CN114540491B - 一种基于岩藻糖基化细胞外囊泡中差异化表达miRNA的肝癌预测模型建立及应用 - Google Patents

一种基于岩藻糖基化细胞外囊泡中差异化表达miRNA的肝癌预测模型建立及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种基于岩藻糖基化细胞外囊泡中差异化表达miRNA的肝癌预测模型建立及应用，通过GlyExo糖捕获技术快速有效的捕获样本中岩藻糖基化细胞外囊泡，通过NGS测序技术、生信分析技术可有效获得肝癌患者样本的差异化表达miRNA的组合，共涉及75个差异化表达miRNA，通过对差异化表达miRNA单变量分析、或模型组合分析，可有效区分肝癌样本和非肝癌样本，充分体现了基于糖基化细胞外囊泡miRNA在肝癌诊断领域具有重大的临床应用前景。本发明为肝癌早期诊断提供了一种与现有检测方法完全不同的全新检测策略，可有效避免现有检测方法的缺陷，其综合应用的临床价值更高。

Description

一种基于岩藻糖基化细胞外囊泡中差异化表达miRNA的肝癌 预测模型建立及应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种基于岩藻糖基化细胞外囊泡中差异化表达miRNA(简称DEMs)的肝癌预测模型建立及应用。
背景技术
近年来，人们越来越关注评估循环生物标志物，特别是血液中游离的miRNA，miRNA。它可以通过重复和非侵入性的采样来获得关于肿瘤发生的早期分子信息来检测癌症。然而，血液游离miRNA的表达是高度异质性的，它可能来自于癌细胞或其他细胞。因此，血液游离miRNA可能不能代表癌细胞的miRNA表达组合，特别是在肿瘤的早期阶段。因此，可靠性和稳定性是直接使用血清miRNA进行癌症早期筛查方面的主要挑战。
细胞外囊泡(EVs)是由各种类型的细胞释放的脂质膜结构的纳米级颗粒，EVs可以携带像它们所来源的细胞一样的蛋白质、DNA、RNA和代谢物等，并在细胞间交流中发挥不同的作用。EVs不仅参与正常生理过程的调节，而且还参与肿瘤的生物生成和发展，与普通细胞相比，由于微环境的改变，癌细胞所分泌的EVs的数量和组成都有所不同，携带来自母细胞生物大分子的肿瘤特异性EVs可能成为潜在的肿瘤诊断生物标志物。
肿瘤细胞表面的糖类可以保护肿瘤细胞免受免疫攻击，使免疫系统变得迟钝，研究发现，细胞膜表面的糖类是碳水化合物结构，通过糖基转移酶调控的生物合成途径修饰蛋白质或脂质，是细胞-细胞交流和细胞-基质相互作用的重要媒介。肿瘤细胞表面的聚糖可以干扰癌症的发展，包括致癌信号的激活、细胞外基质(ECM)的粘附和癌细胞的转移。糖基化途径的改变是细胞恶性转化的一个共同特征。
报告显示，糖基化的存在参与了EVs的生物生成、细胞识别和受体细胞对EVs的有效摄取，大多数肿瘤相关的糖链改变已经被确定在癌症EVs中富集到，糖基化EVs就像肿瘤细胞发射的“糖衣炮弹”，有可能用于改善目前的癌症诊断路径，成为癌症早期诊断的重要生物学标志物；循环肿瘤细胞(CTC)、循环肿瘤DNA(ctDNA)、细胞外囊泡被誉为肿瘤早期诊断液体活检的三驾马车，其中CTC和ctDNA研究及应用较为广泛，细胞外囊泡用于肿瘤早期诊断液体活检尚处于早期研究阶段，更无直接应用糖基化细胞外囊泡相关标志物应用于肿瘤早期诊断液体活检的技术与产品。
因此，建立一种基于糖基化细胞外囊泡相关生物学标志物的用于肿瘤早期诊断、液体活检的技术、方法是必须的。
发明内容
针对现有技术不足，本发明提供了一种基于岩藻糖基化细胞外囊泡中差异化表达miRNA的肝癌预测模型的建立与应用，利用GlyExo-Capture糖捕获技术快速、有效分离富集人血液样本中岩藻糖基化细胞外囊泡，对分离后的岩藻糖基化细胞外囊泡进行高通量测序和生物信息学分析，共发现具有差异表达miRNA75种，包括52种miRNA表达上调、23种miRNA表达下调，通过miRNA单变量分析或不同组合分析，优选出最优miRNA组合，并建立用于肝癌早期诊断的预测分析模型，能有效提升肝癌早诊的预测能力，为肝癌的早期诊断、筛查提供新的思路、技术和方法。
本发明提供了一种基于岩藻糖基化细胞外囊泡中差异化表达miRNA的肝癌预测模型建立方法及应用，包括：应用GlyExo-Capture糖捕获技术分离血液样本中的岩藻糖基化细胞外囊泡；对岩藻糖基化细胞外囊泡中差异化表达miRNAmiRNA进行任意一种单变量分析，或任意两种及两种以组合的miRNA组合变量分析；通过变量分析获得任意一种miRNA、或任意两种及两种以上miRNA组合的差异化表达结果，即通过岩藻糖基化细胞外囊泡中miRNA上调表达或下调表达的差异化表达可快速、有效区分肝癌患者样本和非肝癌患者样本，进一步可用于肝癌早期诊断和筛查。
所述血液样本包括血清样本、血浆样本的任意一种。
所述糖捕获技术分离血液样本中的糖基化细胞外囊泡的分离时间≤15min。
