MX2010014331A - Biomarcador y antígeno asociado a tumor: alfa 1-antitripsina para el diagnostico e inmunodiagnostico de cancer de mama en etapas tempranas. - Google Patents

Abstract

Se ha demostrado que sueros de pacientes con cáncer contienen anticuerpos que reaccionan con autoantigenos llamados antígenos asociados a tumor (AAT). En el presente estudio se realizó inmunoproteómica de sueros de 25 pacientes con cáncer de mama en etapa II, y sueros de 20 donantes sanos para la detección de AATs. Las muestras de suero pre-clarificadas se sometieron a 2DE y transfirieron a membrana de nitrocelulosa (NC), estas se incubaron con sueros de pacientes con Cáncer de Mama y donantes sanos. Comparando los patrones de Western-Blot de 2D, tres proteínas fueron reconocidas por anticuerpos presentes en los sueros de pacientes con cáncer y no por los de personas sanas. Las tres proteínas se obtuvieron de los geles de 2D, se analizaron por MALDI-MS. Los resultados mostraron que la proteína es la alfa-1-antitripsina (A1AT). Un análisis 1DE de Western-blot se realizó con la proteína confirmando la presencia de anticuerpos anti-A1AT en el suero de los pacientes, detectándose en 24 de 25 con cáncer de mama (96%) y en 2 de 20 controles (10%). Nuestros resultados sugieren que la A1AT y anticuerpos contra esta proteína son útiles como marcadores para la detección del cáncer de mama y el diagnóstico en etapas tempranas.

Description

BIOMARCADOR Y ANTIGENO ASOCIADO A TUMOR: ALFA 1-ANTITRIPSINA PARA EL DIAGNÓSTICO E INMUNODIAGNÓSTICO DE CÁNCER DE MAMA EN ETAPAS TEMPRANAS. 5 CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN La presente invención tiene aplicación dentro del área de la biotecnología biomédica y trata sobre un biomarcador que clasifica e identifica un estado de cáncer en pacientes. En particular permite detectar autoanticuerpos en pacientes con cáncer de mama en etapa temprana y distinguirlos de personas sanas. El biomarcador es utilizado como auto-10 antígeno para detectar autoanticuerpos en suero de pacientes mediante ¡nmunoensayos.

El uso de este biomarcador permitirá evitar que las personas lleguen a un estado avanzado de cáncer (etapas III y IV) incrementando así las posibilidades de sobrevida y la reducción de los índices de morbilidad y mortalidad y por consecuencia los costos económicos. 15 ANTECEDENTES El cáncer de mama es una de las neoplasias más comunes en las mujeres y es la principal causa de muerte en el mundo por cáncer, con una incidencia de 1 ,1 millones de casos anuales. La detección temprana del cáncer de mama es de gran importancia. El uso de la mastografía ha demostrado su eficacia puesto que se ha observado una reducción de la mortalidad entre un 20 y 35% en mujeres con edades entre 40 y 69 años. Sin embargo, el valor predictivo de la mastografía disminuye cuando los pacientes presentan tejido mamario denso, lesiones pequeñas y en mujeres pre-menopausicas. La ^ sensibilidad de la mastografía es alrededor del 70%-80% y su especificidad del 5%-10%, estos porcentajes dependen del personal que opera e interpreta los resultados. Si el cáncer de mama se diagnóstica y se trata cuando aún está confinado exclusivamente a la mama, es decir en etapas I y II, la tasa de recuperación después de un tratamiento es cercana al 100%. Pero el incremento en la efectividad del tratamiento en etapas ^ tempranas depende del diagnostico temprano. Se han reportado la presencia de autoanticuerpos en personas con diferentes tipos de cáncer: cáncer de pulmón, de páncreas, de hígado y de ovario. En el caso de cáncer de mama se han reportado autoanticuerpos contra c-erbB-2/HER2/neu, RS/DJ-1 , la mucina, y más recientemente otras como PPIA, PRDX2 y FKBP52, Ciclofilina A, y contra la Alfa 2-glicoproteína (AHSG). El porcentaje de personas con cáncer de mama que presentan autoanticuerpos contra las proteínas ya señaladas se encuentra entre un 20% y un 79%.

