CN105929162B - 一种基于唾液蛋白鉴别乳腺癌的凝集素芯片和试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

一种基于唾液蛋白鉴别乳腺癌的凝集素芯片和试剂盒及其应用，涉及一种用于甄别癌症的凝集素芯片，具体涉及一种基于蛋白鉴别乳腺癌的凝集素芯片和试剂盒及其应用。目的在于提供一种非损伤，通过唾液中糖链变化来鉴别乳腺癌的凝集素芯片和试剂盒及其应用。该基于唾液蛋白鉴别乳腺癌的凝集素芯片，包括测试凝集素探针组，所述测试凝集素探针组至少包括PHA‑E+L、LTL、BS‑I、MAL‑I、LCA、BPL、PTL‑II、NPA、GSL‑I的组合或者至少包括LTL、BS‑I、MAL‑I、LCA、BPL、NPA、GSL‑I的组合。该凝集素芯片可以快速检测出患者唾液样品中差异性表达的糖蛋白糖链结构，确定对应的人群是否患有乳腺肿瘤，并确定是否为乳腺癌；此外，本发明中采用唾液作为待检测物，其采集简便易行，避免了现有通过血清采集样本进行检测存在的健康风险。

Description

一种基于唾液蛋白鉴别乳腺癌的凝集素芯片和试剂盒及其 应用

技术领域

本发明涉及一种用于甄别癌症的凝集素芯片，具体涉及一种基于蛋白鉴别乳腺癌的凝集素芯片及其试剂盒。

背景技术

乳腺癌是全球范围内最常见的一类恶性肿瘤，严重危害女性身心健康。近年来，我国乳腺癌发病呈现明显上升趋势，IARC预计，我国女性乳腺癌患者于2030年可达234,000例，且死亡率较2008年将增长47.94%，由于发病率的不断攀升、发病年龄的年轻化以及发病形式的多样化，乳腺癌筛查、诊断和治疗方面的进展一直备受关注。在欧美乳腺癌高发地区，其死亡率的降低一定程度上得益于基于影像学检测手段的女性高危人群普查，更多的乳腺癌患者在发病早期被发现并得到及时有效的治疗，但钼靶乳腺X线摄影并非最为精准和经济的早期筛查方法，仍有约11%的患者无法被检出，特别是乳腺密度较高的女性患者；另一方面，我国人口基数庞大、地区差异明显，采用更为无创、简便、经济的方法进行早期筛查和诊断将是我国乳腺癌防控的重点。

随着医学技术的迅速发展，人们不仅可通过组织活检对肿瘤进行诊断，还实现了依据血清、尿液等体液中的生物指标对疾病进行检测、监测和评估，使人们意识到采用更为简便的方法检测疾病的可能性。唾液作为一种来源于口腔唾液腺体的外分泌液，包含多种电解质和蛋白成分，当机体状况出现变化时，唾液的流率和内容成分的种类和浓度也会发生改变。已有研究发现，同健康女性唾液相比，乳腺癌患者唾液中可检测到不同浓度的HER2，VEGF和EGF蛋白等具有乳腺癌诊断潜能的血清标志物。同时，作为一种易采集、安全无创的临床样本，唾液中疾病特异性的标志物在头颈癌、口腔癌、龋病、糖尿病、自身免疫性疾病等领域也得到了广泛关注和应用。

糖生物学在癌症相关研究中备受关注。细胞中，糖以单糖或寡聚糖的形式存在，寡糖链既是糖复合物（糖蛋白、糖脂等）的重要组成部分，同时也发挥着重要的生物学功能。作为一种翻译后修饰，蛋白质糖基化最为人们所了解，研究表明，70%的人类蛋白质含有一个或多个糖链，这些糖链由甘露糖、半乳糖及N-乙酰葡糖胺等十几种单糖组成，经不同糖基转移酶、糖苷酶及磺基转移酶的催化以不同的连接方式可构成庞大的糖链谱。相较于蛋白质和脂质部分，糖链的改变往往是对机体状态变化更灵敏的应答，因此研究糖复合物糖基化将有望提高标志物的特异性与灵敏度，为癌症早期发现、诊断、预后及耐药性监测提供新的方法，而肝细胞癌中岩藻糖基化的甲胎蛋白（Alpha-fetoprotein, AFP）的临床应用是最成功的案例。

