CN102687011B - 癌症生物标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

胃癌是在世界范围内与癌症相关的死亡的主要原因。目前还没有可用于胃癌筛检的特异性标志物。鉴定了37种蛋白的表达谱在正常对象和胃癌对象的血浆之间存在一贯性差异。已证实胃癌患者的血浆中的补体组分C9蛋白的表达显著高于正常对象。而这与患者的胃炎和幽门螺杆菌状况无关。我们还观察到了肠型和弥漫型胃癌患者的C9表达水平间的统计学显著差异(p＜0.04)。两个独立的盲试研究证实了胃癌检测的高灵敏度和特异性。C9蛋白是用于筛检胃癌的生物标志物。

Description

癌症生物标志物及其应用

相关申请交叉引用

本申请并要求于2009年7月23日递交的新加坡专利申请200904976-8号的权益和优先权，其内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及诊断或预后生物标志物或用于筛检或检测胃癌的生物标志物。

背景技术

胃癌(gastric cancer或stomach cancer)是指在食管下部、胃内或小肠最上部产生的肿瘤。胃癌是在世界范围内与癌症相关的死亡的主要原因，其中每年有近一百万新病例被确诊(Lam，K.W.，Lo，S.C.，Proteomics Clin.Appl.2008，2，219-228)。全球的五年存活率为20％左右，除了日本是近60％(Kamangar F，et al.J Clin Oncol 2006；24：2137-50)。已报道西方和东方人群在该疾病的早期检测和预后的次数上存在有趣的差异，这可能是由在胃癌的流行病学、分期系统和治疗上的不同造成的(Davis，P.A.，Japanese journalof clinical oncology 2000，30，463-464)。早期检测被认为是治疗胃癌的核心支柱。在日本和其他东方国家使用的通过内镜进行的人群筛检使得近70％的胃癌在早期被确诊，而相比之下，在筛检仍然难以进行的西方国家，只有15％的胃癌在早期被确诊(Cunningham and Chua，The New Englandjournal of medicine 2007，357，1863-1865)。然而在除了日本和韩国的其他国家中，人群筛检的花费收益还不确定。对高风险对象的筛检可能是一个可行的选择(Yeoh，K.G.，Journal of gastroenterology and hepatology 2007，22，970-972.Leung，W.K.，et al.，The lancet oncology 2008，9，279-287)。然而，目前还没有特异性的可临床用于胃癌的筛检和诊断的生物标志物，常用的标志物如CA19-9、胎蛋白抗原、胃蛋白酶原I/II、癌胚抗原(CEA)等则不灵敏(Lam and Lo 2008)。显然有发现更好的分子标志物的需求。

传统的肿瘤标志物如CA19-9、CA72-4和CEA都不够灵敏且/或不具有对胃癌检测的特异性。一份最近的评论总结了肿瘤标志物在胃癌检测中的灵敏度，包括：CEA在16％到63％间，CA19-9在20％到56％间，和CA72-4在18％到51％间(Ebert，M.P.，Rocken，C.，European journal ofgastroenterology & hepatology 2006，18，847-853.；)这些标志物的特异性则不确定。M2丙酮酸激酶被描述为与肿瘤相关的代谢标志物，也在胃癌检测中被评估，其灵敏度和特异性分别在57％到67％和89％到95％的范围内(Kumar，Y.，et al.European journal of gastroenterology & hepatology 2007，19，265-276]Hardt，P.D.，et al.Anticancer research 2000，20，4565-4568.；Cervenka，H.，et al.，Anticancer research 1999，19，849-851。大体上可从以上报告中得出两点结论：i)目前备选的肿瘤标志物对胃癌的灵敏度低于67％，和ii)它们中的多数都不具有对任意癌症类型的特异性。

胃癌的分类通常是基于劳伦分类。这可能是目前最成功和广泛使用的分类(Vauhkohen，M.，et al.Best practice & research 2006，20，651-674)。根据劳伦分类，胃癌可被分为两种主要的癌症发病机制：-(i)肠亚型(IGCA)和(ii)弥漫亚型(DGCA)。这两种亚型在流行病学和预后特征上具有显著的差异，这使得临床医生和肿瘤医生去进一步理解该分类基础(Kountouras，J.，et al.Hepatogastroenterology 2005，52，1305-1312)。肠型(IGCA)的比例约占50％，弥漫型(DGCA)为35％，剩下的15％被定义为“未分类”或混合型癌症。肠型(IGCA)的特征为粘合的赘生细胞形成腺体样管状结构的，而在弥漫型(DGCA)细胞中不存在粘合，使得独立的细胞渗透或增厚胃壁而不形成分散的块。这种微观生长模式上的差异也反映在这两种组织学亚型的不同宏观外观上。在肠型(IGCA)中，其宏观边缘大致与其宏观扩散相对应，而弥散型(DGCA)作为一种低分化癌可在粘膜下延伸至远超出其宏观边缘。这两种劳伦分类类型在肿瘤扩散上的差异在确定适当的治疗方案方面具有临床意义。肠型(IGCA)主要占据高风险区域，更经常发生在远端胃，且经常在之前有长期的癌前阶段，而弥漫型(DGCA)肿瘤主要发生在年轻患者和女性中，且遗传因素在其诱因中比例较高。根据劳伦分类对胃癌进行的分类需要侵入性取样方法。

分析工具和质谱分析平台的发展刺激了生物标志物的发现。用于发现生物标志物的蛋白质组学方法在乳腺癌、前列腺癌、肺癌、卵巢癌上取得了成功，在胃癌上取得了较小程度的成功，其中通过肿瘤组织(He，Q.Y.，etal.，Proteomics 2004，4，3276-3287)和细胞系(Takikawa，M.，et al.，Oncologyreports 2006，16，705-711)确定了潜在的备选物。例如，一项研究使用二维凝胶电泳(2-DE)的方法来描述胃液中的疾病特异性蛋白的表达(Lee，K.，etal.，Proteomics 2004，4，3343-3352)。另一种2-DE方法进一步确定了14种在胃癌和正常组织中差异表达的蛋白(Ryu，J.W.，et al.，Journal of Koreanmedical science 2003，18，505-509)。尽管对于肿瘤和胃液的研究为该疾病提供了深入的理解，但基于这些方法的生物标志物的发现需要侵入性取样方法，从临床角度看不够理想。

一些小组使用蛋白质芯片(ProteinChip)系统研究用血样挖掘生物标记物，该系统是基于表面增强激光解吸/电离(SELDI)方法(Liang，Y.，et al.，Experimental and molecular pathology 2006，81，176-180)；(Ebert，M.P.，et al.，Journal of proteome research 2004，3，1261-1266)；(Poon，T.C.，et al.，Gastroenterology 2006，130，1858-1864)。尽管在肽质量指纹谱中发现了差异，该信息却由于不能确定蛋白质的身份而不完整。尽管最近的一篇论文成功地开发了一种使用蛋白质芯片和串联质谱联合鉴定SELDI谱峰的方法(Peng，J.，et al.，Proteomics 2009，9，492-498)，但需要注意，由于各种内在的和外在的因素，使用SELDI重现血清谱可能会比较困难。另一方面，一项研究使用传统的2-DE凝胶联合质谱分析并揭示了在胃癌患者的血清中的组织蛋白酶B的上调可用作预后标志物，但不能用于早期诊断(Ebert，M.P.，et al.，Proteomics 2005，5，1693-1704)。然而2-DE方法的灵敏度仍然是个问题，而低丰度蛋白的检测仍具有挑战性。而由于血液中的蛋白具有涵盖了10个数量级的较宽的蛋白质动力学范围，该问题就更加严重。

C9通常作用在先天免疫系统中，该系统是宿主对抗外来物的防御系统之一。C9是补体系统的末端途径的一部分，并与C5b、C6、C7和C8一起用于导致细胞溶解的膜攻击复合物的组装。

发明内容

本发明致力于提供新型的胃癌检测或筛检方法以改善一些上述困难，并对现有的胃癌的检测或筛检方法进行补正。本发明还致力于提供用于检测或筛检胃癌的试剂盒。

我们发现，相对于不具有胃癌症状的正常患者的体液中的蛋白质表达，补体蛋白C9和/或其它蛋白在胃癌患者的体液中过表达。

因此，本发明的一个方面提供了一种用于检测疑似患有癌症或处于患癌症风险的个体内癌症存在的方法，该方法包含以下步骤：(a)测定补体组分C9蛋白在获得自所述个体的合适的流体样品中补体组分C9蛋白的浓度，和(b)将步骤(a)中测得的浓度与健康个体的补体组分C9蛋白浓度的标准数值范围相比较，其中当所述个体的补体组分C9蛋白浓度与健康个体的补体组分C9蛋白浓度的标准数值范围相比升高时，表明可能存在癌症。