Se han reportado biomarcadores candidatos que han sido identificados y evaluados, y continúan los esfuerzos para el hallazgo de nuevos biomarcadores. Pero un problema frecuente es que los ensayos de detección de biomarcadores no logran ser lo suficientemente sensibles o específicos para ser confiables para el diagnóstico temprano. En la solicitud de patente US 2009/0227692 A1 , se describen tres biomarcadores para la detección de pacientes con cáncer de mama en etapa I y II, uno de estos biomarcadores son fragmentos de la proteína Alfa 1 Antitripsina, sin embargo, estos fragmentos fueron detectados por medio de Espectrometría de Masas (SELDI), la cual, es una técnica muy cara debido a que se requiere de un equipo especial muy costoso, en esta invención describen solo dos fragmentos que corresponden a la Alfa 1 Antitripsina: el fragmento C-terminal 1 y el fragmento C-terminal 2, la solicitud de patente US 2009/0227692 A1 establece claramente que los tres biomarcadores no pueden ser utilizados para detectar el cáncer de mama mediante un método de cuantificación de estos fragmentos de la proteína y que esta proteína provenga de algún paciente.

La presente invención describe un biomarcador para el diagnostico del cáncer de mama en etapas tempranas mediante la proteína Alfa 1 Antitripsina, la cual fue reconocida por anticuerpos presentes en el suero de pacientes con cáncer de mama en etapas tempranas y por lo que se identifico como un Antígeno Asociado a Tumor (AAT). La proteína Alfa 1 Antitripsina es un antígeno para el Diagnóstico e Inmunodiagnóstico oportuno de Cáncer de Mama. La proteína Alfa 1 Antitripsina detecta autoanticuerpos en pacientes con cáncer de mama en etapas tempranas (etapa II) y esto a su vez permite distinguir pacientes con cáncer de personas sanas, con las siguientes ventajas: (1 ) la proteina Alfa 1 Antitripsina en ensayos de Inmuno-Blot presenta una sensibilidad del 96% en pacientes con cáncer y con un margen de error del 10%. (2) La proteína alfa 1-antitripsina se identificó como un (AAT) en pacientes con cáncer de mama, lo cual permite ser un (AAT) en el Diagnóstico e Inmunodiagnóstico oportuno de cáncer de mama, ya que el cáncer de mama es una enfermedad heterogénea con tumores que expresan una variedad de proteínas aberrantes (antígenos) capaces de provocar una respuesta inmune (producción de autoanticuerpos) frente a tales antígenos asociados a tumor (AAT), esta respuesta inmune parece surgir meses o años antes del diagnóstico clínico de un tumor (4, 6-8), los (AAT) y sus anticuerpos específicos pueden proporcionar una amplificación in vivo de una señal temprana al inicio de una transformación celular, esto puede dar lugar a la detección temprana del cáncer, a diferencia de lo que los métodos ordinarios no permiten. (3) Para la búsqueda de biomarcadores, los fluidos corporales como sangre, saliva y orina entre otros, son considerados como fuentes ideales para evaluar la presencia de estas moléculas indicadoras de cáncer. El suero contiene varios antígenos circulantes y anticuerpos relacionados con la presencia y progresión del cáncer.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Los detalles característicos de esta invención que se refiere a un Biomarcador y antígeno asociado a tumor: Alfa 1 -Antitripsina para el Diagnóstico e Inmunodiagnóstico de cáncer de mama en etapas tempranas, se muestran claramente en las siguientes figuras, las cuales se mencionan a manera de ejemplo y no deben de considerarse como limitativas a la presente invención: Figura 1.- Es un patrón electroforético en 2D, en el cual se observan las proteínas provenientes de sueros, las flechas indican a la proteína Alfa 1 Antitripsina.

Figura 2.- Inmuno-blot en 2D, en el que se observa señalada por las flechas la proteína Alfa 1 Antitripsina (A1AT), la cual fue reconocida por anticuerpos presentes en los pacientes con cáncer de mama en etapa II.

Figura 3.- Inmuno-Blot en 2D de sueros de personas sanas, en el cual, no se encontró reconocimiento alguno de la proteína Alfa 1 Antitripsina. PMP: marcadores de Peso Molecular, pH: rango de pH de las tiras IPG, Flechas: Proteínas Reconocidas = A1AT. Figura 4.- Es un gel de poliacrilamida en 1 D. Electroforesis unidimensional de la proteína identificada, aislada de los geles de 2D y caracterizada mediante espectrometría de masas como A1AT, la cual se puede observar con un peso molecular aproximado de 50 kDa. MPM: Marcadores de Peso Molecular, Carril 1 : Electroforesis de la A1AT, Flecha: Proteína A1AT.