近十年间，大量文献报道：未成熟的MUC型O-糖链、Lewis糖抗原在乳腺癌癌细胞表面被发现；乳腺癌患者血清中蛋白质糖基化修饰存在差异，具体表现为增多的MUC型O-糖链、含多聚N-乙酰乳糖胺(poly-LacNAc)结构的糖链、分支型N-糖链，减少的β1-4GlcNAc等分型和拥有LacdiNAc末端结构的复杂型N-糖链，以及糖链岩藻糖基化、唾液酸化修饰增加等；且这些糖基化的改变与某些临床病理学参数（如肿瘤大小、淋巴结转移等）存在相关性。但以上研究均以组织或血清作为样本，人们对唾液中蛋白质糖基化水平的变化知之甚少，且尚未被应用于乳腺癌女性患者的早期筛查。凝集素是一类糖结合蛋白，其可识别不同的糖链结构并以多价形式与这些糖链特异性结合。通过将凝集素探针固定于经环氧化修饰的固体片基上制成凝集素芯片，凭借生物芯片便捷、快速和高通量的优势，人们便可获得临床样本中糖复合物糖基化相关信息，发现与疾病特异性相关的差异性表达的糖链。基于凝集素芯片技术对健康女性、乳腺疾病包括乳腺癌患者唾液中蛋白质糖基化进行分析，将有助于构建新的乳腺癌筛查、诊断方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种非损伤，通过唾液中糖链变化来鉴别乳腺癌的凝集素芯片和试剂盒及其应用。

本发明提供一种基于唾液蛋白鉴别乳腺癌的凝集素芯片，包括测试凝集素探针组，所述测试凝集素探针组至少包括PHA-E+L、LTL、BS-I、MAL-I、LCA、BPL、PTL-II、NPA、GSL-I的组合或者至少包括LTL、BS-I、MAL-I、LCA、BPL、NPA、GSL-I的组合。

本发明还提供利用上述凝集素探针制备得到的试剂盒。

进一步地，本发明还提供利用上述凝集素探针制备得到的试剂盒的应用方法，选定对照组，将待检测样本的凝集素芯片结果同对照组的凝集素芯片结果进行对比，得到每种凝集素的Fold-change值，以Fold-change>1.5和Fold-change<0.67作为选择标准，Fold-change>1.5为上调糖链，Fold-change<0.67为下调糖链，筛选出表达上调和下调的糖链组合。

选定的对照组为采集健康人群或良性乳腺肿瘤患者的唾液，并对其处理和荧光标记后得到的凝集素芯片结果。

当以健康人群样本为对照组，待测样本的凝集素芯片与对照组对比，当PHA-E+L上调，LTL、NPA下调，同时BS-I、MAL-I、LCA、BPL、PTL-II、GSL-I无变化，则为良性乳腺肿瘤样本；

当PHA-E+L、BS-I、LCA上调，LTL、MAL-I、BPL、PTL-II、NPA下调，同时GSL-I无变化，则为乳腺癌I期样本；

当PHA-E+L、BS-I上调，LTL、MAL-I下调，同时LCA、BPL、PTL-II、NPA、GSL-I都无变化，则为乳腺癌II期样本。

以良性乳腺纤维瘤样本为对照组，将待测样本的凝集素芯片与对照组对比，当LTL、GSL-I无变化，BS-I、LCA上调，同时MAL-I、BPL、NPA下调，则为乳腺癌I期样本；

当LTL、MAL-I下调，同时BS-I、LCA、BPL、NPA、GSL-I都无变化，则为乳腺癌II期样本。

上述方法中凝集素芯片的制备为现有常规方法，其步骤包括唾液采集，唾液蛋白处理和荧光标记，凝集素芯片及其数据分析，凝集素印记及其数据分析和唾液芯片及其数据分析。

本发明还提供上述凝集素探针在鉴别女性乳腺癌上的应用。

进一步地，本发明还提供上述试剂盒在鉴别女性乳腺癌上的应用。

本发明具有如下有益效果：

本发明将特定的凝集素探针固定于固体片基上，通过凝集素与女性唾液中糖蛋白糖链特异性结合，可以快速检测出患者唾液样品中差异性表达的糖蛋白糖链结构，确定对应的人群是否患有乳腺肿瘤，并确定是否为乳腺癌；此外，本发明中采用唾液作为待检测物，其采集简便易行，避免了现有通过血清采集样本进行检测存在的健康风险。

