CN109239363A - 一种凝集素探针组合在基于尿蛋白糖型鉴别秦岭川金丝猴性别方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种凝集素探针组合在基于尿蛋白糖型鉴别秦岭川金丝猴性别方面的应用。该凝集素探针组合是PNA、VVA、BPL、AAL和PTL‑I的组合；若样本检测结果为PNA、VVA表达下调，且BPL、AAL和PTL‑I表达上调，则表明相应主体为雌性的秦岭川金丝猴；反之，则为雄性的秦岭川金丝猴。利用本发明对秦岭川金丝猴性别进行鉴别，快速、简便、准确，实现成本较低。

Description

一种凝集素探针组合在基于尿蛋白糖型鉴别秦岭川金丝猴性 别方面的应用

技术领域

本发明涉及一种鉴别秦岭川金丝猴(成年)性别的方法。

背景技术

为了提高家畜的生产力，哺乳动物性别控制成为畜牧研究中的重要内容，人们往往希望产生预期性别的动物，从而促进动物遗传育种技术的进步，加强如伴性疾病的防治，更好的利用资源，从而服务于人类自身。而在野生动物的研究中，性比是动物种群生态学研究的基本内容之一，是动物种群中，雌雄性动物存在的个体比例对于揭示种群结构起着重要的作用。然而，在实际野生动物保护研究中，对于很多动物，我们都很难做到近距离观察，学者们探索出了多种间接研究种群性别结构的方法，也不断在发展多种性别鉴定的方法。

随着分子遗传学，发育生物学及相关学科的发展，早期的性别鉴定方法有：X-相关酶法鉴定、染色体核型分析、H-Y抗原检测法，但因采集方法，评价的主观性，使胚胎鉴定结果尚不稳定。目前，随着分子生物技术的快速发展，应用DNA样品进行PCR反应鉴定性别最普遍的方法。

金丝猴属于灵长类疣猴亚科仰鼻猴属，川金丝猴(Rhinopithecusroxellana)是金丝猴的指名亚种，为中国的特有物种，属国家I级重点保护动物。作为珍稀濒危灵长类，国内外各大动物园都有饲养，通过繁育扩大种群数量，从而将濒危物种就地保护或者迁移到合适的环境中，也为濒危物种野外放归提供可能。川金丝猴在幼年及青年仍不能从肉眼上明显分出性别，如能以金丝猴为例，尽早判断出性别，将对野生动物饲养有极大帮助。

糖基化是最普遍的蛋白质翻译后修饰之一，研究发现约一半以上的哺乳动物蛋白质都发生了糖基化。糖基化作为一种重要的翻译后修饰，可以影响蛋白质的溶解度、折叠、定位及构象的维持，调节蛋白质的功能和降解；还可以介导分子与分子之间、分子与细胞之间、细胞与细胞之间的相互作用，参与几乎所有的生命过程。尿液由于蛋白质成分相对简单，而尿液糖蛋白质组学的研究由于能够有效地去除非糖基化修饰的白蛋白，能够在尿液中糖基化寻找到更多有意义的低丰度糖蛋白，因此在对人的生理变化、疾病诊断当中发挥更大的作用。修饰的改变主要包括两个方面：1)多肽链上糖基化结合位点的改变；2)寡糖链结构的改变。已有研究发现，在人类血清、唾液、尿液中的糖链在男性与女性中均有所不同，但目前还没有得出足够完整、明晰的糖链分布信息。

生物芯片现已成为快速、高效、高通量取得相关信息的重要手段。随着糖生物学及糖组学研究的进展，糖芯片正发展成为糖生物学及糖组学新兴的检测工具。凝集素芯片检测样品用量少、高通量、灵敏度极高，并且可以与多种检测手段整合使用，可以快速、准确检测出待测样本中糖蛋白糖链的差异，因而可大大提生物芯片结果检测、分析的速度和效率。

凝集素芯片是通过固定于芯片上的凝集素探针与样品中糖蛋白糖链特异性结合，可以高通量地检测出样品中糖蛋白糖链结构和连接方式的变化，是研究糖蛋白糖链结构变化最有效的分析工具之一。

发明内容

本发明的目的在于获得一种简便、准确的鉴别秦岭川金丝猴性别的方法。申请人通过对秦岭川金丝猴的尿液糖蛋白糖链进行大量的分析、实验，提出了一种特定凝集素探针组合，可快速鉴别尿液中糖蛋白糖链的变化，以此有效鉴别秦岭川金丝猴的性别。

该特定凝集素探针组合是PNA、VVA、BPL、AAL和PTL-I的组合。当样本检测结果为PNA、VVA表达下调，且BPL、AAL和PTL-I表达上调，则表明相应主体为雌性的秦岭川金丝猴；反之，则为雄性的秦岭川金丝猴。

