CN104293914A - 用于检测原发性肝细胞癌的血清miRNA标志物组合及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属生物技术领域，涉及一种用于区分原发性肝细胞癌与正常人的血清miRNA标志物组合及应用。本发明的用于检测原发性肝细胞癌的血清miRNA标志物组合包括下列8种has-miRNA：hsa-miR-206,hsa-miR-141-3p,hsa-miR-433-3p,hsa-miR-1228-5p,hsa-miR-199a-5p,hsa-miR-122-5p,hsa-miR-192-5p,和hsa-miR-26a-5p。本发明能够实现原发性肝细胞癌的早期发现以及迅速的无创性检测。
Description
技术领域
本发明涉及本发明属生物技术领域，涉及一种用于区分原发性肝细胞癌与正常人及乙肝肝硬化的血清miRNA标志物组合及应用。
背景技术
原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是全球第三大肿瘤死亡的疾病，每年有近50万死亡病例。一年内高死亡的重要原因是只有30％-40％的HCC能得到早期正确的诊断而进行治疗，所以，研究认为早期诊断是提高HCC生存的关键。目前诊断HCC的主要手段是：影像学诊断和生物标志物诊断。因此，寻找新的敏感性高和特异性强的血清标志物显得尤为重要。
miRNA(microRNA)是一类内源性非编码单链小分子RNA，长度为18～24个核苷酸。miRNA普遍存在于人类的体液中，性质稳定，可以定量检测，且存在显著的疾病特异性。近年的研究表明，血液、唾液、尿液、乳汁及脑脊液等体液miRNA检测可应用于妊娠等生理状态的判断以及肿瘤、感染、代谢及阿尔海默茨病等疾病的诊断和预后判断。体液特异性miRNA检测的临床意义及应用前景已引起高度关注，miRNA作为一类非编码调节性的小分子RNA有可能取代传统的特异蛋白为代表的生物标志物。体液miRNA含量丰富且性质稳定，具备成为优异生物标志物的潜质，并且拥有以蛋白质为代表的传统生物标志物不具备的特性，无需抗体制备且易于精确定量，可能克服抗原抗体类生物标志物的制备瓶颈。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种能够用于HCC的早期发现以及进行快速的无创性检测的血清miRNA标志物组合及应用。
本发明包括以下技术方案：
本发明的用于检测原发性肝细胞癌的血清miRNA标志物组合包括下列8种hsa-miR-206,hsa-miR-141-3p,hsa-miR-433-3p,hsa-miR-1228-5p,hsa-miR-199a-5p,hsa-miR-122-5p,hsa-miR-192-5p,和hsa-miR-26a-5p。
本发明的用于检测原发性肝细胞癌的miRNA探针组合，是基于下列核苷酸序列：SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.7、SEQ ID N0.8。
上述用于检测原发性肝细胞癌的miRNA探针组合在制备检测HCC的试剂中的应用。
本发明的用于检测原发性肝细胞癌的试剂盒，包括上述用于检测HCC的miRNA探针组合，还包括Taq酶、氯化镁和PCR缓冲液。
本发明的权利要求用于检测原发性肝细胞癌的miRNA引物组合是基于下列核苷酸序列：SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ IDN0.5、SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.7、SEQ ID N0.8。
本发明权利要求用于检测原发性肝细胞癌的试剂盒，包括上述用于检测原发性肝细胞癌的miRNA引物组合，还包括Taq酶、氯化镁和PCR缓冲液。
本发明能够实现HCC的早期发现以及迅速的无创性检测。
附图说明
图1是本发明实施例的三组mappable reads数据及长度分析图；
图2训练集HCC 8种miRNA与正常对照组和肝硬化组的比较；
图3－图10是8种miRNA在训练集ROC曲线下面积；
图11－图12是miRNA组合在训练集和验证集ROC曲线下面积；
图13－图14是miRNA组合区分HCC组与正常对照组和HCC组与肝硬化组的ROC曲线下面积；
图15－图17是AFP在不同组别的ROC曲线下面积；
图18－图20是miRNA组合比较AFP在不同组别的ROC曲线下面积。
具体实施方式
研究对象
共有261例HCC患者，233例肝硬化患者和173例健康对照者，患者来自门诊及住院患者，健康志愿者来自体检中心，无器质性疾病以及精神性疾病人群。发现阶段分别有3例正常对照、3例肝硬化患者和3例HCC患者混合血清标本进行Illumina Hiseq 2000深度测序；筛选阶段分别20例正常对照、20例肝硬化患者和20例HCC患者；训练阶段有90例正常对照、132例肝硬化患者和135例HCC患者入选；验证阶段60例正常对照、78例肝硬化患者和103例HCC患者。患者和健康人群基本情况见表1。