附图说明

图1为凝集素芯片点样阵列图及应用于糖蛋白糖链的荧光检测图，图中A为凝集素芯片点样阵列图，包括健康女性（HC）、良性乳腺肿瘤女性患者（B）、乳腺癌I期女性患者（BC-I）及乳腺癌II期女性患者（BC-II）混合唾液糖蛋白糖链荧光检测结果图；

图2和图3为HC、B、BC-I、BC-II混合唾液糖蛋白糖链荧光信号归一化数据图；

图4为验证结果图，图中A为凝集素MAL-I的lectin blotting图， B左侧为唾液芯片矩阵设计图，中间为凝集素LCA与唾液芯片结合的荧光检测结果图，右侧为对应HC、B、BC-I、BC-II唾液结合强度比较。

具体实施方式

下面通过给出的具体实施例对本发明做进一步说明，但不作为对本发明的限定。

本发明从37种凝集素（如表1所示）中筛选用于甄别乳腺癌女性患者的凝集素探针。

表1

本发明中使用的试剂材料包括：蛋白酶抑制剂，DMSO，Cy3、Cy5荧光染料，Sephadexg G-25柱，牛血清白蛋白（BSA），玻璃片基，氧基硅烷试剂（GPTS），Bradford试剂，PVDF膜，Tween-20，以及国产分析纯常用试剂。

采用的设备包括：超速冷冻离心机5804R：德国Eppendorf公司；微量核酸蛋白测定仪：德国Implen公司；芯片点样仪：博奥晶芯SmartArrayer48点样仪；生物芯片扫描仪4000B：美国Axon公司；芯片杂交箱HL-2000：美国UVP公司。Immobilon-P半干转膜仪：美国GE公司。

1.研究人群和全唾液采集

选取118名唾液提供者均为无其它疾病的中年女性，且一周之内没有服用任何药物，其中包括确诊的乳腺癌I期患者30例，乳腺癌II期患者30例，良性乳腺纤维瘤患者28例，健康志愿者30例，如表2所示，由于唾液糖蛋白糖链与提供者年龄具有相关性，因此四组唾液提供者年龄均相互匹配，全唾液采集在志愿者进食3小时后进行，经生理盐水漱口后采集唾液至少1 mL并立即置于冰上，加入蛋白酶抑制剂（每毫升唾液加入1μL）防止蛋白质降解。

表2

2.唾液蛋白处理和荧光标记

收集到的全唾液经12 000 rpm 4°C离心10 min后收集上清液，再经0.22μm孔径的滤膜过滤掉上清唾液中的细菌和其他微生物。为了减小个体差异并归一化个体样本，唾液样本按照表2分组各取100 μL混合。取定量后混合样本（内含蛋白质100μg）用Cy3荧光染料标记后用Sephadex G-25除盐柱纯化，收集到的荧光标记后的唾液蛋白用于凝集素芯片孵育。未标记的个例样本从中抽样各15例用于唾液芯片的点制。

3．凝集素芯片及其数据分析

凝集素芯片的制备，Cy3荧光标记的样本蛋白与凝集素芯片的孵育步骤及凝集素芯片数据获取与归一化分析与专利申请号为201110021447.3发明专利描述的凝集素芯片和数据分析过程一致。

4．凝集素印记及其数据分析

采用Bradford法测量四组唾液混合样本中蛋白质浓度，并取含6μg蛋白的样本同5×加样缓冲液混合，沸水加热5min使其完全变性。配制3%的浓缩胶及10%聚丙烯酰胺分离胶进行蛋白质电泳。完成电泳后的凝胶采用银染方法进行染色，一方面检测四组唾液中蛋白水平变化情况，另一方面检测蛋白质浓度检测是否准确，保证一致的上样量。另取30μg蛋白质进行SDS-PAGE电泳，后采用半干转仪将蛋白转至PVDF膜上，经过Carbo-free试剂封闭PVDF膜1h后，加入Cy5荧光标记的凝集素至终浓度2 µg/mL，4 °C避光震荡过夜。孵育结束后用TTBS清洗膜两次，每次10 min，然后在Storm 840凝胶成像系统中设置PMT为800，红色荧光通道(635nm激发波长/650LP 发射波长)下扫描图像，图像利用ImageJ软件测量凝集素-蛋白条带灰度值。