所述GlyExo-Capture糖捕获技术分离的盐藻糖基化细胞外囊泡中差异化表达miRNA共包含75种miRNA，所述miRNA的任意一种单变量差异化表达，或任意两种及以上miRNA组合多变量的差异化表达，或由上述miRNA构建的肝癌预测模型均能显著区分肝癌患者样本和非肝癌患者样本，或肝癌患者样本和非肝癌患者样本具有统计学差异。
所述75种miRNA中包括52种miRNA表达上调：
所述75种miRNA中包括23种miRNA表达下调包：
序号 miRNA names 序号 miRNA names 序号 miRNA names
1 hsa-miR-381-3p 9 hsa-miR-6747-3p 17 hsa-miR-3188
2 hsa-miR-616-3p 10 hsa-miR-432-5p 18 hsa-miR-6741-3p
3 hsa-miR-485-3p 11 hsa-miR-8069 19 hsa-miR-6068
4 hsa-miR-4497 12 hsa-miR-4676-3p 20 hsa-miR-4686
5 hsa-miR-744-5p 13 hsa-miR-4473 21 hsa-miR-6859-5p
6 hsa-miR-941 14 hsa-miR-6772-3p 22 hsa-miR-509-3-5p
7 hsa-miR-6716-3p 15 hsa-miR-659-5p 23 hsa-miR-7110-3p
8 hsa-miR-10401-5p 16 hsa-miR-4743-5p
所述糖基化细胞外囊泡差异化表达miRNA检测分析方法为RT-PCR、NGS高通量测序、或基于探针杂交的方法的任意一种。
更进一步通过生信分析，优选岩藻糖基化细胞外囊泡差异表达miRNA组合包括miR-182-3p、miR-215-5p、miR-429、miR-483-5p、miR-651-5p、miR-432-5p六种miRNA的组合。
所述岩藻糖基化细胞外囊泡差异表达miRNA组合进一步优选为具有显著表达差异、且具有高互补性的四种miRNA，包括miR-182-3p、miR-429、miR-483-5p、miR-651-5p。
所述具有显著表达差异、且具有高互补性的上述miR-182-3p、miR-429、miR-483-5p、miR-651-5p四种miRNA构建的肝癌预测模型的构建方法包括常规逻辑回归模型(Logistic Regression)，和8种机器学习模型：支持向量机模型(support vectormachines,SVC模型)、K近邻算法(K Neighbors Classifier)、高斯贝叶斯分类器(GaussianNB)、决策树模型(Decision Tree Classifier)、随机森林模型(Random ForestClassifier)、梯度提升决策树模型(Gradient Boosting Classifier)、BaggingClassifier模型、AdaBoost Classifier模型的任意一种。
所述基于上述任意一种数学模型构建的基于miR-182-3p、miR-429、miR-483-5p、miR-651-5p四种miRNA肝癌预测模型的AUC均值≥0.82，显著高于主要miRNA单变量分析的AUC值，主要miRNA单变量分析的AUC值为0.6-0.8，即肝癌预测模型的预测能力显著高于miRNA单变量分析预测能力。
所述肝癌预测模型进一步优选为随机森林模型(Random Forest Classifier)、AdaBoost Classifier模型的任意一种机器学习模型构建的肝癌预测模型，所述肝癌预测模型的AUC均值≥0.95，显著高于其他七种预测模型AUC均值；
所述肝癌预测模型更进一步优选为甲胎蛋白(AFP)和miR-182-3p、miR-429、miR-483-5p、miR-651-5p四种miRNA联合构建的肝癌预测模型，上述预测能力显著高于四种miRNA的独立预测模型的预测能力和AFP独立预测能力；通过另一组独立样本验证分析，AFP联合四种miRNA肝癌预测模型的AUC＝0.922，显著高于4个miRNA的独立预测模型AUC＝0.86和AFP的独立预测AUC＝0.633。
在本发明中，还提供了一种肝癌早期筛查、诊断的方法包括：应用GlyExo-Capture糖捕获技术分离、富集血液样本中的岩藻糖基化外泌体；检测所分离、富集的岩藻糖基化外泌体中的所述miRNA的表达水平；通过已构建肝癌筛查模型对上述检测的miRNA表达水平进行评估，和肝癌早期筛查、诊断的判定，能显著区分肝癌患者样本和非肝癌患者样本，或肝癌患者样本和非肝癌患者样本具有统计学差异。
在本发明中，所述肝癌预测模型中miRNA单变量分析，或任意一种组合变量分析还可用于包含所述miRNA的肝癌早筛或早诊的相关产品或试剂中。
在本发明中，还提供了一种岩藻糖基化外泌体在制备用于治疗肝细胞癌的药物中的用途；优选地，所述用于治疗肝细胞癌的药物包括岩藻糖基化外泌体和针对肝细胞癌的治疗性药物；优选地，在所述用于治疗肝细胞癌的药物中，所述岩藻糖基化外泌体作为针对肝细胞癌的治疗性药物的运载载体。
