CN113105990A - 一种用于痰液中脱落肿瘤细胞确认及肺癌诊断的微流控装置及其应用 - Google Patents

一种用于痰液中脱落肿瘤细胞确认及肺癌诊断的微流控装置及其应用 Download PDF

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Abstract

本申请提供了一种用于痰液中脱落肿瘤细胞确认及肺癌诊断的微流控装置及其应用，该装置包含螺旋芯片和微孔阵列芯片，微孔阵列芯片上包含微孔阵列；螺旋芯片包括单螺旋型通道、位于单螺旋通道螺旋中心末端的入口和位于单螺旋通道螺旋外侧末端的出口；所述入口为两个，分别为内侧入口和外侧入口，内侧入口为鞘流液入口，外侧入口为样品进样口；所述出口为两个，分别为内侧出口和外侧出口，内侧出口为肿瘤细胞出口，外侧出口为非肿瘤细胞出口。本发明的装置能够实现痰液中ETCs的快速分选和高通量单细胞分析，有望实现肺癌的无创、快速的诊断。

Description

一种用于痰液中脱落肿瘤细胞确认及肺癌诊断的微流控装置 及其应用
技术领域
本申请涉及微流控芯片检测技术领域，尤其涉及一种用于痰液中脱落肿瘤细胞确认及肺癌诊断的微流控装置及其应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本申请的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
为了实现对肺癌的及时有效的检测和治疗，肿瘤信息的获取无疑是首要因素。组织病理作为一种传统的肿瘤检测手段，是目前临床中获取肿瘤信息的主要手段。但依靠组织病理获取肿瘤信息的方式具有取样难、创伤大、适用性小等缺点，已很难满足检测和个性化诊疗的要求。对于高危人群、早期肺癌患者(无明显实性肿瘤)、晚期肺癌患者(无手术价值)等无肿瘤组织情况的肺癌检测存在诸多局限性，难以满足早期检测和个性化诊疗的要求。液体活检是一种近年来新型肿瘤检测方式，具有非侵入性、可重复取样、适用范围广等诸多优势，为监测肿瘤动态及个体化治疗提供新的方式。在众多液体活检技术中，基于微流控的肿瘤液体活检具有灵敏度高、消耗量低、自动化程度高以及可控性强等特点，受到越来越多的重视。目前，基于微流控技术的液体活检相关研究与临床应用主要集中在血液中肿瘤标志物(核酸，肿瘤衍生的囊泡或蛋白质以及代谢物)以及循环肿瘤细胞(CTCs)的检测。通常情况下，血清肿瘤标志物检测可用于辅助诊断、监测肿瘤进展和复发，但是目前尚缺少特异性的肺癌血清肿瘤标志物，易出现假阳性和假阴性。血液中CTCs通常可作为癌症诊断和治疗评估的一个生物标志物进行检测，但从外周血中分离CTCS则面临外周血总量较大，CTCs数量微少，早期患者无CTCs及表面肿瘤标志物缺失等原因导致的假阴性问题。
痰液是肺、支气管、气管呼吸道的分泌物，当呼吸道黏膜受到病理性刺激时则分泌的细胞即时的增多，因此，基于痰液中脱落细胞的细胞学检查是诊断呼吸道疾病的一种独特方法。通常，它具有无创、简单、可重复的优点。此外，多项研究表明，在影像学可见实体瘤形成之前痰液中已经可以检测到痰液中脱落的肿瘤细胞(ETCs)。同时，在一些肺癌高风险人群中，癌变的细胞学变化在癌症确诊的几年前就已经出现。然而，在传统的痰细胞学中，ETCs只能通过特定的细胞形态进行鉴别。该方法灵敏度低，自动化程度低，依赖病理医师经验，只能作为辅助诊断方法，假阴性率高。
痰液中ETCs的分离鉴定与外周血中CTCs的分离鉴定有显著差异。目前，血液中CTCs的分离鉴定主要依赖于上皮细胞粘附分子(EpCAM)、细胞角蛋白(CKs)、E-Cadherin等膜蛋白，这些蛋白在恶性上皮细胞上表达，而不在周围白细胞上表达。与血液不同，痰液除了含有恶性上皮细胞外，还含有正常上皮细胞(鳞状上皮细胞、柱状上皮细胞等)。上皮细胞特有的膜蛋白标记物通常在上皮来源的肿瘤细胞和正常上皮细胞上表达。因此，基于上皮肿瘤标志物的肿瘤细胞分离鉴定方法不适合痰液检测。确认痰液中ETCs的关键是排除非肿瘤上皮细胞的干扰。
发明内容
为解决目前组织病理学作为癌症诊断的金标准存在着取样难、创伤大、适用性小的不足和基于痰液中脱落细胞的传统细胞学检查灵敏度低，自动化程度低，依赖病理医师经验，假阴性率高的缺点，本发明提供了一种用于痰液中脱落肿瘤细胞确认及肺癌诊断的微流控芯片装置，以及利用该装置确认痰液中脱落肿瘤细胞、及肺癌诊断的方法，该方法能够实现痰液中ETCs的快速分选和高通量单细胞分析，有望发展一种无创、快速的肺癌诊断方法。