5.唾液芯片及其数据分析

唾液芯片的设计参见图3B，唾液芯片由个例唾液样本点制而成，样本根据HC、B、BC-I和BC-II分成四组，各15例，个例唾液蛋白溶于点样缓冲液（0.5 mg/mL BSA 溶于1×PBS，pH 7.4）中至终浓度1 mg/mL，并用芯片点样仪点制于环氧化修饰的玻片上。唾液芯片的布局图显示在图3中B部分，每个样本区内重复三次，每张片基两个重复区，点好的片基在50%湿度中孵育过夜，然后37 °C真空干燥3 h固定，固定好的芯片可4 °C避光密封保存备用。进行验证实验时，芯片首先在封闭缓冲液中常温封闭1h，后经1×PBST和1×PBS洗液各清洗两次，每次5min，离心甩干，Cy3标记的凝集素用以检测这些唾液样本中凝集素特异识别的糖链结构表达水平，甩干后的唾液芯片同配好的含Cy3标记凝集素的孵育缓冲液在芯片杂交箱内4 rpm孵育3h，1×PBST和1×PBS各清洗两次，每次10min，离心甩干，通过芯片扫描仪设置光电倍增管70%和激光强度100%，在532 nm波长处扫描芯片图像，图像经Genepix3.0软件分析获取原始数据，原始数据中小于两倍背景标准偏差的值去掉，每张芯片上每个样本六个重复点的有效值再取平均值（AS），每组平均值表示为组内每个样本平均值（AS）的均值（AG）±标准偏差（SDG），任意两组间借助SPSS statistics 19软件进行单因素方差分析（one-way ANOVA）或秩和检验寻找显著差异，参见图3中B部分。

6.结果分析

（1）早期乳腺女性患者、良性乳腺纤维瘤患者同健康女性唾液糖蛋白糖基化的比较

利用凝集素芯片分别对健康女性、纤维瘤女性患者及早期（I期、II 期）乳腺癌女性患者唾液样本进行检测，通过专业软件获取芯片数据并归一化处理后，首先将三组患乳腺疾病患者的芯片结果与健康组结果进行比较，即每个凝集素对应的归一化后NFI在B组和BC组分别比HC得到Fold-change值，我们将Fold-change > 1.5和Fold-change < 0.67作为乳腺疾病患者相较于健康女性在唾液中上调和下调表达的糖链。

结果发现，有2种凝集素识别的糖链在HC中同 B，BC-I，BC-II女性患者唾液相比差异性表达（见表3和图1B、图2和图3），其中PHA-E+L识别的Bisecting GlcNAc，bi-antennaryN-glycans，tri- 和tetra-antennary complex-type N-glycan在HC组唾液中表达量低于患有乳腺疾病的女性唾液中的表达量，相反，LTL识别的Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc，Fucα1-3(Galβ1-4) GlcNAc和 anti-H blood group specificity糖链结构在三个患病组唾液中均表达减少。

凝集素BS-I识别的α-Gal，α-GalNAc，Galα-1,3Gal糖链在早期乳腺癌患者唾液中比健康女性唾液中高表达，但良性乳腺疾病患者唾液则与健康女性唾液无明显差异，相反的是，MAL-I识别的Galβ-1,4GlcNAc，Siaα2-3Gal，Galβ1-3GlcNAc和Siaα2-3在早期癌症患者唾液中表达量远低于患良性乳腺疾病和健康女性，而后两组间无显著性差异。

LCA识别的α-D-Man，Fucα-1,6GlcNAc和α-D-Glc结构在只在BC-I组唾液中与正常组唾液相较高表达，其余两个患病组均与健康组无明显差别。而BPL识别的Galβ1-3GalNAc和Terminal GalNAc，以及PTL-II识别的Gal，blood group H和T-antigen只在BC-I组唾液中低表达，其余两个患病组则与健康组无显著差异。此外NPA识别的High-Mannose，Manα1-6Man结构在B组和BC-I组唾液中较HC组低表达，但在BC-II组唾液中与HC组无差异。

（2）早期乳腺女性患者同良性乳腺纤维瘤女性患者唾液糖蛋白糖基化的比较

将两组早期乳腺癌患者混合唾液的芯片结果与良性乳腺疾病组结果进行比较，即每个凝集素对应的归一化后NFI在BC-I组和BC-II组分别比B组得到Fold-change值，我们将Fold-change > 1.5和Fold-change < 0.67作为早期乳腺癌女性患者相较于良性乳腺疾病女性患者在唾液中上调和下调表达的糖链。