因此，所述基于糖基化细胞外囊泡中差异化表达miRNA的肝癌预测模型可显著提升区分肝癌样本和非肝癌样本的检出能力，且预测效率显著高于糖基化细胞外囊泡中差异化表达miRNA独立用于肝癌预测预测效率，具有优异的临床应用性能，为肝癌的早期诊断、筛查、治疗提供新的思路、技术和方法。
有益效果
本发明是发明人在糖基化细胞外囊泡研究与应用领域，经过长期探索研究和充分的实验证据分析，发明的一种用于肝癌早期诊断、肝癌筛查的新技术、新产品，本发明利用GlyExo-Capture糖捕获技术快速、有效分离人血液样本中岩藻糖基化细胞外囊泡，富集血液样本中来自癌细胞的岩藻糖基化细胞外囊泡，对分离后的岩藻糖基化细胞外囊泡进行高通量测序，对测序结果进行生物信息学分析，共发现差异表达miRNA 75种，包括52种miRNA表达上调、23种miRNA表达下调，通过多种建模分析，优选出最优miRNA并建立数学分析模型，有效提升肝癌早诊的预测能力，为肝癌的早期诊断、筛查提供新的思路、技术和方法；为糖基化细胞外囊泡及其标志物用于肿瘤液体活检、早期诊断、肿瘤筛查供了一种与现有检测方法完全不同的全新的检测策略，有效避免现有肿瘤检测方法的局限性，在肿瘤早期诊断、筛查方面具有优异的临床应用前景；此外，藻糖基化外泌体作为针对肝细胞癌的治疗性药物的运载载体同样具有非常高的临床应用前景。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
图1：实验用样本集合应用流程图
图2：差异化超速离心(UC)、GlyExo捕获技术分离细胞外囊泡示意图；
图3(图3A-3E)差异化超速离心(UC)和GlyExo捕获技术分离的血清EVs的特征，：
图3A.在透射电子显微镜(TEM)下分析通过差速超离心和GlyExo捕获技术分离的EVs，代表性的EVs形态由黑色箭头突出；
图3B.纳米颗粒追踪分析(NTA)的结果显示了代表性的EVs样品；
图3C.使用Western blot评估GlyExo、UC分离细胞外囊泡的CD81、Alix、TSG101和Calnexin的蛋白水平；
图3D、3E.GlyExo和UC的Exoview分析，检测了EVs四跨膜蛋白标志物CD63、CD81和CD9，MIgG被用作阴性对照。
图4(图4A-4H)：测序分析血清岩藻糖基化EVs：
图4A.血清岩藻糖基化EVs衍生的miRNA数据集的火山图；
图4B.75个差异表达的miRNAs的表达水平的热图；
图4C.维恩图显示了TCGA数据集和血清岩藻糖基化EVs来源的miRNA数据集之间共享的差异表达的miRNAs；
图4D.LDA分析显示了75个miRNAs能够有效区分肝癌和非肝癌人群；
图4E.肝癌细胞系HepG2分泌岩藻糖基化细胞外囊泡比例对比图
图4F.肝癌细胞系HepG2细胞摄取细胞外囊泡具有时间和剂量依赖性分析；
图4G.HepG2细胞对高、低岩藻糖基化细胞外囊泡的摄取效率对比图。
图4H.血清岩藻糖基化的EVs miRNA数据集中发现的75个差异表达的miRNA所靶向mRNA的KEGG富集通路。
图5(图5A-5H)：糖基化EVs中特异性miRNA的成对散点图矩阵图。
图6：糖基化EVs miRNA中经qPCR验证的结果与NGS结果的一致性分析。
图7(图7A-7B)：糖基化EVs中特异性miRNA差异化表达分析：
图7A.6个miRNA在肝癌人群样本和非肝癌对照样本中表达差异；
图7B.4个miRNA的sperman相关性分析热图；
图8(图8A-8D)：糖基化EVs的miRNA组合在肝癌预测中的表现：
图8A.基于4个miRNA组合的不同模型在训练数据集上的预测效率比较；
图8B.基于4个miRNAs组合的肝癌预测模型对回顾性样本数据ROC曲线分析；
图8C.基于4个miRNAs组合的肝癌预测模型对独立前瞻性数据ROC曲线分析；
图8D.回顾性样本和独立前瞻性样本研究数据集中表现出相似的趋势；
图9：AFP联合4个miRNA组合的肝癌预测模型ROC曲线分析。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
实施案例1：受试者样本信息
在本实施案例中，受试者样本信息包括三个样本集合，包括：
回顾性样本集合：61名肝癌患者样本、24名非肝癌的其他肝病患者样本、30名无肝脏相关疾病的健康人群样本；
RT-PCR验证样本集合：16名肝癌患者样本、16名非肝癌的其他肝病患者样本、16名无肝脏相关疾病的健康人群样本；
前瞻性样本集合：52名肝癌患者样本、30名非肝癌的其他肝病患者样本、23名无肝脏相关疾病的健康人群样本；
上述样本集合用于后续实施案例糖基化细胞外囊泡分离、富集、miRNA测序分析、肝癌预测模型筛选和构建、肝癌预测模型验证等；在以下实施案例中，肝癌患者样本为病例组样本，非肝癌的其他肝病患者样本和无肝脏相关疾病的人群样本均作为肝癌患者样本的对照组样本。上述样本集合应用流程图1所示.