实验方法
样品采集：患者在首次门诊或住院时采集新鲜血液5ml于医用血清管中(无肝素抗凝)，上下轻轻颠倒混匀，立即将全血置于4O℃冰盒中保存，并在2h内4000g，离心10min。将上层血清转移至1.5ml离心管(RNase free)中，13000g，离心2min。最后将上清液转移至2ml旋盖尖底离心管中(RNase free)，每个管子吸入250ul血清进行分装，弃去血细胞沉淀。置于-80℃长期保存。
总RNA提取及质检：血清RNA的抽提采用LCS TRK1001试剂盒(LC Sciences)操作说明书进行。随机抽取两个在血清中稳定表达的miRNA作为标准检测总RNA提取质量，分别为hsa-miR-16、hsa-miR-192。然后各取2μl，以上述引物对应的逆转录引物分别逆转录(反应体系为10μl)；以1μl/孔的cDNA为模板，进行realtimePCR，反应体系为20μl，复孔为三个，同时做引物NTC(模板以水代替)。然后检测hsa-miR-16和hsa-miR-192PCR扩展曲线、溶解曲线以及CT值。
文库构建：使用Illumina Truseq Small RNA Preparation kit试剂盒参照试剂盒说明书Illumina’s TruSeq Small RNA Sample Preparation Guide构建小RNA文库。总RNA链接5，接头和3，接头后经RT-PCR扩增形成小分子RNA的cDNA文库，经过6％TBE变性胶电泳分离，将长度范围在147bp的小分子RNA切胶回收。
第二代测序：cDNA经纯化后在Illumina’s Cluster Station上生成DNA簇后上机(Illumina GAIIx)进行测序。通过Illumina’s Sequencing ControlStudio software version 2.8(SCS v2.8)软件实时分析测序图片并使用Illumina's Real-Time Analysis version 1.8.70(RTA v1.8.70)提取base-calling。提取的原始序列利用ACGT101-miR v4.2(LC Sciences)软件分析，生成RawData数据库，同时去除由于样品制备、测序化学与处理以及测序仪器的光学数码处理而产生的非纯序列。剩下的序列(长度在15和32bases)按照families进行分组，生成mappableReads。Mappable序列与最新版本的miRbase数据库以及测序物种基因组进行序列比对，鉴定该物种已知的miRNA；同时发现新的5p或者3p miRNA序列，鉴定在其它近源物种中已有报道，在该物种中崭新的miRNA序列。其中Mappable序列能与Rfam(ierRNA,tRNA,snRNA,snoRNA and others)，Repbase以及mRNA序列比对上的均被去除。除此之外，为了保证筛选到高质量的基因结果，把reads数小于10的基因剔除掉。最后分析实验组和对照组之间差异表达的miRNAs，两组间表达差异miRNA经过差异倍数2倍以上和P<0.05筛选。
差异表达miRNA的RT-PCR验证
挑选共同表达差异的miRNAs进行验证，根据既往实验报道和我们预实验miR-24获得了稳定表达，以miR-24为内参照。取3ul总RNA进行逆转录，然后取1.5ul的cDNA加入20ul的反应体系中。qRT-PCR反应中样本均重复三次后放入Rotor-gene 3000仪器中完成反应条件的循环。经过55℃，30s预变性，98℃，5min变性，经过40个60℃15s，95℃30s循环后在65℃溶解。miRNAs的表达水平由Ct值衡量。两组差异表达基因的比较用2-△△ct表示。
ΔΔCT＝[CT(target,test)–CT(ref,test)]–[CT(target,calibrator)–CT(ref,calibrator)]
所有引物均由杭州联川生物设计，invitrogen公司合成。
统计学处理
计量数据以均数±标准差表示，三阶段样本集的临床资料均有SPSS21.0处理；两组差异表达基因的比较用2-△△ct表示，Mann-Whitney非配对t检验；logistic regression和ROC曲线下面积均由MedCalc检验。
实验结果
第二代测序结果分析
通过上述测序分析，健康对照组、肝硬化组和HCC组经过初级分析后得到9,364,754,10,491,694,和7,896,608条原始序列，经过去除冗余后剩余459,890,859,216,和494,523条可比对序列。对三组mappable reads数据进行长度分析见图2。可见miRNAs的长度集中在22nt。