结果发现，有5种凝集素识别的糖链在BC-I组中同B组女性患者唾液相比差异性表达（见表3和图1B、图2和图3），与B组唾液相比，其中BS-I识别的α-Gal，α-GalNAc，Galα-1,3Gal糖链和LCA识别的α-D-Man，Fucα-1,6GlcNAc和α-D-Glc结构在BC-I组唾液中有小幅度的表达上调。同时MAL-I识别的Galβ-1,4GlcNAc，Siaα2-3Gal，Galβ1-3GlcNAc和Siaα2-3和BPL识别的Galβ1-3GalNAc和Terminal GalNAc糖链在BC-I组唾液中表达量显著降低，而NPA识别的糖链有小幅度的表达下调。

另有2种凝集素识别的糖链在BC-II组中与B组患者唾液中表达量显著性降低，分别是MAL-I识别的Galβ-1,4GlcNAc，Siaα2-3Gal，Galβ1-3GlcNAc和Siaα2-3糖链结构和LTL识别的Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc，Fucα1-3(Galβ1-4) GlcNAc和 anti-H blood groupspecificity糖链。

此外，经过Fold change值比较和统计学检验，GSL-I识别的糖链在任意两组唾液样本间表达无差异，且在所有凝集素芯片中荧光信号归一化值稳定在0.2-0.3之间，属于较高信号水平，因此可用GSL-I作为本发明中的内参凝集素。

表3四组混合唾液糖蛋白糖型的表达比较

^aSignal intensities obtained for 9 repeated blocks in three repeatedslides were normalized and averaged, and the ratios of HC vs B, BC-I, BC-II(B/BC-I, B/BC-II and BC-I/BC-II) were calculated. HC: healthy control; B:patients with benign breast diseases; BC-I: patients with I stage breastcancer; BC-II: patients with II stage breast cancer.

^b/, negative signal; －, no significant difference; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001.

7．凝集素芯片结果验证

为进一步验证凝集素芯片的结果，选择特异性的凝集素分别进行凝集素印迹和唾液芯片实验，以凝集素MAL-I为例，将Cy5荧光标记的MAL-I同转膜后的四组唾液蛋白孵育，经扫描仪扫描并测量其荧光条带灰度（见图4中B部分），另以LCA为例，将Cy3荧光标记的凝集素LCA与点制好的血清芯片孵育，经扫描仪扫描（见图4中B部分）和Genepix 3.0软件分析芯片数据，结果显示，MAL-I与HC组和B组唾液中分子量在15—25KDa的蛋白结合信号高于其与BC-I组和BC-II组唾液中对应分子量的蛋白质的结合信号，总灰度值测量结果同样表明HC组和B组印迹总灰度值高于早期乳腺癌患者组，与凝集素芯片结果一致，LCA的唾液芯片结果表明，该凝集素同与15例BC-I患者唾液糖链的结合显著性高于其与15例HC女性唾液及15例B组唾液样本中糖链的结合强度（见图4中B部分），经单因素方差分析发现P值小于0.05，其余凝集素探针验证参照此方法，结果均显示与凝集素芯片结果相符，证明这些凝集素可以作为探针通过对唾液中的糖蛋白糖链的检测从健康女性中筛选出患有良性乳腺肿瘤和早期乳腺癌的女性。

8．凝集素探针组的确定

通过上述结果分析，若以健康女性唾液作为对照标准，用于筛选早期乳腺疾病患者唾液的凝集素探针表达结果参见表4。

表4 用于从健康女性中筛选良性、早期恶性乳腺肿瘤患者的凝集素探针

若以良性乳腺肿瘤女性患者唾液作为对照标准，用于筛选乳腺肿瘤患者唾液（特别是乳腺癌病理分期I的患者唾液）的凝集素探针表达结果参见表5。

表5 用于从良性乳腺纤维瘤女性患者中筛选早期乳腺患者的凝集素探针

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所做的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种基于唾液蛋白鉴别乳腺癌的凝集素芯片，包括测试凝集素探针组，其特征在于：所述测试凝集素探针组由PHA-E+L、LTL、BS-I、MAL-I、LCA、BPL、PTL-II、NPA、GSL-I的组合组成或者由LTL、BS-I、MAL-I、LCA、BPL、NPA、GSL-I的组合组成。

2.一种利用权利要求1所述凝集素探针制备得到的试剂盒。