CN105628934B - 特定凝集素组合在制备用以鉴别肺癌类型及分期的测试载体方面的用途 - Google Patents

特定凝集素组合在制备用以鉴别肺癌类型及分期的测试载体方面的用途 Download PDF

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Abstract

本发明明确了针对血清样本，特定凝集素组合在制备用以鉴别肺癌类型的测试载体方面的用途。其中，凝集素GSL‑I和SNA的组合、凝集素HHL、WFA、WGA、PWM、LEL和MAL‑I中任意两种以上的组合、凝集素MAL‑I、PTL‑II、BPL和MAL‑II中任意两种以上的组合分别对应于小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞癌的种类鉴别。本发明还明确了另外的特定凝集素组合在制备用以鉴别相应种类肺癌分期的测试载体方面的用途。

Description

特定凝集素组合在制备用以鉴别肺癌类型及分期的测试载体 方面的用途
技术领域
本发明涉及一种基于血清糖蛋白糖型利用凝集素鉴别肺癌类型及病期的方案，具体涉及特定凝集素组合在制备用以鉴别肺癌类型及分期的测试载体方面的用途。
背景技术
原发性支气管肺癌，简称肺癌，是起源于支气管粘膜或腺体的恶性肿瘤。目前在全世界范围内因恶性肿瘤引起的死亡中，肺癌最为常见。而且，它的发生率正在以约5％的速度逐年增加，预计到2020年，因肺癌而死亡的人数将达到恶性肿瘤引起的总死亡人数的50％。
肺癌已经成为全世界各个国家亟待解决的重大健康问题和社会问题，在发展中国家尤甚。在2010年进行的全国性抽样调查显示，肺癌的死亡率已升高为30.83/10万，其中，男性为41.34/10万，女性为19.84/10万，肺癌死亡人数占肿瘤相关的总死亡人数已达到22.70％，居第1位，值得指出的是，在我国城市人口中，肺癌的死亡率为40.98/10万，居首位，且明显高于农村地区(26.93/10万)。
根据肺癌的分化程度、形态特征和生物学特点，目前将大多数肺癌分成两大类：非小细胞肺癌(Non-Small-Cell Lung Cancer，NSCLC)和小细胞肺癌(Small-Cell LungCancer，SCLC)。前者主要包括腺癌和鳞状细胞癌(简称鳞癌)。其中，腺癌发病率最高，约占肺癌的50％；鳞癌，曾经最为常见 的肺癌类型，现约占肺癌的1/3。而小细胞肺癌仅占肺癌的15％。
虽然，近年来肺癌的治疗方面已取得了长足的进步，但从总体上来说，肺癌的预后情况仍旧很不理想，非小细胞肺癌和小细胞肺癌的5年生存率仅分别为14％和4％。引起这一情况的主要原因是由于肺癌起病隐匿，早期通常无明显症状，大多数肺癌患者在确诊时已处于进展期，失去了手术治愈的机会。因此，肺癌的早期筛查和诊断对于提高肺癌患者的生存率、延长患者的生存期，都是至关重要的。
糖基化是最普遍的蛋白质翻译后修饰之一，研究发现约一半以上的哺乳动物蛋白质都发生了糖基化。糖基化作为一种重要的翻译后修饰，可以影响蛋白质的溶解度、折叠、定位及构象的维持，调节蛋白质的功能和降解；还可以介导分子与分子之间、分子与细胞之间、细胞与细胞之间的相互作用。大量研究表明，蛋白质糖基化，作为重要的翻译后修饰，在肿瘤发生、浸润、转移的过程中会发生改变并有相应的功能性作用。糖基化修饰的改变主要包括两个方面：1)多肽链上糖基化结合位点的改变；2)寡糖链结构的改变。因此，差异性表达的蛋白质糖基化亚型可以成为新型肿瘤标记物，用于肿瘤的早期诊断，还可以成为肿瘤生物靶向治疗的新靶点。
70％以上的血清蛋白质是糖基化修饰的。研究发现，在肿瘤细胞中，糖基化的加工、合成机制发生了改变，这些改变导致了异常糖基化蛋白质的产生和释放。虽然，目前糖基化改变对肿瘤的发展关系还没有一个完整的了解，但这些改变对早期诊断或作为预后的指示总是有利无弊的。现在，已经有一些研究者通过检测这些外周血中的异常糖蛋白亚型，以期寻找到更理想的肿瘤标志物。