收集上述病例组和对照组血清样本不低于1.5ml/份；既往研究结果证明，血清样本与血浆样本仅样本类型不同，在本发明实施案例中均采用血清样本进行说明。
实施案例2：岩藻糖基化细胞外囊泡的分离富集
在本实施案例中，为更好说明岩藻糖基化细胞外囊泡的分离富集方法与效果，分别采用常规差速超速离心法(UC)分离样本中总细胞外囊泡，采用GlyExo-Capture糖捕获技术分离、富集岩藻糖基化细胞外囊泡。
1、应用差速超速离心法分(UC)离血清样本总细胞外囊泡
(1)血清样本在37℃下解冻后，在3,000×g下离心10分钟，以去除细胞碎片；
(2)用20倍体积的磷酸盐缓冲液(PBS)稀释步骤(1)中分离的500μl血清样本，采用直径0.22μm过滤器处理，去除血清样本中的大颗粒；
(3)使用型号为XPN-100超速冷冻离心机(CP100NX；Hitachi，Brea，CA，USA)的100型TI转子在100,000×g转速，4℃条件下超速离心90min，用于沉淀分离总细胞外囊泡；
(4)将步骤(3)分离的总细胞外囊泡重新悬浮在1.8mL PBS缓冲液中，使用型号为XPN-100超速冷冻离心机在100,000×g转速，4℃下再次超速离心90min。
(5)将步骤(4)分离的总细胞外囊泡用PBS缓冲液洗涤后，将富含总细胞外囊泡的颗粒重新悬浮在500μl PBS缓冲液中，即为通过超速离心法分离的血清样本总细胞外囊泡溶液。
2、采用GlyExo-Capture糖捕获技术分离、富集样本中岩藻糖基化细胞外囊泡
(1)准备GlyExo-Capture糖捕获技术分离、富集用深孔板和试剂，所述分离、富集试剂包括磁珠MBL、清洗缓冲液WBL、洗脱缓冲液EBL，参考本公司专利技术“202010060055.7，一种用于分离临床样本中的糖基化细胞外囊泡的凝集素-磁性载体偶联复合物”制备；所述磁珠MBL为岩藻糖特异性凝集素与磁性载体偶联形成的偶联复合物，岩藻糖特异性凝集素包括小扁豆凝集素(LCA)及与LCA具有相同功能的凝集素，在本实施案例中采用小扁豆凝集素(LCA)进行说明。
(2)在深孔板第1列和第7列的孔中分别加入磁珠MBL，在第2列和第8列的孔中加入清洗缓冲液WBL，在第3列和第9列中加入洗脱缓冲液EBL；
(3)在第1列和第7列的孔中加入250μl血清样本；
(4)用北京尧景基因的GlyExo-Capture全自动细胞外囊泡提取仪进行自动分离、富集岩藻糖基化细胞外囊泡，自动化分离、富集全部过程小于等于15min。
差速超速离心法(UC)和GlyExo-Capture糖捕获技术分离、富集岩藻糖基化细胞外囊泡示意图如图2所示。
实施案例3：分离后细胞外囊泡的鉴定
对实施案例2中采用常规差速超速离心法分离的总细胞外囊泡和采用GlyExo-Capture糖捕获技术分离、富集的岩藻糖基化细胞外囊泡分别通过透射电子显微镜(Transmission electron microscopy，TEM)和纳米粒子跟踪分析(Nanoparticletracking analysis，NTA)评估细胞外囊泡的形态和大小分布；通过Western blot蛋白免疫印迹和Exoview分析技术进一步验证细胞外囊泡。其中：透射电子显微镜(TEM)用于观察细胞外囊泡的形态和结构，测量其大小；纳米粒子跟踪分析(NTA)用于测算EVs粒子群体直径分布和数量；Western Blot和Exoview分析技术通过识别细胞外囊泡表面的标志蛋白来鉴定分离物是否为细胞外囊泡。
1、透射电子显微镜(TEM)分析
(1)将4μl细胞外囊泡样品悬浮液滴在铜网上静置1分钟，用滤纸吸去铜网边缘的多余液体；
(2)滴入阴性染色液(0.5％醋酸铀水溶液，pH4.5)染色1分钟；用滤纸吸去阴性染色液，重复此步骤两次。
(3)干燥后，可用于电子显微镜观察，并在FEI Tecnai Spirit 120KV上拍摄EVs的透射电子显微镜(TEM)图像。
2、纳米粒子跟踪分析(NTA)
(1)采用Nanosight NS 300系统(NanoSight Technology,Malvern,UK)跟踪测量细胞外囊泡的数量和大小，将细胞外囊泡样品稀释10到1000倍，以达到每帧20到100个对象；
(2)稀释后的细胞外囊泡样品在环境温度下，手动注入样品室，每个样品配置一个488nm的激光器和一个高灵敏度的科学互补金属氧化物半导体相机，在相机上设置为13，采集时间为30s，检测阈值设置为7的情况下进行测量，一式三份。
(3)每个视频至少分析和获得200个完整的轨迹。
(4)使用NTA分析软件(2.3版)对细胞外囊泡样品的纳米颗粒追踪数据进行分析。
3、western blot分析
(1)将细胞外囊泡样品和HepG2细胞(对照组)在1×RIPA缓冲液中裂解，并补充蛋白酶抑制剂；
(2)细胞外囊泡样品和HepG2细胞的蛋白质定量测定使用NanoDrop One微量紫外分光光度计(Thermo Fisher,Waltham,MA)进行测定；
(3)取5μg的裂解物在SDS-PAGE凝胶上进行电泳，然后转移到免疫杂交PVDF膜上，使用PBS-T和5％印迹级阻断剂中的一级抗体对印迹进行检测。一级抗体是抗CD81[M38](1:400稀释，Abcam，美国)，抗Alix[3A9](1:400稀释，Abcam，美国)，抗TSG101[4A10](1:400稀释，Abcam，美国)和抗Calnexin[EPR3633(2)](1:2000稀释，Abcam，美国)；二级抗体是兔抗鼠IgGk BP-HRP和鼠抗兔IgGk BP-HRP；
(4)使用BeyoECL Plus检测系统(Beyotime，中国)和X射线胶片(Fuji，东京，日本)检测蛋白质条带，X射线胶片使用GS-700成像密度计(Bio-Rad)分析。
4、Exoview分析
在本实施例中，所有的芯片、试剂和抗体都由NanoView Biosciences(Brighton,MA,Cat#EV-TETRA-C)提供。
(1)取35μl分离后的细胞外囊泡溶液，分别在孵化缓冲液(IB)中1:1稀释，并在室温下，在印有抗人CD81(JS-81)、抗人CD63(H5C6)、抗人CD9(HI9a)和抗鼠IgG1(MOPC-21)的ExoView R100芯片上孵化；
