JP6029218B2 - 肺癌鑑別マーカー - Google Patents
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Description
本発明の第1の実施形態は、前記表1又は表2に記載の肺癌鑑別マーカー糖タンパク質及びその糖タンパク質の断片である。
本実施形態の「肺癌鑑別マーカー糖タンパク質」は、表1においてタンパク質番号#1〜31で、及び表2においてタンパク質#1〜48で、それぞれ示されるタンパク質が該当する。これらのタンパク質は、いずれもそのアミノ酸配列において、少なくとも表中の「糖鎖付加位置」で示される位置(開始アミノ酸残基の位置を1とする)のアスパラギン残基に糖鎖が付加された肺癌特異的な糖タンパク質である。例えば、表1のタンパク質#1のacid alpha-glucosidase(酸性αグルコシダーゼ)であれば、そのタンパク質のアミノ酸配列上の少なくとも390位、470位及び882位のアスパラギン残基に糖鎖が付加されている。以降本明細書では、糖鎖が付加されたタンパク質を「糖タンパク質」として表す。
本実施形態の「肺癌鑑別マーカー糖タンパク質(の)断片」とは、前記肺癌鑑別マーカー糖タンパク質の一部からなるオリゴペプチド又はポリペプチドの断片であって、そのアミノ酸配列中に表1又は表2に示す糖付加位置のアスパラギン残基を少なくとも一つ含み、かつそのアスパラギン残基に前記「1−1.肺癌鑑別マーカー糖タンパク質」で説明した肺癌特異的な糖鎖が付加されていることを特徴とする。
本実施形態の肺癌鑑別マーカー糖タンパク質断片及び肺癌鑑別マーカー糖タンパク質を取得及び同定した方法について、以下で説明をする。
肺癌特異的糖タンパク質の大規模な選択的捕集、濃縮は、大きく分けて、糖鎖との親和性を有するプローブを用いる方法、糖鎖との化学反応を利用する方法(Zhang H.et al.Nat Biotechnol 21、660-666(2003))、糖鎖への親和性タグを導入する方法等、いずれの方法も利用することができるが、ここでは、表1及び表2の肺癌鑑別マーカー糖タンパク質の取得に用いたプローブを用いる方法について説明する。
捕集された肺癌鑑別マーカー候補糖タンパクは、次に、IGOT法(isotope-coded glycosylation site-specific tagging:糖鎖付加位置安定同位体標識法)と質量分析法に基づく方法で処理され、その候補糖タンパクのコア糖ペプチドが同定される。例えば、特開2004-233303号公報(特許第4220257号)やKaji H,ほかMass spectrometric identification of N-linked glycopeptides using lectin-mediatedaffinity capture and glycosylation site-specific stable isotope tagging. Nature Protocols 1,3019-3027 (2006)に記載のLec-IGOT-LC/MS法により前記糖ペプチドを分析することができる。具体的な方法について、一例を挙げて、以下で説明をする。
プローブレクチン又はプローブ抗体で捕集された前記候補糖タンパク質群をプロテアーゼで消化して、得られたペプチド群から試料となる候補糖ペプチド群を、同じプローブを用いて再捕集する。又は、試料粗タンパク質混合物から候補糖タンパク質群を分離することなく、粗タンパク質混合物をプロテアーゼ消化して、得られた粗ペプチド群より、直接プローブレクチン又はプローブ抗体で捕集することもできる。続いて、得られた候補糖ペプチドをIGOT法により標識する。IGOT法では、同位体酸素でラベルされた水の中でグリコペプチダーゼ等の酵素で処理して糖鎖を解離させ、この処理によって、糖鎖結合部位のアスパラギンがアスパラギン酸となり、このときに水中の同位体酸素(18O)が候補糖ペプチドに取り込まれる。