具体地，本发明提供了下述的技术特征，以下技术特征的一个或多个的结合构成本发明的技术方案。
在本发明的第一方面，本发明提供了一种用于痰液中脱落肿瘤细胞确认及肺癌诊断的微流控芯片装置，其包含螺旋芯片和微孔阵列芯片，微孔阵列芯片上包含微孔阵列；
螺旋芯片包括单螺旋型通道、位于单螺旋通道螺旋中心末端的入口和位于单螺旋通道螺旋外侧末端的出口；所述入口为两个，分别为内侧入口(inner inlet)和外侧入口(outer inlet)，内侧入口为鞘流液(本领域也常称之为鞘液)入口，外侧入口为样品进样口；所述出口为两个，分别为内侧出口(inner outlet)和外侧出口(outer outlet)，内侧出口为肿瘤细胞出口，外侧出口为非肿瘤细胞出口；本发明中所述内和外是以单螺旋型通道的螺旋中心作为基准，螺旋中心即两入口的交汇处，靠近螺旋中心一侧定义为内(比如内侧、内壁)、远离螺旋中心一侧定义为外(比如外侧、外壁)。
在本发明的实施方式中，螺旋芯片中单螺旋型通道的横截面为矩形，其宽(矩形的长边)为500μm，高(矩形的短边)为170μm。如无特殊说明，本发明所述矩形的宽表示矩形的长边，矩形的高表示矩形的短边。
在本发明的实施方式中，入口和出口的横截面为矩形，其中，内侧入口的横截面矩形的宽为425μm，外侧入口的横截面矩形的宽为75μm；内侧出口的横截面矩形宽为150μm，外侧出口的横截面矩形宽为350μm；入口和出口的横截面矩形的高恒为170μm。
在本发明的实施方式中，微孔阵列为PDMS材质。
在本发明的实施方式中，微孔阵列尺寸为10×10mm，其上包含250×250个微孔，微孔的尺寸为20×20×50μm。
本发明中所述微流控芯片装置的尺寸及截面形状、及微孔尺寸和数量是特定的，在该特定设计下痰液样品与鞘流液以特定的流速在其各自的特定的入口汇入单螺旋型通道，在通道内形成层流的同时实现力的平衡，使得肿瘤细胞在内侧出口被分选得到。
在本发明的一些实施方式中，所述微流控芯片装置中还含有离心加载装置，微孔阵列芯片通过离心加载装置与螺旋芯片的内侧出口相连。
在本发明的第二方面，本发明提供了上述第一方面中所述的微流控芯片装置在确认痰液中脱落肿瘤细胞方面以及在肺癌诊断或肺癌辅助诊断中的应用。
在本发明的第三方面，本发明提供了一种确认痰液中脱落肿瘤细胞的方法，所述方法基于本发明上述第一方面中所述的微流控芯片装置。具体地，所述方法包括以下步骤：
提供一种微流控装置，所述微流控装置包含螺旋芯片和微孔阵列芯片，微孔阵列芯片上包含微孔阵列；
螺旋芯片包括单螺旋型通道、位于单螺旋通道螺旋中心末端的入口和位于单螺旋通道螺旋外侧末端的出口；所述入口为两个，分别为内侧入口和外侧入口，内侧入口为鞘流液入口，外侧入口为样品进样口；所述出口为两个，分别为内侧出口和外侧出口，内侧出口为肿瘤细胞出口，外侧出口为非肿瘤细胞出口。
将痰液样品由外侧入口注入单螺旋型通道，并在内侧入口通入鞘流液，样品与鞘流液以各自流速汇入单螺旋型通道，于通道内实现细胞分选；收集出口分选得到的细胞，并分别以单分散细胞的形式离心加载在微孔阵列芯片的微孔中；
对微孔中加载的单分散细胞进行原位RT-PCR检测，检测肿瘤标志物为TERT和HK-2，根据单分散细胞中TERT和HK-2的荧光强度建立阈值，单分散细胞中TRET和HK-2的表达同时超过所述阈值，则认为该细胞为肿瘤细胞。
端粒酶逆转录酶(TERT)在维持端粒稳定和控制细胞无限增殖中起着重要作用。研究表明，85％的人类肿瘤组织中都检测到端粒酶活性。在端粒酶的重要组成部分中，虽然人端粒酶RNA(hTR)和人端粒酶相关蛋白1(hTEP1)在所有组织中都有表达，但正常细胞中TERT表达受到抑制，肿瘤细胞中TERT表达上调。因此，与肿瘤永生化相关的TERT表达可用于区分肿瘤细胞与非肿瘤细胞。己糖激酶2(HK-2)是糖酵解途径的第一个酶，是肿瘤组织中糖酵解的限速酶。它在肿瘤组织中的表达和活性增加，使肿瘤组织在低氧条件下保证足够的能量。同时，许多糖酵解的中间产物可以被肿瘤细胞用来合成蛋白质、核酸、酯类等，为肿瘤细胞的生长增殖提供了物质基础。研究表明，HK-2在许多肿瘤细胞中过表达。因此，与肿瘤高代谢相关的HK-2可以作为另一种肿瘤标志物。因此，本发明根据肿瘤细胞的永生化性和高代谢性，选择两种肿瘤功能相关标记物TERT和HK-2来区分肿瘤细胞和非肿瘤细胞。