Figura 5.- Ensayos de Inmuno-Blot en 1 D. En esta figura se puede observar el análisis realizado con los sueros de pacientes con cáncer de mama que fueron incubados en la membrana de Nitrocelulosa conteniendo únicamente a la proteína A1AT aislada de los geles de 2D. los carriles 1 -25 indican los diferentes sueros de pacientes con cáncer de mama incubados con la membrana de nitrocelulosa conteniendo la proteína A1AT los sueros mostraron los diferentes niveles de intensidad de reconocimiento. Del grupo de pacientes con cáncer de mama solo uno dio resultado negativo (carril 15) Figura 6.- En esta figura se muestra el mismo análisis que la figura anterior, pero con sueros de pacientes sanos incubados en la membrana de Nitrocelulosa (carriles 1-20), en la cual solamente se observa reconocimiento de la proteína A1AT por parte de dos pacientes sanos (carril 6 y 12); en los demás no hubo tal reconocimiento. MPM: marcadores de Peso Molecular, Flechas: Proteína A1AT reconocida por los anticuerpos de los pacientes.

Tabla 1.- Muestra el rango y el promedio de edad de los pacientes con cáncer de mama y personas sanas. El análisis estadístico de los datos refleja que no existe diferencia significativa entre los dos grupos de estudio y por lo tanto la edad no es un factor influye en la detección de anticuerpos contra la proteína Alfa 1 Antitripsina.

Tabla 2.- Muestra el número de personas con cáncer y sin cáncer analizadas, número pacientes cuyos sueros presentaron anticuerpos contra la Alfa 1 Antitripsina.

Tabla 3.- Muestra el porcentaje de detección de personas con cáncer y sin cáncer. El análisis estadístico de los resultados indican que la Alfa 1 Antitripsina es un biomarcador para el diagnóstico del cáncer de mama en etapas tempranas.

La invención describe un método para identificar y caracterizar a un autoantígeno o Antígeno Asociado a Tumor (AAT) de cáncer de mama proveniente de sueros de pacientes y que es reconocido por autoanticuerpos séricos presentes en pacientes con cáncer de mama en etapa II, mediante ensayos de Inmuno-Blot.

De igual manera la invención detalla un método para la identificación del AAT (Alfa 1 Antitripsina = A1AT) y el uso de esta proteina para el Diagnóstico e Inmunodiagnóstico de cáncer de mama: a) la identificación de la presencia de autoanticuerpos anti-A1AT y b) la correlación de la presencia de los autoanticuerpos contra la A1AT y la presencia de cáncer de mama en etapas tempranas (etapa II).

La invención consiste en la identificación, aislamiento y caracterización de la proteína Alfa-1 -Antitripsina (A1AT) obtenida de diferentes sueros de pacientes con cáncer de mama y personas sanas.

MEJOR METODO CONOCIDO PARA LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN El Biomarcador y antígeno asociado a tumor: Alfa 1 -Antitripsina para el Diagnóstico e Inmunodiagnóstico de cáncer de mama en etapas tempranas, constan de las siguientes tres fases para su identificación, aislamiento y caracterización. Fase 1.- Electroforesis en 2D. Una vez depletadas las muestras fueron precipitadas en acetona (1 :4, -20°C) 1 h. La pastilla se resuspendió en 125µ? de Buffer de hidratación (Urea 7M, Thiourea 2M, CHAPS), DTT 1 M e IPG Buffer (4-7) 20mM. Se utilizaron IPG tiras de 7cm, gradiente pH 4-7. La muestra se dejo hidratando durante 16 horas. Las condiciones de Isoelectroenfoque (IEF) fueron dispuestas en 4 pasos: 1 Stp 300V/2:30 min, 2 Grd 1000V/0:30 min, 3 Gd 5000V/1 :30 min, 4 Stp 5000V/0:35 min. Las tiras IPG fueron equilibradas con DTT (1 % w/v) buffer de equilibrio (tris HCI pH 8.8 75mM, Glicerol 29% (v/v), SDS 2%(v/v), 1 % azul de bromofenol 0.002% (w/v), Agua bidestilada) durante 20 min, Yodoacetamida (2.5% w/v) buffer de equilibrio. La electroforesis se realizo en geles de poliacrilamida a una concentración 12% (acrilamida 30%, bisacrilamida 0.8%; 4X Tris-CI/SDS pH8.8l; Agua destilada; Persulfato de amonio 10%, TEMED). Finalmente fueron teñidos con plata (Proteo Silver Silver Stain Kit). Las imágenes de electroforesis bidimensional fueron capturadas utilizando Molecular Imager Gel Doc XR y analizados por Quantity One Software para calcular el peso molecular de las proteínas.

Fase 2.- Inmuno-Blot en 2D. Se realizaron ensayos de Immuno-Blot de doble dimensión, geles 2-DE que contienen las proteínas, se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Las membranas posteriormente se incubaron de 6 a 48h, preferentemente 18 horas de 2°C -6°C preferentemente a 4°C con sueros de pacientes sanos y con cáncer de mama (1 :25 - 1 :500 preferentemente 1 :200 las diluciones), se lavó de 3 a 6 veces preferentemente cinco con solución de lavado PBS-Tween20 0,1 %.