该凝集素探针组合可用于制备基于尿蛋白糖型鉴别秦岭川金丝猴性别的试剂盒，试剂盒中的凝集素芯片上点制有上述凝集素探针组合。

进一步的，凝集素芯片上可以增加凝集素WGA和ACA作为内参。

利用该凝集素探针组合，基于尿蛋白糖型鉴别秦岭川金丝猴性别的方法，包括以下步骤：

1)取待检秦岭川金丝猴尿液样本，进行蛋白质富集、荧光标记；

2)取凝集素芯片，并利用封闭缓冲液对其完成封闭；所述凝集素芯片至少点制有以下五种凝集素：PNA、VVA、BPL、AAL和PTL-I；

3)将荧光标记的尿液蛋白与孵育缓冲液混匀，然后与凝集素芯片完成孵育；

4)扫描凝集素芯片，分析得出对应于所述五种凝集素的糖链表达是否发生显著变化：若样本检测结果为PNA、VVA表达下调，且BPL、AAL和PTL-I表达上调，则表明相应主体为雌性；反之，则为雄性。

本发明的优点：

对于秦岭川金丝猴性别的鉴别，快速、简便、准确，实现成本较低。

附图说明

图1为凝集素芯片上凝集素探针布局图；

图2为川金丝猴雌性(F)和雄性(M)的尿液蛋白凝集素芯片荧光检测结果；其中，对应于表2中的编号，1-6为妊娠成年雌性(P)，7-9为非妊娠成年雌性(NP)，10-12为成年雄性。

具体实施方式

1、实验部分

1.1试剂与材料

甘氨酸，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，吐温-20和蛋白酶抑制剂均购自美国Sigma-Aldrich公司。牛血清白蛋白(BSA)购自德国Merck公司。Cy3荧光均购自美国Amerhsma公司。其他化学试剂均为分析纯级别，在使用前没有经过进一步纯化。所有实验用水都为经Milli-Q50纯水系统(美国Millipore公司)处理的超纯水。Sephadex G-25柱脱盐购自美国GE Healthcare公司。芯片杂交盒购自美国Bio-Rad伯乐公司。其它常见玻璃器皿均为国产。37种凝集素(具体名称见表1)分别购自Sigma-Aldrich公司、德国Vector公司。

表1:凝集素名称及其特异识别糖链

1.2实验仪器

电热鼓风干燥箱：天津泰斯特公司；高压灭菌锅：日本TOMY公司；超速冷冻离心机5804R：德国Eppendorf公司；微量核酸蛋白测定仪：德国Implen公司；生物芯片扫描仪4000B：美国Axon公司；芯片点样仪：博奥晶芯SmartArrayer48点样仪；芯片杂交箱HL-2000：美国UVP公司。

1.3研究对象和尿液采集

该实验获得陕西省珍稀野生动物抢救饲养中心的支持，成年雌性金丝猴在5岁以上，成年雄性金丝猴在8岁以上，收集尿液各数例(表2)。

表2:成年雌性、成年雄性情况表

1.4尿液混合及荧光标记

为了消除采集时间上的差异，取相同个体不同时间收集的样品进行混样。其中，10号样本因为样本量过少，为保证蛋白浓度，将等量样本(取自三个不同的个体)进行混合，用3KD分子筛滤过样本进行蛋白质富集，然后用BCA法蛋白定量。混合样本经Cy3荧光染料标记后用Sephadex G-25除盐柱去掉游离荧光。标记好的蛋白准备用于凝集素芯片孵育。

1.5凝集素芯片和数据分析

1.51凝集素芯片的制备

将玻片用无水乙醇清洗三次，每次10min。离心机中甩干玻片。浸泡入250mL10％NaOH溶液中，避光，摇床上反应12h后超声15min。然后用超纯水清洗四次，每次2min，无水乙醇清洗两次，每次2min。甩干。再将玻片浸泡到200mL 10％GPTS溶液中，避光，摇床上孵育反应3h，对玻片进行环氧化修饰。超声清洗15min，无水乙醇清洗三次，每次10min。甩干后将玻片置于37℃真空干燥箱中，干燥3h。最后将环氧化玻片放置于室温干燥器中保存备用。

设计凝集素芯片矩阵(图1)，选用1mg/mL BSA作阴性质控，Cy3荧光染料标记的BSA作位置标记，与37种凝集素共同构成12×10矩阵，每种凝集素重复点样3次，每张芯片上重复4个矩阵。在384孔板中按矩阵设计顺序依次加入配制好的点样液，使用博奥晶芯48点样仪的针点系统，在环氧修饰片基上点制芯片。在室温且湿度为55％～65％的环境中孵育6h后，37℃真空干燥芯片，使凝集素固定于芯片上。将制备好的凝集素芯片放置于4℃干燥器，避光保存，备用。