IGOT法で標識された候補糖ペプチドを液体カラムクロマトグラフィー(LC)で分離し、質量分析(MS)に導入し、タンデム質量分析法により、そのアミノ酸配列を網羅的に同定する。
例えば、標準技術集(特許庁編)、質量分析の3−6−2−2アミノ酸配列解析に示されるMS/MSイオンサーチ法により、得られた各候補糖ペプチドのMS/MSペプチド測定結果に対して、データベースに登録された全タンパク質のアミノ酸配列から、実際に使用したプロテアーゼの特異性にしたがって予測される全ペプチドの仮想的MS/MSスペクトルと比較して、検索することができる。検索においては、アミノ酸の修飾、すなわち、メチオニン残基側鎖の酸化、アミノ末端グルタミンのピロ化(脱アミド化、環化)、アミノ末端の脱アミノ化(カルバミドメチルシステイン)アスパラギン残基側鎖の脱アミド化(ただし、安定同位体酸素の取り込みが生じたもの)を勘案する。その候補糖ペプチドを含む候補糖タンパク質の同定は、検索ソフトMascotにより行う。
MS/MSイオンサーチ法によって同定された候補糖ペプチドのうち、アスパラギン残基側鎖に脱アミド化(安定同位体取り込み)が生じ、かつN結合型糖鎖付加のコンセンサス配列(Asn-Xaa-[Ser/Thr]、ただしXaaはProでない)を含む候補糖ペプチドを本実施形態の糖タンパク質断片とする。また、得られた糖タンパク質断片のコンセンサス配列中のアスパラギン残基を糖鎖結合部位とする。なお、XaaがLys/Argであり、同定されたペプチド配列がこの位置で切除されている場合には、そのタンパク質全体のアミノ酸配列を参照し、Xaaの次の残基が[Ser/Thr]であれば、その候補糖ペプチドも糖タンパク質断片に含めるものとする。原則的にはコンセンサス配列が糖鎖結合位置であるが、これに則らない部位も報告されている。本願ではペプチド-N-グリカナーゼ(グリコペプチダーゼF、PNGase)処理で切除される糖鎖結合位置を同定することができる。
前記1−3−2の項で絞り込まれた肺癌鑑別マーカーについては、その有意性をさらに検証することができる。例えば、肺癌培養細胞上清中からプローブレクチンで捕集した糖タンパク質及び/又は糖タンパク質断片を、前記分離・同定された肺癌鑑別マーカーを特異的に認識する抗体を用いて、ウェスタンブロッティング又は免疫沈降によって検出し、確認することができる。本明細書においては、表1に示した31種の肺癌鑑別マーカー糖タンパク質及びその糖タンパク質断片が、上記抗体検出によって、さらに選択された肺癌鑑別マーカーに該当する。
1−4−1.質量分析法
肺癌鑑別マーカー糖ペプチド及び糖タンパク質は、糖鎖に結合するプローブレクチン等で捕集した試料について、質量分析計を検出器として検出することができる。
(1)レクチンマイクロアレイによる糖鎖プロファイリング
(a)レクチンマイクロアレイ(単にレクチンアレイとも呼ぶ)
レクチンアレイは、糖鎖プローブとして、複数種の特異性の異なるレクチンを1つの基板上に並列に固定(アレイ化)したもので、分析対象となる複合糖質にどのレクチンがどれだけ相互作用したかを一斉に解析できるものである。レクチンアレイを用いることで、糖鎖構造推定に必要な情報が一度の分析で取得でき、かつ、サンプル調製からスキャンまでの操作工程は迅速かつ簡便にできる。質量分析等の糖鎖プロファイリングシステムでは、糖タンパク質をそのまま分析することはできず、あらかじめ糖ペプチドや遊離糖鎖の状態にまで処理をしなければならない。一方、レクチンマイクロアレイでは、例えば、コアタンパク質部分へ直接蛍光体を導入するだけで、そのまま分析できるという利点がある。レクチンマイクロアレイ技術は、本発明者等が開発したもので、その原理・基礎は、例えば、Kuno A., et al. Nat. Methods 2,851-856(2005).に記載されている。