本发明的另一方面提供了一种检测疑似患有胃癌或处于患胃癌风险的个体内胃癌存在的方法，该方法包含以下步骤：(a)测定获得自所述个体的合适的流体样品中补体组分C9蛋白的浓度，和(b)将步骤(a)中测得的浓度与健康个体的补体组分C9蛋白浓度的标准数值范围相比较，其中当所述个体的补体组分C9蛋白浓度与健康个体的补体组分C9蛋白浓度的标准数值范围相比升高时，表明可能存在胃癌。

本发明的另一方面提供了一种在合适的流体样品中检测潜在胃癌的试剂盒，其包含能够选择性结合补体组分C9蛋白的抗体和用于检测所述抗体与补体组分C9蛋白形成的复合物的试剂。

本发明的另一方面提供了合适的流体样品中的补体组分C9蛋白的浓度作为胃癌生物标志物的用途。

本发明的另一方面提供了能够选择性结合补体组分C9蛋白的分离的抗体，其用于通过测定合适的流体样品中的补体组分C9蛋白的浓度来检测胃癌。

本发明的另一方面提供了能够选择性结合补体组分C9蛋白的适体，其用于通过测定合适的流体样品中的补体组分C9蛋白的浓度来检测胃癌。

附图说明

图1(A)本研究的工作流程和实验设计的概述，包括收集血液、制备血浆样品和所使用的蛋白质组学方法。独立进行了三个iTRAQ实验。(B)根据C9免疫印迹对血浆样品进行(1)验证和(2)盲试研究的方案的示意图。将验证研究的样品之一(在图中用黑点表示)加入用于盲试的凝胶中以作为内部标准。该内部标准用于(i)在测试印迹间和(ii)在测试印迹和验证印迹间进行归一化。每个验证和测试印迹都各进行三个印迹。

图2(A)由iTRAQ实验III产生的代表性MS/MS谱，表示了ISEGLPALEFPNE的iTRAQ报告离子的相对丰度，该多肽是双电荷的肽，前体质量为780.4158，属于补体成分C9前体。iTRAQ标记与样品性质的关系如下：114-正常，115-早期胃癌，和116-晚期胃癌。(B)iTRAQ结果和C9蛋白的代表性验证印迹。备注：*由3个iTRAQ实验得到的平均比例(其比例为1.34、1.74和1.84)用于表示晚期胃癌的趋势。缩写：(i)早期GC-早期胃癌(I-II期)，(ii)晚期GC-晚期胃癌(III-IV期)和(iii)LC-肺癌。(C)条形图，表示在早期胃癌、晚期胃癌和肺癌的血浆样品的三份验证印迹中C9蛋白条带的密度计量读数，该读数根据正常对照进行归一化。(D)正常对照、早期和晚期胃癌对象及肺癌对象的混合血浆样品中的总蛋白谱。使用SYPRO Ruby对凝胶染色以便在分析时保证相同的上样量。

图3(A)三重验证印迹之一表示iTRAQ实验中的患者个体中的C9表达。在验证中包含了另外11个肺癌样品以将样本大小由原先的5个增加到16个。对每个样品的三重C9验证印迹的平均密度读数进行评估。(B)根据样品的性质，即正常、早期胃癌(I-II期)、晚期胃癌(III-IV期)和肺癌组，将这些平均读数以条形图的形式绘制出来。在图中计算并列举出每个样品种类的平均C9密度计量读数。(C)表示C9表达在每个样品种类中的分布的箱形图。使用每个样品种类的平均C9密度计量读数进行方差分析(ANOVA)。在正常与癌症组(早期、晚期胃癌和肺癌)间发现了C9表达水平的显著差异(p值＜0.05)。缩写：GC＝胃癌和LC＝肺癌。

图4由Tan Tock Seng医院(TTSH)组取得的血浆样品的三重盲试的代表性图像。对总共55个盲样进行C9表达检测。将验证研究中的一个样品加入分析凝胶中以作为用于在(i)三重盲试印迹之间和(ii)验证印迹和盲试印记间进行归一化的内部标准。

图5用于该研究(验证+盲试)的所有单独血浆样品中的C9表达。条形图表示在对经过验证和盲试印迹分析的血浆样品进行免疫印迹后C9蛋白条带的密度计量读数，血浆样品来自：(A)所有胃癌样品(早期和晚期，即I-IV期)，(B)早期胃癌(I-II期)，(C)晚期胃癌(III-IV期)和(D)肺癌样品。(E)点状图表示患者的血浆样品中的C9表达水平，该类患者的癌症被分为弥漫型、肠型或混合型胃癌。虚线表示在正常对照的血浆中C9印迹表达的平均值。

图6在胃癌细胞系中增加的C9表达。(A)胃癌细胞系裂解物的C9免疫印迹。(B)正常与胃癌细胞系裂解物的C9表达密度图。(C)在条件培养基中的正常和胃癌细胞系分泌的C9表达的密度图。HFE145为正常的胃上皮细胞系。将肌动蛋白的免疫印迹作为上样对照。

具体实施方式

描述了一种用于检测、诊断或预后癌症的方法，该方法包括(a)测定合适的流体样品中补体组分C9蛋白(C9)的浓度，该流体样品包括体液样品，如从个体取得的血液、血浆或血清样品，和(b)将步骤(a)中测得的浓度与健康个体的合适流体样品中的补体组分C9蛋白浓度的标准值相比较，其中当补体组分C9蛋白浓度与健康个体的补体组分C9蛋白浓度的标准值相比升高时，表明可能存在癌症。所述癌症可以是肺癌、胃癌或其它类型的癌症，如膀胱、大脑、乳腺、血液、鼻咽、子宫、宫颈、结肠、直肠、食管、口腔、头部、皮肤、肾脏、肺、卵巢、颈部、胰腺、前列腺、睾丸、肝脏和腹腔内的肿瘤，然而优选所述癌症为胃癌。与健康个体的C9蛋白浓度的标准值相比，优选步骤(a)中测定的C9蛋白浓度的升高是至少3倍的升高。患有早期胃癌的个体的体液中C9蛋白的浓度的升高可能是约3倍的升高，而患有晚期胃癌或肺癌的个体的体液中的C9蛋白的浓度的升高可能是约3倍到45倍或更多的升高。合适的流体样品可包括体液样品，如血浆、胃液、尿液等。流体样品可被缓冲液或其它试剂如检测试剂稀释。个体可以是任何动物，但优选人类。

该方法还可进一步包含鉴定肠型胃癌，其中与健康个体的合适流体样品中的补体组分C9蛋白浓度的标准值相比，补体组分C9蛋白的浓度3到4倍的升高表明存在肠型胃癌。由此可进行肠型胃癌的预后。

该方法还可进一步包含鉴定弥漫型胃癌，其中与健康个体的血液、血浆或血清中的补体组分C9蛋白浓度的标准值相比，补体组分C9蛋白的浓度4到45倍的升高表明存在弥漫型胃癌。由此可以进行弥漫型胃癌的预后。

以上鉴定方法具有可以快速并有效地判断胃癌类型的优点。由于肠型和弥漫型胃癌的预后不同，可以想到对于这两种不同类型而言此后的治疗手段也会有所不同。因此使用C9表达水平来区分这两种类型的胃癌的方法在无需进行重复和过量的侵入性试验的情况下可有效地确定使用哪种治疗手段更为有效并在治疗过程中监测治疗是否成功。

该方法可进一步包括以下步骤：(c)测定获得自所述个体的合适的流体样品中的癌胚抗原(CEA)蛋白的浓度，和(d)将步骤(c)中测得的浓度与健康个体的癌胚抗原浓度的标准值相比较，其中癌胚抗原浓度与健康个体的癌胚抗原浓度的标准值相比的升高表明可能存在胃癌。

C9在合适流体样品如血液、血浆或血清样品中的存在可通过使用本领域中已知方法检测C9蛋白来确定。本发明不限制用于测定C9或C9活性的测试的类型。例如，可通过使用C9特异性抗体的免疫测试来检测C9。该抗体可选择性结合补体组分C9蛋白和/或CEA。该抗体可用于，例如，一维或二维凝胶的蛋白质印迹、高通量方法如酶联免疫测试和/或细胞总蛋白或部分纯化蛋白的点印迹(抗体夹心)测试中。合适流体中的C9浓度可通过本领域中已知方式使用ELISA来测定。

酶联免疫吸附测试(ELISA)是广泛使用的体外方法。在一个测试实例中，血清样品被稀释400倍，并被施加到连接有来自一种动物来源的补体组分C9蛋白(C9)抗体(一抗)的板上。如果血清中存在足量的C9，则C9可结合这些C9抗体。之后将板进行清洗以除去血清中所有其它组分。将一种特别制备的“二抗”(其动物来源与一抗不同，是一种与一抗结合的抗体)加到板上，之后进行再一次清洗。二抗预先与酶化学连接。因此，板上所含有的酶与结合到板上的二抗的量成正比。加入这种酶的底物，在该酶的催化下会导致颜色或荧光的变化。以数值报道ELISA的结果；阳性结果和阴性结果间的“截断”点可通过将其与已知标准比较得到。所产生的信号强于已知非癌样品的样品为“阳性”。所产生的信号弱于已知非癌样品的样品为“阴性”。