正常的人新鲜痰液中会含有非肿瘤上皮细胞(比如柱状上皮细胞、鳞状上皮细胞)和以及粒细胞；肺癌患者的新鲜痰液样品中还会含有ETCs。其中，痰液中细胞的尺寸(直径)分别为：痰液中肿瘤细胞的尺寸(直径)在15-20μm左右，柱状上皮细胞的尺寸在23-27μm左右，鳞状上皮细胞的尺寸为50-60μm左右，粒细胞的尺寸为7-9μm左右。在本发明的实施方式中，痰液样品与鞘流液以其各自的流速分别注入外侧入口和内侧入口，然后以各自的速率汇入单螺旋型通道内形成层流，ETCs、柱状上皮细胞和粒细胞的粒径与核质比不同，因此在单螺旋型通道内受到的惯性升力(FL)和Dean拖拽力(FD)也不同，随着样品在螺旋通道中不断流动，在FL和FD的共同作用下，不同尺寸的细胞在通道中会被定位在不同的位置。在不同受力作用下粒径较小的细胞(如粒细胞)在通道外壁附近呈带状分布，被分选到外侧出口，粒径较大的细胞(如肿瘤细胞和少量的非肿瘤上皮细胞)集聚在通道内壁附近，被分选到内侧出口，由此实现了脱落肺癌细胞的初步分选。
在本发明的一个或多个实施方式中，单螺旋通道的横截面为矩形，矩形的宽为500μm，高为170μm。
入口和出口的横截面为矩形，其中，内侧入口的横截面尺寸为425μm(宽)，外侧入口的横截面尺寸为75μm(宽)；内侧出口的横截面尺寸为150μm(宽)，外侧出口的横截面尺寸为350μm(宽)。
在本发明的实施方式中，初步分选得到的细胞通过离心的方式加载到微孔阵列芯片的微孔中，当以特定的细胞浓度离心加载时，细胞以单分散的形式分散在微阵列芯片中，实现高通量单细胞装载，同时微孔可以装载RT-PCR试剂进行原位RT-PCR分析。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述该阵列芯片使用标准的微工艺软光刻技术以聚二甲基硅氧烷(PDMS)为原料制备。
在本发明的一个或多个实施方式中，微孔阵列尺寸为10×10mm，其上包含250×250个微孔(62500个)，微孔的尺寸为20×20×50μm。
在本发明的实施方式中，痰液样品的流速100μL/min；鞘流液的流速为800-900μL/min，优选为850μL/min。在本发明的一个或多个实施方式中，所述鞘流液为PBS缓冲液。
在本发明的一些实施方式中，发明人研究了样品和鞘流液的流速，结果发现，以已知肿瘤细胞浓度的痰液作为样品，当痰液样品的流速为100μL/min，以PBS缓冲液作为鞘流液以700-900μL/min的流速通入螺旋芯片的内侧入口，并进一步研究了825-875μL/min的流速，其中，以鞘流液流速为850μL/min时，肿瘤细胞的回收率更优，肿瘤细胞的回收率可达92.44％；以及，在该研究的基础上，本发明还研究了痰液样品的细胞浓度对肿瘤细胞回收率的影响，结果发现，痰液样品的细胞浓度为102-106cell/mL，肿瘤细胞的回收率均处于较高的水平(约为90％)，当细胞密度过大，比如超过106cell/mL时，回收率数值出现较大波动，出现回收率略低的情况，这主要是因为肿瘤细胞分选时存在惯性升力和Dean拖拽力，较高的细胞密度会使螺旋芯片通道中细胞间相互碰撞或者受到力的相互作用，从而影响通道内的力平衡，难以实现预期的层流状态。
在本发明的实施方式中，将分选得到的细胞处理成单分散细胞悬液可采用本领域的常规处理方式，或者采用能够实现单细胞分散的细胞离心加载装置。离心加载时的浓度为10-500cell/μL，优选为10-100cells/μL的细胞浓度。
为在本发明的实施过程中，发明人发现，单细胞加载时的细胞浓度会影响微孔内可加载的细胞个数，单孔内加载多个细胞时会对实验中单细胞分析产生影响，为此，本发明对单细胞加载的细胞浓度范围进行了研究。在本发明的一些实施方式中，取细胞浓度为10-500cell/μL的200μL细胞悬液，以离心的方式(3000rpm，5min)将细胞装入微孔阵列。结果发现，随着细胞浓度的增加，不含细胞的微孔数量不断减少，含1个细胞的微孔数量不断增加。然而，随着细胞浓度的增加，含有一个以上细胞的微孔数量也在增加。通过计算含有单个细胞的微孔占所有含有细胞的微孔的百分比，结果显示在上述细胞浓度范围内细胞浓度越低，含单细胞的微孔在含细胞的微孔中所占比例越大。在本发明的一些实施方式中，10-100cells/μL的细胞浓度作为单细胞加载浓度时，既能够保持较高的细胞加载速率，又能够保证微孔阵列芯片具有较高的单细胞分散率。
在本发明的实施方式中，在微孔中装载RT-PCR试剂，对微孔中加载的单分散细胞进行原位RT-PCR检测。
在本发明的一个或多个实施方式中，RT-PCR试剂包括2×reaction mix，SuperScript III RT Platinum Taq Mix，TERT荧光探针，HK-2荧光探针和RNase-free水；RT-PCR试剂的体积为120μL；