(2)孵化16小时后，在500转/分的轻柔水平搅拌下，用孵化缓冲液(IB)清洗芯片4次，每次3分钟；
(3)在室温下，将芯片与抗人CD81(JS-81，CF555)、抗人CD63(H5C6，CF647)和抗人CD9(HI9a，CF488A)的荧光抗体鸡尾酒在体积比为1:1200的孵化缓冲液(IB)和阻断缓冲液的混合物中孵育1小时。
(4)将缓冲液换成孵化缓冲液(IB)，接着用孵化缓冲液(IB)洗1次，用洗涤缓冲液洗3次，用冲洗缓冲液洗1次，每次清洗均为3分钟，500rpm；
(5)将芯片在冲洗缓冲液中浸泡两次，每次约5秒，然后以45度角取出，让液体离开芯片；
(6)在ExoView芯片上，每个抗体捕获点理论上装载10,000个颗粒；总共35微升的稀释后细胞外囊泡被孵化在ExoView芯片上，充分干燥；
(7)所有芯片在ExoView扫描仪(NanoView Biosciences,Brighton,MA)上通过干涉反射成像和荧光检测进行成像；使用NanoViewer 2.8.10软件(NanoView Biosciences)对数据进行分析，荧光截止点如下：CF555通道230，CF488通道475，CF647通道250(生物颗粒)和CF555通道675，CF488通道600，CF647通道375(SS和PS)。
5、实施案例3的实验分析结果
以差速超速离心法(UC)分离的总细胞外囊泡为对照组，对比分析GlyExo-Capture糖捕获技术分离、富集的岩藻糖基化细胞外囊泡，实验对比分析结果如图3(图3A-3E)所示。
采用透射电子显微镜(TEM)和纳米粒子跟踪分析(NTA)评估细胞外囊泡的形态和大小分布。结果显示：差速超速离心法(UC)和GlyExo-Capture糖捕获技术分离出的大部分细胞外囊泡均为椭圆形或碗状，均能分离到完整得细胞外囊泡(图3A)；分离后的细胞外囊泡粒径尺寸均在100-150nm之间，浓度均大于1×109(图3B)说明糖基化细胞外囊泡含量在总细胞外囊泡中比例较高，分布广，具备优异的检测性能。
采用Western blot蛋白免疫印迹评估细胞外囊泡特异性蛋白及阴性标记物，用于验证分离后产物是否为细胞外囊泡，细胞外囊泡跨膜蛋白CD9、CD63和CD81为细胞外囊泡的阳性标记蛋白，检测阳性则表面分离物为细胞外囊泡，而Calnexin标记物则为阴性标记物，在细胞外囊泡中不应出现。(图3C)的分析结果显示GlyExo-Capture糖捕获技术分离出的细胞外囊泡CD9、CD63和CD81阳性，Calnexin阴性，为典型细胞外囊泡；而差速超速离心法(UC)分离后的细胞外囊泡同时存在Calnexin阳性条带，说明差速超速离心法(UC)分离存在杂蛋白干扰；同时，Exoview分析结果(图3D、图3E)显示GlyExo-Capture糖捕获技术分离出的细胞外囊泡CD9、CD63和CD81的浓度高且颜色更清晰，说明对比差速超速离心法(UC)分离细胞外囊泡，GlyExo-Capture糖捕获技术能够有效去除血液样品中杂蛋白干扰，获得高浓度、高纯度的糖基化细胞外囊泡，更有利于后续miRNA分析。
同时结合实施案例2分析，GlyExo-Capture糖捕获技术分离糖基化细胞外囊泡时间小于等于15min，且应用常规全自动细胞外囊泡提取仪即可自动完成分离过程，不需要特殊设备即可实现高通量分离过程；而差速超速离心法(UC)需要用到进口超速冷冻离心机及特殊转子、0.22μm过滤器，整个分离过程超过190min；因此GlyExo-Capture糖捕获技术具有更优质的临床适用性能，满足肿瘤筛查、早期诊断需求。
实施案例4：糖基化细胞外囊泡miRNA高通量测序及筛选确认
对实施案例1-3中分离的糖基化细胞外囊泡进行高通量测序和筛序，主要步骤如下：
1、使用NEBNext1 Small RNA Library Prep Set for Illumina1(MultiplexCompatible)(NEB,Cat No.:E7330)产品制备测序文库，按照产品说明书操作，从血清样本中获得的糖基化细胞外囊泡miRNA浓度≥5ng；
2、使用E-Gel Power Snap电泳系统(ThermoFisher Scientific Inc,MA,USA)的E-Gel SizeSelect II凝胶选择文库大小，检查cDNA文库的质量和浓度，将24-26个样本以相同浓度集中起来备用；
3、应用Illumina NextSeq 550测序系统(75nt，单端)测序；
4、通过miRNA测序得到61名肝癌患者样本、24名其他肝病患者样本和30名正常人群样本中的岩藻糖基化细胞外囊泡来源miRNA的表达组合；
5、来自Illumina NextSeq 550测序系统的原始数据被转换为fastq格式，用cutadapt v1.18修剪3'adapter(无错配)后，用fastQC v0.11.9评估reads，过滤掉质量分数低于30或长度短于10bp的reads，剩余的reads用bowtie v1.3.0与人类基因组GRch38汇编进行比对，然后用HTseq v0.13.5确定miRNA的表达水平，注释由miRbase版本22生成；对于每个样品，产生不少于15M的原始读数。
6、测序结果分析：
在实施案例4的测序结果分析中，采用生物信息学分析方法对测序结果进行分析：
(1)共鉴定了1938个miRNAs，其中75个为差异表达的miRNA(表1、图4A、图4B)；
(2)在差异表达的miRNA分析中(|log2(FC)|>1，p<0.05)，发现肝癌检测组比非肝癌对照组共有52种miRNA上调，23种下调(表1、图4A、图4B)；
表1 log2FC排序的75个为差异表达的miRNA信息表
(3)与肿瘤基因组图panel(TCGA)数据集中差异表达的miRNAs相比，共有19种差异表达的miRNA在这两个分析中共享，其中18种上调，1种下调(图4C)，且其中14个差异表达的miRNA的表达趋势一致；
(4)用75个差异表达的miRNA对本发明中上述所有样本进行线性判别分析(LDA)，线性判别分析(LDA)是一种监督学习的降维技术方法，可将数据进行二维分解并进行有类别输出，LDA分析显示，上述75个岩藻糖基化细胞外囊泡差异表达的miRNA通过线性判别分析(LDA)能够有效区分肝癌和非肝癌患者样本(图4D)；
