30

Lys Pro Gly Ala Thr Val Thr Leu Arg Cys Val Gly Asn Gly Ser Val

35 40 45

Glu Trp Asp Gly Pro Pro Ser Pro His Trp Thr Leu Tyr Ser Asp Gly

50 55 60

Ser Ser Ser Ile Leu Ser Thr Asn Asn Ala Thr Phe Gln Asn Thr Gly

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Cys Thr Glu Pro Gly Asp Pro Leu Gly Gly Ser Ala Ala

85 90 95

Ile His Leu Tyr Val Lys Asp Pro Ala Arg Pro Trp Asn Val Leu Ala

100 105 110

Gln Glu Val Val Val Phe Glu Asp Gln Asp Ala Leu Leu Pro Cys Leu

115 120 125

Leu Thr Asp Pro Val Leu Glu Ala Gly Val Ser Leu Val Arg Val Arg

130 135 140

Gly Arg Pro Leu Met Arg His Thr Asn Tyr Ser Phe Ser Pro Trp His

145 150 155 160

Gly Phe Thr Ile His Arg Ala Lys Phe Ile Gln Ser Gln Asp Tyr Gln

165 170 175

Cys Ser Ala Leu Met Gly Gly Arg Lys Val Met Ser Ile Ser Ile Arg

180 185 190

Leu Lys Val Gln Lys Val Ile Pro Gly Pro Pro Ala Leu Thr Leu Val

195 200 205

Pro Ala Glu Leu Val Arg Ile Arg Gly Glu Ala Ala Gln Ile Val Cys

210 215 220

Ser Ala Ser Ser Val Asp Val Asn Phe Asp Val Phe Leu Gln His Asn

225 230 235 240

Asn Thr Lys Leu Ala Ile His Gln Gln Ser Asp Phe His Asn Asn Arg

245 250 255

Tyr Gln Lys Val Leu Thr Leu Asn Leu Asp Gln Val Asp Phe Gln His

260 265 270

Ala Gly Asn Tyr Ser Cys Val Ala Ser Asn Val Gln Gly Lys His Ser

275 280 285

Thr Ser Met Phe Phe Arg Val Val Glu Ser Ala Tyr Leu Asn Leu Ser

290 295 300

Ser Glu Gln Asn Leu Ile Gln Glu Val Thr Val Gly Glu Gly Leu Asn

305 310 315 320

Leu Lys Val Met Val Glu Ala Tyr Pro Gly Leu Gln Gly Phe Asn Trp

325 330 335

Thr Tyr Leu Gly Pro Phe Ser Asp His Gln Pro Glu Pro Lys Leu Ala

340 345 350

Asn Val Thr Thr Lys Asp Thr Tyr Arg His Thr Phe Thr Leu Ser Leu

355 360 365

Pro Arg Leu Lys Pro Ser Glu Ala Gly Arg Tyr Ser Phe Leu Ala Arg

370 375 380

Asn Pro Gly Gly Trp Arg Ala Leu Thr Phe Glu Leu Thr Leu Arg Tyr

385 390 395 400

Pro Pro Glu Val Ser Val Ile Trp Thr Phe Ile Asn Gly Ser Gly Thr

405 410 415

Leu Leu Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Pro Gln Pro Asn Val Thr Trp Leu