在本发明的一个或多个实施方式中，所述荧光探针为TERT-FAM，HK-2-VIC。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述原位RT-PCR扩增条件为：55℃孵育45min；95℃预变性6min；95℃60s、65℃60s，12个循环；95℃60s、60℃60s，18个循环；最后4℃冷却。
在本发明的一些实施方式中，采用微孔阵列上的RT-PCR方法分析了肿瘤标志物TERT和HK-2中在肺癌细胞系A549细胞、肺癌患者临床组织(肿瘤组织和癌旁组织)和白细胞中的表达情况以验证该方法是否能够区分肿瘤细胞和非肿瘤细胞。结果表明，与非肿瘤细胞(白细胞、癌旁组织)相比，肿瘤细胞(肺癌细胞系、肿瘤组织)高表达TERT和HK-2。因此，TERT和HK-2的表达差异可用于区分肿瘤细胞和非肿瘤细胞。
在本发明的一些实施方式中，本发明以已知肿瘤细胞(肺癌细胞系或肿瘤组织)和非肿瘤细胞(癌旁组织或白细胞)的单细胞荧光强度的95％以上作为反映肿瘤细胞基因表达的有效数据，建立荧光阈值，在本发明的一些实施方式中，将代表A549单细胞表达水平的TERT和HK-2的单细胞荧光强度的95％以上作为反映肿瘤细胞基因表达的有效数据，建立了肿瘤细胞阈值，其中，TERT的阈值为35.70，HK-2的阈值为34.50。若细胞中TRET和HK-2的表达同时超过这个阈值，则认为该细胞为肿瘤细胞。同时验证了该阈值的有效性。
基于上述方法，在本发明的第四方面，本发明还提供了一种基于痰液脱落肿瘤细胞的肺癌诊断系统，其包括：
细胞分选单元、RT-PCR检测单元和数据分析单元；
其中，细胞分选单元将待处理痰液作为样本通入分选单元，实现对痰液中细胞的分选，并获得单分散的细胞；
RT-PCR检测单元以TERT和HK-2为标志物对获得的单分散细胞进行原位RT-PCR检测，获取荧光数据并输送至数据分析单元；
数据分析单元将分选细胞的荧光强度与肿瘤细胞的TRET和HK-2荧光强度阈值进行比较，并输出比较结果。
其中，分选细胞的荧光强度与肿瘤细胞的TRET和HK-2荧光强度阈值进行比较，均高于肿瘤细胞的TRET和HK-2荧光强度阈值时，则认为分选细胞为肿瘤细胞。
在本发明的实施方式中，所述细胞分选单元包含螺旋芯片、离心加载装置、微孔阵列芯片；
螺旋芯片包括单螺旋型通道、位于单螺旋通道螺旋中心末端的入口和位于单螺旋通道螺旋外侧末端的出口；所述入口为两个，分别为内侧入口和外侧入口，内侧入口为鞘流液入口，外侧入口为痰液样品进样口；所述出口为两个，分别为内侧出口和外侧出口，内侧出口为肿瘤细胞出口，外侧出口为非肿瘤细胞出口；
微孔阵列芯片上包含微孔阵列，微孔阵列芯片通过离心加载装置与螺旋芯片的内侧出口相连。
通过上述技术手段，可实现以下有益效果：
(1)本发明提出了一种基于微流控系统的肺癌无创诊断新方法，通过分析痰液中ETCs的变化来实现肺癌的无创诊断。本发明提出的微流控系统由用于ETCs分选的螺旋结构和用于高通量单细胞分析的微孔阵列组成，能够进一步识别ETCs。
(2)本发明首次提出使用痰液中ETCs作为肺癌诊断的分选样本。此外，通过单细胞RT-PCR分析与肿瘤细胞永生化和高代谢相关的TERT和HK-2的表达水平，建立了一种区分肿瘤细胞与非肿瘤细胞，特别是非肿瘤上皮细胞的新的分析方法。
(3)本发明方法通过分析临床肺癌患者痰液中的脱落细胞，实现了肺癌的诊断。为肺癌患者的无创检测和高危人群肺癌的实用筛查提供一种新的策略，也为其他非血液体液样本的肿瘤细胞分析提供一种新的方法。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。以下，结合附图来详细说明本申请的实施方案，其中：
图1：螺旋芯片示意图。
图2：(A)微孔阵列芯片的照片；(B)局部微孔阵列芯片的代表性图像。(C)单个微孔的结构。
图3示出了痰液样本的H&E染色图，其中(A)肺腺癌细胞，(B)粒细胞，(C)鳞状上皮细胞和(D)柱状上皮细胞的示例图像。Scale bars,20μm。
图4示出了痰液样本中不同细胞的大小频率分布直方图；(A)肿瘤细胞，(B)柱状上皮细胞，(C)鳞状上皮细胞，(D)粒细胞。
图5：(A)不同鞘流液流速下A549模拟临床样品的回收率；(B)825-875μL/min的鞘流液流速下A549模拟临床样品的回收率；(C)不同浓度A549细胞下，模拟临床样品中A549细胞的回收率；(D)从模拟临床样品中分选出A549的分选纯度。