(5)随机抽取上述75个差异表达miRNA的子集合绘制两两配对的散点矩阵图，如图5(图5A-图5H)所示，可以看出上述75个差异表达miRNA的任意两种及以上组合应用均对肝癌和非肝癌患者样本有一定的区分效果。
根据上述(1)-(5)的结果分析表明，来源于岩藻糖基化细胞外囊泡的75个差异表达的miRNA单独应用或任意两种及以上组合应用均可有效区分肝癌和非肝癌患者样本，为肝癌早期诊断或筛查提供检测和分析基础。
7、岩藻糖基化细胞外囊泡及其差异表达的miRNA来源于肝癌细胞分析
在为确定岩藻糖基化细胞外囊泡来源及岩藻糖基化细胞外囊泡的功能，在本实施案例中，评估了岩藻糖基化细胞外囊泡被肝癌母细胞摄取的模式。
在本实施案例中，采用GlyExo-Capture糖捕获技术获得的细胞外囊泡被认定为高岩藻糖基化EVs(HF-EVs)，而分离、富集过程中剩余上清液中细胞外囊泡被认定为低岩藻糖基化细胞外囊泡(LF-EVs)。通过对肝癌细胞系HepG2和正常肝细胞MIHA分泌的岩藻糖基化EVs比例对比分析，并使用LCA-磁珠和BSA-磁珠(对照)对捕获岩藻糖基化细胞外囊泡进行对比分析，如图3E显示，肝癌细胞系HepG2分泌岩藻糖基化细胞外囊泡比例约60％，正常肝细胞系MIHA分泌岩藻糖基化细胞外囊泡比例约30％(图4E)，表明在肝脏癌变过程中，岩藻糖基化糖基化细胞外囊泡的分泌大幅增加，是潜在的肝癌检测、筛查生物学标志物；并通过LCA-磁珠和BSA-磁珠(对照)对岩藻糖基化糖基化细胞外囊泡捕获验证，LCA-磁珠可将样本中的岩藻糖基化糖基化细胞外囊泡全部捕获分离，而对照用BSA-磁珠基本无法捕获岩藻糖基化糖基化细胞外囊泡。
为验证岩藻糖基化糖基化细胞外囊泡是否具有肝癌细胞特异性，在本实施案例中：
(1)采用DiD荧光染料标记岩藻糖基化糖基化细胞外囊泡，然后用流式细胞仪检测肝癌细胞系HepG2摄取细胞外囊泡的效果。如图4F结果表明，肝癌细胞系HepG2细胞摄取细胞外囊泡具有时间和剂量依赖性(图4F)，且HepG2细胞对高岩藻糖基化细胞外囊泡的摄取效率比对低岩藻糖基化细胞外囊泡的摄取效率更高。
(2)用PNGase F糖苷酶酶切去除细胞外囊泡的N-聚糖后，HepG2细胞对高岩藻糖基化细胞外囊泡的摄取效率降低，但对低岩藻糖基化细胞外囊泡的摄取效率无显著变化(图4G)；因此表明，细胞外囊泡糖基化类型与肝癌母细胞的吸附、内化和分泌过程有关。
(3)在获得高岩藻糖基化细胞外囊泡更易被肝癌母细胞摄取的实验现象后，在本实施案例中进一步评估了上述现象是否具有肝癌细胞特异性；用Did染料分别标记HepG2细胞分泌的高岩藻糖基化细胞外囊泡和低岩藻糖基化细胞外囊泡，然后进行不同细胞的摄取实验；如图4G的实验结果表明，HepG2细胞能够快速吸收高岩藻糖基化细胞外囊泡，但HCT-116和Hela细胞摄取低岩藻糖基化细胞外囊泡比高岩藻糖基化细胞外囊泡更多(图4G)，表明高岩藻糖基化细胞外囊泡具有肝癌细胞特异性。
(4)进一步在本实施案例中分析了差异表达的miRNA(简称DEMs)对蛋白编码mRNAs的潜在影响，用于揭示岩藻糖基化细胞外囊泡衍生的miRNA在肝癌患者中上调/下调的潜在功能。利用mirpath软件对本实施案例中的75个DEMs数据作用到的靶基因进行分析，并将结果进行KEGG富集分析，结果发现，岩藻糖基化细胞外囊泡mRNAs主要富集在癌症、细胞摄取作用、Ras信号通路、Rap1信号通路和癌症中的蛋白糖基化等途径中(图4H)。
上述(1)-(4)的实验分析均表明岩藻糖基化细胞外囊泡及其差异表达的miRNA可以反映肝癌原发肿瘤部位的miRNA组合，可用于肝癌的早期诊断和筛查；且由于盐藻糖基化细胞外囊泡更易被肝癌细胞摄取，具有时间和剂量依赖性，且岩藻糖基化细胞外囊泡mRNAs主要富集在癌症、细胞摄取作用、Ras信号通路、Rap1信号通路和癌症中的蛋白糖基化等途径中，均显示岩藻糖基化细胞外囊泡在肝细胞癌治疗过程中，作为药物运载载体，具有重要的应用潜力和临床研究应用价值。
8、筛选肝癌诊断中的潜在生物标志物
为了筛选肝癌诊断中的潜在生物标志物，在本实施案例中，利用生信分析手段自动计算了每个DEMs的特异性和敏感性，按p-adj值排列显示了前45个DEMs，大多数的候选糖基化细胞外囊泡miRNAs显示出0.44-0.92的特异性，0.44-0.90的敏感性和0.60-0.8的AUC值(表2)，筛选结果显示岩藻糖基化细胞外囊泡差异表达的miRNA均能够有效区分肝癌和非肝癌患者样本。
表2：TOP 45DEM识别肝癌患者的特异性和敏感性按p-adj值排序
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实施案例5：通过RT-PCR方法验证糖基化细胞外囊泡中NGS高通量测序miRNAs的表达准确性；
在本实施案例中，对实施案例4中筛选的75个差异表达的miRNA应用RT-PCR方法进行随机选择验证，以确保NGS高通量测序miRNAs的表达准确性。
随机选择糖基化细胞外囊泡中差异表达的miRNA共计12个，包括：miR-145-5p、miR-4444、miR-194-5p、miR-4673、miR-141-3p、miR-200b-5p、miR-651-5p、miR-483-5p、miR-122-3p、miR-200c-3p、miR-182-3p、miR-429；同时应用RT-PCR方法和NGS高通量测序法对糖基化细胞外囊泡中miRNA的差异表达进行验证，结果如图6所示，12个miRNA的RT-PCR验证结果与NGS高通量测序法的miRNA-seq数据趋势一致(图6)，其表现的ROC曲线的线下面积AUC值分别为0.713、0.691、0.719、0.754、0.785、0.686、0.744、0.785、0.712、0.708、0.748、0.746，两种方法均可分别有效区分早期肝癌组样本与非肝癌对照组样本；上述验证结果显示特定的岩藻糖基化细胞外囊泡差异表达的miRNA应用RT-PCR法和NGS高通量测序法均能够有效区分肝癌组样本和非肝癌对照组样本。