レクチンアレイは、現在では、精製標品だけでなく、血清や細胞ライセート等の混合試料の定量比較糖鎖プロファイリングができる実用化技術にまで発展してきている。特に細胞表層糖鎖の比較糖鎖プロファイリングはその発展がめざましい(Ebe, Y. et al. J. Biochem. 139, 323-327(2006)、Pilobello, K.T. et al. Proc Natl Acad Sci USA.104,11534-11539(2007)、Tateno, H. et al. Glycobiology 17, 1138-1146(2007))。
レクチンマイクロアレイのプラットフォームは基本的に上記の通りとし、検出に際しては上記被験者の試料を直接蛍光等で標識するのではなく、抗体を介して間接的に蛍光基等を被験者の試料に導入することで、一斉に多検体に対する分析を簡便、高速化することができる応用法である(「Kuno A, Kato Y, Matsuda A, Kaneko MK, Ito H, Amano K, Chiba Y, Narimatsu H, Hirabayashi J. Mol Cell Proteomics. 8, 99-108(2009)」、「平林淳、久野敦、内山昇「レクチンマイクロアレイを用いた糖鎖プロファイリング応用技術の開発」、実験医学増刊「分子レベルから迫る癌診断研究〜臨床応用への挑戦〜」、羊土社、Vol25(17)164-171(2007)」、久野敦、平林淳「レクチンマイクロアレイによる糖鎖プロファイリングシステムの糖鎖バイオマーカー探索への活用」、遺伝子医学MOOK11号「臨床糖鎖バイオマーカーの開発と糖鎖機能の解明」、pp.34-39、メディカルドゥ(2008)参照)。
レクチンマイクロアレイの代わりにコアタンパク質に対する抗体をガラス基板等の基板上に並列に固定(アレイ化)した抗体マイクロアレイを用いる方法である。調べるマーカーに対するだけの数の抗体が必要である。糖鎖変化を検出するレクチンをあらかじめ確定することが必要である。
レクチンアレイの結果をもとに簡易で安価なサンドイッチ検出法をデザインできる。基本的には2種の抗体を用いたサンドイッチ検出法に用いられるプロトコルのうち、一方の抗体をレクチンに置き換えるだけで適用できる。したがって、この手法は既存の自動免疫検出装置を用いた自動化にも適用可能である。唯一考慮しなければならない点は、サンドイッチに用いる抗体とレクチン間の反応である。抗体は、少なくとも2本のN結合型糖鎖を有する。したがって、使用するレクチンが抗体上の糖鎖を認識する場合は、サンドイッチ検出時にその結合反応に起因するバックグランドノイズを生じてしまう。このノイズシグナルの発生を抑制するのに抗体上の糖鎖部分に修飾を導入する方法や、糖鎖部分を含まないFabのみを用いる方法が考えられるが、これらは公知の手法を用いればよい。糖鎖部分への修飾方法としては、例えばChen SらNat Methods. 4, 437-44 (2007)やComunale MAらJ Proteome Res. 8, 595-602(2009)等があり、Fabを用いる方法としては例えばMatsumoto HらClin Chem Lab Med 48, 505-512 (2010)等がある。
抗体オーバーレイ・レクチンアレイは、肺癌鑑別マーカー糖タンパク質上の疾患特異的糖鎖変化を最も反映するレクチンを、統計学的に見出す最善の手法である。一方で、免疫沈降及びオーバーレイ検出が可能な抗体が必須である。しかしながら、そのような抗体が必ずしも入手できるとは限らない。したがって、より多くの候補分子を肺癌検出に利用するための手段として、プローブレクチンで捕集した糖タンパク質に対する、標的糖タンパク質の免疫学的定量検出を行うのが一般的である。具体的にはSDS-PAGEを行い、膜転写後にウェスタンブロットにより免疫学的な検出をする。得られたバンドのシグナル強度の比較より、各試料間での変動を定量的に見積もることができる。癌性糖鎖を持つタンパク質の量的変動から各マーカー候補の有意性を確証した絞り込みができる。本実施形態では、候補分子の同定工程において使用したAALレクチンを、検証時においてもプローブタンパク質として用いるのが一般的である。例えば、その様な戦略で実施している例として、Liu YらJ Proteome Res. 9, 798-805 (2010)の報告等が挙げられる。