另外，可使用测谱方法如LC-MS/MS质谱、GSMS质谱、SDS PAGE方法(之后通过密度计量或质谱方法定量)或其它本领域已知的类似的对蛋白质定量的方法来检测C9蛋白，从而确定合适流体中补体组分C9蛋白的浓度。

抗体

本发明还提供了对本发明中的C9多肽具有特异性的标记和未标记的单克隆和多克隆抗体，及产生本发明中的单克隆抗体的永生化细胞系。优选的抗体可选择性结合补体组分C9蛋白以通过测定血液、血浆或血清中补体组分C9蛋白的浓度来检测胃癌。根据本发明的抗体制备包括：(a)将C9多肽与载体蛋白缀合；(b)用与佐剂混合的步骤(a)中的C9多肽片段-载体蛋白缀合物免疫宿主动物；和(c)从免疫的宿主动物获得抗体。

根据本发明，通过重组或化学合成产生的C9多肽，及其片段或其它衍生物或类似物，包括融合蛋白，可用作免疫原以产生可识别C9多肽的抗体。这样的抗体包括但不局限于多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段和Fab表达文库。

因此，本发明还提供了多克隆和/或单克隆抗体及其片段，和其免疫结合等效物，它们可以特异性结合C9多肽及其片段，或结合来自C9多肽如ISEGLPALEFPNE多肽(SEQ ID NO：1)，特别是来自C9基因序列或其一部分的核苷酸序列。因此这样的抗体包括但不局限于，例如，多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段和Fab表达文库。C9多肽或其片段的特异性抗体的产生将在下文进行描述。

当分子可与免疫系统中的抗原识别分子(如免疫球蛋白(抗体)或T细胞抗原受体)特异性相互作用时，其是“抗原”分子。抗原多肽含有至少约5个，优选至少约10个氨基酸。分子的抗原部分可为对抗体或T细胞受体识别为免疫显性的部分，也可以为通过将所述抗原部分与用于免疫的载体分子缀合来产生所述分子的抗体的部分。抗原分子本身不需要是免疫原性的(即能够不需载体而引起免疫应答)。

“抗体”为任何结合特异性表位的免疫球蛋白，包括抗体及其片段。该术语包括多克隆、单克隆和嵌合抗体(后者在美国专利号4,816,397和4,816,567中被进一步详细描述)，以及抗体的抗原结合部分，包括Fab、F(ab’)2和F(v)(包括单链抗体)。因此，文中所用的各种语法形式的短语“抗体分子”包括完整的免疫球蛋白分子及免疫球蛋白分子的含有抗体结合位点的免疫活性部分。“抗体结合位点”是包含可特异性结合抗原的重、轻链可变区和高变区的抗体分子的结构部分。

示例性的抗体分子为完整的免疫球蛋白分子、基本上完整的免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子含有互补位的部分，包括本领域已知的如Fab、Fab’、F(ab’)2和F(v)的部分，所述部分优选用于文中所述的诊断、预后和筛检的方法。

抗体分子的Fab和F(ab’)₂部分分别使用已知方法通过木瓜蛋白酶和胃蛋白酶在基本完整的抗体分子上的蛋白水解反应制备。例如参见美国专利4,342,566号。Fab′抗体分子部分也是已知的，并可从F(ab’)2部分产生，如使用巯基乙醇还原连接两个重链部分的双硫键，接着使用如碘代乙酰胺的试剂对所得蛋白质硫醇进行烷基化。本文优选含有完整抗体分子的抗体。

以多种语法形式出现的术语“单克隆抗体”是指只具有一种能够与特定抗原进行免疫反应的抗体结合位点的抗体。因此单克隆抗体通常显示对与其进行免疫反应的任何抗原的单一结合亲和力。因此单克隆抗体可含有具有多个抗体结合位点的抗体分子，其中每一位点对不同的抗原具有免疫特异性；如，双特异性(嵌合)单克隆抗体。

术语“佐剂”是指增强对抗原的免疫应答的化合物或混合物。佐剂可作为缓慢释放抗原的组织仓库，也可作为非特异性增强免疫应答的淋巴系统激活剂。没有佐剂而只有抗原自身的一级攻击通常不会引发体液或细胞免疫应答。佐剂包括，但不局限于，弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、皂苷、矿物凝胶如氢氧化铝、表面活性物质如溶血卵磷脂、复合多元醇、聚阴离子、肽、油或乳化烃、钥孔血蓝蛋白、二硝基苯酚、和可能有用的人类佐剂如BCG(卡介苗(bacilli Calmette-Guerin))和短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum.)。优选地，所述佐剂为药物学可接受的。

C9多肽、或其片段、衍生物或类似物的多克隆抗体可通过多种本领域中已知的方法制备。可注射C9多肽或其衍生物(如片段或融合蛋白)以使多种宿主动物免疫，从而产生抗体，宿主动物包括但不局限于兔、小鼠、大鼠、绵羊、山羊等。在一个实施方式中，C9多肽或其片段可缀合于免疫原性载体，如牛血清白蛋白(BSA)或钥孔血蓝蛋白(KLH)。根据宿主物种，可使用多种佐剂以增强免疫应答，所述佐剂包括但不局限于弗氏佐剂(完全或不完全)、矿物凝胶如氢氧化铝、表面活性物质如溶血卵磷脂、复合多元醇、聚阴离子、肽、油乳液、钥孔血蓝蛋白、二硝基苯酚、和可能有用的人类佐剂如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌。

任何通过培养连续细胞系来生产抗体分子的技术都可被用于制备针对C9多肽或其片段、类似物或衍生物的单克隆抗体。这包括但不局限于首先由Kohler et al.，Nature，256：495-497(1975)开发的杂交瘤技术、三源杂交瘤技术、人类B细胞杂交瘤技术[Kozbor et al.，Immunology Today，4：72(1983)]和产生人类单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术[Cole et al.，in MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy，pp.77-96，Alan R.Liss，Inc.，(1985)]。永生化的产生抗体的细胞系也可通过融合以外的技术产生，如将致癌DNA直接转化B淋巴细胞，或用Epstein-Barr病毒转染。参见，如，M.Schreier et al.，“Hybridoma Techniques”(1980)；Hammerling et al.，Monoclonal Antibodiesand T-cell Hybridomas”(1981)；Kennett et al.，“Monoclonal Antibodies”(1980)；还参见美国专利4,341,761号；4,399,121号；4,427,783号；4,444,887号；4,451,570号；4,466,917号；4,472,500号；4,491,632号；和4,493,890号。

在本发明的另一个实施方式中，可使用最近的技术从无菌动物体内生产单克隆抗体(PCT/US90/02545)。根据本发明，可使用人类抗体，其可通过人杂交瘤[Cote et al.，Proc.Natl.Acd.Sci.USA，80：2026-2030(1983)]或通过在体外用EBV病毒转化人类B细胞而获得(Cole et al.，1985，supra)。事实上，根据本发明，可使用通过将来自小鼠C9多肽特异性抗体分子的基因与来自具有适当的生物活性的人类抗体分子的基因剪接在一起以获得“嵌合抗体”的技术[Morrison et al.，J.Bacteriol.，159-870(1984)；Neuberger et al.，Nature，312：604-608(1984)；Takeda et al.，Nature，314：452-454(1985)]；这样的抗体在本发明的范围内。由于人抗体或人源化抗体自身不像异种抗体那样容易引发免疫应答，特别是过敏反应，所述人抗体或人源化嵌合抗体优选用于治疗人类的疾病或紊乱(将会在以下描述)。

根据本发明，可使用用于产生单链抗体(美国专利4,946,778号)的技术来产生C9多肽特异性单链抗体。本发明的另一个实施方式使用用于构建Fab表达文库的技术[Huse et al.，Science，246：1275-1281(1989)]来快速简便地鉴定对C9多肽或其衍生物或类似物具有所需特异性的单克隆Fab片段。

可使用已知技术来产生含有抗体分子的独特型的抗体片段。例如，该片段包括但不局限于：可通过胃蛋白酶消化抗体分子制备的F(ab’)₂片段；可通过还原F(ab’)₂片段中的二硫键制备的Fab’片段，和可通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子制备的Fab片段。

在制备抗体时，可使用本领域已知的技术筛选所需抗体，如放射免疫测试、ELISA(酶联免疫吸附测试)、夹心免疫测试、免疫放射测试、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散测试、原位免疫测试(使用例如胶体金、酶或放射性同位素标记)、蛋白质印迹、沉淀反应、凝集测试(如凝胶凝集测试、血凝测试)、补体结合测试、免疫荧光测试、蛋白A测试和免疫电泳测试等。在一个实施方式中，通过检测一抗上的标记来检测抗体的结合。在另一个实施方式中，通过检测二抗或试剂与一抗的结合来检测一抗。在另一个实施方式中，二抗被标记。本领域中有很多已知方法用来检测免疫测试中的结合，并都在本发明的范围内。例如，为了选择识别C9多肽的特异性表位的抗体，可测试所产生的杂交瘤，测定其与含有所述表位的C9多肽片段结合的产物。