实施案例6：筛选具有最佳评估效率的岩藻糖基化细胞外囊泡差异表达miRNAs组合
在本实施案例中，采用生物信息学分析方法，利用决策树和支持向量机(SVM)模型评估岩藻糖基化细胞外囊泡差异表达miRNAs在区分肝癌和非肝癌组中的价值。基于决策树模型和R软件包"adabag"的adaboost算法，随机选择75％的样本训练一个包含100个加权树(交叉验证＝10)的模型，每个miRNA的重要性是它在这些树中的加权频率，重复30次并计算miRNAs的平均重要性水平。
随机包含75％样本的训练集中，基于线性SVM模型，得到垂直于支持向量的系数向量W＝{αi}；miRNA Gi的重要性可以被测量为重复500次并计算miRNAs的平均重要性水平。
分别用这两种重要性评价方法对岩藻糖基化细胞外囊泡差异表达miRNAs进行排序，并通过逐步删除重要性最小的岩藻糖基化细胞外囊泡差异表达miRNAs以缩减miRNAs的组合；错误发现率(FDR)定义为原始数据上的预测错误率与标签随机混淆数据上的预测错误率之比，被用来评估miRNA组合的预测效果，并由此确定最佳miRNA组合。
在本实施案例中，使用上述多变量分析，进行最优组合筛选，筛选出了由六个岩藻糖基化细胞外囊泡差异表达miRNAs组成的优化组合，包括：miR-182-3p、miR-215-5p、miR-429、miR-483-5p、miR-651-5p、miR-432-5p；其中miR-182-3p、miR-215-5p、miR-429、miR-483-5p、miR-651-5p在肝癌患者检测组的NGS高通量测序中明显上调表达，miR-432-5p则下调表达；在miRNA组合机器自动优化训练、筛选过程中，该miRNA组合在区分肝癌患者与非肝癌患者样本中显示出优于其他任选组合的区分能力。
在本实施案例中，以p≤0.01的最严格模式从严优化选择判定，用于建立最优肝癌预测模型；在上述优化的六个岩藻糖基化细胞外囊泡差异表达miRNA的组合中，其中4个miRNA在肝癌组和非肝癌对照组之间具有显著差异表达(图7A)，具体包括miR-182-3p、miR-429、miR-483-5p、miR-651-5p，且4个miRNA彼此之间相关性很低，说明筛选出的4个miRNA在分离不同样本组方面具有非常高的互补性(图7B)，具备被进一步确定为疾病标志物进行建模的特征。
实施案例7：基于4个miRNA的肝癌预测模型构建
在本实施案例中，将研究样本数据集以7:3的比例随机分为训练集和测试集。通过对训练集进行100次放回式抽样，比较了肝癌预测模型的sklearn包中9种模型，包括常规逻辑回归模型(Logistic Regression)，和8种机器学习模型：支持向量机模型(supportvector machines,SVC模型)、K近邻算法(K Neighbors Classifier)、高斯贝叶斯分类器(Gaussian NB)、决策树模型(Decision Tree Classifier)、随机森林模型(Random ForestClassifier)、梯度提升决策树模型(Gradient Boosting Classifier)、BaggingClassifier模型、AdaBoost Classifier模型的性能和稳定性，根据每次抽样得到的训练数据集内进行交叉验证计算的AUC值，选择最佳模型。
在本实施案例中，不同模型构建的基于4个miRNA肝癌预测模型如图(8A)所示，均具有良好的肝癌预测效率，其预测效率均大于0.82；其中随机森林模型(Random ForestClassifier)和AdaBoost Classifier模型具有更高的预测效率，其预测效率均大于等于0.95，明显高于其他预测模型。
以AdaBoost Classifier模型构建的基于4-miRNAs组合的肝癌预测模型为例说明，同时采用测试集和后续独立研究样本对构建的4-miRNAs组合进行验证，其中：测试集样本数据中的ROC曲线线下面积AUC＝0.859(图8B)，显著高于大部分差异表达的miRNA独立用于肝癌预测时的0.6-0.8的AUC值；后续独立研究样本验证，AUC＝0.836(图8C)，说明在前瞻性队列研究中具有优异的肝癌样本检测能力；并且在两组独立的研究样本数据中，miR-182-3p、miR-429、miR-483-5p、miR-651-5p等4个miRNA在肝癌检测组与非肝癌对照组中具有相似的表达趋势(图8D)。由此说明基于岩藻糖基化细胞外囊泡差异表达的miR-182-3p、miR-429、miR-483-5p、miR-651-5p等四个miRNA构建的组合标志物在不同样本之间均具有优异的适应性，预测能力显著高于miRNA独立使用预测的能力。
实施案例8：基于4个miRNA联合甲胎蛋白(AFP)的肝癌预测模型构建
甲胎蛋白(AFP)是一种广泛用于临床肝癌诊断的血清学标志物，也以被列入《原发性肝癌诊疗指南》，但其灵敏度和特异性均有限，单独应用具有较大局限性。本实施案例中，AFP检测采用北京热景生物的甲胎蛋白测定试剂盒(磁微粒化学发光免疫分析法)，参照试剂盒说明书进行测定。
在本实施案例中，基于实施案例7的研究成果，联合血清样本甲胎蛋白(AFP)检测结果，构建AFP联合miR-182-3p、miR-429、miR-483-5p、miR-651-5p等4个miRNA的肝癌预测模型，并与四种miRNA的独立预测模型、AFP独立检测判定进行对比；采用与肝癌预测模型构建不同的独立前瞻性研究样本对模型进行验证，上述三种模型ROC曲线线下面积表明：AFP联合4个miRNA构建的肝癌预测模型具有更优的预测效率，其AUC＝0.922(图9)，明显高于4个miRNA的独立预测模型0.86和AFP的独立预测模型0.633，上述AFP联合四种miRNA肝癌预测模型的预测能力显著高于四种miRNA的独立预测模型的预测能力和AFP独立预测能力。
根据以上实施例可知，本发明提供的利用GlyExo-Capture糖捕获技术快速、有效分离人血液样本中岩藻糖基化细胞外囊泡，并对细胞外囊泡中的miRNA建模分析，建立优异的肝癌预测模型，该模型对肝癌样本具有优异的预测能力，联合AFP使用效果更优，能有效提升肝癌早诊的预测能力，为肝癌的早期诊断、筛查提供新的思路、技术和方法。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (6)