Fase 3.- Aislamiento de la proteína A1AT e Immuno-Blot en 1 D. Para la validación individual, se realizaron ocho geles 2-DE; geles que contienen la manchas de proteína correspondientes a Alfa 1 Antitripsina fueron removidos de los geles 2-DE y usados para realizar la electro-elución de las proteínas de 2-8 h preferentemente por 4 horas a 10 mA. Al purificado Alfa 1 -antitripsina se le realizo electroforesis en gel preparativo de poliacrilamida 1 1 %. Las proteínas separadas fueron transferidas a una membrana de nitrocelulosa. Después de bloquear, pequeñas fracciones se obtuvieron de la membrana de nitrocelulosa de preparación y se incubó de 6 a 48h, preferentemente durante 18 horas, de 2°C - 6°C preferentemente a 4 0 C con sueros de 20 controles sanos y 25 pacientes con cáncer de mama de manera individual (1 :25 - 1 :500 preferentemente 1 : 100 dilución), las membranas fueron lavadas de 3 a 6 veces preferentemente cinco con PBS-Tween20 0,1 %. La membrana se incubó de 30 min. a 5 h preferentemente 3 horas con un anticuerpo cabra anti IgG (H + L) de humano acoplado a Biotina a una dilución de 1 :2500 - 1 : 10000 preferentemente 1 :5.000, se realizaron lavados de 3 a 6 veces preferentemente cinco con PBS-Tween20 0,1 %, y posteriormente se incubaron con HRP-estreptavidina peroxidasa (KPL) por 30 minutos y se visualizaron por quimioluminiscencia con solución una solución reveladora de color HRP. Figuran 3, Tablas 2 y 3.

Para una mejor compresión, del mejor método para la identificación del AAT (Alfa 1 Antitripsina = A1AT) y el uso de esta proteína para el Diagnóstico e Inmunodiagnóstico de cáncer de mama para la identificación de la presencia de autoanticuerpos anti-A1AT y para la correlación de la presencia de los autoanticuerpos contra la A1AT y la presencia de cáncer de mama en etapas tempranas (etapa II), se muestra a continuación en el: EJEMPLO DE APLICACIÓN DE LA INVENCION 1.- Obtención de sueros cáncer de mama y de personas sanas.

Se obtuvo sangre periférica de pacientes con cáncer de mama y personas sanas, la sangre se centrifugó (4°C, 3000 g/15 minutos), una vez obtenido el suero, se sometió a microfiltración (poro de 0,2 m) y se almacenó en alícuotas de 100µ? a -80°C (hasta su uso).

En total se analizaron 45 casos: 25 pacientes con cáncer de mama recién diagnosticados sin haber sido sometidos a tratamiento, incluyendo cirugía, quimioterapia y tratamiento hormonal provenientes de la División de Oncología y Hematología, Instituto Nacional del Seguro Social (IMSS) a partir de junio 2008 a julio 2009, y 20 personas controles sanos, que fueron los donantes voluntarios en el IMSS y el CIBO (Centro de Investigaciones Biomédicas de Occidente) a los cuales se les realizaron los estudios de rutina para demostrar su estado de salud, de septiembre 2008 a febrero 2009, los resultados de todas las revisiones, incluyendo la mastografía, no mostraron nada que pudiera ser considerado como evidencia de malignidad. La edad media de las 20 mujeres voluntarias sanas en el momento de toma de muestras de sangre fue de 37 años de edad. A las 20 mujeres voluntarias, se les explico el objetivo de este estudio y también firmaron el consentimiento informado, se elaboro y preparo de la misma manera que de los 25 pacientes con Cáncer de Mama. Las muestras de suero que se obtuvieron de los pacientes con cáncer de mama recién diagnosticado fueron clasificadas como carcinoma ductal infiltrante antes de la extirpación del tumor primario o un tratamiento. En ninguno de los pacientes controles sanos había otros tumores malignos o cualquier otra enfermedad autoinmune. Todos los pacientes dieron su consentimiento informado para participar en el estudio (Tabla 1 ). 2.- Pre-clarificación y precipitación de proteínas de sueros.

Los sueros se obtuvieron después de él diagnostico por mastografía. Los diagnósticos definitivos se realizaron por medio de biopsia. El suero de 25 pacientes con cáncer de mama y de 20 individuos sanos son los que se utilizaron posteriormente. Los sueros se almacenaron a -80 ° C se procesaron para su análisis en 2-DE. Para este 5 análisis se realizo una deplesión de proteínas abundantes del suero por medio de Proteoprep 20 Plasma Inmunodepletion Kit (Sigma-Aldrich) se siguió el protocolo de fabricante. Los volúmenes de 30µ? de suero fueron pasados a través de las columnas. Las muestras de sueros depletadas de proteínas (fracciones a flujo continuo) se precipitaron con acetona fría (-20°C) por 2 h (volumen muestra-acetona, 1 :4). Las 10 muestras se centrifugaron a 8000 g durante 15 min a 4 ° C, y los "pellets" de proteínas se resuspendieron en solución de rehidratación para electroforesis bidimensional Figura. 1. 3 - Caracterización de la A1AT por Espectrometría de Masas.