420 425 430

Gln Cys Ser Gly His Thr Asp Arg Cys Asp Glu Ala Gln Val Leu Gln

435 440 445

Val Trp Asp Asp Pro Tyr Pro Glu Val Leu Ser Gln Glu Pro Phe His

450 455 460

Lys Val Thr Val Gln Ser Leu Leu Thr Val Glu Thr Leu Glu His Asn

465 470 475 480

Gln Thr Tyr Glu Cys Arg Ala His Asn Ser Val Gly Ser Gly Ser Trp

485 490 495

Ala Phe Ile Pro Ile Ser Ala Gly Ala His Thr His Pro Pro Asp Glu

500 505 510

Phe Leu Phe Thr Pro Val Val Val Ala Cys Met Ser Ile Met Ala Leu

515 520 525

Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Tyr Lys Tyr Lys Gln Lys Pro

530 535 540

Lys Tyr Gln Val Arg Trp Lys Ile Ile Glu Ser Tyr Glu Gly Asn Ser

545 550 555 560

Tyr Thr Phe Ile Asp Pro Thr Gln Leu Pro Tyr Asn Glu Lys Trp Glu

565 570 575

Phe Pro Arg Asn Asn Leu Gln Phe Gly Lys Thr Leu Gly Ala Gly Ala

580 585 590

Phe Gly Lys Val Val Glu Ala Thr Ala Phe Gly Leu Gly Lys Glu Asp

595 600 605

Ala Val Leu Lys Val Ala Val Lys Met Leu Lys Ser Thr Ala His Ala

610 615 620

Asp Glu Lys Glu Ser Leu Met Ser Glu Leu Lys Ile Met Ser His Leu

625 630 635 640

Gly Gln His Glu Asn Ile Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr His Gly

645 650 655

Gly Pro Val Leu Val Ile Thr Glu Tyr Cys Cys Tyr Gly Asp Leu Leu

660 665 670

Asn Phe Leu Arg Arg Lys Ala Glu Ala Met Leu Gly Pro Ser Leu Ser

675 680 685

Pro Gly Gln Asp Pro Glu Gly Gly Val Asp Tyr Lys Asn Ile His Leu

690 695 700

Glu Lys Lys Tyr Val Arg Arg Asp Ser Gly Phe Ser Ser Gln Gly Val

705 710 715 720

Asp Thr Tyr Val Glu Met Arg Pro Val Ser Thr Ser Ser Asn Asp Ser

725 730 735

Phe Ser Glu Gln Asp Leu Asp Lys Glu Asp Gly Arg Pro Leu Glu Leu

740 745 750

Arg Asp Leu Leu His Phe Ser Ser Gln Val Ala Gln Gly Met Ala Phe

755 760 765

Leu Ala Ser Lys Asn Cys Ile His Arg Asp Val Ala Ala Arg Asn Val

770 775 780

Leu Leu Thr Asn Gly His Val Ala Lys Ile Gly Asp Phe Gly Leu Ala

785 790 795 800

Arg Asp Ile Met Asn Asp Ser Asn Tyr Ile Val Lys Gly Asn Ala Arg

805 810 815

Leu Pro Val Lys Trp Met Ala Pro Glu Ser Ile Phe Asp Cys Val Tyr

820 825 830

Thr Val Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Ile Leu Leu Trp Glu Ile

835 840 845

Phe Ser Leu Gly Leu Asn Pro Tyr Pro Gly Ile Leu Val Asn Ser Lys

850 855 860

Phe Tyr Lys Leu Val Lys Asp Gly Tyr Gln Met Ala Gln Pro Ala Phe

865 870 875 880

Ala Pro Lys Asn Ile Tyr Ser Ile Met Gln Ala Cys Trp Ala Leu Glu

885 890 895

Pro Thr His Arg Pro Thr Phe Gln Gln Ile Cys Ser Phe Leu Gln Glu

900 905 910

Gln Ala Gln Glu Asp Arg Arg Glu Arg Asp Tyr Thr Asn Leu Pro Ser

915 920 925

Ser Ser Arg Ser Gly Gly Ser Gly Ser Ser Ser Ser Glu Leu Glu Glu

930 935 940

Glu Ser Ser Ser Glu His Leu Thr Cys Cys Glu Gln Gly Asp Ile Ala

945 950 955 960

Gln Pro Leu Leu Gln Pro Asn Asn Tyr Gln Phe Cys

965 970

<210> 3

<211> 861

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> WFA

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(861)