1.用于预测肝癌的标志物组合物，其特征在于，所述标志物组合物由以下岩藻糖基化外泌体中的miRNA组成：miR-182-3p、miR-429、miR-483-5p、miR-651-5p。
2.用于预测肝癌的标志物组合物，其特征在于，所述标志物组合物由以下岩藻糖基化外泌体中的miRNA组成：
miR-182-3p、miR-429、miR-483-5p、miR-651-5p、miR-215-5p和miR-432-5p。
3.用于预测肝癌的标志物组合物，其特征在于，所述标志物组合物由以下组成：
岩藻糖基化外泌体中的miR-182-3p、miR-429、miR-483-5p、miR-651-5p和甲胎蛋白(AFP)。
4.一种用于肝癌预测或诊断的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂包括针对性检测受试者的血液样本中的如权利要求1或2所述的标志物组合物的表达水平的试剂；
或者，所述检测试剂包括针对性检测受试者的血液样本中的岩藻糖基化外泌体中的miR-182-3p、miR-429、miR-483-5p、miR-651-5p表达水平的试剂，以及针对性检测血清样本中AFP的表达水平的试剂。
5.一种用于肝癌预测或诊断的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求4所述的检测试剂。
6.如权利要求4所述的检测试剂在制备肝癌预测或诊断产品中的用途。
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miR-145-5p Acts as a Novel Tumor Suppressor in Hepatocellular Carcinoma Through Targeting RAB18;Wang B,等;Technology in Cancer Research & Treatment;第18卷(第1期);摘要和第5页右栏最后一段 *
Pivotal role of long non-coding ribonucleic acid-X-inactive specifictranscript in regulating immune checkpoint programmed deathligand 1 through a shared pathway between miR-194-5p and miR-155-5p in hepatocellular carcinoma;Sara M Atwa,等;World Journal of Hepatology;第12卷(第12期);第1222页最后一段和图9 *
Sara M Atwa,等.Pivotal role of long non-coding ribonucleic acid-X-inactive specifictranscript in regulating immune checkpoint programmed deathligand 1 through a shared pathway between miR-194-5p and miR-155-5p in hepatocellular carcinoma.World Journal of Hepatology.2020,第12卷(第12期),第1222页最后一段和图9. *
Serum levels of miRNA in patients with hepatitis B virus-associated acute-on-chronic liver failure;Ya Wen等;Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International;第2018卷(第17期);第126页摘要 *
Serum miR-182 and miR-331-3p as diagnostic and prognostic markers in patients with hepatocellular carcinoma;Lin Chen等;Tumor Biology;第36卷(第1期);7439-7447 *
Serum miR-483-5p as a potential biomarker to detect hepatocellular carcinoma;Zhoujing Zhang等;Hepatology international;第7卷(第1期);第199页左栏摘要 *
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Ya Wen等.Serum levels of miRNA in patients with hepatitis B virus-associated acute-on-chronic liver failure.Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International.2018,第2018卷(第17期),第126页摘要. *
Zhoujing Zhang等.Serum miR-483-5p as a potential biomarker to detect hepatocellular carcinoma.Hepatology international.2012,第7卷(第1期),第199页左栏摘要. *
哺乳动物核心岩藻糖基化研究进展;田银平等;浙江大学学报(农业与生命科学版);第,47卷(第1期);1-10 *
武建国等.医学实验诊断学进展.东南大学出版社,2000,第1卷(第1版),第95页. *
糖基化标志物在肝胆肿瘤临床诊断中的应用研究;徐学文;硕士学位论文电子期刊;第2021卷(第9期);1-72 *

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