图6示出了螺旋芯片内部出口处的肿瘤细胞(A549)的代表性图像(视频截图)，Scale bars,150μm，视野中箭头所指细胞即为肿瘤细胞。
图7：(A)包含单个细胞的微孔占所有包含细胞的微孔的百分比；(B)在不同浓度的细胞下，含0、1、多个细胞的微孔占所有含细胞微孔的百分比。
图8：荧光强度散点图表示不同类型细胞中单细胞TERT(A)和HK-2(B)的表达水平；(C)荧光强度代表了不同类型细胞中TERT和HK-2的单细胞表达水平。
图9：荧光强度的散点图表示从A-M患者分离的所有细胞中单细胞TERT或HK-2的表达水平。N值表示样本中TERT和HK-2表达水平均高于阈值的细胞数，即肿瘤细胞数。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本申请。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本申请所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本申请所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本申请方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
文中术语“和/或”，仅仅是一种描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，单独存在B，同时存在A和B三种情况，本文中术语“/和”是描述另一种关联对象关系，表示可以存在两种关系，例如，A/和B，可以表示：单独存在A，单独存在A和B两种情况，另外，本文中字符“/”，一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
本文使用的术语仅用于描述特定实施例，并且不意在限制本申请的示例实施例。如本文所使用的，单数形式“一”、“一个”以及“该”意在包括复数形式，除非上下文明确指示相反意思。还应当理解术语“包括”、“包括了”、”包含”、和/或“包含了”当在本文中使用时，指定所声明的特征、整数、步骤、操作、单元和/或组件的存在性，并且不排除一个或多个其他特征、数量、步骤、操作、单元、组件和/或他们的组合的存在或增加。
应当理解，尽管在本申请可能采用术语第一、第二、第三等来描述各种信息，但这些信息不应限于这些术语。这些术语仅用来将同一类型的信息彼此区分开。例如，在不脱离本申请范围的情况下，第一信息也可以被称为第二信息，类似地，第二信息也可以被称为第一信息。取决于语境，如在此所使用的词语“如果”可以被解释成为“在……时”或“当……时”或“响应于确定”。
此外，特定特征、结构、功能或特性可以以任何适合的方式组合到一个或多个实施例中。例如，第一实施例可以结合第二实施例，只要与这两个实施例相关联的特定特征、结构、功能或特性不互相排斥。
本发明提出的一种用于痰液中脱落肿瘤细胞快速分选和高通量单细胞分析的微流控装置，该装置由螺旋芯片和微孔阵列芯片组成。如图1所示，螺旋芯片包括单螺旋型通道、位于单螺旋通道螺旋中心末端的入口和位于单螺旋通道螺旋外侧末端(外周)的出口。所述入口为两个，分别为内侧入口(inner inlet，入口1)和外侧入口(outer inlet，入口2)，内侧入口为鞘流液入口，外侧入口为样品进样口。所述出口为两个，位于螺旋芯片外周，分别为内侧出口(inner outlet，出口4)和外侧出口(outer outlet，出口3)，内侧出口收集尺寸较大的细胞，外侧出口收集尺寸较小的细胞。
单螺旋型通道横截面为矩形，矩形的宽为500μm，高为170μm。
入口和出口的横截面为矩形，其中，入口1的横截面尺寸为425μm(宽)，入口2的横截面尺寸为75μm(宽)；出口4的横截面尺寸为150μm(宽)，出口3的横截面尺寸为350μm(宽)。痰液样品与鞘流液以特定的流速在其各自的入口汇入单螺旋型通道，在该特定通道内形成层流，如图1中(a)和(b)的细节图可知。
所述微孔阵列芯片如图2所示，其微孔阵列使用标准的微工艺软光刻技术以聚二甲基硅氧烷(PDMS)为原料制备。所述微孔阵列芯片10×10mm的PDMS上包含62500(250×250)个孔，每个孔的尺寸为20×20×50μm。
实施例1使用上述微流控装置对痰液样品进行高效分选和高通量分析具体步骤如下：