Del gel de poliacrilamida de dos dimensiones (2-DE) teñido con ProteoSilver Silver Stain Kit fueron extraídas las manchas de proteínas correspondientes a los puntos positivos identificados por Western-blot. Las manchas de los geles fueron digeridas con tripsina Gharahdaghi et al (1999). electroforesis de 1999, 20, 601-605, y se lavo con varios cambios de agua hasta que no se vio el color amarillo. El agua fue eliminada y reemplazada con 100µ? 0.01 M DTT/0.1 M Tris, pH 8,5, y el tubo fue colocado en un calentador a 55 ° para 1-2h. Tras enfriar el tubo a temperatura ambiente, el líquido fue eliminado y reemplazado con 100µ? 0.015M iodoacetamide/0.1 M Tris, pH 8,5. Esto se dejo reaccionar durante 30 min. en oscuridad, después el líquido se retiro y el gel se lavo con acetonitrilo/0.05M 2x 30% Tris, pH 8,5 durante 15 min con agitación. El gel se ^ deshidrato durante unos minutos luego se remojo en 200µ? acetonitrilo. El acetonitrilo se retiro y el gel se secó completamente durante 30 minutos en el concentrador Vacufuge. Los geles se rehidrataron con 0.020 g de tripsina y O.^g Lys-C en la cantidad mínima de 0.025M Tris, pH 8,5, y los tubos fueron colocados en un bloque de 32 0 C de calentamiento durante toda la noche. Los péptidos se extrajeron con 2X 50µ? 50% ^ acetonitrilo / 2% TFA y los extractos combinados se secaron, y después se resuspendió en una solución matriz. La solución Matrix fue elaborada tomando de 10 mg / mi de solución de ácido 4-hidroxi-a-cyanocinnamic en 50% acetonitrile/0.1 % TFA y la adición de dos normas internas, la angiotensína y la insulina bovina, a la solución de la matriz. El secado para digerir fue disuelto en 3 µ? de matriz / solución de referencia y 0,7 µ? fue captada en la placa de muestra. Cuando la mancha se secó por completo, se lavó dos veces con agua. Brevemente, el análisis de espectrometría de masas MALDI se realizó usando un espectrómetro de masas PerSeptive Voyager DE-Pro en modo lineal. La búsqueda de los mapas peptídicos se realizó con la ayuda de programas y en la base de datos GenPept (http://129.85.19.192/profound-bin/WebProFound.exe y MS-Fiten http://prospector.ucsf.edu), Figura. 2.

DOCUMENTOS CITADOS 1. - Chapman C, Murray A, Chakrabarti, Thorpe A, Woolston C, Sahin U, Barnes A. Autoantibodiesin breast cáncer: their use as an aid to early diagnosis. Ann Oncol 2007; 18:868-73. 2. Tabar L, Fagerberg CJ, Gad A, et al. Reduction in mortality from breast cáncer after mass screening with mammography. Randomised trial from the Breast Cáncer Screening Working Group of the Swedish National Board of Health and Welfare. Lancet 1985;1 : 829 - 32. 3. - Desmetz C, Bibeau F, Boissiere Proteomics based identification of HSP60 as a tumor-associated antigen in early stage breast cáncer and ductal carcinoma in situ. J Proteome Res 2008;7:3830-7. 4. Pereira-Faca SR, Kuick R, Puravs, et Identification of 14-3-3 T as an antigen that induces a humoral response in lung cáncer. Cáncer Res 2007;67:12000-6. 4. - Park BW, Oh JW, Park SH, Kim KS, Lee KS. Preoperative CA15-3 and CEA serum levéis as predictor for breast cáncer outcomes. Ann Oncol 2008;19:675-81. 5. Downes MR, Byrne JC, Dunn MJ, Fitzpatrick JM, Watson RW, Pennington SR. Application of proteomic strategies to the identification of urinary biomarkers for prostate cáncer: a review. Biomarkers 2006; 11 :406 - 16. 6. - Chang JW, Kang UB, Kim DH, et al. Identification of circulating endorepellin LG3 fragment: potential use as a serological biomarker for breast cáncer. Proteomics Clin Appl 2008;2:23 - 32. 7. - Carón M, Choquet-Kastylevsky G, Joubert-Caron R. Cáncer immunomics using autoantibody signatures for biomarker discovery. Mol Cell Proteomics 2007;6:11 15 - 22. 8. - Fernández-Madrid F. Autoantibodies in breast cáncer sera: candidate biomarkers and reporters of tumourigenesis. Cáncer letters 2007;230:187-98. 9 - Fujita Y, Nakanishi T, Hiramatsu M, et al. Proteomics-based approach identifying autoantibody against peroxiredoxin VI as a novel serum marker in esophageal squamous cell carcinoma. Clin Cáncer Res 2006;12:6415 - 20. 10. Volkmann M, Sinn HP, Gaugel D, et al. Anti-p53 in breast cáncer: concordance of different assay procedures and association with p53 antigen expression. Oncology 2002;63:297 - 305. 1 1. Douglas DT, Cicek GT, Lynn PP. Patient-derived tumor-reactive antibodies as diagnostic markers for ovarían cáncer. Gynecol Oncol 2009;1 15: 112-120. 12. Disis ML, Pupa SM, Gralow JR, Dittadi R, Menard S, Cheever MA High-titer HER-2/neu protein-specific antibody can be detected in patients with early-stage breast cáncer.