差异目标miRNA的筛选
对三数据归一化后比较，HCC与正常健康组两者的表达差异。P<0.05表示有统计学差异。共发现143条有差异显著性的miRNAs，其中表达上调的有105条，表达下调的有38条。符合表达差异倍数2倍以上，P<0.05的6个miRNA为上调基因，9个下调miRNA表达基因.见表2。比较HCC与肝硬化组差异miRNAs，共发现84条有差异显著性的miRNAs，符合表达差异倍数2倍以上，P<0.05的5个miRNA为上调基因，12个下调miRNA表达基因.见表3。
表2.HCC组与正常对照组差异miRNA表达
| no. | miR_名 | 倍数 | 倍数(log2) | 上/下 | miR_序列 |
| 1 | hsa-miR-190b_R+1 | 12.4564 | 3.6388 | 上 | UGAUAUGUUUGAUAUUGGGUUU |
| 2 | hsa-miR-141-3p | 6.8951 | 2.7856 | 上 | UAACACUGUCUGGUAAAGAUGG |
| 3 | hsa-miR-4532_R+2 | 6.6370 | 2.7305 | 上 | CCCCGGGGAGCCCGGCGCG |
| 4 | hsa-mir-6127-p3 | 4.6459 | 2.2160 | 上 | UGAGGGAGUGGGUGGGAGG |
| 5 | hsa-miR-99b-3p_R-2 | 4.5838 | 2.1965 | 上 | CACCCGUAGAACCGACCUUG |
| 6 | hsa-miR-1228-5p | 4.4131 | 2.1418 | 上 | GUGGGCGGGGGCAGGUGUGUG |
| 7 | hsa-miR-30a-3p | 0.4634 | -1.1098 | 下 | UGUAAACAUCCUCGACUGGAAG |
| 8 | hsa-miR-199a-5p | 0.4452 | -1.1673 | 下 | ACAGUAGUCUGCACAUUGGUUA |
| 9 | hsa-let-7f-5p | 0.3459 | -1.5315 | 下 | UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU |
| 10 | hsa-miR-122-5p | 0.3405 | -1.5541 | 下 | UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG |
| 11 | hsa-miR-192-5p | 0.2755 | -1.8601 | 下 | CUGACCUAUGAAUUGACAGCC |
| 12 | hsa-miR-98-5p | 0.2603 | -1.9419 | 下 | UGAGGUAGUAAGUUGUAUUGUU |
| 13 | hsa-miR-574-3p | 0.1954 | -2.3556 | 下 | UGAGUGUGUGUGUGUGAGUGUGU |
| 14 | hsa-miR-30e-3p | 0.1895 | -2.3999 | 下 | CUUUCAGUCGGAUGUUUACAGC |
| 15 | hsa-miR-6852-5p | 0.0739 | -3.7583 | 下 | CCCUGGGGUUCUGAGGACAUG |
表3.HCC组与肝硬化组差异miRNA表达
表达差异的miRNA进一步筛选
对上述表达差异的32个差异miRNA进一步筛选，筛选条件为：Ct值〈35，检测率〉75％，共筛选出8个候选miRNA，分别为：hsa-miR-206,hsa-miR-141-3p,hsa-miR-433-3p,hsa-miR-1228-5p,hsa-miR-199a-5p,hsa-miR-122-5p,hsa-miR-192-5p,和hsa-miR-26a-5p.见表4。
表4 32个表达差异的miRNA在筛选集的进一步筛选
ND:未测出,miRNA Ct值>35和检测率<75％
训练集试验
对上阶段筛选出的8个候选miRNA使用新的训练集进行qRT-PCR检验，发现HCC组与健康组比较有6个差异表达miRNA，，同样有6个差异表达miRNA存在于HCC与肝硬化组之间，在HCC组和总对照组间，8个miRNA均有显著差异表达，见图2和表5。
表5 8个候选miRNA在训练集进行qRT-PCR检验
8个miRNA的ROC曲线下面积
hsa-miR-206,hsa-miR-141-3p,hsa-miR-433-3p,hsa-miR-1228-5p,hsa-miR-199a-5p,hsa-miR-122-5p,hsa-miR-192-5p,和hsa-miR-26a-5p的ROC曲线下面积分别为0.665,0.68,0.607,0.534,0.609,0.729,0.69和0.677,见图3－图10。