血清中のタンパク質は、その種類によってN結合型糖鎖の構造(分岐の度合い等)、フコース修飾(コアフコース、血液型抗原等)は異なることが知られている。それ故、同一分子であっても異なるフコース修飾を受ける場合があることも報じられている。例えば、Nakagawa TらJ. Biol. Chem. 281, 29797-29806 (2006)では、α1アンチトリプシンが異なるフコース修飾を受けていることが開示されている。これらは、疾患の種類、進展度合いによる増加の有無、タイミングを異にするため、ほぼすべてのフコース修飾を認識し、捕集できるAALをプローブとして用い、フコース含有糖タンパク質全体を捕集し、量的比較するのは理想的とはいえない。そこでわれわれは2つの異なるフコース認識レクチンを用いて連続クロマトグラフィーにより分離分画し、それぞれの画分を定量比較解析することを考えた。このときに使用するレクチンはLCAとAALである。これまでのレクチン特異性解析によりLCAはN結合型糖鎖のうち低分岐型のコアフコース修飾を受けたものを認識するレクチンであることが知られている。AALはN結合型糖鎖のどのような分岐のコアフコースでも認識することができ、かつABOやルイス抗原等に代表される非還元末端側のフコース修飾をも認識することができることも知られている。つまり、LCAは特異性が高く、AALは低い。そこで第一段階としてLCAカラムクロマトグラフィーを行い、LCAに結合するフコース含有糖タンパク質を捕獲する。これをLCA結合性フコース含有糖タンパク質とする。クロマトグラフィー時において、コアフコース修飾を受けている低分岐型N結合型糖鎖を有さないフコース含有糖タンパク質はLCAカラムには結合せず、非結合画分に分画される。このようなフコース含有糖タンパク質群をLCA非結合画分から捕獲するために、LCA非結合画分に対しAALカラムクロマトフラフィーを行う。この時にAALに捕獲された糖タンパク質群をLCA非結合/AAL結合性フコース含有糖タンパク質とする。この操作により、疾患に伴う同一タンパク質上のフコシル化の増減を修飾の種類ごとに評価することができると推測される。
本発明の第2の実施形態は、肺癌罹患判定方法である。本実施形態の方法は、被験者より採取された試料から、前記実施形態1に記載の肺癌鑑別マーカーを検出することによって、該被験者が肺癌に罹患していると判定することを特徴とする。
本明細書において「被験者」とは、検査に供される者、すなわち後述する試料を提供する者を指す。被験者は、何らかの疾患を有する患者又は健常者のいずれであってもよい。好ましくは、肺癌に罹患している可能性がある者又は肺癌患者である。
肺癌鑑別マーカーの検出方法としては、例えば、2つの方法、すなわち、肺癌鑑別マーカーの糖鎖と特異的に結合するレクチン(本明細書では、便宜的に、以下、レクチンAとする)を用いて当該糖鎖を有する肺癌鑑別マーカーを選択する方法と肺癌鑑別マーカーの糖鎖以外の部分(コアタンパク質)を検出することによって当該肺癌鑑別マーカーを検出する方法の組合せ、又はレクチンAと特異的に結合する糖鎖を有する肺癌鑑別マーカーに対する特異的な抗体であって、糖鎖結合部分近傍をエピトープとする抗体を用いて目的の肺癌鑑別マーカーを検出する方法を挙げることができる。
新規肺癌鑑別マーカー糖タンパク質又はその断片である糖ペプチドを利用する肺癌の検出方法において、前記鑑別マーカー糖タンパク質又はその糖ペプチドに特異的なポリクローナル抗体及び/又はモノクローナル抗体用いてもよい。例えば、市販の抗体のように、前記糖タンパク質等に対する特異的抗体を容易に入手することができる場合には、それらを用いることができる。しかし、容易に入手できない場合は、例えば、以下の方法で調製できる。