生物芯片现已成为快速、高效、高通量取得相关信息的重要手段。随着糖生物学及糖组学研究的进展，糖芯片正发展成为糖生物学及糖组学新兴的检测工具。凝集素芯片检测样品用量少、高通量、灵敏度极高，并且可以与多种检测手段整合使用，可以快速、准确检测出待测样本中糖蛋白糖链的差异，因而可大大提生物芯片结果检测、分析的速度和效率，是一种新型的快速、高效的鉴别病症的手段。
凝集素芯片是通过固定于芯片上的凝集素探针与样品中糖蛋白糖链特异性结合，可以高通量地检测出样品中糖蛋白糖链结构和连接方式的变化，是研究糖蛋白糖链结构变化最有效的分析工具之一，其有助于发展新的诊断和监测疾病的方法。
发明内容
本发明通过大量的实验和分析，最终确立了针对血清样本的特定凝集素组合能够快速鉴别血清中糖蛋白糖链的变化，为快速、有效鉴别肺癌种类(小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞癌)以及分期提供新的检测方案，从而明确了特定凝集素组合在制备用以鉴别肺癌类型及分期的测试载体方面的用途。
本发明的技术解决方案是：
针对血清样本，凝集素GSL-I和SNA的组合在制备用以鉴别小细胞肺癌的测试载体方面的用途。
其中，测试载体上还可以设置凝集素SBA和PNA作为内参。
另外，针对血清样本，本发明还提出特定凝集素组合在制备用以鉴别小细胞肺癌分期的测试载体方面的用途，所述特定凝集素组合是以下四种组合之一：
(1)凝集素WFA和STL的组合；
(2)凝集素HHL、LCA、NPA和UEA-I的组合；
(3)凝集素LTL、LEL和DBA的组合；
(4)单独一种凝集素PHA-E；
或者是再对以上(1)至(4)的任意组合。
针对血清样本，凝集素HHL、WFA、WGA、PWM、LEL和MAL-I中任意两种以上的组合在制备用以鉴别肺腺癌的测试载体方面的用途。
其中，测试载体上还可以设置凝集素SBA和PNA作为内参。
另外，针对血清样本，本发明还提出特定凝集素组合在制备用以鉴别肺腺癌分期的测试载体方面的用途，所述特定凝集素组合是以下四种组合之一：
(1)凝集素PTL-I、ConA和PTL-II的组合；
(2)凝集素ConA和PTL-II的组合；
(3)凝集素MAL-II和SNA的组合；
(4)凝集素SNA、WFA和STL的组合；
或者是再对以上(1)至(4)的任意组合。
针对血清样本，凝集素MAL-I、PTL-II、BPL和MAL-II中任意两种以上的组合在特定凝集素组合在制备用以鉴别肺鳞癌的测试载体方面的用途。
其中，测试载体上还可以设置凝集素SBA和PNA作为内参。
另外，针对血清样本，本发明还提出特定凝集素组合在制备用以鉴别肺鳞癌分期的测试载体方面的用途，所述特定凝集素组合是以下四种组合之一：
(1)单独一种凝集素BPL；
(2)凝集素RCA120、STL和BPL的组合；
(3)凝集素SJA和PSA的组合；
(4)凝集素SJA和NPA的组合；
或者是再对以上(1)至(4)的任意组合。
上述测试载体可以是凝集素芯片、酶标板、磁粒、琼脂糖等。
以凝集素芯片的固定为例：
凝集素芯片是将各种不同来源的凝集素固定于醛基化、环氧化或经其他方式修饰后的玻璃片基上，再与标记后的糖蛋白、菌体、细胞等待检测样品反应，以检测待检测样品的糖链结构。
以环氧化磁粒为例：
合成Fe3O4磁性微粒，然后用硅烷化试剂修饰磁性微粒制备得到环氧化磁性微粒。合成的环氧化磁性微粒被应用于凝集素等蛋白的固定化。
基于以上方案，还可以以上述特定凝集素组合为单元再进行组合，制备包含凝集素种类更多的测试载体。例如，在一个凝集素芯片上固定以上所提到的所有凝集素，则能够一次确定肺癌类型及其分期。这类方案自然也是属于本申请的保护范围的。
本发明具有以下技术效果：