miRNA组合的建立
Logistic回归分析建立联合预测因子，经过逐步Logistic回归建立LogitP，logitP＝-11.8472+0.52147miR122-0.22949miR1228-0.27621miR141+0.34063miR192+0.33325mi199a-0.30556miR206+0.40777miR26a-0.38006miR433。
利用建立的miRNA组合的ROC曲线下面积是0.887(95％CI＝0.850-0.918),敏感性＝85.55％,特异性＝73.3％,图11)。
验证集验证miRNA组合
miRNA组合在验证集的ROC曲线下面积是0.891(95％CI＝0.842–0.941；敏感性＝90.3％,特异性＝76.2％,图12)。
miRNA组合在验证集区别HCC和健康对照组的ROC曲线下面积是0.894；
(95％CI＝0.849-0.94；敏感性82.8％；特异性83.3％)和区别HCC和肝硬化组的ROC曲线下面积是0.892；95％CI＝0.844-0.939；敏感性81.6％；特异性84.6％)。见图13－图14。
miRNA组合与AFP诊断价值的比较
AFP在验证集区别HCC和健康对照组的ROC曲线下面积是0.844；(95％CI＝0.785-0.902；敏感性60.2％；特异性100％)和区别HCC和肝硬化组的ROC曲线下面积是0.708；95％CI＝0.632-0.783；敏感性57.3％；特异性79.5％)。
miRNA组合和AFP区别HCC和健康对照组的ROC曲线下面积差异是0.0735，(95％CI 0.000145-0.148，p＝0.514，图18)；区别HCC和肝硬化组的ROC曲线下面积差异是0.184；95％CI＝0.0925-0.276，p＝0.0001，图19；区别HCC和总对照组的ROC曲线下面积差异是0.113；95％CI＝0.0344-0.192，p＝0.0049，图20。
8个miRNA的核苷酸序列如下：
| MiRNA | 编号 | 对应的核苷酸序列 |
| hsa-miR-206 | SEQ ID N0.1 | uggaauguaa ggaagugugu gg |
| hsa-miR-141-3p | SEQ ID N0.2 | uaacacuguc ugguaaagau gg |
| hsa-miR-433-3p | SEQ ID N0.3 | aucaugaugg gcuccucggu gu |
| hsa-miR-1228-5p | SEQ ID N0.4 | gugggcgggg gcaggugugu g |
| hsa-miR-199a-5p | SEQ ID N0.5 | acaguagucu gcacauuggu ua |
| hsa-miR-122-5p | SEQ ID N0.6 | uggaguguga caaugguguu ug |
| hsa-miR-192-5p | SEQ ID N0.7 | cugaccuaug aauugacagc c |
| hsa-miR-26a-5p | SEQ ID N0.8 | uucaaguaau ccaggauagg cu |
Claims (5)
1.一种用于检测原发性肝细胞癌的血清miRNA标志物组合，其特征是：包括下列8种has-miRNA：hsa-miR-206,hsa-miR-141-3p,hsa-miR-433-3p,hsa-miR-1228-5p,hsa-miR-199a-5p,hsa-miR-122-5p,hsa-miR-192-5p,和hsa-miR-26a-5p。
2.一种用于检测原发性肝细胞癌的miRNA探针组合，其特征是：基于以下核苷酸序列：SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ IDN0.5、SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.7、SEQ ID N0.8。
3.一种用于检测原发性肝细胞癌的试剂盒，其特征是：包括权利要求2所述包括的miRNA探针组合，还包括Taq酶、氯化镁和PCR缓冲液。
4.一种用于检测原发性肝细胞癌的miRNA引物组合，其特征是：是基于下列核苷酸序列，包括以下序列：SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQID N0.4、SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.7、SEQ ID N0.8。
5.一种用于检测原发性肝细胞癌的试剂盒，其特征是：包括权利要求4所述的miRNA引物组合，还包括Taq酶、氯化镁和PCR缓冲液。
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