本発明の第3の実施形態は、組織染色用肺癌細胞鑑別抗体である。本実施形態の抗体は、前記実施形態1に記載の肺癌鑑別マーカー、すなわち表1又は表2に示す糖付加位置のアスパラギン残基に糖鎖が付加された表1又は表2に記載の一以上の肺癌鑑別マーカー糖タンパク質、及び/又は糖鎖が付加された、表1又は表2に示す糖付加位置のアスパラギン残基を少なくとも一つ含む一以上の前記糖タンパク質断片を特異的に認識して、それに結合することで、組織染色において肺癌細胞を特異的に鑑別することのできる抗体である。
グライコプロテオミクス(IGOT-LC/MS法)による糖ペプチドマーカーの選択
1.ヒト肺癌培養細胞上清の調製法
肺腺癌3種(H358、H1975、LX-1)及び肺小細胞癌3種(H2171、H524、H526)を、それぞれ高グルコース含有90%DMEM、10%FBS(PS+)の培地を用いて、直径14cmのディッシュで3日間培養し、80〜90%コンフルエントとした。前記FBS血清含有培培地を吸引して廃棄し、無血清培地10mL/ディッシュ(100%DMEM−高グルコース、添加物無し)で洗浄した。無血清培地を30mL/ディッシュで添加して、48時間培養した。培養後、1000rpm×30分で遠心し、さらに上清を回収し3000rpm×30分で上清(培養上清)を回収し、−80℃で凍結保存した。前記温度下で保存した培養上清は、使用前に融解し、0.45μmフィルターろ過後、以下の実施例に用いた。なお、終濃度0.1%となるようにNaN3を添加した。
(1)ペプチド試料の調製
前記調製した培養上清に、終濃度10%となるようトリクロロ酢酸(TCA、100%飽和水溶液)を加え、氷上で10〜60分間冷却し、タンパク質を沈殿させた。4℃で高速遠心分離して前記沈殿物を回収した。沈殿物は、氷冷したアセトンに懸濁し、2回の洗浄によってTCAを除去した。沈殿物に可溶化緩衝液(0.5Mトリス−塩酸緩衝液、pH8-8.5、7Mグアニジン塩酸、10mM EDTAを含む)を、タンパク質濃度がおよそ5〜10mg/mLとなるように加え、溶解した。別法として、培養上清を4℃、分子量1万カットの限外濾過膜により、タンパク質を濃縮し、これに可溶化緩衝液を加え、再度濾過することにより、試料タンパク質溶液とした。
前記工程で調製された試料ペプチドを、プローブレクチン(AALレクチン又はConAレクチン)を固定化したカラムに供し、洗浄後、レクチンの特異性に応じた方法、すなわち、AALレクチンについては、5mMフコースを含有する緩衝液により、ConAレクチンについては、0.2Mメチルマンノシドを含む緩衝液により、候補糖ペプチドを溶出した。得られた候補糖ペプチド溶液に等容量のエタノール及び4倍容量の1-ブタノールを加え、水:エタノール:1-ブタノール(1:1:4(v/v))で予め平衡化したSepharoseカラムに供した。カラムを同平衡化溶媒で洗浄後、50%エタノール(v/v)で候補糖ペプチドを溶出した。候補糖ペプチド画分を、2μLのグリセロールの入ったマイクロチューブに少量ずつ移し、減圧遠心濃縮、すなわち、減圧遠心によって水を除去し、その操作を繰り返すことによって、全ての候補糖ペプチド画分を濃縮した。
精製した候補糖ペプチド(グリセロール溶液)に必要量の緩衝液を加え、再度減圧遠心濃縮した後、安定同位体酸素-18(18O)で標識した水(H2 18O)を加え、溶解した(グリセロール濃度は、10%以下とする)。これに標識水で調製したペプチド-N-グリカナーゼ(グリコペプチダーゼF、PNGase)を加え、37℃で終夜反応させた。この反応により、糖鎖結合部位のアスパラギンがアスパラギン酸となり、このときに水中の同位体酸素(18O)が候補糖ペプチドに取り込まれることで、候補糖ペプチドが標識される。
IGOT反応液を0.1%ギ酸で希釈し、LC/MSショットガン分析した。このとき高分離能、高再現性、高感度に検出するため、ダイレクトナノフローポンプを基礎とするナノLCシステムを利用した。インジェクトした候補糖ペプチドは脱塩を目的としたトラップカラム(逆相C18シリカゲル系の担体)上に一旦捕集し、洗浄後、同じ樹脂を詰めたスプレーチップの形状をしたフリットレス微小カラム(内径150μm×50mL)を用い、アセトニトリルの濃度グラジェント法により分離した。溶出液は、エレクトロスプレーインターフェースを介してイオン化し、直接質量分析機に導入した。質量分析はデータ依存モードで最大2つのイオンを選択しながら、衝突誘起解離(CID)によるタンデム質量分析を行った。