基于本发明，可以制备凝集素芯片、酶标板等测试载体，快速、有效鉴别肺癌类型(小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞癌)及其分期，且检测操作简单、成本可控。
附图说明
图1为凝集素芯片上凝集素探针布局图；
图2为凝集素芯片结果扫描图，具体有健康志愿者(HV)，肺部良性病变(BLD)患者，小细胞肺癌局限期(SCLC-LS)患者，小细胞肺癌广泛期(SCLC-ES)患者，肺鳞癌早期(SCC-ES)患者，肺鳞癌晚期(SCC-AS)患者，肺腺癌早期(ADC-ES)患者及肺腺癌晚期(ADC-AS)患者血清蛋白凝集素芯片荧光检测结果。
具体实施方式
以下主要介绍本发明在研究过程中的重点过程。
1、实验部分
1.1试剂与材料
甘氨酸，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，吐温-20和蛋白酶抑制剂均购自美国Sigma-Aldrich公司。牛血清白蛋白(BSA)购自德国Merck公司。Cy3荧光均购自美国Amerhsma公司。其他化学试剂均为分析纯级别，在使用前没有经过进一步纯化。所有实验用水都为经Milli-Q50纯水系统(美国Millipore公司)处理的超纯水。Sephadex G-25柱脱盐购自美国GE Healthcare公司。芯片杂交盒购自美国Bio-Rad伯乐公司。其它常见玻璃器皿均为国产。37种凝集素(具体名称见表1)分别购自Sigma-Aldrich公司、德国Vector公司。
表1 凝集素名称及其特异识别糖链
1.2实验仪器
电热鼓风干燥箱：天津泰斯特公司；高压灭菌锅：日本TOMY公司；超速冷冻离心机5804R：德国Eppendorf公司；微量核酸蛋白测定仪：德国Implen公司；生物芯片扫描仪4000B：美国Axon公司；芯片点样仪：博奥晶芯SmartArrayer48点样仪；芯片杂交箱HL-2000：美国UVP公司。
1.3研究人群和全血清采集
该实验获得西安交通大学第一附属医院和西北大学伦理委员会及样本提供者同意。符合条件的肺部良性病变、肺癌患者不能同时罹患其它疾病，48h内没有服用任何药物。医院专业人员采集肺部良性病变、肺癌患者和健康志愿者新鲜血液各数例(表2)。全血收集后静置于室温下15-30min，待自然凝结后，在冷冻离心机中1000-2000g离心l0min后取上清，即为血清。将血清立刻分装入干净无菌的0.5mL离心管中-20℃以下冻存。血清不可有溶血现象，也避免反复冻融。
表2 肺部良性病变患者、肺腺癌患者、肺鳞癌患者情况表
1.4血清混合及荧光标记
为了消除个体差异带来的影响并归一化个体样本，本研究中，按照健康志愿者、肺部良性病变、小细胞肺癌局限期、小细胞肺癌广泛期、肺腺癌早期、肺腺癌晚期、肺鳞癌早期和肺鳞癌晚期进行分组，每例样本取10μL进行混合，然后用Brandford法蛋白定量。混合样本经Cy3荧光染料标记后用Sephadex G-25除盐柱去掉游离荧光。标记好的蛋白准备用于凝集素芯片孵育。个例样本用于血清芯片的点制。
1.5凝集素芯片和数据分析
1.51凝集素芯片的制备
将玻片用无水乙醇清洗三次，每次10min。离心机中甩干玻片。浸泡入250mL 10％NaOH溶液中，避光，摇床上反应12h后超声15min。然后用超纯水清洗四次，每次2min，无水乙醇清洗两次，每次2min。甩干。再将玻片浸泡到200mL 10％GPTS溶液中，避光，摇床上孵育反应3h，对玻片进行环氧化修饰。超声清洗15min，无水乙醇清洗三次，每次10min。甩干后将玻片置于37℃真空干燥箱中，干燥3h。最后将环氧化玻片放置于室温干燥器中保存备用。