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Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Habiendo descrito suficientemente nuestra invención, consideramos de nuestra exclusiva propiedad lo contenido en las siguientes cláusulas: 5 1.- Un método para identificar, aislar y caracterizar la proteína Alfa-1 -Antitripsina (A1AT) obtenida de diferentes sueros de pacientes con cáncer de mama y personas sanas, caracterizado porque comprende: a) Electroforesis en 2D. Una vez depletadas las muestras fueron precipitadas en acetona (1 :4, -20°C) 1 h. La pastilla se resuspendió en 125µ? de Bufer de hidratación (Urea 7M, 10 Thiourea 2M, CHAPS), DTT 1 M e IPG Buffer (4-7) 20mM. Se utilizaron IPG tiras de 7cm, gradiente pH 4-7. La muestra se dejo hidratando durante 16 horas. Las condiciones de Isoelectroenfoque (IEF) fueron dispuestas en 4 pasos: 1 Stp 300V/2:30 min, 2 Grd 1000V/0:30 min, 3 Gd 5000V/1 :30 min, 4 Stp 5000V/0:35 min. Las tiras IPG fueron equilibradas con DTT (1% w/v) buffer de equilibrio (tris HCI pH 8.8 75mM, Glicerol 29% 15 (v/v), SDS 2%(v/v), 1 % azul de bromofenol 0.002% (w/v), Agua bidestilada) durante 20 min, Yodoacetamida (2.5% w/v) buffer de equilibrio. La electroforesis se realizo en geles de poliacrilamida a una concentración 12% (acrilamida 30%, bisacrilamida 0:8%; 4X Tris- CI/SDS pH8.8l; Agua destilada; Persulfato de amonio 10%, TEMED). Finalmente fueron teñidos con plata (Proteo Silver Silver Stain Kit). Las imágenes de electroforesis 20 bidimensional fueron capturadas utilizando Molecular Imager Gel Doc XR y analizados por Quantity One Software para calcular el peso molecular de las proteínas. b) Inmuno-Blot en 2D. Se realizaron ensayos de Immuno-Blot de doble dimensión, geles 2-DE que contienen las proteínas, se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Las ^ membranas posteriormente se incubaron de 6 a 48h, preferentemente 18 horas de 2°C - 6°C preferentemente a 4°C con sueros de pacientes sanos y con cáncer de mama (1 :25 - 1 :500 preferentemente 1 :200 las diluciones), se lavó de 3 a 6 veces preferentemente cinco con reactivo colorante HRP. c) Aislamiento de la proteína A1AT e Immuno-Blot en 1 D. Para la validación individual, ^ se realizaron ocho geles 2-DE; geles que contienen la manchas de proteína correspondientes a Alfa 1 Antitripsina fueron removidos de los geles 2-DE y usados para realizar la electro-elución de las proteínas de 2-8 h preferentemente por 4 horas a 10 mA. Al purificado Alfa 1 -antitripsina se le realizo electroforesis en gel preparativo de poliacrilamida 1 1%. Las proteínas separadas fueron transferidas a una membrana de nitrocelulosa. Después de bloquear, pequeñas fracciones se obtuvieron de la membrana de nitrocelulosa de preparación y se incubo de 6 a 48h, preferentemente durante 18 horas de 2°C -6°C preferentemente a 4 ° C con sueros de 20 controles sanos y 25 pacientes con cáncer de mama de manera individual (1 :25 - 1 :500 preferentemente 1 : 100 dilución), las membranas fueron lavadas de 3 a 6 veces preferentemente cinco con PBS-5x Tween20 0,1 %. La membrana se incubó de 30 min. a 5 h preferentemente 3 horas con un anticuerpo cabra anti IgG (H + L) de humano acoplado a Biotina a una dilución de 1 :2500 - 1 :10000 preferentemente 1 :5.000, se realizaron lavados de 3 a 6 veces preferentemente cinco con PBS-Tween20 0,1 %, y posteriormente se incubaron con HRP-estreptavidina peroxidasa (KPL) por 30 minutos y se visualizaron por quimioluminiscencia con solución una solución reveladora de color HRP. 2. - Un método para identificar, aislar y caracterizar la proteína Alfa-1 -Antitripsina (A1AT) obtenida de diferentes sueros de pacientes con cáncer de mama y personas sanas, según clausula 1 , caracterizado porque es una proteína nativa o recombinante completa o una fracción de ella y que esta sea identificada mediante inmunoensayo: Inmuno-Blot (Western Blot), inmunoprecipitación, ensayos de ELISA, o microarreglos de proteínas para el inmunodiagnostico. 