示例性抗体可包括亲和纯化的兔抗肽LQYENVDEDSSDSDA抗体。

以上抗体可用于涉及C9多肽的定位和活性的本领域中已知方法中，如蛋白质印迹、C9多肽的原位成像、测定其在合适的生理样品中的含量等。

在一个具体的实施方式中，使用根据蛋白质序列合成的肽或通过细菌表达载体制备的重组蛋白来使兔免疫以产生抗体。合成多肽的选择是在根据上文所述对所预测的蛋白结构进行仔细分析后做出的。具体地，选择在假定裂解位点间的多肽序列。使用碳二亚胺将合成多肽缀合至到载体，如KLH血蓝蛋白或BSA，并将其用于弗氏佐剂中使兔免疫。为了制备重组蛋白，可使用载体来表达C9多肽。或者可以只使用亲水结构域来生成融合蛋白。所表达的蛋白会被大量制备并与弗氏佐剂一起使兔免疫。

在另一个实施方式中，使用重组C9多肽使兔免疫，并在进一步使用前对多克隆抗体进行免疫纯化。纯化的抗体在半定量测试中特别有用，特别是用于检测C9多肽的存在。

优选地，用于本发明中的诊断、预后和筛检方法的抗调节剂(anti-modulator)抗体是亲和纯化的多克隆抗体。更优选地，所述抗体是单克隆抗体(mAb)。另外，本文所用的抗调节剂抗体分子优选以完整抗体分子的Fab、Fab’、F(ab’)2或F(v)部分的形式存在。

在本发明的一个优选实施方式中，抗体会将C9蛋白从溶液中免疫沉淀出来，也会在聚丙烯酰胺凝胶的Western印迹或免疫印迹上与C9蛋白反应。

优选的实施方式涉及到检测C9蛋白或其变体的方法，包括酶联免疫吸附测试(ELISA)、放射免疫测试(RIA)、免疫放射测试(IRMA)和免疫酶促测试(IEMA)，包括使用单克隆和/或多克隆抗体的夹心测试。

根据本发明，提供了一种诊断或预后生物标志物，C9，其可以区分胃癌个体和不患有癌症的健康个体。

优选的C9核酸包含核苷酸序列SEQ ID NO：2。

优选的C9多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO：3。

在一个优选的实施方式中，将所提取的血液、血浆或血清中的补体组分C9蛋白浓度用作胃癌的生物标志物。补体组分C9蛋白可以是胃癌的血液、血浆或血清生物标志物。

适体

本发明还提供了本发明中的C9多肽的特异性适体。优选的适体可选择性结合补体组分C9蛋白，用于通过测定补体组分C9蛋白的血液、血浆或血清浓度来检测胃癌。

根据本发明，通过重组或化学合成制备的C9多肽及其片段或衍生物或类似物，包括融合蛋白，可以用作免疫原以生成识别所述C9多肽的适体。

因此，本发明还提供了适体及其片段和其免疫结合等效物，它们可特异性结合C9多肽和其片段，或结合来自C9多肽如ISEGLPALEFPNE肽(SEQ ID NO：1)的核苷酸序列(特别是来自于C9基因序列或其部分)。下文将会描述C9多肽或其片段的特异性适体的制备。

术语“适体”是指与靶化合物(如特异性抗原、治疗药物标记物或替代标记物)具有特异性作用的非天然存在的寡核苷酸链或肽分子。特异性作用包括但不局限于，结合靶化合物、催化改变靶化合物、和以改性/改变靶化合物或靶化合物的功能活性的形式与靶化合物反应。

由于其分子识别特性，适体可用于很多应用中，如癌症诊断和治疗。癌症细胞需要与不同类型的分子进行物理相互作用以生长、复制和扩散。在诊断领域中，对那些在癌症早期阶段呈现异常的蛋白质具有高度特异性的适体可作为癌症的早期检测工具。适体也可能比抗体的免疫原性低。因此，它们也不太可能引起并发症如宿主排异。

可通过重复的多轮体外选择或SELEX^TM(通过指数富集的配体系统进化)改造适体以结合不同的分子靶如小分子。尽管存在修改，但适体的制备/合成及选择方法与以下论文中所述大体相同：Elington，A.D.，Szostak，J.W.，1990.in vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.Nature 346，818-822；Tuerk，C.，Gold，L.，1990.Systematic evolution of ligandsby exponential enrichment：RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.Science 249，505-510.

“SELEX^TM”方法包括将选择核酸配体与所选核酸的扩增相结合，其中所述配体与特异性表位以所需形式相互作用，如与蛋白结合。这种选择/扩增步骤的任选的迭代循环可以从含有大量核酸的库(pool)中选择一种或少量与特异性表位相互作用最强的核酸。继续该筛选/扩增循环过程，直到达到所选定目标。SELEX方法在以下美国专利和专利申请中被描述：美国专利序列号07/536,428和美国专利号5,475,096和5,270,163。

在本发明的一个优选的实施方式中，适体会将C9蛋白从溶液中免疫沉淀出来，也会在聚丙烯酰胺凝胶的Western或免疫印迹上与C9蛋白反应。

涉及到检测C9蛋白或其变体的方法的优选的实施方式包括但不局限于酶联免疫吸附测试(ELISA)，这是由于其高通量的特性和易于设置和操作。

诊断试剂盒

检测试剂盒可含有抗体、扩增系统、检测试剂(发色剂、荧光团等)、稀释缓冲液、洗涤溶液、复染剂或其任意组合。试剂盒组分可被包装用于手动或部分或全部地自动化实施前述方法。在另一个涉及到试剂盒的实施方式中，本发明考虑了试剂盒，其包含本发明中的组合物以及任选的关于其使用的说明书。该试剂盒具有多种用途，包括，例如，对患者人群分类、诊断、预后、指导治疗性治疗决策及其它应用。

优选的用于在合适的流体如血液、血浆或血清样品中检测可能的胃癌的试剂盒包含可选择性结合补体组分C9蛋白和用于检测所述抗体与补体组分C9蛋白形成的复合物的试剂的抗体。该试剂盒还可包含可选择性结合癌胚抗原和用于检测所述抗体与CEA形成的复合物的试剂的抗体。该试剂盒还可包含ELISA试剂和板。

假设肿瘤特异性标志物由癌组织释放到体液如血液、血浆、血清和尿液中。这些体液任何一种都是用于发现生物标记物的理想基质，因为其获取过程具有最小的侵入性并可重复进行而不会产生不良后果。

不局限于任何理论，可以预期人体免疫系统对癌细胞发出反应，而这会导致提高血液中C9蛋白的产生。还可以预期在癌症患者的血浆内检测到升高的C9量是由于胃癌细胞相对于正常细胞分泌较多的C9(图6)。

优选实施方式的实施例

胃癌是在世界范围内与癌症相关的死亡的主要原因。目前还没有特异性标志物可临床用于胃癌的筛检和诊断。通过使用基于抗体的消除、用于相对和绝对定量的同位素标签(iTRAQ)和串联质谱的组合获得取自正常对象、早期(I-II)和晚期(III-IV)胃癌患者的临床血浆样品中的蛋白质表达水平谱，本研究尝试发现用于胃癌的潜在标志物。使用三个独立的iTRAQ实验分析取自总共25个正常对象和36个胃癌对象的样品。

在该研究中，我们使用了血浆蛋白质组学的方法来发现胃癌的潜在生物标志物。由于其在取样过程中的简易性，对血浆/血清中的标志物进行分析是最具吸引力的方法之一。我们的工作验证了相对于正常对照而言，C9蛋白在多数胃癌患者的血浆中高度表达。至今还没有报道过C9表达的升高与胃癌相关。

本研究使用了用于相对和绝对定量同位素标签(iTRAQ)来获得早期和晚期胃癌阶段相对于正常对照的血浆中的蛋白质表达水平谱。本研究的目的为：(i)使用蛋白质组学的方法鉴定和验证还未显示与胃癌相关的蛋白质，和(ii)检验这些备选物相对于CEA在用于胃癌诊断中的特异性和灵敏度。

血液采集和血浆样品的制备

自2006年1月以来，在新加坡的国立大学医院和Tan Tock Seng医院被新近诊断出胃癌的患者在知情同意的情况下预先加入到研究(胃癌生物标记物的发现II，GASCAD II)，收集其血液、配对的正常和肿瘤组织及胃液样品以及临床和病理注释。在手术或化疗前获得血样。通过组织病理学结合所有临床信息确定分期信息。不存在其它恶性肿瘤的迹象。使用了美国癌症联合协会(AJCC)的胃癌分期系统和胃癌性质的劳伦分类。从各机构的审查委员会取得了伦理批准。