设计凝集素芯片矩阵(图1)，选用1mg/mL BSA作阴性质控，Cy3荧光染料标记的BSA作位置标记，与37种凝集素共同构成12×10矩阵，每种凝集素重复点样3次，每张芯片上重复4个矩阵。在384孔板中按矩阵设计顺序依次加入配制好的点样液，使用博奥晶芯48点样仪的针点系统，在环氧修饰片基上点制芯片。在室温且湿度为55％～65％的环境中孵育6h后，37℃真空干燥芯片，使凝集素固定于芯片上。将制备好的凝集素芯片放置于4℃ 干燥器，避光保存，备用。
1.52凝集素芯片的孵育及数据分析
(1)凝集素芯片的封闭
将点制好的凝集素芯片从4℃干燥器中取出，回温。首先用PBST、PBS各清洗玻片一次，每次5min，离心甩干。将凝集素芯片与700μl封闭缓冲液在芯片杂交盒中孵育，25℃旋转反应1h。封闭结束后用PBST、PBS各清洗玻片两次，每次5min，甩干。用Genepix4000B芯片扫描仪扫描封闭后芯片，检查封闭效果。
(2)血清样本的凝集素芯片检测
将荧光标记的血清蛋白5μg与孵育缓冲液混匀(比例约1：9)，并在盖玻片均匀加入700μl，盖上封闭后的凝集素芯片，于芯片杂交仪中25℃避光旋转孵育3h。孵育结束后用PBST、PBS各清洗玻片两次，每次5min，离心甩干。
(3)数据的扫描与分析
使用Genepix4000B芯片扫描仪扫描芯片，GenePix3.0软件从芯片扫描结果图圈点分析后，导出GPR文件，根据其中的数据信息进行分析。原始数据中小于两倍背景标准偏差的值去掉，每张芯片上每个样本九个重复点的有效值再取平均值(AS)，每组平均值表示为组内每个样本平均值(AS)的均值(AG)±标准偏差(SDG)。
2、结果部分
2.1小细胞肺癌局限期及广泛期血清糖蛋白糖链的变化
利用凝集素芯片分别对健康志愿者、肺部良性病变患者、小细胞肺癌局 限期及广泛期患者血清进行检测，通过专业软件获取芯片数据并归一化处理后，首先将两组肺癌结果分别与健康组和良性病变组结果进行比较，即每个凝集素对应的归一化后荧光强度(NFI)在小细胞肺癌局限期组(SCLC-LS)和小细胞肺癌广泛期组(SCLC-ES)分别比健康志愿者组(HV)和肺部良性病变患者组(BLD)得到Fold-change值。我们认为Fold-change>1.5和Fold-change<0.67为肺病患者相较于健康人和肺部良性病变患者在血清中上调和下调表达的糖蛋白糖链。结果如下：
(1)37种不同的凝集素对各组血清糖蛋白糖链均有不同程度的识别，说明在小细胞肺癌发生发展的过程中，血清中的糖蛋白糖链均发生了变化。
(2)相对于健康志愿者，分别有5种和7种凝集素识别的糖链在SCLC-LS和SCLC-ES患者血清中差异表达；相对于肺部良性病变患者，分别有9种和7种凝集素识别的糖链在SCLC-LS和SCLC-ES患者血清中差异表达。(表3和图2)其中多数属于甘露糖型的糖链、唾液酸化的糖链和半乳糖型的糖链，说明甘露糖型的糖链、唾液酸化的糖链和半乳糖型的糖链在小细胞肺癌发生发展过程中，其表达发生着显著的变化。
表3：小细胞肺癌局限期及广泛期患者血清糖蛋白糖链谱的表达
表中数据表示该组的凝集素芯片结果中每个凝集素对应NFI相对于对照组NFI的Fold-change值。HV，健康志愿者；BLD，肺部良性病变；SCLC-LS，小细胞肺癌局限期；SCLC-ES，小细胞肺癌广泛期；―，无显著差异。2.2腺癌早期及晚期血清糖蛋白糖链的变化
利用凝集素芯片分别对健康志愿者、肺部良性疾病患者、腺癌早期及晚期患者血清进行检测，通过专业软件获取芯片数据并归一化处理后，首先将三组肺病结果与健康组结果进行比较，即每个凝集素对应的归一化后荧光强度(NFI)在腺癌早期组(ADC-ES)和腺癌晚期组(ADC-AS)分别比健康志愿者组(HV)和肺部良性病变患者组(BLD)得到Fold-change值。我们认为Fold-change>1.5和Fold-change<0.67为肺病患者相较于健康人和肺部良性病变患者在血清中上调和下调表达的糖蛋白糖链。
结果如下：