得られた数千のMS/MSスペクトルについて、個々にスムージング、中心化処理を行ってピークリストを作成し、このデータを元にタンパク質アミノ酸配列データベースを用いてMS/MSイオンサーチ法で、候補糖ペプチドを同定した。検索エンジンにはマトリックスサイエンス社のMascotを用いた。検索条件のパラメータとして、使用した断片化法(トリプシン消化)、ミスクリーベージ許容数:2、固定する修飾:システインのカルバミドメチル化、変動的な修飾:N末端アミノ基の脱アミノ化(末端グルタミン)、酸化(メチオニン)、18Oを取り込んだ脱アミド化(アスパラギン:糖鎖付加部位)、MSスペクトルの許容誤差:500ppm、MS/MSスペクトルの許容誤差:0.5Daを用いた。
上述の条件で検索し、得られた結果より、下記の同定確認処理を行った。得られた候補糖ペプチドを肺癌鑑別マーカー糖ペプチド(肺癌鑑別マーカー糖タンパク質断片)とした。
選別された肺癌鑑別マーカー糖ペプチドの配列から、この配列を含む糖タンパク質を規定することができる。より具体的には、表1及び表2において配列番号1〜223で示す肺癌鑑別マーカー糖ペプチドの「ペプチド配列」に基づいてアミノ酸配列データベースNCBI-Refseqより対応する肺癌鑑別マーカー糖タンパク質の全アミノ酸配列を同定した。
上記工程によって得られた肺癌鑑別マーカー糖タンパク質を表2に示す。
無血清培地で24時間培養した肺癌細胞株(肺腺癌3種:H358、H1975、LX-1;肺小細胞癌3種:H2171、H524、H526)の培養上清をAmicon Ultra-154 centrifugal filter units (10kDaカットオフ、ミリポア社)で10倍濃縮し、そのサンプル10μLをXV PANTERA SYSYTEM の10%、12.5%若しくは17%アクリルアミドゲル(丸幸商会社)を用いてSDS-PAGEで展開した後、200 mA、40minでPVDF膜(Amarsham社)に転写した。ブロッキング剤は、PBS(ダルベッコ社)に1% Triton X-100を加えたPBSTxに溶解した5%スキムミルク又は5% BSAを使用し、室温で1時間ブロッキングした。PBSTxで10分間の洗浄を3回行った後、予めBiotin Labeling Kit-NH2(同仁化学研究所)でビオチン化した一次抗体(表4)とメンブレンを1時間反応させた。再びPBSTxで10分間の洗浄を3回行った後、二次抗体HRP-conjugated streptavidin(1:3000希釈、GEヘルスケア社) で1時間反応させた。PBSTxで10分間の洗浄を3回行った後、Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus (パーキンエルマー社)によってHRPの酵素反応を行い、得られたシグナルをAmersham Hyperfilm ECL (GEヘルスケア社)に現像し、肺腺癌と肺小細胞癌の細胞株由来の培養上清に存在しているタンパク量について比較解析を行った。
上記工程によって得られた肺癌鑑別マーカー糖タンパク質を表1、図1、図2に示す。
AALレクチンを用いて培養上清を分画した。具体的にはAALレジンは3倍量のPBSで5回洗浄を行った後、50%スラリー溶液に調製した。調製したAALレジン30μLに対し培養上清30μLを加え4℃で5時間震盪させた。遠心後(2,000rpm、2分間)上清を除去した後、Wash Buffer(0.1% SDS in PBST,0.1% Triton X-100)50μLを加え遠心(2,000rpm、2分間)を2回繰り返した後Wash Bufferを500μL加え、遠心(2,000rpm、2分間)し、上清を除去洗浄した。洗浄後の溶出には0.02% SDS を含む0.2 M Fucose in PBSを15μL加え4℃で5時間震盪させた。遠心後(2,000rpm、2分間)上清を回収しさらにElution Bufferを15μL加え遠心(2,000rpm、2分間)を行いAAL結合画分として溶出した。溶出した画分10μLをそれぞれSDS-PAGEに展開してウェスタンブロットで検出した。ConAレクチンを用いる場合も同様な操作を行った。ただし、溶出には0.5M メチルマンノシドを用いた。