(1)以加有标记肿瘤细胞的非肿瘤患者的痰液来模拟肺癌患者的临床痰液样本。向非癌症病人的痰液处理液中加入DiD染色的A549细胞，使A549的细胞浓度为104cell/mL作为模拟样品，将模拟样品注入螺旋芯片的入口2，对出口4和出口3处的A549细胞进行计数，验证螺旋芯片的分选效率。其中，DiD为一种亲脂染料，能够保证染料不会污染样品中原始的细胞。图3示出了痰液样本的H&E染色图，图4示出了痰液样本中不同细胞的大小频率分布直方图。
PBS缓冲液作为鞘流液以700-900μL/min的流速通入螺旋芯片的入口1。当鞘流液流速为850μL/min时，肿瘤细胞的回收率为92.44％(图5A)。为进一步优化鞘流液地流速，在流速为825μL/min和875μL/min的分选效率进行测试，证明流速为850μL/min时，肿瘤细胞的回收率最高(图5B)，确定850μL/min为最佳流速。
将鞘流液(PBS)以850μL/min的流速通入螺旋芯片的入口1，将A549的浓度分别为102、103、104、105、106cell/mL的模拟临床样品以100μL/min的流速通入螺旋芯片的样品入口2，统计经分选后的肿瘤细胞A549的回收率。如图5C，在一定的细胞密度范围内(102-105cell/mL)，肿瘤细胞回收率均处于较高的水平(约为90％)。当细胞密度过大时(106cell/mL)，回收率数值出现较大波动，出现回收率略低的情况，这主要是因为肿瘤细胞分选时存在惯性升力和Dean拖拽力，较高的细胞密度使芯片通道中的细胞之间相互碰撞或者受到力的相互作用，从而影响了之前的力平衡。
向预处理过的非肺癌患者痰液中加入A549细胞，使A549细胞的浓度为104cell/mL，以此模拟临床样品，并以100μL/min通入入口2，PBS缓冲液以850μL/min的流速通入入口1，统计各出口处细胞的数量计算螺旋芯片的分选纯度。如图5D所示，内侧出口(出口4)中肿瘤细胞A549纯度高达91.33％，而脱落的非肿瘤上皮细胞及粒细胞相对较少。相反，外侧出口(出口3)的肿瘤细胞纯度在7％左右，大部分的细胞是非肿瘤细胞。由此可见，螺旋芯片用于肿瘤细胞的分选时具有较好的分选效果。图6示出了螺旋芯片内部出口处的肿瘤细胞(A549)的代表性图像，根据该图可明显看出，肿瘤细胞明显往内侧出口处流出。
(2)为了保证芯片能够实现孤立细胞的单细胞加载，对微孔芯片的单细胞加载能力进行了评估。
考虑到微孔数量(m)远大于细胞数量(n)，微孔中细胞分布定义为泊松分布。对于一定数量的微孔，微孔最多包含一个细胞的概率可以表示为：
Figure BDA0002965935510000121
Figure BDA0002965935510000122
Figure BDA0002965935510000131
根据上式，每个微孔芯片包含62500个孔，当微孔中包含一个细胞或不包含细胞的概率达到99.9％以上时，微孔芯片捕获到的细胞小于2750个。分选的痰处理液细胞浓度通常小于104个cell/mL(体积为200μL)，因此微孔阵列上装载的细胞数一般小于2750个。因此，此微孔阵列芯片在理论上可以进行单细胞水平上的高通量分析。
进一步地，为了避免单孔加载多个细胞对实验中单细胞分析的影响，对单细胞加载的细胞浓度范围进行了优化。取细胞浓度为10-500cell/μL的200μL细胞悬液，以离心的方式(3000rpm，5min)将细胞装入微孔阵列。结果如图7A所示，随着细胞浓度的增加，不含细胞的微孔数量不断减少，含1个细胞的微孔数量不断增加。然而，随着细胞浓度的增加，含有一个以上细胞的微孔数量也增加。通过计算含有单个细胞的微孔占所有含有细胞的微孔的百分比，显示细胞浓度越低，含单细胞的微孔在含细胞的微孔中所占比例越大(图7B)。在保持较高的细胞加载速率的前提下，必须保证芯片具有较高的单细胞分散率。综上所述，选择10-100cells/μL的细胞浓度作为最佳单细胞加载浓度。
实施例2检测单细胞中TERT和HK-2的表达
(1)本发明采用微孔阵列上的RT-PCR方法分析了TERT和HK-2在A549、肺癌患者临床组织(肿瘤组织和癌旁组织)和白细胞中的表达情况，以验证该方法是否能够区分肿瘤细胞和非肿瘤细胞。在检测样本中，A549和肿瘤组织分别代表痰液中的ETCs，癌旁组织和白细胞分别代表痰液中的非肿瘤上皮细胞和粒细胞。对阵列芯片上的微孔的平均荧光强度进行统计，通过平均荧光强度评估TERT和HK-2在不同类型细胞中的表达。分别统计A549、肿瘤组织、癌旁组织和白细胞的TERT和HK-2荧光强度。图8A、B中各点的纵坐标为含单细胞微孔的平均荧光强度，代表细胞中TERT或HK-2的表达。结果表明，与非肿瘤细胞(白细胞、癌旁组织)相比，肿瘤细胞(肺癌细胞系、肿瘤组织)高表达TERT和HK-2。因此，TERT和HK-2的表达差异可用于区分肿瘤细胞和非肿瘤细胞。
