CN109342729B - 特定凝集素组合在基于唾液糖型鉴别食管癌方面的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种特定凝集素组合在基于唾液糖型鉴别食管癌方面的应用，该特定凝集素组合(所识别的糖链)作为基于唾液糖型鉴别食管癌的生物标志物，包括：上调组：Jacalin、ECA、HHL、GSL‑II、MAL‑II、EEL、RCA120、DSA、NPA、MAL‑I；下调组：SJA、LEL、LCA、STL、ConA、PSA、ACA、PWM、GNA；当所述上调组的各凝集素所识别的糖链均发生上调、且所述下调组的各凝集素所识别的糖链均发生下调，则表明相应的个体患有食管癌。基于本发明，能够非损伤、高通量、快速鉴别食管癌。

Description

特定凝集素组合在基于唾液糖型鉴别食管癌方面的应用
技术领域
本发明涉及一种通过唾液样本鉴别食管癌的方法，具体涉及确定一组特定的凝集素在基于唾液糖型鉴别食管癌方面的应用。
背景技术
食管癌(esophageal cancer,EC)是起源于食管黏膜上皮的恶性肿瘤,是临床常见的恶性肿瘤之一。在全球所有癌症中的发病率排第七(572000)，死亡率在所有癌症中占第六(509000)。其中70％的EC患者为男性，男性的发病率是女性的2-3倍，且具有明显的地域差异。EC在东亚、南非地区国家高发。我国是食管癌最高发的国家之一，每年食管癌新发病例超过22万例，死亡约20万例。而目前超过90％的食管癌患者确诊时已进展至中晚期，生活质量低，总体5年生存率仅为19.2％。病理组织学检查仍是目前食管癌诊断的金标准，但鉴于组织学检查固有的缺陷如损伤性检查、不能动态检测、存在取样差异等，因此寻求非损伤性检查，进行食管癌早期诊断，是防控食管癌的关键。
随着糖生物学与糖组学研究的发展，生物芯片已成为取得相关信息的重要手段，提供了快速、高效高通量筛选差异糖链的方法，因此，从全新的角度解析各种疾病发生、发展过程中潜在的分子机制以及发现新的生物标志物成为可能。
凝集素芯片通过固定于芯片上的凝集素探针与样品中糖蛋白糖链特异性结合，能够检测出样品中糖蛋白糖链结构和连接方式的变化，是研究糖蛋白糖链结构变化最有效的分析工具之一；且可以与多种检测手段联用，快速、准确检测出待测样本中糖链数量及种类的差异，具有检测样品用量少、高通量、灵敏度极高的优点。
目前研究发现，人唾液中有1939种蛋白质，人血浆中有3020种蛋白质，仅有27％的唾液蛋白质组与血浆蛋白质组重合。血浆蛋白质组学发现的177个与心血管疾病相关的潜在生物标志物的蛋白质中，也仅有40％的蛋白质出现在唾液蛋白质组中；在已列出的1058个潜在癌症相关生物标志物的蛋白质中，仅有34％的蛋白质出现在唾液蛋白质组中。这表明许多血液循环中的生物标志物并非能够在唾液中得到鉴定。另外，即使是同一种蛋白，较之于血清，其在唾液中的含量通常明显较低。所以，常规的血清检测结论，对于基于唾液糖型鉴别食管癌的研究工作不具有参考意义。
目前，尚未见有关食管癌的唾液糖链生物标志物的研究成果。
发明内容
本发明确立了一种特定凝集素组合(所识别的糖链)作为生物标志物，在基于唾液糖型鉴别食管癌方面的应用。
上述特定凝集素组合包括：
上调组：Jacalin、ECA、HHL、GSL-II、MAL-II、EEL、RCA120、DSA、NPA、MAL-I；
下调组：SJA、LEL、LCA、STL、ConA、PSA、ACA、PWM、GNA；
当所述上调组的各凝集素所识别的糖链均发生上调、且所述下调组的各凝集素所识别的糖链均发生下调，则表明相应的个体患有食管癌。
该特定凝集素组合可用于制备基于唾液糖型鉴别食管癌的测试载体。其中，测试载体可以是凝集素芯片，也可以是金属片、硝酸纤维素膜、瓷片、酶标板等。
相应的，该特定凝集素组合还可用于制备基于唾液糖型鉴别食管癌的试剂盒。
相应的，本发明还提供一种基于唾液糖型鉴别食管癌的系统(医疗诊断系统/设备)，包括：
(1)上述特定凝集素组合；