<400> 3

atg gct agc tcc caa act caa aat tca ttc tcc gtt ctt cta tcc att 48

Met Ala Ser Ser Gln Thr Gln Asn Ser Phe Ser Val Leu Leu Ser Ile

1 5 10 15

tcc tta act ttg ttc ctc ttg cta ctc aac aag gtg aac tca aaa gaa 96

Ser Leu Thr Leu Phe Leu Leu Leu Leu Asn Lys Val Asn Ser Lys Glu

20 25 30

aca act tcc ttt gtc ttc acc agg ttt tcc cca gac cca cag aac ttg 144

Thr Thr Ser Phe Val Phe Thr Arg Phe Ser Pro Asp Pro Gln Asn Leu

35 40 45

ctc ctc caa ggt gac acc gtt gtt acc tca tca ggg cat tta caa ctc 192

Leu Leu Gln Gly Asp Thr Val Val Thr Ser Ser Gly His Leu Gln Leu

50 55 60

acc cag gta aag gac ggc gaa cca gtc tat agt tct ctt ggg cga gcc 240

Thr Gln Val Lys Asp Gly Glu Pro Val Tyr Ser Ser Leu Gly Arg Ala

65 70 75 80

cta tat tat gcc cct atc cac att tgg gac agc aac acc gac acc gtg 288

Leu Tyr Tyr Ala Pro Ile His Ile Trp Asp Ser Asn Thr Asp Thr Val

85 90 95

gct aac ttt gtc acc agc ttc tcc ttt gtc atc gat gca cct aac aaa 336

Ala Asn Phe Val Thr Ser Phe Ser Phe Val Ile Asp Ala Pro Asn Lys

100 105 110

gcc aaa gct gca gat ggc ctt gcc ttc ttc ctt gca cct gtg gat act 384

Ala Lys Ala Ala Asp Gly Leu Ala Phe Phe Leu Ala Pro Val Asp Thr

115 120 125

gag ccc caa aaa cct gga gga ctg ctc ggg ctt ttc cat gac gac cgt 432

Glu Pro Gln Lys Pro Gly Gly Leu Leu Gly Leu Phe His Asp Asp Arg

130 135 140

cac aat aaa tcc aac cat att gtt gcg gtt gaa ttt gac acc ttc aag 480

His Asn Lys Ser Asn His Ile Val Ala Val Glu Phe Asp Thr Phe Lys

145 150 155 160

aac agc tgg gat cca gaa ggt aca cat att gga atc aat gtc aac tct 528

Asn Ser Trp Asp Pro Glu Gly Thr His Ile Gly Ile Asn Val Asn Ser

165 170 175

atc gta tcg aga aaa acc aca tca tgg gat ttg gag aat ggc gaa gta 576

Ile Val Ser Arg Lys Thr Thr Ser Trp Asp Leu Glu Asn Gly Glu Val

180 185 190

gcc aat gtt gtc ata agc tac caa gct tct acc aaa acc ttg act gcc 624

Ala Asn Val Val Ile Ser Tyr Gln Ala Ser Thr Lys Thr Leu Thr Ala

195 200 205

tct ttg gtt tat cct tca agt tca act agt tat atc cta aat gat gtt 672

Ser Leu Val Tyr Pro Ser Ser Ser Thr Ser Tyr Ile Leu Asn Asp Val

210 215 220

gtg gat ttg aag caa att ctt ccc gag tat gta aga gtt ggt ttc acc 720

Val Asp Leu Lys Gln Ile Leu Pro Glu Tyr Val Arg Val Gly Phe Thr

225 230 235 240

gct gca agt gga cta tct aaa gac cac gtt gaa aca cac gat gtt ctt 768

Ala Ala Ser Gly Leu Ser Lys Asp His Val Glu Thr His Asp Val Leu

245 250 255

gcg tgg act ttc gac tca gat ttg cca gat cct agc agt gat gat tgc 816

Ala Trp Thr Phe Asp Ser Asp Leu Pro Asp Pro Ser Ser Asp Asp Cys

260 265 270

aac aac ttg cat ctt tca agc aat gtt ctg cgc ggt tcc atc taa 861

Asn Asn Leu His Leu Ser Ser Asn Val Leu Arg Gly Ser Ile