上記工程によって得られた肺癌鑑別マーカー糖タンパク質を図3に示す。
表1に記載の全ての候補糖タンパク質抗体についてビオチン化されていないものについてはBiotin Labeling Kit-NH2(同仁化学研究所)を用いて、マニュアルに従いビオチン化した。培養上清100μLに対してビオチン化抗体を1μg加え、20℃で2時間1,400rpmで振盪した。磁気ビーズ(invitrogen社)の洗浄は、20μLの磁気ビーズに対して100μLのTBSTx(50mM Tris-HCl (pH 8.0)、150mM NaCl、1% Triton X-100)を加えて、撹拌後遠心(10,000 rpm、3秒)し、上清の除去を3回行った。反応させた培養上清と抗体を磁気ビーズに移し、20℃で1時間1,400 rpmで振盪した。磁気スタンドを用いて磁気ビーズと結合した抗体を回収した。回収した磁気ビーズは1mLのTBSTxで3回洗浄した。溶出バッファー(0.2% SDS in TBS)20 ulを加え撹拌後98℃または60℃で5分加熱を2回行い、溶出した。溶出したサンプルの抗体を除去するために同様に洗浄した40μLの磁気ビーズを溶出サンプルに加え20℃で2時間1,400rpmで振盪した。磁気スタンドで抗体-磁気ビーズを取り除いたものをサンプルとして用いた。調製したサンプルをSDS-PAGEで展開した後レクチンブロットを行った。
上記工程によって得られた肺癌鑑別マーカー糖タンパク質を図4に示す。
免疫沈降したサンプル10μLを10% SDS-PAGEに展開した。SDS-PAGE後タンパク質をPVDF膜(Amersham)に転写した。PVDF膜を5% BSAで1時間室温にてブロッキングした後、すでにビオチン化されたAALレクチン(生化学工業)で1時間室温にて反応させた。その後二次抗体HRP-conjugated streptavidinで1時間室温にて反応させた。Western Lightningを用い検出した。レクチンの希釈にはPBS-Tを用いた。
上記工程によって得られた肺癌鑑別マーカー糖タンパク質を図4に示す。
AALレクチンを用いて血清を分画した。具体的には市販のカラムにAALレジンを1mL充填し、レジンの10倍量のTBSで洗浄、レジンの2倍量の0.5MのNaClで洗浄、レジンの10倍量のTBSで洗浄を行い、AALカラムを調製した。血清をAALカラムに加えた後、レジン中で1時間反応させた後、レジンの5倍量のTBSで洗浄を行った。溶出には20 mM Fucoseを1mL加えレジン中で1時間反応させた後さらに20mM Fucoseを4mL加え全量5mLで溶出した。
上記工程によって得られた肺癌鑑別マーカー糖タンパク質を図5に示す。
連続クロマトグラフィーを用いた血清の分画は、LCAアガロース(J-オイルミルズ社)とAALアガロース(J-オイルミルズ社)を用いて低温下で行った。100μLの血清をPBSで4倍希釈して、まず、カラムに充填した5mLのLCAアガロース(0.7×13cm)に血清サンプルを興じた。次に、得られた非結合血清画分をカラムに充填した2.5mLのAALアガロース(0.7×5.5cm)に興じ、PBSで十分に洗浄を行った後0.2M フコースを含むPBSで溶出を行った。溶出画分をウルトラフリー遠心濃縮デバイス(カットオフ: 30kDa、ミリポア社)で濃縮し、得られたサンプルを上記と同様にイムノブロットにより候補分子の比較解析を行った。
上記工程によって得られた肺癌鑑別マーカー糖タンパク質を図6に示す。