1.52凝集素芯片的孵育及数据分析

(1)凝集素芯片的封闭

将点制好的凝集素芯片从4℃干燥器中取出，回温。首先用PBST、PBS各清洗玻片一次，每次5min，离心甩干。将凝集素芯片与700μl封闭缓冲液在芯片杂交盒中孵育，25℃旋转反应1h。封闭结束后用PBST、PBS各清洗玻片两次，每次5min，甩干。用Genepix4000B芯片扫描仪扫描封闭后芯片，检查封闭效果。

(2)尿液样本的凝集素芯片检测

将荧光标记的尿液蛋白5μg与孵育缓冲液混匀(比例约1:9)，并在盖玻片均匀加入700μl，盖上封闭后的凝集素芯片，于芯片杂交仪中25℃避光旋转孵育3h。孵育结束后用PBST、PBS各清洗玻片两次，每次5min，离心甩干。

(3)数据的扫描与分析

使用Genepix4000B芯片扫描仪扫描芯片，GenePix7.0软件从芯片扫描结果图圈点分析后，导出GPR文件，根据其中的数据信息进行分析。原始数据中小于一倍背景标准偏差的值去掉，每张芯片上每个样本三个重复点的有效值再取平均值(AS)，每组平均值表示为组内每个样本平均值(AS)的均值(AG)±标准偏差(SDG)。

2、结果部分

2.2雌雄和雄性尿液糖蛋白糖链的变化

利用凝集素芯片分别对成年雌性川金丝猴及成年雄性川金丝猴尿液进行检测，通过专业软件获取芯片数据并归一化处理后，将两组结果进行比较，即每个凝集素对应的归一化后荧光强度(NFI)在成年雌性比成年雄性组得到Fold-change值。我们认为Fold-change>2和Fold-change<0.5为成年雌性相较于成年雄性在尿液中高表达和低调表达的糖蛋白糖链。

结果如表3所示：

(1)37种不同的凝集素对各组血清糖蛋白糖链均有不同程度的识别，说明在成年雌性和雄性尿液中，糖蛋白糖链有差异。

(2)相对于雌性，7种凝集素识别的糖链在雄性尿液中有显著性差异表达，其中多数属于半乳糖型。

表3：成年雌性与雄性川金丝猴尿液糖蛋白糖链谱的表达

表中数据表示凝集素芯片结果中凝集素对应雌性NFI相对雄性NFI的Fold-change值大于2小于0.5。F为所有雌性，M为所有雄性；—，无显著性差异。

因研究对象珍稀，样本不易采集；基于以上分析结果，申请人后期还在秦岭野外进行了多次个体采集、检测，通过一定时间的观察验证，均与表3结果相符。

经过对表中数据的筛选，选定NFI的Fold change大于2.3，小于0.5的凝集素作为探针，WGA、ACA为内参(在两组的样本比较中，ratio值介于1.00-1.11之间，认为该凝集素所识别的糖链在两组样本中无差异)设计了一套用于鉴别雌雄的凝集素探针组合。

表4:鉴别雌雄的凝集素探针组合

F,雌性川金丝猴；M，雄性川金丝猴；↑，雌性相对于雄性表达上调；↓，雌性相对于雄性表达下调；―：无显著差异。

利用本发明给出的凝集素探针组合，在实际对个体进行检测时，可预先给出以上五种凝集素表达水平的参考阈值，或者选取已知性别金丝猴的样本作为对照样本，来判定表达上调、下调情况。

雌性金丝猴的样本参考荧光信号值如下：

雌性上调：BPL0.046169；AAL0；PTL-I0.007523；

雌性下调：PNA0.008125；VVA0.085679。

Claims (4)

1.一种凝集素探针组合在基于尿蛋白糖型鉴别秦岭川金丝猴性别方面的应用，其特征在于：凝集素探针组合是PNA、VVA、BPL、AAL和PTL-I的组合；若样本检测结果为PNA、VVA表达下调，且BPL、AAL和PTL-I表达上调，则表明相应主体为雌性的秦岭川金丝猴；反之，则为雄性的秦岭川金丝猴。

2.权利要求1中所述的凝集素探针组合在制备基于尿蛋白糖型鉴别秦岭川金丝猴性别的试剂盒的用途，试剂盒中的凝集素芯片上点制有所述凝集素探针组合。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述凝集素芯片上还点制有凝集素WGA和ACA，作为内参。

4.一种基于尿蛋白糖型鉴别秦岭川金丝猴性别的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)取待检秦岭川金丝猴尿液样本，进行蛋白质富集、荧光标记；

2)取凝集素芯片，并利用封闭缓冲液对其完成封闭；所述凝集素芯片至少点制有以下五种凝集素：PNA、VVA、BPL、AAL和PTL-I；

3)将荧光标记的尿液蛋白与孵育缓冲液混匀，然后与凝集素芯片完成孵育；

4)扫描凝集素芯片，分析得出对应于所述五种凝集素的糖链表达是否发生显著变化：若样本检测结果为PNA、VVA表达下调，且BPL、AAL和PTL-I表达上调，则表明相应主体为雌性；反之，则为雄性。