275 280 285

<210> 4

<211> 286

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体（Synthetic Construct）

<400> 4

Met Ala Ser Ser Gln Thr Gln Asn Ser Phe Ser Val Leu Leu Ser Ile

1 5 10 15

Ser Leu Thr Leu Phe Leu Leu Leu Leu Asn Lys Val Asn Ser Lys Glu

20 25 30

Thr Thr Ser Phe Val Phe Thr Arg Phe Ser Pro Asp Pro Gln Asn Leu

35 40 45

Leu Leu Gln Gly Asp Thr Val Val Thr Ser Ser Gly His Leu Gln Leu

50 55 60

Thr Gln Val Lys Asp Gly Glu Pro Val Tyr Ser Ser Leu Gly Arg Ala

65 70 75 80

Leu Tyr Tyr Ala Pro Ile His Ile Trp Asp Ser Asn Thr Asp Thr Val

85 90 95

Ala Asn Phe Val Thr Ser Phe Ser Phe Val Ile Asp Ala Pro Asn Lys

100 105 110

Ala Lys Ala Ala Asp Gly Leu Ala Phe Phe Leu Ala Pro Val Asp Thr

115 120 125

Glu Pro Gln Lys Pro Gly Gly Leu Leu Gly Leu Phe His Asp Asp Arg

130 135 140

His Asn Lys Ser Asn His Ile Val Ala Val Glu Phe Asp Thr Phe Lys

145 150 155 160

Asn Ser Trp Asp Pro Glu Gly Thr His Ile Gly Ile Asn Val Asn Ser

165 170 175

Ile Val Ser Arg Lys Thr Thr Ser Trp Asp Leu Glu Asn Gly Glu Val

180 185 190

Ala Asn Val Val Ile Ser Tyr Gln Ala Ser Thr Lys Thr Leu Thr Ala

195 200 205

Ser Leu Val Tyr Pro Ser Ser Ser Thr Ser Tyr Ile Leu Asn Asp Val

210 215 220

Val Asp Leu Lys Gln Ile Leu Pro Glu Tyr Val Arg Val Gly Phe Thr

225 230 235 240

Ala Ala Ser Gly Leu Ser Lys Asp His Val Glu Thr His Asp Val Leu

245 250 255

Ala Trp Thr Phe Asp Ser Asp Leu Pro Asp Pro Ser Ser Asp Asp Cys

260 265 270

Asn Asn Leu His Leu Ser Ser Asn Val Leu Arg Gly Ser Ile

275 280 285

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CSF1R-正向引物（CSF1R-Fwd-primer）

<400> 5

aggccatggg cccaggagtt ctgctgct 28

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CSF1R-反向引物（CSF1R-Rev-primer）

<400> 6

ggaattcgtt gtgggccctg cactcgtag 29

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> B4GALNT3-顶（B4GALNT3-Top）

<400> 7

tggccaaggc tctggccagc gtttt 25

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> B4GALNT3-gPCR-正向引物（B4GALNT3-gPCR-Fwd primer）

<400> 8

gagaggtgag aagggaagac ggt 23

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> B4GALNT3-gPCR-反向引物（B4GALNT3-gPCR-Rev primer）

<400> 9

actctggggg ctgtttatcc tct 23

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> B4GALNT4-顶（B4GALNT4-Top）

<400> 10

ccagtgagac cgacggccgg gtttt 25

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> B4GALNT4-gPCR-正向引物（B4GALNT4-gPCR-Fwd primer）

<400> 11

aagcagatga gaaggagagg ctt 23

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> B4GALNT4-gPCR-反向引物（B4GALNT4-gPCR-Rev primer）

<400> 12

acagagctcc agacaggatg gct 23

Claims (32)