多検体血清の比較解析を行う際に、少量の血清サンプルを短時間でフラクショネーションする必要があるため、高スループットな連続クロマトグラフィー方法を確立した。連続クロマトグラフィーを用いた血清の分画は、LCAアガロース(J-オイルミルズ社)とAALアガロース(Vector社)を用いて行った。チップカラムに充填した300μLのLCAアガロース(0.37×2.3cm)に50μLの血清サンプルを興じた。次に、得られた非結合血清画分をオープンカラムに充填した250μLのAALアガロース(0.8×0.5cm)に興じ、PBSで十分に洗浄を行った後0.02M フコースを含むPBSで溶出を行った。溶出画分をウルトラフリー遠心濃縮デバイス(カットオフ: 10kDa、ミリポア社)で濃縮し、得られたサンプルのうち血清10μL相当を上記と同様にイムノブロットにより候補分子の比較解析を行った。
上記工程によって得られた肺癌鑑別マーカー糖タンパク質を図8に示す。
上記「5.免疫沈降による分画」で得られた糖タンパク質溶液を適当量とり、レクチンアレイ反応バッファーである1% Triton X-100含有Phosphate-buffered saline (PBSTx)で60μLに調製した。この溶液をガラス1枚当たり8つの反応槽が形成されているレクチンアレイの各反応槽へ添加し、20℃で10時間以上反応した。この8つの反応槽からなるレクチンアレイ基盤の作製は、内山ら(Proteomics 8, 3042-3050 (2008))の手法に従った。これにより糖タンパク質上の糖鎖とアレイ基板上に固定されている43種のレクチンとの結合反応が平衡状態に達する。未反応の基板上のレクチンに検出用抗体の糖鎖が結合して、ノイズを発生することを防止するため、その後、ヒト血清由来IgG溶液(シグマ社製)を2μL加えて、30分反応させた。60μLのPBSTxで各反応槽を3回洗浄した後、再度ヒト血清由来IgG溶液を2μL加え、若干撹拌した。続いて、検出用の該糖タンパク質に対する抗体(ビオチン化物)を100ng相当加え、20℃で1時間反応させた。抗原抗体反応後、60μLのPBSTxで各反応槽を3回洗浄した後、モリテックス社製アレイスキャナーGlycoStationによりアレイスキャンを行い、肺癌組織特異的に反応するレクチンスポット上の蛍光強度について比較を行った。
上記工程によって得られた肺癌鑑別マーカー糖タンパク質を図9及び図10に示す。
肺癌鑑別マーカーを用いて抗体による組織染色について検証した。
上記工程によって得られた肺癌鑑別マーカー糖タンパク質を図7に示す。小細胞癌にのみ特異的に染色されているのがわかる。
Claims (8)
- 68位及び/又は346位のアスパラギン残基に肺小細胞癌特異的な、フコース修飾を伴う糖鎖、高マンノース型糖鎖、混成型糖鎖及び/又は複合型二本鎖糖鎖が付加されたセクレトグラニンIII糖タンパク質、又は
前記位置に前記肺小細胞癌特異的な糖鎖が付加されたアスパラギン残基を少なくとも一つ含むセクレトグラニンIII糖タンパク質の断片
からなる肺小細胞癌鑑別マーカー。 - 被験者より採取された試料から、請求項1に記載の肺小細胞癌鑑別マーカーを一以上検出することによって、該被験者の肺小細胞癌罹患判定を補助する方法。
- 肺小細胞癌特異的な、フコース修飾を伴う糖鎖、高マンノース型糖鎖、混成型糖鎖、及び/又は複合型二本鎖糖鎖に結合する一以上の糖鎖プローブを用いて肺小細胞癌鑑別マーカーを検出する、請求項2に記載の方法。
- 前記糖鎖プローブがレクチン、抗体又はファージ抗体である、請求項3に記載の方法。
- 前記レクチンがAAL又はConAである、請求項4に記載の方法。
- 前記試料が体液、細胞又は肺洗浄液である、請求項2〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記体液が、血液(血清、血漿及び間質液を含む)、リンパ液、細胞の抽出液、痰又は胸水である、請求項6に記載の方法。
- 請求項1に記載の肺小細胞癌鑑別マーカーに結合する抗体からなる肺小細胞癌細胞鑑別用の組織染色試薬。
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