(2)利用特定凝集素组合与唾液样本结合检测唾液糖型的装置；
(3)分析判断特定凝集素组合所识别的糖链是否发生相应的上调、下调的数据分析模块。
本发明的有益效果是：
明确了食管癌的一种新的生物标志物，能够非损伤、高通量、快速鉴别食管癌。
附图说明
图1为研发过程中凝集素芯片上凝集素探针布局图。
图2为聚类分析图；图中可见健康志愿者与食管癌患者能够独立聚集，在糖链水平上具有显著差异，HV：健康志愿者；EC：食管癌患者。
图3为PCA主成分分析图；图中可见健康志愿者与食管癌患者分别聚集在两边，两组样本在唾液糖蛋白糖链水平具有显著的差异，HV：健康志愿者；EC：食管癌患者。
图4食管癌患者中上调的凝集素芯片结果散点图。
图5食管癌患者中下调的凝集素芯片结果散点图。
具体实施方式
1、实验部分
1.1试剂与材料
环氧基硅烷试剂(GPTS)，Bradford试剂，蛋白酶抑制剂，DMSO，Tween-20，盐酸羟胺均购自美国Sigma公司，Cy3，Cy5荧光染料构自美国Amerhsam公司,Sephadex G-25柱购自美国GE Healthcare公司，384孔板构自英国Genetix公司，牛血清白蛋白(BSA)购自德国Calbiochem公司，玻璃片基购自Gold Seal公司，0.2μm滤膜，0.45μm滤膜购自日本Sartorius公司，其他常用试剂购自国产分析纯。37种凝集素(见表1)分别购自Vector公司，Sigma公司。
表1凝集素对照表
Figure BDA0001847423050000031
Figure BDA0001847423050000041
1.2实验仪器
电热鼓风干燥箱：天津泰斯特公司；高压灭菌锅：日本TOMY公司；超速冷冻离心机5804R：德国Eppendorf公司；微量核酸蛋白测定仪：德国Implen公司；生物芯片扫描仪4000B：美国Axon公司；芯片点样仪：博奥晶芯SmartArrayer48点样仪；芯片杂交箱HL-2000：美国UVP公司。
1.3研究人群和全唾液采集
健康志愿者30例，无其它疾病，一周之内没有服用任何药物；已确诊的食管癌患者44例。饭后两小时，约9点到10点之间，生理盐水漱口三次后迅速采集自然分泌的全唾液。唾液采集至少1ml并立即置于冰上，加入蛋白酶抑制剂(每毫升唾液加入1μL)防止蛋白降解。
表2健康志愿者与食管癌患者情况表
Figure BDA0001847423050000042
1.4唾液蛋白处理和荧光标记
收集到的全唾液经12 000rpm 4℃离心10min后吸取上清弃去不溶沉淀物。上清再经0.22μm孔径的滤膜过滤掉细菌和其他微生物。样本经Cy3荧光染料标记后用Sephadex G-25除盐柱去掉游离荧光。标记好的蛋白准备用于凝集素芯片孵育。
1.5凝集素芯片和数据分析
1.5.1凝集素芯片的制备
将未处理的玻片用无水乙醇清洗三次，每次10min。离心甩干后，将玻片浸泡入250mL10％NaOH溶液中，摇床上轻摇反应，避光过夜。反应后，超声15min，再用超纯水清洗四次，每次2min，无水乙醇清洗两次，每次2min。离心甩干后，再将玻片浸泡到200mL10％GPTS溶液中，摇床上轻摇，避光反应3h。反应后，超声清洗15min，无水乙醇清洗三次，每次10min。离心甩干后，芯片的环氧化修饰完成，并将修饰好的玻片放置于4℃干燥器中保存备用。制备好的凝集素芯片的点样设计如图1,每张芯片共分为4个矩阵，每个矩阵规格为12*10，每个样品点重复三次。
1.5.2凝集素芯片的孵育及数据分析
(1)凝集素芯片的封闭
将点制好的凝集素芯片从4℃干燥器中取出，回温。首先用PBST、PBS各清洗玻片一次，每次3min，离心甩干。将凝集素芯片与600μl封闭缓冲液在芯片杂交盒中孵育，25℃旋转反应1h。封闭结束后用PBST、PBS各清洗玻片两次，每次3min，甩干。用Genepix4000B芯片扫描仪扫描封闭后芯片，检查封闭效果。
(2)唾液样本的凝集素芯片检测