进一步地，A549、肿瘤组织、癌旁组织和细胞都需要处理成细胞浓度小于104个cell/mL的单细胞悬液以保证样品以单细胞的形式分散在芯片中。将上述细胞通过离心(3000rpm，5min)加载至微孔芯片进行原位RT-PCR，将加载细胞的微孔阵列芯片在75℃下完全干燥7min，然后在脱水的微孔芯片上加入120μL PCR试剂，4℃下离心(3000rpm)15min。随后将一个与微孔阵列大小相同的PCR胶粘剂放置在微孔芯片的顶部，4℃下离心(3000rpm)10min。将一个0.15mm玻璃载玻片放置在芯片的顶部，并用PCR胶带固定。然后将矿物油置于盖玻片和显微镜玻片之间，以防止热循环过程中的蒸发。将已经加载细胞并密封好的芯片放置在原位PCR仪上进行热循环。
所述加入RT-PCR试剂的体积为120μL。
所述RT-PCR试剂包括2×reaction mix(66.6μL)，SuperScript III RT PlatinumTaq Mix(3μL)，TERT荧光探针(6μL)，HK-2荧光探针(6μL)，RNase-free水(38.4μL)。
所述TERT、HK-2荧光探针为TERT-FAM，HK-2-VIC。
所述原位RT-PCR扩增条件为：55℃孵育45min；95℃预变性6min；95℃60s、65℃60s，12个循环；95℃60s、60℃60s，18个循环；最后4℃冷却。
进一步地，将肿瘤组织和癌旁组织处理单细胞悬液具体步骤为：首先将组织用PBS冲洗3遍，将组织外表的脂肪、上皮以及坏死组织去除后，剪碎。随后将组织碎块用PBS清洗至上清液澄清。吸取上清液后，加入5mL工作液：10μL DNA Ι聚合酶、10μL DNA Ι聚合酶Buffer、5mg胶原酶Ι、50μL TH胶原酶、及RNase-free水(补足5mL)。室温下，摇床(110rpm)振荡消化2h(根据组织的大小和消化的情况适当增加消化时长)后，弃上清液。向消化过的细胞沉淀中加入PBS，轻轻吹散细胞沉淀后将其上清液通过70μm的无菌过滤网。上述操作重复5次。将过滤的单细胞悬液在4℃下离心(500g)5min。在沉淀中加入1-2mL红细胞裂解液,室温消化3-4min后在4℃下离心(500g)5min。加入PBS吹匀细胞沉淀即得到了组织分散的单细胞悬液。癌旁组织采用相同的处理方法。
进一步地，得到白细胞悬液的具体步骤：将全血样品，以1500rpm的速度离心5min去除上清液(血清)。加入PBS配至8mL，30°倾斜加入4mL的人淋巴细胞分离液并以2000rpm的速度离心20min。取中间白细胞层转移到PBS溶液中至12mL，以1500rpm的速度离心5min后去上清，得到白细胞悬液。
实施例3区分和确认肿瘤细胞的分析方法的构建
根据已知肿瘤细胞(肺癌细胞系或肿瘤组织)和非肿瘤细胞(癌旁组织或白细胞)的单细胞荧光数据建立阈值。本发明将代表A549单细胞表达水平的TERT和的HK-2的单细胞荧光强度的95％以上作为反映肿瘤细胞基因表达的有效数据，建立了肿瘤细胞阈值。如图8C，TERT的阈值为35.70，HK-2的阈值为34.50。若细胞中TRET和HK-2的表达同时超过这个阈值，则认为该细胞为肿瘤细胞。
为了验证阈值的有效性，图5C列出了已知的A549、肿瘤组织、癌旁组织和白细胞的荧光强度。位于区域2的细胞是两种基因均高表达的肿瘤细胞。结果表明，癌旁组织，白细胞位于区域1、3、4，癌组织中大量细胞位于区域2，说明阈值有效。
实施例4利用所建立的微流控芯片装置和分析方法对痰液中脱落的肺癌细胞进行检测
本发明对9名肺癌患者(肺鳞癌和肺腺癌)和4名非肺癌病人的痰液用相同的方法进行了分析。图9列出了样品中所有的有效荧光信号。如图4C所示，大多数肺癌患者痰中细胞的荧光强度明显高于非癌症患者的细胞。根据之前建立的肿瘤细胞阈值，统计不同样本中ETCs的数量。9例肺癌患者痰标本中有6例(N≥3)存在ETCs，3例肺癌患者(N≤3)未检测到足够的ETCs，这可能是由于缺乏ETCs或在治疗过程中丢失所致。所有非肿瘤患者细胞中TERT和HK-2的表达均分布在非肿瘤细胞区，这些样本中均未发现肿瘤细胞。这一结果与临床诊断相符。数据显示，不同患者的肿瘤细胞数量和基因表达存在显著差异，在一定程度上反映了肺癌患者的个体异质性。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，尽管参照前述实施例对本申请进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.用于痰液中脱落肿瘤细胞确认及肺癌诊断的微流控芯片装置，其包含螺旋芯片和微孔阵列芯片，微孔阵列芯片上包含微孔阵列；