1.肝硬化患者的肝细胞癌的发病风险值的算出方法，其中，其包括(1)～(4)的工序：

(1)测定采自肝硬化患者的受试者的一定体积的体液试样中的总CSF1R量A的工序，以下，采自肝硬化患者的受试者的一定体积的体液试样也简称为被检试样；

(2)测定被检试样中的含有WFA和/或VVA结合性糖链的CSF1R量B的工序，以下，WFA和/或VVA记作WFA/VVA；和

(3)将含有WFA/VVA结合性糖链的CSF1R量在总CSF1R中所占的比率C作为“C％＝B/A×100”而算出的工序；

(4)将工序(3)中得到的C％的值确定为受试者的肝细胞癌的发病风险值的工序。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，(1)的测定总CSF1R量的工序，利用使用至少2种抗CSF1R抗体的夹心测试体系进行测定，或者使用抗CSF1R抗体从被检试样中纯化CSF1R并测定纯化CSF1R量。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，(1)的测定被检试样中的总CSF1R量A的工序，是测定被检试样中的含有CSF1R特异性凝集素结合性糖链的CSF1R量的工序，在该工序中，利用至少含有CSF1R特异性凝集素和抗CSF1R抗体的夹心测试体系进行测定，或者使用抗CSF1R抗体从被检试样中纯化CSF1R并测定与CSF1R特异性凝集素结合的纯化CSF1R量。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，CSF1R特异性凝集素是从由RCA120、DSA、PHA-E4、SNA、SSA、TJA-I、LEL、STL和ConA组成的组中选出的至少1种凝集素。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其特征在于，(2)的测定含有WFA/VVA结合性糖链的CSF1R量B的工序，利用至少含有WFA/VVA凝集素和抗CSF1R抗体的夹心测试体系进行测定，或者使用抗CSF1R抗体从被检试样中纯化CSF1R并测定与LDN特异性凝集素结合的纯化CSF1R量。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，WFA/VVA凝集素是从天然WFA、重组WFA、单体重组WFA和VVA中的任一者中选出的至少1种凝集素。

7.根据权利要求3～6中任一项所述的方法，其特征在于，工序(1)和工序(2)是至少使用CSF1R特异性凝集素和WFA/VVA凝集素以及抗CSF1R抗体并且同时进行的工序，在该工序中，使用含有这两种凝集素和抗CSF1R抗体的相同的夹心测试体系进行测定，或者使用抗CSF1R抗体从被检试样中纯化CSF1R后，使用相同测试体系测定与各凝集素结合的CSF1R量。

8.判定肝硬化患者的肝细胞癌的发病风险值的方法，其中，其包括(1)～(3)的工序：

(1)按照权利要求1～7中任一项所述的方法算出作为肝硬化患者的受试者的肝细胞癌的发病风险值C％的工序；

(2)对预先采自足够的参量的未罹患肝细胞癌的肝硬化患者的各体液试样，利用与工序(1)相同的算出工序，将各自的含有WFA/VVA结合性糖链的CSF1R量在总CSF1R中所占的比率Cn与随访各个患者而得到的肝细胞癌发病率数据进行对比，从而算出肝细胞癌发病的最佳截止值M％的工序；

(3)将工序(1)中算出的肝细胞癌的发病风险值C％与(2)中算出的最佳截止值M％对比，超过时判定为受试者的肝细胞癌发病风险显著高，小于最佳截止值则判定为发病风险显著低。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述最佳截止值为35.0±10.0％的值。

10.肝硬化患者的预后判定指数值的算出方法，其中，其包括(1)和(2)的工序：

(1)测定采自作为肝硬化患者的受试者的一定体积的体液试样中的含有WFA/VVA结合性糖链的CSF1R量B的工序，采自作为肝硬化患者的受试者的一定体积的体液试样是被检试样；

(2)将工序(1)中得到的B ng/ml的值确定为受试者的预后判定指数值的工序。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，(1)的测定含有WFA/VVA结合性糖链的CSF1R量B的工序，利用至少含有WFA/VVA凝集素和抗CSF1R抗体的夹心测试体系进行测定，或者使用抗CSF1R抗体从被检试样中纯化CSF1R并测定与LDN特异性凝集素结合的纯化CSF1R量。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，WFA/VVA凝集素是从天然WFA、重组WFA、单体重组WFA和VVA中的任一者中选出的至少1种凝集素。

13.判定肝硬化患者的预后的方法，其中，其包括(1)～(3)的工序：

(1)按照权利要求10～12中任一项所述的方法算出作为肝硬化患者的受试者的预后判定指数值B ng/ml的工序、

(2)对预先采自足够的参量的未罹患肝细胞癌的肝硬化患者的各体液试样，利用与工序(1)相同的算出工序，将各自的含有WFA/VVA结合性糖链的CSF1R量Bn与随访各个患者而得到的累积生存率数据对比，从而算出肝细胞癌患者预后的最佳截止值N ng/ml的工序；