将荧光标记的唾液蛋白3μg与孵育缓冲液混匀，配置成600μl上样体系。并均匀加载在盖玻片上，盖上封闭后的凝集素芯片，于芯片杂交仪中25℃避光旋转孵育3h。孵育结束后用PBST、PBS各清洗玻片两次，每次5min，离心甩干。
(3)数据的扫描与分析
使用Genepix4000B芯片扫描仪扫描芯片，GenePix3.0软件从芯片扫描结果图圈点分析后，导出GPR文件，根据其中的数据信息进行分析。原始数据中小于两倍背景标准偏差的值去掉，每张芯片上每个样本12个重复点的有效值再取平均值(AS)，每组平均值表示为组内每个样本平均值(AS)的均值(AG)±标准偏差(SDG)。
2、结果部分
2.1相对于健康志愿者组食管癌患者唾液糖蛋白糖型的变化
利用凝集素芯片分别对健康志愿者、食管癌患者唾液进行检测，通过专业软件获取芯片数据并归一化处理后，首先将健康志愿者组芯片结果与食管癌患者组芯片结果进行聚类以及PCA分析，在总体水平观测健康志愿者与食管癌患者在唾液糖蛋白糖链水平上的差异,进而进行Fold-change比较以及绘制散点图，进行单种凝集素间的差异分析。Fold-change>2和Fold-change<0.5(p<0.05)分别认为该凝集素所识别的糖链存在上调、下调。
结果如下：
(1)如聚类分析图(图2)与PCA图(图3)所示，健康志愿者与食管癌患者在唾液糖蛋白糖链水平有极为显著的差异，唾液糖蛋白糖链具有区分健康志愿者与食管癌患者的潜能。
(2)存在10种凝集素在食管癌中显著上调(表3，图4)
表3.食管癌中10种上调的凝集素
Figure BDA0001847423050000061
表中数据表示该组的凝集素芯片结果中每个对应NFI平均值相对于对照组NFI平均值的Fold-change值.*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。
(3)存在9种凝集素在食管癌中显著下调(表4，图5)
表4：食管癌中9种下调的凝集素
Figure BDA0001847423050000062
表中数据表示该组的凝集素芯片结果中每个对应NFI平均值相对于对照组NFI平均值的Fold-change值.*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001
(4)经过对表3、表4，图4、图5中数据的筛选，设计了一套用于鉴别食管癌的凝集素探针组合。(表5)
本发明凝集素探针筛选的结果，参见表5:
表5：小型凝集素芯片探针组合
Figure BDA0001847423050000071
利用本发明给出的凝集素组合，在实际对个体进行检测时，可预先给出相应凝集素表达水平的参考阈值，或者选取已知健康个体的样本作为对照样本，来判定表达上调、下调情况。

Claims (4)

1.特定凝集素组合在制备基于唾液糖型鉴别食管癌的测试载体方面的用途，其特征在于，针对唾液样本，所述特定凝集素组合包括：
上调组：Jacalin、ECA、HHL、GSL-II、MAL-II、EEL、RCA120、DSA、NPA、MAL-I；
下调组：SJA、LEL、LCA、STL、ConA、PSA、ACA、PWM、GNA；
当所述上调组的各凝集素所识别的糖链均发生上调、且所述下调组的各凝集素所识别的糖链均发生下调，则表明相应的个体患有食管癌。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述测试载体为凝集素芯片、金属片、硝酸纤维素膜、瓷片或酶标板。
3.权利要求1中所述的特定凝集素组合在制备基于唾液糖型鉴别食管癌的试剂盒的用途。
4.一种基于唾液糖型鉴别食管癌的系统，其特征在于，包括：
(1)权利要求1中所述的特定凝集素组合；
(2)利用特定凝集素组合与唾液样本结合检测唾液糖型的装置；
(3)分析判断特定凝集素组合所识别的糖链是否发生相应的上调、下调的数据分析模块。
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