从在临床研究中经过上消化道内镜筛检被排除患有胃癌的对象中获得非癌对照。使用同样的血液采集方案。对象已知情同意且研究方案取得了各机构的审查委员会的批准。

本研究中各中心使用的血液采集和血浆制备的标准方案参照血浆蛋白组计划(PPP)中的报道(Omenn，G.S.，et al.，Proteomics 2005，5，3226-3245)。通过静脉穿刺从每个患者体内取出约5mL的血液并转移到涂有K₂EDTA(cat#362788，真空采血管；BD，美国)的真空采集管中。之后将管轻轻倒转8次，之后在室温下静置30分钟。将装有血样的管保存在冰上并转移到实验室中。接着以1,100x g的速度在4℃下离心10分钟将血浆与红细胞分离，向血浆样品中加入蛋白抑制剂并使用0.22m的过滤单元(Millipore，MA，美国)净化。将1mL等份的血浆样品储存在-80℃下等待进一步分析。为了保证血浆制备的一致性，需要进行质量控制测试，其中所有的血样需要在临床采集血液后一小时内(包括在室温下30分钟的培养)在实验室中被处理为血浆。进行1D SDS PAGE并使用SyproRuby荧光染料染色来检测可能存在的大规模蛋白质降解或样品恶化以进一步验证各血浆样品的完整性。不满足这些特定的时间范围或完整性检测的样品会被储存起来但不会被用于该研究。

三个实验中共同的37种蛋白的表达被验证为在正常对象和癌症对象的血浆中存在一贯性差异。通过使用免疫印迹，验证了胃癌患者血浆中的补体组分C9蛋白的表达显著高于正常对象。该观察结果并不是由于患者间的差异，且不受到患者的胃炎和幽门螺杆菌(H.pylori)状况的影响。我们还观测到患有肠型和弥漫型癌症的患者间存在C9蛋白表达水平的统计学显著差异(p＜0.04)。在取自两个不同医院的总共119个血浆样品上进行的两个各自独立的关于C9表达的盲试研究显示其灵敏度为78％到89％，且其特异性为69％到78％。血清中的C9表达相对于CEA来说更为灵敏(CEA在7％到29％的范围内)。这表明由于其对胃癌是灵敏的和特异的，C9可作为人群筛检或诊断的癌症标记物。

免疫检测试剂

从Abcam(Cambridge，英国)购得小鼠单克隆C9抗体。增强化学发光(ECL)检测试剂盒购自通用General Electric Healthcare，Bio-sciences(Uppsala，瑞典)；预染色的分子量标记物和丙烯酰胺/双丙烯酰胺29∶1来自Bio-Rad(Hercules，CA)，蛋白酶抑制剂混合物来自Roche(Mannheim，德国)。原钒酸钠和TEMED电泳试剂购自SigmaAldrich(St Louis，MO)。BCA蛋白质测试试剂盒来自Pierce(Thermo Fisher Scientific，美国)，用于Hu-7消除(depletion)的缓冲液A和B购自Agilent Technologies(CA，美国)。测序级胰蛋白酶购自Promega(WI，美国)。

本研究中的分组(cohort)样本的表征

我们通过3个iTRAQ实验研究了15个早期胃癌患者和8到22个晚期胃癌患者，如表1中所示。这里我们将那些根据美国癌症联合协会(AJCC)的分期系统诊断为I期和II期的胃癌定义为早期胃癌，而晚期胃癌为III期和IV期的胃癌。进行三个相对独立的定量研究以保证所得结果的可靠性。由于该课题在早期阶段样品的限制，从第一个到第三个实验所用的样品量逐渐增加。增加的样品量应会产生更具代表性的数据，并减少患者间的潜在偏差和差异。在每个实验中，用作对照的取自正常/健康对象的血浆样品的数量与所用的实验血浆样品(胃癌样品)相同。将对照和测试样品按照年龄和性别配对。正常血浆样品采自健康个体，他们没有癌症，但由于其家族胃癌病史被归类为胃癌高风险人群。在基于iTRAQ的质谱分析中还包括采自5个新近被诊断为肺癌的患者的血浆样品，以作对比。用于iTRAQ实验的样品的详细临床数据如表1所示。

表1.用于3个iTRAQ实验的样品的表征和临床数据

a不患有癌症的胃癌高风险血浆样品被用作正常对照。这些样品根据患者的性别和年龄与胃癌样品进行配对。

b将取自新近被诊断为肺癌的患者的血浆样品包括在内以测定所鉴定的潜在备选物的癌症特异性。

对早期和晚期胃癌的血浆蛋白的鉴定和相对定量

为了鉴定胃癌的潜在新型生物标志物，我们使用基于iTRAQ的质谱方法测量了胃癌患者的血浆蛋白表达水平谱，如图1A所示。每个实验中的样品(胃癌患者的血浆)根据性别和平均年龄与对照样品配对，如表1中注明的。在三个独立实验中分析了来自早期(AJCC I-II期)、晚期(AJCC III-IV期)和不患有癌症的高风险患者的血浆样品。该方法包含：(a)除去高丰度蛋白；(b)标记剩下的肽；(c)分离所标记的肽；(d)基于大小鉴定和(d)对现有肽的量进行定量。该实验利用了这些方法中一定程度上的差异。简单来说，这些差异包括：i)由于在该课题的进行过程中可用样品的增多导致的样品数量的增加，ii)不同消除方案的使用和iii)具有不同离子化模式的质谱的使用。将三个独立实验的数据结合起来解释有助于提高生物学发现的可靠性，因为只会进一步研究在至少两个iTRAQ实验中共同发现的蛋白。尽管样品数量小，但还是在实验3中包括了5个采自肺癌患者的血浆样品以确认特定的观察结果是否胃癌独特的。补充列表1提供了在每个iTRAQ实验中鉴定的蛋白质和肽的完整列表(蛋白质总结和肽总结)。

高丰度蛋白从血浆中的消除及iTRAQ标记

在所有3个iTRAQ实验中，在除去高丰度蛋白前将表1中所列的血浆样品数量根据其分类(即正常、早期胃癌、晚期胃癌或肺癌)合并在一起。在第一和第二组的iTRAQ实验中，从每个样品中总共合并35mg的蛋白。之后将合并的样品通过以130,000xg在4℃下离心2小时进行脱脂。收集由超速离心产生的上层透明血浆层，使用BCA测试(Pierce Biotechnology，IL，美国)估计蛋白总量。之后根据制造商的方案使用IgY-12离心柱(BeckmanCoulter，CA，美国)对血浆样品进行消除(参见图1A)。

在第三个iTRAQ实验中，使用去除系统(MARS Hu-7)亲和柱进行消除，如图1A中所示。将除去高丰度蛋白组分的流穿级分以4,500xg在4℃下进行离心，接着使用截留分子量为5kDa的Millipore的离心过滤装置进行浓缩。使用pH 8.0的50mM的TEAB缓冲液在同一个离心过滤装置上对浓缩的样品清洗3次，接着使用BCA测试估算蛋白总量。

之后根据推荐的方案(Applied Biosystems，Framingham，MA，美国)将蛋白样品进行还原、烷基化、消化并使用iTRAQ试剂标记。样品的标记如以下所述：a)实验1：115-正常，116和117-晚期胃癌(技术实验)，b)实验2：115-正常，116-晚期胃癌，和117-肺癌，用于提供关于潜在备选物的癌症特异性额外信息的变量；和c)实验3：114-正常，115-早期胃癌和116-晚期胃癌。

用于蛋白质鉴定和相对定量的蛋白质分离LC-MS/MS分析。

在iTRAQ实验1和2中，使用基质辅助激光解吸电离(MALDI)-ToF-ToF分析对所标记的多肽进行蛋白质鉴定和定量(图1A)。使用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)对iTRAQ标记的多肽混合物进行分离，此处使用的是装有ProbotTM MALDI点样装置的UltimateTM LC系统(Dionex-LCPackings)，如我们之前的研究中所述(Chem，Y.，et al.，Mol Cell Proteomics2007，6，2072-2087)。使用ABI 4700 Proteomics Analyzer MALDI-TOF/TOF质谱(Applied Biosystems，Foster City，CA，美国)对MALDI点样靶板进行分析，以结果独立采集模型操作，其设定与我们之前的研究相同(Chem，Y.，et al.，Mol Cell Proteomics 2007，6，2072-2087)。使用GPS ExplorerTM软件版本3.5(Applied Biosystems)和MASCOT搜索引擎(版本2.1；MatrixScience)来建立和搜索文件以进行多肽和蛋白质鉴定。使用国际蛋白质索引(IPI)人类数据库(版本3.41，发行日期：2008年3月，72155个序列)进行搜索并限定为胰蛋白酶切的肽。选择半胱氨酸甲硫醇化(methanethiolation)、氮端iTRAQ标记、iTRAQ标记赖氨酸和氧化蛋氨酸作为可变修饰，且允许发生一次错切(miss-cleavage)。前体容错被设定为100ppm，MS/MS碎片容错为0.3Da。最高多肽等级设定为2，最小离子得分C.I.％(多肽)设定为95％。使用GPS ExplorerTM软件版本3.5进行iTRAQ定量。