3. - Un método para identificar, aislar y caracterizar la proteína Alfa-1 -Antitripsina (A1AT) obtenida de diferentes sueros de pacientes con cáncer de mama y personas sanas, según clausula 1 , caracterizado porque dicha fracción de proteínas séricas pre-clarificadas y precipitadas fueron sometidas a una separación mediante la técnica de electroforesis en 2D. 4. - Un método para identificar, aislar y caracterizar la proteína Alfa-1 -Antitripsina (A1AT) obtenida de diferentes sueros de pacientes con cáncer de mama y personas sanas, según clausula 1 , caracterizado porque dichas proteínas fueron transferidas a una membrana de Nitrocelulosa, que se realizaron ensayos de Inmuno-Blot en 2D y se identificó la proteína Alfa-1 -Antitripsina A1AT. 5. - Un método para identificar, aislar y caracterizar la proteína Alfa-1 -Antitripsina (A1AT) obtenida de diferentes sueros de pacientes con cáncer de mama y personas sanas, según clausula 1 , caracterizado porque la proteína A1AT identificada fue aislada de geles de Poliacrilamida en 2D y que dicha proteína fue utilizada para ensayos de Immuno-Blot en 1 D con sueros de pacientes con cáncer y personas sanas. 6. - Un método para identificar, aislar y caracterizar la proteína Alfa-1 -Antitripsina (A1AT) obtenida de diferentes sueros de pacientes con cáncer de mama y personas sanas, según clausula 1 , caracterizado porque la proteína A1AT identificada y aislada fue caracterizada por mapeo peptídico mediante análisis por espectrometría de masas: 7. - Un método para identificar, aislar y caracterizar la proteína Alfa-1 -Antitripsina (A1AT) obtenida de diferentes sueros de pacientes con cáncer de mama y personas sanas, según clausula 1 , caracterizado porque la proteína Alfa-1 -Antitripsina (A1AT) se identifico como un Antígeno Asociado a Tumor (AAT). 8. - Un método para identificar, aislar y caracterizar la proteína Alfa-1 -Antitripsina (A1AT) obtenida de diferentes sueros de pacientes con cáncer de mama y personas sanas, según clausula 1 , caracterizado porque la proteína Alfa-1 -Antitripsina (A1AT) es reconocida por auto-anticuerpos séricos presentes en pacientes con cáncer de mama en etapa II, mediante ensayos de Inmuno-Blot. 9. - Un método para identificar, aislar y caracterizar la proteína Alfa-1 -Antitripsina (A1AT) obtenida de diferentes sueros de pacientes con cáncer de mama y personas sanas, según clausula 1 , caracterizado porque la proteína Alfa- -Antitripsina (A1AT) es obtenida de diferentes sueros de pacientes con cáncer de mama y personas sanas. 10. - Un método para identificar, aislar y caracterizar la proteína Alfa-1 -Antitripsina (A1AT) obtenida de diferentes sueros de pacientes con cáncer de mama y personas sanas, según clausula 1 , caracterizado porque en la fase mediante ensayos de Inmuno-Blot en 2D, las membranas de nitrocelulosa se incubaron de 6 a 48h, preferentemente 18 horas de 2°C -6°C preferentemente a 4°C con sueros de pacientes sanos y con cáncer de mama a diluciones entre 1 :25 y 1 :500, preferentemente 1 :200, se lavó de 3 a 6 veces preferentemente cinco con PBS-Tween 0.1% y se revelaron con el reactivo colorante HRP. 12. - Un método para identificar, aislar y caracterizar la proteína Alfa-1 -Antitripsína (A1AT) obtenida de diferentes sueros de pacientes con cáncer de mama y personas sanas, según clausula 1 , caracterizado porque el suero se sometió a un proceso de pre-clarificación y precipitación de proteínas antes de su análisis por Electroforesis en 1 D y 2D: 13. - El uso de un Biomarcador y antígeno asociado a tumor: Alfa 1 -Antitripsina para el Diagnóstico e Inmunodiagnóstico de cáncer de mama en las etapas I y II, que comprende el fragmento C-terminal 1 y el fragmento C-terminal 2. 