螺旋芯片包括单螺旋型通道、位于单螺旋通道螺旋中心末端的入口和位于单螺旋通道螺旋外侧末端的出口；所述入口为两个，分别为内侧入口和外侧入口，内侧入口为鞘流液入口，外侧入口为样品进样口；所述出口为两个，分别为内侧出口和外侧出口，内侧出口为肿瘤细胞出口，外侧出口为非肿瘤细胞出口。
2.根据权利要求1所述的用于痰液中脱落肿瘤细胞确认及肺癌诊断的微流控芯片装置，其特征在于，螺旋芯片中单螺旋型通道的横截面为矩形，其宽为500μm，高为170μm；
优选地，入口和出口的横截面为矩形，其中，内侧入口的横截面矩形的宽为425μm，外侧入口的横截面矩形的宽为75μm；内侧出口的横截面矩形的宽为150μm，外侧出口的横截面矩形的宽为350μm；入口和出口的高为170μm；
优选地，微孔阵列为PDMS材质；
优选地，微孔阵列尺寸为10×10mm，其上包含250×250个微孔，微孔的尺寸为20×20×50μm；
优选地，所述微流控芯片装置中还含有离心加载装置，微孔阵列芯片通过离心加载装置与螺旋芯片的内侧出口相连。
3.权利要求1或2中所述的微流控芯片装置在确认痰液中脱落肿瘤细胞方面中的应用。
4.一种确认痰液中脱落肿瘤细胞的方法，其基于权利要求1或2所述的微流控芯片装置，其包括：
将痰液样品由外侧入口注入单螺旋型通道，并在内侧入口通入鞘流液，样品与鞘流液以各自流速汇入单螺旋型通道，于通道内实现细胞分选；收集出口分选得到的细胞，并分别以单分散细胞的形式离心加载在微孔阵列芯片的微孔中；
对微孔中加载的单分散细胞进行原位RT-PCR检测，检测肿瘤标志物TERT和HK-2，根据单分散细胞中TERT和HK-2的荧光强度建立阈值，单分散细胞中TRET和HK-2的表达同时超过所述阈值，则认为该细胞为肿瘤细胞。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，痰液样品的流速100μL/min；鞘流液的流速为800-900μL/min，优选为850μL/min；
优选地，所述鞘流液为PBS缓冲液。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，痰液样品的细胞浓度为102-106cell/mL；
优选地，单分散细胞的离心加载浓度为10～500cell/μL，优选为10～100cells/μL。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，RT-PCR试剂包括2×reaction mix，SuperScript III RT Platinum Taq Mix，TERT荧光探针，HK-2荧光探针和RNase-free水；
优选地，所述荧光探针为TERT-FAM，HK-2-VIC；
优选地，所述原位RT-PCR扩增条件为：55℃孵育45min；95℃预变性6min；95℃60s、65℃60s，12个循环；95℃60s、60℃60s，18个循环；最后4℃冷却。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，TERT的阈值为35.70，HK-2的阈值为34.50。
9.一种基于痰液脱落肿瘤细胞的肺癌诊断系统，其包括：
细胞分选单元、RT-PCR检测单元和数据分析单元；
其中，细胞分选单元将待处理痰液作为样本通入分选单元，实现对痰液中细胞的分选，并获得单分散的细胞；
RT-PCR检测单元以TERT和HK-2为标志物对获得的单分散细胞进行原位RT-PCR检测，获取荧光数据并输送至数据分析单元；
数据分析单元将分选细胞的荧光强度与肿瘤细胞的TRET和HK-2荧光强度阈值进行比较，并输出比较结果。
10.根据权利要求9所述的肺癌诊断系统，其特征在于，所述细胞分选单元包含螺旋芯片、离心加载装置、微孔阵列芯片；
螺旋芯片包括单螺旋型通道、位于单螺旋通道螺旋中心末端的入口和位于单螺旋通道螺旋外侧末端的出口；所述入口为两个，分别为内侧入口和外侧入口，内侧入口为鞘流液入口，外侧入口为痰液样品进样口；所述出口为两个，分别为内侧出口和外侧出口，内侧出口为肿瘤细胞出口，外侧出口为非肿瘤细胞出口；
微孔阵列芯片上包含微孔阵列，微孔阵列芯片通过离心加载装置与螺旋芯片的内侧出口相连。
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