相反，将第三个iTRAQ实验的干燥的标记多肽混合物重新悬浮在200μl缓冲液A中，使用200mm长度x4.6mm ID、孔径大小为具有AKTAPurifier FPLC单元(GE Healthcare，英国)的5μm PolySULFOETHYLTM A柱(PolyLC，Columbia，MD，美国)对混合物进行分馏，恒定流速为1mL/min，注射体积为200μL。缓冲液A由5mM KH₂PO4和30％乙腈组成，pH 2.65，而缓冲液B由5mM KH₂PO4、25％乙腈和350mM KCl组成，pH 2.65。55分钟的梯度由5分钟的100％A，30分钟的5％到21％B，15分钟的30％到100％B和5分钟的100％B组成。之后使用100％缓冲液C(20mM Tris-HClpH 8)对柱子清洗10分钟，再用100％A复原20分钟。使用UV-900(GEHealthcare，英国)监控色谱，并在每分钟使用Frac-950(GE Healthcare，英国)收集级分，之后根据基于峰强度的手动操作色谱图合并各级分。总共合并了15个级分。将所述级分在真空浓缩器中干燥，之后使用C18DSC-18 SPE柱(100mg容量，Supelco，Sigma-Aldrich)进行C-18清洗。

之后使用Agilent 1100nLC系统(Agilent)在线串联四级杆飞行时间质谱(QStar XL，Applied Biosystems)分析所得干燥清洁的级分。将SCX级分重新悬浮在40μL的脱盐溶液中，所述溶液在水中含有0.1％三氟乙酸和2％乙腈，之后将所述级分加载到反相多肽Captrap(Michrom Bioresources)上，以10μL/min的流速脱盐13分钟。在脱盐后，将离子阱(trap)在线转移到150μmx10cm C-183μm的ProteCol柱上(SGE)。使用120分钟的梯度，将缓冲液B通过三个线性梯度步骤由5％过渡到90％以稀释多肽。使用100％B将柱子清洗15分钟，并在下一个样品之前使用100％缓冲液A平衡30分钟。缓冲液A由水中0.1％的甲酸组成，缓冲液B由90％的乙腈中0.1％的甲酸组成。将来自反相nLC的洗脱液直接用于正离子纳米流电喷射分析，即：信息依赖采集模式(IDA)的电子喷射离子源(ESI)，其中采集ToF MS质谱扫描(m/z 370-1600，0.5sec)，并使用MS/MS连续分析三个最高强度的多电荷离子(计数)70)。将MS/MS事件的时间总和设定为在m/z 100-1600的质量范围内为2秒钟。

使用ProteinPilotTM软件(版本2.0；Applied Biosystems，MDS-Sciex)对iTRAQ样品进行蛋白质鉴定和定量。在国际蛋白质索引(IPI)人类数据库(版本3.41，发行时间：2008年3月，72155个序列)中进行搜索。使用Paragon AlgorithmTM进行搜索，所述软件在其它地方详细描述(Shilov，I.V.，et al.，Mol Cell Proteomics 2007，6，1638-1655)。

根据生成的iTRAQ比例，使用30％的截断值以容纳可能的技术误差，也就是本研究中的主要误差，因为样本合并效应使生物学误差减到了最低。因此，使用1.30和0.77的上限和下限及＜0.05的p值来过滤数据集。iTRAQ比值大于上限(＞1.30)的蛋白被认为是过表达，而比值低于下限(＜0.77)的被认为是低表达。只有当这些差异蛋白的p值低于0.05的时候才会被认为是显著的。该截断点是公认的，并被用于其它使用iTRAQ方法进行大规模蛋白质鉴定和定量的研究中(Pierce，A.，et al.，Mol Cell Proteomics 2008，7，853-863；和Gan，C.S.，et al.Journal of proteome research 2007，6，821-827)。尽管本方法存在缺点，即对所有蛋白使用统一标准，但随后使用免疫印迹进行的验证步骤会对主要发现进行证实。

只有那些被鉴定为具有至少95％置信度的蛋白质会被考虑在内。所有结果被输出到Excel中以进行手动数据分析。为了保证数据的可靠性，通过搜索连续的伪逆数据库来估算假阳性率，所述数据库为独立制造，由前数据库及它们的伪逆序列组成(Elias，J.E.，Gygi，S.P.，Nature methods 2007，4，207-214)。使用本方案，本数据集的假阳性发现率(FDR)被估算为约1％。这里我们将FDR定义为被鉴定的诱饵蛋白相对于被鉴定的所有蛋白的百分比。所述数据集中的不显著的假阳性率是可接受和可容忍的。

如前所述，只有那些被发现在iTRAQ实验间共同的蛋白会被考虑在内。共鉴定了68种共同蛋白(数据未显示)，但只有其中37种被发现是差异表达(即比率＞1.3或＜0.77，且p值＜0.05)，它们的相对表达水平如表3所示。这些共同蛋白中的一些使用单一独特肽鉴定，因此不具有误差因子或标准偏差值，除非由于该单一肽存在于不同LC级分中因此使用多个MS/MS对它们进行鉴定。单一肽命中的发生并不出人意外，因为血浆蛋白质具有较宽的动力学范围且一些蛋白质具有低丰度。根据相对比例，将这些蛋白分类为10个表达趋势簇，如表3所示。11种差异表达的蛋白在所有3个iTRAQ实验中被鉴定，而剩余的26种蛋白在至少两个实验中发现。有意思的是，有12种蛋白(在两个趋势簇中)只在肺癌中表现出高表达或低表达，而在胃癌中没有显著变化。我们不会对这些蛋白进行进一步研究，因为肺癌不是本研究的主要重点。然而不论怎样，本列表可能是有帮助的且可能为肺癌研究提供相关信息。

C9在三个iTRAQ实验中表现出相似和一致的表达趋势(见表3)。图2A表示了C9蛋白的MS/MS肽谱的一部分，表明了早期和晚期胃癌样品中的报道离子(reporter ion)(m/z分别为115和116)的强度相比于正常对照样品(m/z 114)较高。

免疫印迹、验证和盲试研究

为了证实iTRAQ实验所揭示的C9表达趋势，在相同的原本用于蛋白质组学分析的合并的血浆样品上进行免疫印迹。

根据之前的研究所描述的，对用于iTRAQ分析的合并的的经消除的血浆样品进行C9免疫印迹(Lim，Y.P.，et al.Molecular cancer therapeutics 2003，2，1369-1377；Lim，Y.P.，et al.The Journal of biological chemistry 1999，274，19025-19034)。对每个样品进行三次重复印迹以保证所得数据的可靠性。为了获得C9在个体血浆样品中的表达水平谱，使用粗血浆样品(未经消除高丰度蛋白)进行免疫印迹。在这之前，通过改变蛋白上样量及x-射线胶片曝光时间(数据未显示)得到在粗样品中进行C9免疫印迹的最佳条件。之后，将从每个样品中获得的总共5μg的粗血浆蛋白上样至1D SDS PAGE上。从不同的1D凝胶上将跨越包含C9迁移的所需分子量范围的凝胶带割下。之后将所有所需条带放置于同一PVDF膜上并进行免疫印迹(如图1B所示)。在C9免疫印迹后，对来自每个血浆样品的三次跑胶的三重PVDF膜在单个x射线胶片上进行化学发光检测。对密度计量，使用Imager Scanner及其相应的软件LabScan版本5.0(General Electric Healthcare)首先捕捉x射线胶片上的图像。按厂商说明书定期进行仪器校准。之后使用ImageQuantTL软件v2003.03(General Electric Healthcare)中的1-D凝胶分析模块对图像进行分析。简单地说，自动检测目标条带。之后手动调节高亮区域以保证所有条带都被适当显示，并不会被非目标区域干扰。将背景扣除并测量每个条带的大小。

免疫印迹中观察到的C9表达趋势与通过iTRAQ方法得到的蛋白质表达相同，其中，相对于正常对象，C9被发现在癌症患者的血浆中过表达至少1.3倍(参见图2B和2C)。通过使用SyproRuby荧光染料对凝胶染色获得的总体蛋白质表达谱表明在每个所分析的泳道中具有相同的上样量(图2D)。通过这两种独立方法(iTRAQ和免疫印迹)获得相同的观察结果，证明了我们的发现的真实性。

对于临床血浆样品的主要担心和挑战是患者间的差异。很多因素，例如遗传背景、饮食和环境因素都可导致对象间蛋白质表达水平的差异。为了减少在胃癌患者的血浆中观察到的相对于正常对照较高的C9表达是由于患者间差异的可能性，对所有用于3个独立的iTRAQ分析的样品分别适用免疫印迹获得C9表达水平谱。总体上，我们总共筛检了77个样品，其中包括25个正常，15个早期胃癌，21个晚期胃癌和16个肺癌样品。11个肺癌样品(包括5个用于iTRAQ分析的)被包括在本筛检中以作为对比。