(3)将工序(1)中算出的预后判定指数值B ng/ml与(2)中算出的最佳截止值N ng/ml对比，超过时判定为受试者的受试者的预后显著不良，小于最佳截止值则判定为受试者的预后显著良好。

14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述最佳截止值是310±100ng/ml的值。

15.用于检测或定量含有WFA/VVA结合性糖链的CSF1R的凝集素-抗体夹心测试法，其中，其使用：WFA/VVA凝集素和从由CSR-3、CSR-4、CSR-18、CSR-21、CSR-30、CSR-5、CSR-6、CSR-22、CSR-24、CSR-7、CSR-9、CSR-13、CSR-26、CSR-27和CSR-29抗体组成的组中选出的至少1种抗CSF1R抗体，并且包括(1)～(3)的工序：

(1)在液相中使所述凝集素或所述抗CSF1R抗体中的任一者与被检试样接触而形成与被检试样中的CSF1R的复合体的工序；

(2)分离(1)中得到的与凝集素或抗体的CSF1R复合体或不进行分离，在溶解或分散有另一者的检测用液相中使另一者与CSF1R复合体结合而得到被凝集素和抗体夹心的CSF1R复合体的工序；

(3)对(2)中得到的凝集素和抗体夹心CSF1R复合体量进行检测或定量的工序。

16.根据权利要求15所述的测试法，其中，WFA/VVA凝集素是从由天然WFA、重组WFA、单体重组WFA和VVA组成的组中选出的至少1种凝集素。

17.试剂盒，其中，其是用于检测或定量含有WFA/VVA结合性糖链的CSF1R的凝集素-抗体夹心测试用试剂盒，并且包含(1)和(2)：

(1)WFA/VVA凝集素；

(2)从由CSR-3、CSR-4、CSR-18、CSR-21、CSR-30、CSR-5、CSR-6、CSR-22、CSR-24、CSR-7、CSR-9、CSR-13、CSR-26、CSR-27和CSR-29抗体组成的组中选出的至少1种抗CSF1R抗体。

18.根据权利要求17所述的试剂盒，其中，其还含有以下的(3)：

(3)由含有WFA/VVA结合性糖链的CSF1R和/或不含WFA/VVA结合性糖链的CSF1R构成的标准物质。

19.根据权利要求18或19所述的试剂盒，其中，WFA/VVA凝集素是从由天然WFA、重组WFA、单体重组WFA和VVA组成的组中选出的至少1种凝集素。

20.根据权利要求17～19中任一项所述的试剂盒，其中，凝集素-抗体夹心测试是应用于来自受试者的体液试样并且用于检测或定量体液试样中的含有WFA/VVA结合性糖链的CSF1R的测试。

21.抗CSF1R抗体或抗CSF1R抗体的抗体结合性片段，其中，其由从由国际保藏号为NITEBP-02117的CSR-3、国际保藏号为NITE BP-02118的CSR-4、国际保藏号为NITE BP-02119的CSR-18、国际保藏号为NITE BP-02120的CSR-21、国际保藏号为NITE BP-02121的CSR-30组成的组中选出的任一杂交瘤产生。

22.试剂盒，其特征在于，其为用于算出作为肝硬化患者的受试者的肝细胞癌发病风险值和/或预后判定值的试剂盒，包含(1)和(2)的凝集素：

(1)WFA/VVA凝集素；

(2)CSF1R特异性凝集素。

23.根据权利要求22所述的试剂盒，其特征在于，还包含(3)：

(3)抗CSF1R抗体或抗CSF1R抗体的抗体结合性片段。

24.根据权利要求22或23所述的试剂盒，其中，

(1)的WFA/VVA凝集素是从由天然WFA、重组WFA、单体重组WFA和VVA组成的组中选出的至少1种凝集素；

(2)的CSF1R特异性凝集素是从由RCA120、DSA、PHA-E4、SNA、SSA、TJA-I、LEL、STL和ConA组成的组中选出的至少1种凝集素。

25.根据权利要求22～24中任一项所述的试剂盒，其中，(1)或(2)的凝集素中的任一者结合于固相并且另一者溶解或分散于检测用的液相，所述固相是用于捕捉含有WFA/VVA结合性糖链的CSF1R而设置的。