14. - El uso de un Biomarcador y antígeno asociado a tumor: Alfa 1 -Antitripsina para el Diagnóstico e Inmunodiagnóstico de cáncer de mama en las etapas I y II, según clausula 2, caracterizado por la identificación cualitativa o cuantitativa de anticuerpos específicos en muestras biológicas (orina, saliva, suero, secreciones de glándula mamaria y lavados vaginales.) de individuos/pacientes con cáncer de mama. 15. - El uso de un Biomarcador y antígeno asociado a tumor: Alfa 1 -Antitripsina para el Diagnóstico e Inmunodiagnóstico de cáncer de mama en las etapas I y II, según clausula 2, caracterizado porque la proteína es usada para la identificación cualitativa de anticuerpos específicos en suero. 16.- El uso de un Biomarcador y antígeno asociado a tumor: Alfa 1 -Antitripsina para el Diagnóstico e Inmunodiagnóstico de cáncer de mama en las etapas I y II, según clausula 2, caracterizado porque la proteína es usada para la identificación cualitativa y cuantitativa de anticuerpos específicos en orina, lavados vaginales, lagrimas 17. - El uso de un Biomarcador y antígeno asociado a tumor: Alfa 1 -Antitripsina para el Diagnóstico e Inmunodiagnóstico de cáncer de mama en las etapas I y II, según clausula 2, caracterizado porque la proteína es usada para la identificación cualitativa y cuantitativa de autoanticuerpos específicos en saliva. 18. - El uso de un Biomarcador y antígeno asociado a tumor: Alfa 1 -Antitripsina para el Diagnóstico e Inmunodiagnóstico de cáncer de mama en las etapas I y II, según clausula 2, caracterizado porque la proteína es usada para la identificación cualitativa y cuantitativa de anticuerpos específicos y permite identificar la persona con cáncer en etapa temprana (Etapa II) y personas sin cáncer. 19. - El uso de un Biomarcador y antígeno asociado a tumor: Alfa 1 -Antitripsina para el Diagnóstico e Inmunodiagnóstico de cáncer de mama en las etapas I y II, según clausula 2, caracterizado porque la proteína A1AT es usada para la identificación cualitativa o cuantitativa de de autoanticuerpos específicos contra la A1AT. 20. - El uso de un Biomarcador y antígeno asociado a tumor: Alfa 1 -Antitripsina para el Diagnóstico e Inmunodiagnóstico de cáncer de mama en las etapas I y II, según clausula 2, caracterizado porque permite diferenciar entre personas con cáncer de mama y personas sin cáncer de mama. 21. - El uso de un Biomarcador y antígeno asociado a tumor: Alfa 1 -Antitripsina para el Diagnóstico e Inmunodiagnóstico de cáncer de mama en las etapas I y II, según clausula 2, caracterizado porque comprende de un soporte solido para unir a la proteína A1AT y instrucciones para utilizar el soporte solido con la A1AT unida para detectar cuantitativa o cualitativamente autoanticuerpos específicos contra la proteína A1AT. 22. - El uso de un Biomarcador y antígeno asociado a tumor: Alfa 1 -Antitripsina para el Diagnóstico e Inmunodiagnóstico de cáncer de mama en las etapas I y II, según clausula 2, caracterizado porque se utiliza en forma de solución donde: se encuentre la proteína A1AT y instrucciones para utilizar la solución con la A1AT unida para detectar cuantitativa o cualitativamente autoanticuerpos específicos contra la proteína A1AT. 23. - El uso de un Biomarcador y antígeno asociado a tumor: Alfa 1 -Antitripsina para el Diagnóstico e Inmunodiagnóstico de cáncer de mama en las etapas I y II, según clausula 2, caracterizado porque permita identificar anticuerpos contra la proteína A1AT en condiciones de cáncer de mama. 24. - El uso de un Biomarcador y antígeno asociado a tumor: Alfa 1 -Antitripsina para el Diagnóstico e Inmunodiagnóstico de cáncer de mama en las etapas I y II, según clausula 2, caracterizado porque la identificación de autoanticuerpos contra la A1AT en algún individuo correlaciona con cáncer de mama y éste compromete la administración de algún tipo tratamiento como cirugía, radiación, hormonoterapia y quimioterapia.