(1)37种不同的凝集素对各组血清糖蛋白糖链均有不同程度的识别，说明在腺癌发生发展的过程中，血清中的糖蛋白糖链均发生了变化。
(2)相对于健康志愿者，分别有16种和16种凝集素识别的糖链在ADC-ES和ADC-AS患者血清中差异表达；相对于肺部良性病变患者，分别有13种和14种凝集素识别的糖链在ADC-ES和ADC-AS患者血清中差异表达。(表4和图2)其中多数属于岩藻糖化的糖链、唾液酸化的糖链、半乳糖型糖链和甘露糖型糖链，说明岩藻糖化的糖链、唾液酸化的糖链、半乳糖型糖链和甘露糖型糖链识别的糖结合蛋白在肺腺癌发生发展过程中，其表达发生着显著的变化。
表4：腺癌早期及晚期患者血清糖蛋白糖链谱的表达
表中数据表示该组的凝集素芯片结果中每个凝集素对应NFI相对于对照组NFI的Fold-change值。HV，健康志愿者；BLD，肺部良性病变；ADC-ES，腺癌早期；ADC-AS，腺癌晚期；―，无显著差异。
2.3鳞癌早期及晚期血清糖蛋白糖链的变化
利用凝集素芯片分别对健康志愿者、肺部良性疾病患者、鳞癌早期及晚期患者血清进行检测，通过专业软件获取芯片数据并归一化处理后，首先将三组肺病结果与健康组结果进行比较，即每个凝集素对应的归一化后荧光强度(NFI)在腺癌早期组(SCC-ES)和腺癌晚期组(SCC-AS)分别比健康志愿者组(HV)和肺部良性病变患者组(BLD)得到Fold-change值。我们认为Fold-change>1.5和Fold-change<0.67为肺病患者相较于健康人和肺部良性病变患者在血清中上调和下调表达的糖蛋白糖链。
结果如下：
(1)37种不同的凝集素对各组血清糖蛋白糖链均有不同程度的识别，说明在鳞癌发生发展的过程中，血清中的糖蛋白糖链均发生了变化。
(2)相对于健康志愿者，分别有11种和13种凝集素识别的糖链在SCC-ES和SCC-AS患者血清中差异表达；相对于肺部良性病变患者，分别有9种和11种凝集素识别的糖链在SCC-ES和SCC-AS患者血清中差异表达。(表5和图2)其中多数属于岩藻糖化的糖链、唾液酸化的糖链、半乳糖型糖链和甘露糖型糖链，说明岩藻糖化的糖链、唾液酸化的糖链、半乳糖型糖链和甘露糖型糖链识别的糖结合蛋白在肺鳞癌发生发展过程中，其表达发生着显著的变化。
表5：鳞癌早期及晚期患者血清糖蛋白糖链谱的表达
表中数据表示该组的凝集素芯片结果中每个凝集素对应NFI相对于对照组NFI的Fold-change值。HV，健康志愿者；BLD，肺部良性病变；SCC-ES，鳞癌早期；SCC-AS，鳞癌晚期；―，无显著差异。
经过对表3，表4，表5中数据的筛选，选定凝集素SBA、PNA为内参(在任意两组的样本比较中，ratio值均介于0.78-1.3之间，认为该凝集素所识别的糖链在)设计了一套用于鉴别肺癌种类及分期的凝集素探针组合。
本发明糖探针筛选的结果，参见表6、表7和表8：
表6 鉴别小细胞肺癌及分期的凝集素探针组合
表7 鉴别肺腺癌及分期的凝集素探针组合
表8 鉴别肺鳞癌及分期的凝集素探针组合
HV，健康志愿者；BLD，肺部良性病变；SCLC：小细胞肺癌，SCLC-LS：小细胞肺癌局限期，SCLC-ES，小细胞肺癌广泛期；ADC：腺癌，ADC-ES：腺癌早期，ADC-AS，腺癌晚期；SCC：鳞癌，SCC-ES：鳞癌早期，SCC-AS：鳞癌晚期；↑，表达上调；↓，表达下调；\，不作为指示探针；―：无显著差异。

Claims (2)

1.特定凝集素组合在制备用以鉴别小细胞肺癌的测试载体方面的用途，针对血清样本，其特征在于：所述特定凝集素组合是凝集素GSL-I和SNA的组合。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述特定凝集素组合还包含有凝集素SBA和PNA作为内参。
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