26.根据权利要求22～24中任一项所述的试剂盒，其中，(1)和(2)的凝集素两者结合于相同或不同的凝集素阵列上。

27.判定用试剂盒，其特征在于，其为用于判定作为肝硬化患者的受试者的肝细胞癌发病风险和/或预后的试剂盒，并且含有(1)～(3)：

(1)WFA/VVA凝集素；

(2)CSF1R特异性凝集素；

(3)抗CSF1R抗体或抗CSF1R抗体的抗体结合性片段。

28.根据权利要求27所述的判定用试剂盒，其中，

(1)的WFA/VVA凝集素是从由天然WFA、重组WFA、单体重组WFA和VVA组成的组中选出的至少1种凝集素；

(2)的CSF1R特异性凝集素是从由RCA120、DSA、PHA-E4、SNA、SSA、TJA-I、LEL、STL和ConA组成的组中选出的至少1种凝集素；并且

(3)的抗CSF1R抗体是从由CSR-3、CSR-4、CSR-18、CSR-21、CSR-30、CSR-5、CSR-6、CSR-22、CSR-24、CSR-7、CSR-9、CSR-13、CSR-26、CSR-27和CSR-29抗体组成的组中选出的至少1种抗CSF1R抗体。

29.用于判定作为肝硬化患者的受试者的肝细胞癌发病风险和/或预后的方法，其特征在于，其包括(1)和(2)的工序：

(1)使用抗CSF1R抗体从来自受试者的体液试样中分离纯化CSF1R蛋白的工序；

(2)测定(1)中分离纯化出的CSF1R上的WFA/VVA结合性糖链含量和CSF1R特异性糖链含量的工序。

30.用于判定作为肝硬化患者的受试者的肝细胞癌发病风险和/或预后的方法，其特征在于，其包括(1)和(2)的工序：

(1)使用从由天然WFA、重组WFA、单体重组WFA和VVA组成的组中选出的至少1种凝集素从来自受试者的体液试样中分离含有WFA/VVA结合性糖链的糖蛋白的工序；

(2)使用抗CSF1R抗体从(1)中分离纯化出的含有WFA/VVA结合性糖链的糖蛋白中检测或定量CSF1R蛋白的工序，

所述抗CSF1R抗体是从由CSR-3、CSR-4、CSR-18、CSR-21、CSR-30、CSR-5、CSR-6、CSR-22、CSR-24、CSR-7、CSR-9、CSR-13、CSR-26、CSR-27和CSR-29抗体组成的组中选出的至少1种抗CSF1R抗体。

31.用于判定作为肝硬化患者的受试者的肝细胞癌发病风险和/或预后的方法，其特征在于，其包括对来自受试者的体液试样进行使用(1)和(2)的凝集素-抗体夹心测试的工序：

(1)WFA/VVA凝集素；

(2)从由CSR-3、CSR-4、CSR-18、CSR-21、CSR-30、CSR-5、CSR-6、CSR-22、CSR-24、CSR-7、CSR-9、CSR-13、CSR-26、CSR-27和CSR-29抗体组成的组中选出的至少1种抗CSF1R抗体。

32.用于判定未罹患肝细胞癌的肝硬化患者的肝细胞癌发病风险的方法，其特征在于，其包括(1)和(2)的工序：

(1)测定采自作为未罹患肝细胞癌的肝硬化患者的受试者的体液试样中的含有WFA/VVA结合性糖链的CSF1R量和总CSF1R量的工序；

(2)以(1)中得到的测定值为基础算出具有WFA/VVA结合性糖链的CSF1R量在总CSF1R中所占的比率的工序；

(3)对预先采自足够的参量的未罹患肝细胞癌的肝硬化患者的体液试样，利用与所述(1)和(2)相同的工序对全部患者分别算出具有WFA/VVA结合性糖链的CSF1R量在总CSF1R中所占的比率的工序；

(4)基于随访(3)中使用的全部患者而得到的癌变率数据算出最佳截止值的工序；

(5)将(2)中算出的受试者的比率的值与(4)中算出的最佳截止值对比，超过时判定为肝细胞癌发病风险高。