对于C9的个体筛检，我们决定在免疫印迹中探讨使用粗血浆(未经消除高丰度蛋白)，因为从临床角度看，粗血浆更实用和经济。初步的研究表明C9在粗血浆中的检测具有高可靠性(数据未显示)。因此，对每个粗血浆样品进行三次免疫印迹以保证结果的可重复性。如“实验程序”部分所述，通过将具有所需蛋白质分子量范围的不同凝胶条转移到单个PVDF膜上来进行免疫印迹(参见图1B)。该程序被重复三次，产生三个三重印迹，对所述印迹进行化学发光检测。将三重印迹同时在单个x射线胶片上曝光以保证公平对比。图3A显示了所生成的用于获得个体血浆样品中的C9表达的三重印迹的一个实例。在实际试验之前，滴定血浆蛋白的上样量，并估算在化学发光反应后的x射线胶片曝光时间，以得到最佳的条件/操作程序，从而使得所得C9信号的强度落在线性范围内且不会受到饱和效应的影响(如图3A所示)。

对每个血浆样品的三重数据点的平均密度计量读数进行计算并绘制在图3B中。根据样品的性质对样品进行归类，即正常、早期胃癌(I-II期)、晚期胃癌(III-IV期)和肺癌组。在早期胃癌、晚期胃癌和肺癌这三个癌症组中的C9表达水平的平均值分别是42750、57767、47071。这些平均值被发现比对照组高两倍，对照组的平均密度计量读数为21577(参见图3B)。进行ANOVA统计分析以确定所观察到的差异是否具有统计学意义。图3C中的箱形图表明C9表达差异显著，因为当将3个癌症组(早期胃癌、晚期胃癌和肺癌)与正常组相比较时p值＜0.05。然而，C9表达在区分3个癌症组上并不具有统计学效力。

在盲试中使用C9区分正常和癌症状态

由于C9表达水平能够以统计学置信度区分正常和癌症对象，我们继续进行盲试以确定是否血浆C9水平可用于区分正常和患病状态。两个独立群体参加了盲测试实验以减少机构间导致的偏差。他们包括国立大学医院(NUH)的64个样品和Tan Tock Seng医院(TTSH)的55个样品(表2)。根据可获得性随机选择这些样品。由之前不知道样品性质的操作人员使用免疫印迹对每个样品的C9表达水平检测3次。将验证实验中的晚期胃癌患者的血浆样品搀入含有盲样品的凝胶中(参见图1B)。被搀入的样品作为内部对照使用，用来归一化验证和盲试印迹间的信号强度及盲试印迹内的信号强度。

表2.血浆样品被用于盲试研究的患者的临床数据。这些临床样品根据样品的可获得性随机选自国立大学医院(NUH)和Tan Tock Seng医院(TTSH)。

*临床数据没有正常对照的种族信息。#临床数据中有4个收集的正常样品没有提供具体的性别信息。

对采自以下患者的血浆样品进行盲试：(i)NUH组-采自国立大学医院(NUH)的64个血浆样品或(ii)TTSH组-采自Tan Tock Seng医院(TTSH)的55个血浆样品。用于盲试的这两个样品组的临床数据总结在表2中。所述盲试是由预先不知道样品性质的操作人员完成的。用于盲试的免疫印迹方法与上述用于验证步骤地方法相同，除了在含有盲试样品的凝胶中另外搀入5μg的来自验证步骤的已知晚期胃癌的参照样品作为用于在试验/验证印迹间和内部进行密度计量扫描归一化的内部对照(图1B)。

与验证过程相似，通过三重数据点计算每个样品的平均密度计量读数。图4表示了在NUH组中进行的盲试中的一个三重印迹。之后根据验证印迹中预测的平均C9密度计量读数截断值预测样品是正常、早期胃癌或晚期胃癌。如前所述，验证印迹中正常、早期和晚期胃癌的平均密度计量读数分别为21577、42750和57767。这些数值在盲试预测中被用作截断值-样品的平均密度计量读数(i)＜21577为正常，(ii)在21577-42750范围间的为早期胃癌，和(iii)＞42750的为晚期胃癌。使用这种截断组合，分别在临床数据中对照NUH组(表4A)和TTSH组(表4B)的状态，约66％(64中的42个)和69％(55中的38个)的样品预测正确。在NUH组中，C9特异性被估算为约78％，即比从TTSH组估算的69％高9％。发现C9对早期胃癌中较不灵敏，其中C9的灵敏度在NUH组中发现为31％，在TTSH组中为46％。相反，C9对于晚期胃癌的灵敏度显著增高，即对NUH和TTSH组分别为68％和87％，说明C9在诊断胃癌的发展时期上具有较大的潜力。如果不考虑癌症时期，在NUH和TTSH组中C9的灵敏度分别升高为78％和89％。这表明C9在区分来自(i)癌症患者和(ii)患有晚期癌症的癌症患者的血浆与正常对象的血浆的方面具有很高的特异性和灵敏度。

表4.C9表达水平用于预测来自两个独立医学中心的样品的盲试研究，即(A)国立大学医院(NUH)组和(B)Tan Tock Seng医院(TTSH)组。确定了在检测胃癌时C9的灵敏度和特异性。(C)作为对比，测定了用于验证组的血浆样品和55个随机选自NUH和TTSH盲试组的样品中的癌胚抗原(CEA)水平。之后计算了CEA在预测胃癌中的灵敏度和特异性。

a用于样品预测的平均密度计量读数临界值为：(i)正常＜21577，(ii)21577＜早期胃癌(I-II期)＜42750，(iii)晚期胃癌(III-IV期)＞42750和(iv)胃癌所有阶段＞21577。

b这包括早期和晚期胃癌样品。

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)感染是与胃癌相关的最强风险因素之一(Peek，R.M.，Jr.，Blaser，M.J.，Nature reviews 2002，2，28-37)，而胃炎在胃癌患者中也很常见。为了确定C9的诊断数值是否受到这些临床参数的影响，我们研究了是否这两组被正确预测为正常(61个中的45个)或癌症状态(58个中的48个)的样品具有不同的幽门螺杆菌或胃炎状态。统计学分析给出了阴性结果(参见表5)。这表明正常和胃癌血浆间的C9诊断数值不受到被测试对象的炎症状况或感染状况的影响。

癌胚抗原(CEA)筛检

在临床中，CEA常用作胃肠道癌的标志物(Crepaldi-Filho，R.，et al.，Arquivos de gastroenterologia 2008，45，219-224)。本研究中的CEA筛检在位于国立大学医院内的并被新加坡卫生部认可的专业医疗诊断试验室中进行。183个样品中只有总共115个(验证组中的所有61个样品和两个盲试组中随机选择的54个样品)用于CEA筛检以减少开支。CEA的参考值为＜5μg/L，所述参考值同样用于另一项研究中(Bel Hadj Hmida，Y.，et al.，LaTunisie medicale 2001，79，434-440)。所有低于参考值的样品被认为是正常。

测试两组血浆样品(包括(i)验证组的所有61个样品和(ii)随机选自用于盲试的NUH和TTSH组样品的54个血浆样品)中CEA的存在。由技术人员对这些样品进行标准化CEA分析。简单地说，使用了ADVIA CentaurCEA测试(Siemens Healthcare Diagnostics)，一种使用化学发光技术的两点夹心免疫测试法。在测试中使用两种抗体-(i)吖啶酯标记的纯化多克隆兔抗CEA抗体(Siemens ADVIA Centaur Ready Pack，Primary reagent pack，LiteReagent)和(ii)共价偶联顺磁性颗粒的单克隆小鼠抗CEA抗体(SiemensADVIA Centaur Ready Pack，Primary reagent pack，Solid Phase)。将这两种抗体和50μL的血浆样品加入到试管中并在37℃下培养7.5分钟，之后用水清洗。接着向试管中加入酸性和碱性试剂以启动化学发光反应。样品中存在的CEA含量与检测到的相对发光单位(RLUs)的量具有直接关系。本测试共持续18分钟并以全自动方式进行。诊断实验室使用的CEA参考范围为0.0至0.5μg/L。任何落到本参考范围内的读数被认为是正常。

在验证组和盲试组中的CEA的特异性均为100％，这是不足为奇的，因为之前报道过相似的观察结果(Hao，Y.，et al，Journal of proteome research2008，7，3668-3677)。然而CEA的灵敏度却很低，早期胃癌在7％至13％的范围内，晚期胃癌在18％到29％的范围内，而对于胃癌的所有阶段，CEA的灵敏度在16％到19％的范围内(参见表4C)。所得灵敏度范围与已有图表一致(Ebert，M.P.，Rocken，C.，European journal of gastroenterology &hepatology 2006，18，847-853)。

表4C

C9在区分胃癌类型上的用途

我们的研究表明95％(20个中)的弥漫型胃癌患者在血浆样品中具有高C9表达水平(图5E)。也在35个肠型胃癌患者中发现77％的高C9表达。有10个患者被诊断为弥漫型胃癌和肠型胃癌的混合型，且所有这10个患者都在血浆中具有高C9表达水平。ANOVA和回顾性统计分析表明在试图根据血浆C9表达区分弥漫型和肠型胃癌时可得到具有统计学意义的＜0.04的p值(参见表5)。本发现是临床相关的，因为相对于肠型而言，弥漫型胃癌的症状为相当非特异的，因此诊断困难并经常较晚。

表5.C9表达水平与胃癌亚型的劳伦分类和其它分析的统计相关性。在两个样品组(即盲试组中被正确判断为正常和被正确判断为癌症的样品)之间不存在幽门螺杆菌或胃炎状况的显著区别。相反，所有癌症患者的血浆样品中的C9表达被证明与劳伦分类显著相关，p值＜0.05。

a只包括那些根据其C9表达水平被正确预测为正常和癌症的样品。b由45个被正确预测为正常样品和48个被正确判断为癌症样品的样品组成。c包含20个弥漫型、35个肠型和10个弥漫型和肠型胃癌组合型的样品。d只考虑20个弥漫型和35个肠型胃癌。

通过使用包括ANOVA、卡方检验和回顾性分析的不对称和对称性分析进行统计分析。使用Windows的统计软件SPSS 16.0在5％的显著水平下进行这些分析。使用ANOVA分析研究通过免疫印迹获得的正常血浆和癌症血浆的C9表达水平间的统计学差异。使用卡方检验研究那些根据C9表达水平被正确预测为正常的和被正确预测为癌症的样品的幽门螺杆菌感染(HP+/-)和胃炎感染(+/-)状况。另一方面，使用ANOVA和回顾性分析计算C9表达水平与劳伦分类(弥漫型、肠型或两者的混合型)间的相关性。

获得来自癌症患者的单独血浆样品间的C9表达谱

在测定所有94个胃癌患者的单独血浆样品(用于验证和盲试)的C9表达时，84％的样品(79/94)表现出C9的高表达水平，所述高表达水平被定义为密度计量数值＞21577个单位(图5A)。在这些样品中，39个是早期胃癌样品(I-II期)，而55个是晚期胃癌样品(III-IV期)。分别有约77％(30/39)的早期胃癌样品和89％(49/55)的晚期胃癌样品表现出高C9表达水平(图5B和5C)。这与一份关于多发性骨髓瘤患者的报告一致，在这份报告中，多数早期和晚期患者中经典途径和替代途径被激活，而在晚期中(12个患者中的7个)末端途径(包括C5到C9)被更频繁地激活(Lugassy，G.，et al.，Leuk Lemphoma 1999，33，365-370)。

癌症患者的血浆中C9升高的可能模式-适应症与禁忌症

可以理解身体免疫系统会对癌细胞产生应答，而这导致了血液中C9蛋白产量的升高。这同样暗示了血浆中C9的过表达并不只局限于胃癌。事实上不是这样的，因为在我们的研究中，在75％的肺癌血浆样品以及在急性白血病和恶性毒瘤的血液中都观测到了高水平的C9(Lichtenfeld，J.L.，et al.，Cancer research 1976，36，3678-3680)。

与此相反，Cheng和同事报道了，相对于正常上皮细胞，在食道腺癌中存在C9基因表达的上调。在我们的研究中，我们同样检测到了相对于正常细胞系，胃癌细胞系的板中存在增加的细胞内和细胞外的C9水平(图6)。这表明C9的升高可能是癌症特异性的，而并不仅仅是免疫应答。胃癌中血浆C9水平升高的机理仍待阐明。

现有的使用免疫印迹的筛检方法昂贵、耗时、耗力、低通量，且最重要的是，会受到技术差异的影响因此最多就是半定量。为了在未来的研究中在较大样品量中验证C9用于胃癌诊断的临床应用性，应发展ELISA以实现高通量、更一致和定量的测试。

根据上述讨论，我们在来自两个独立的医院组的超过100个样品上进行的盲试得出的发现表明C9用于胃癌检测的灵敏度为78％到86％。C9对胃癌的特异性在69％到78％的范围内，低于CEA。因此，在血清中检测C9和CEA的组合测试既灵敏又具有特异性，为胃癌提供了一种非常有效的筛检方法。

由于癌症的异质性，可组合不同标志物来提高癌症检测并不奇怪。总之，C9是胃癌检测的潜在备选物。由于在我们的研究中C9水平的升高并不与胃炎相关，而可能是胃癌细胞分泌的高水平C9的结果(图6)，也可以在免疫紊乱患者，如风湿性关节炎和自身免疫疾病患者中观测到高C9血清水平(Kawachi-Takahashi，S.，et al.，International achives of allergy andapplied immunology 1975，48，161-170；Kawachi-Takahashi，S.，et al.，TheJapanese journal of experimental medicine 1974，44，845-847；Oleesky，D.A.，etal.，Clinical endocrinology 1986，25，623-632；Rumfeld，W.R.，et al.，Britishjournal of rheumatology 1986，25，266-270；Greenstein，J.D.，et al.，Clinical andexperimental immunology 1996，104，160-166)。由这些观察结果引出注意事项，即C9作为诊断标志物应被小心使用，而在解释结果时应考虑到患者，尤其是那些有免疫紊乱的患者的病史/背景。这也说明C9最适合用于有针对性的筛检，即具有胃癌高风险性的对象，且可被包括进使用分子癌症标志物进行癌症检测的组合方法中。

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在说明书中，除非上下文另有要求，“包含(comprise)”一词或变体如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”应被理解为暗示包括所述整数或整数组，而不排除任何其它整数或整数组。还需提到的是，在本公开，特别是在权利要求书和/或段落中，术语如“包含(comprise)”、“包含(comprised)、“包含(comprising)”等可具有该术语在美国专利法中被赋予的意义；如它们可以表示“包括(includes)”、“包括(included)”、“包括(includeing)”等；而术语如“基本上由……组成(consisiting essentially of)”、“基本上由……组成(consisits essentially of)”具有该术语在美国专利法中被赋予的意义，如它们包括未被明确记载的成分，但不包括现有技术中被发现或影响本发明的基本或新型特征的成分。

文中所用的所选术语的其它定义可以在本发明的详细说明书中找到并全文适用。除非另作说明，文中所用的所有其它科学和技术术语具有与本发明所属领域中的普通技术人员通常所理解的意义相同的意义。

在描述本发明时参照具体的方法和实施方式，应当理解可以在不偏离本发明的前提下作出各种改动和变化。

Claims (11)

1.能够选择性结合补体组分C9蛋白的抗体在制备用于通过以下方法检测疑似患有胃癌或处于患胃癌风险的个体中的胃癌存在的试剂盒中的用途，所述方法包含：

(a)测量获得自所述个体的合适的流体样品中的补体组分C9蛋白浓度，和

(b)将步骤(a)中测得的浓度与健康个体的补体组分C9蛋白浓度的标准数值范围相比较，

其中当获得自所述个体的补体组分C9蛋白的浓度与健康个体的补体组分C9蛋白浓度的标准数值范围相比升高时，表明可能存在胃癌。

2.权利要求1的用途，其中与健康个体的补体组分C9蛋白浓度的标准数值范围相比，所述补体C9蛋白的浓度的升高是至少三倍的升高。

3.权利要求1或2的用途，其中所述方法进一步包含以下步骤：

(c)测量获得自所述个体的合适的流体样品中的癌胚抗原蛋白浓度，和

(d)将步骤(c)中测得的浓度与健康个体中的癌胚抗原蛋白浓度的标准数值范围相比较，

其中当获得自所述个体的癌胚抗原蛋白的浓度与健康个体的癌胚抗原蛋白浓度的标准数值范围相比升高时，进一步表明可能存在胃癌。

4.权利要求3的用途，其中使用能够选择性结合癌胚抗原的抗体测量所述癌胚抗原的浓度。

5.权利要求1或2的用途，其中通过ELISA测量所述补体组分C9蛋白的浓度。

6.权利要求1或2的用途，其中所述抗体能够选择性结合包含SEQ IDNo:1或SEQ ID No:3的补体组分C9蛋白抗原。

7.权利要求3的用途，其中使用分光光度法测量所述补体组分C9蛋白和/或癌胚抗原的浓度。

8.权利要求1的用途，进一步包含表征肠型胃癌，其中与健康个体的合适的流体样品中的补体组分C9蛋白浓度的标准值相比，补体组分C9蛋白浓度3到4倍的升高表明存在肠型胃癌。

9.权利要求1的用途，进一步包含表征弥漫型胃癌，其中与健康个体的血液、血浆或血清中的补体组分C9蛋白浓度的标准值相比，补体组分C9蛋白浓度4到45倍的升高表明存在弥漫型胃癌。

10.一种试剂盒，其包含：

第一抗体，当用于在合适的流体样品中检测可能的胃癌时，所述第一抗体能够选择性结合补体组分C9蛋白；

用于检测由所述第一抗体和补体组分C9蛋白形成的复合物的试剂；

第二抗体，当用于在合适的流体样品中检测可能的胃癌时，所述第二抗体能够选择性结合癌胚抗原；和

用于检测由所述第二抗体和癌胚抗原形成的复合物的试剂。

11.权利要求10的试剂盒，其中所述第一抗体能够选择性结合包含SEQID No:1或SEQ ID No:3的补体组分C9蛋白抗原。