TWI688655B - 甘胺酸ｎ-甲基轉移酶剔除小鼠應用高通量定序法建立新穎微小核醣核酸癌症與肝臟疾病標誌物與套組 - Google Patents

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Abstract

本發明揭露利用甘胺酸N-甲基轉移酶剔除小鼠及高通量定序法而開發新穎的微小核醣核酸。該微小核醣核酸可用以評估個體是否具有罹患肝臟疾病的風險。據此，本發明並揭露能以聚合酶鏈反應擴增該微小核醣核酸的引子及套組。本發明更揭露可與該微小核醣核酸互補的抑制物，作為治療肝臟疾病的醫藥組合物。本發明更揭露以該微小核醣核酸對器官或組織的組織切片進行原位雜交染色，而評估個體是否具有罹患其他癌症的風險。

Description

甘胺酸N-甲基轉移酶剔除小鼠應用高通量定序法建立新穎微小核醣核酸癌症與肝臟疾病標誌物與套組
本發明關於一種評估方法、套組及醫藥組合物。尤其，本發明關於一種評估個體是否具有罹患肝臟疾病風險的方法及套組，以及治療肝臟疾病的醫藥組合物。
脊椎動物的肝臟用以去除各種代謝物的毒性、合成蛋白質以及製造消化所需的生化物質。肝臟在代謝上的其他角色還包括調節肝醣儲存、分解紅血球以及製造激素。肝臟是也做為製造膽鹽的輔助性消化腺體，再由膽囊儲存膽鹽。肝臟的高度特化組織包括肝細胞，其調節許多生化反應，包括對正常維生功能必需之小分子及複合分子的合成作用及分解作用。由於肝臟負責生物體內多種上述功能，當這些功能異常時通常表明該生物體可能發生了肝臟疾病。
常見的肝臟發炎症狀是A、B、C、D及E型肝炎，成因為肝炎病毒感染或是由性行為傳播。肝臟發炎症狀也可能由皰疹病毒科(Herpesviridae)的其他病毒(例如單純皰疹病毒)引起。由B型或C型肝炎病毒引起的慢性感染是肝癌的主要成因。
此外，當肝細胞內脂質蓄積超過肝濕重5%或組織學上每單位肝臟面積有1/3以上肝細胞產生脂肪堆積時，稱為脂肪肝。脂肪肝的發生是由於肝臟中三酸甘油酯未被肝臟代謝或運送至其他部位，導致脂肪微滴散布於肝臟細胞，造成肝臟脂肪過度浸潤。脂肪肝疾病可分為酒精性脂肪肝疾病(AFLD)與非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)。AFLD包括酒精性肝炎、脂肪肝及肝硬化，嚴重者造成肝癌；NAFLD所涵蓋的肝臟疾病很廣泛，包括單純的肝臟脂肪變性(NAFL)、非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)、肝硬化和肝癌。此外，NAFLD患者可能衍生出肝臟纖維化。
肝癌是發生於肝臟或從肝臟開始的惡性腫瘤，亦可能從其他部位轉移到肝臟，稱為肝轉移瘤。肝癌的主要成因為B型肝炎、C型肝炎或是酒精造成的肝硬化。其他原因包括黃麴毒素、NAFLD及肝吸蟲。
肝臟疾病可透過血液檢驗及醫學影像來診斷或評估之基礎，並透過組織檢驗來證實，例如檢測血液中的各種酵素(例如丙酮酸轉胺酶(GPT)、麩胺酸草乙酸轉胺酶(GOT))、檢測血清中之抗體或病毒等。治療肝癌的方法包括外科手術、靶向治療及放射線療法。
由於慢性肝臟疾病造成的持續性肝臟發炎及損傷，後續通常會導致肝纖維化開始，然後漸漸地纖維化越來越嚴重，才演變到肝硬化甚至肝癌的產生。在肝臟組織病理切片的纖維組織分布情形，由正常到肝硬化分為F0、F1、F2、F3、F4等五期：F0為正常肝組織、F1為輕度纖維化、F2為中度纖維化、F3為重度纖維化、F4為纖維組織已圍成一圈一圈，此時病理上就診斷為肝硬化。
目前全球每年肝硬化或者因肝癌死亡的人達數千萬人，並未具有一個有效且普遍的方法來開發早期診斷或評估生物標誌物模式，進而模擬臨床慢性肝炎、肝硬化或肝癌病理症狀。故，發展方便、廣泛及精準 的評估生物標誌物是必要的。
本案申請人鑑於習知技術中的不足，經過悉心試驗與研究，並一本鍥而不捨的精神，終構思出本案，能夠克服先前技術的不足，以下為本案的簡要說明。
為了克服目前未能有普遍且有效的早期評估生物標誌物之技術，進而能夠分析及模擬各種肝臟疾病(例如肝損傷、臨床慢性肝炎、肝硬化、肝臟腫瘤、肝癌等)，本發明利用次世代定序技術，針對公、母鼠肝癌共同之微小核醣核酸表現，開發出具潛力的新穎微小核醣核酸作為生物標誌物。進一步地，在肝臟疾病發生時因改變微環境而將肝臟組織的特異微小核醣核酸釋出至血液系統循環的條件下，本發明開發出以血清評估肝硬化與早期肝癌生物標誌物的技術。此外，本發明的新穎微小核醣核酸亦能用於精準地偵測及確認肝癌術後的復發率。因此，本發明提供了優異的測試研發平台以及快速便利的新穎評估生物標誌物之方法、試劑、套組及醫藥組合物。
本發明揭露一種評估個體是否具有罹患肝臟疾病之風險的方法，包括：(a)提供個體的樣本；(b)對樣本進行定量反轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)，以獲得產物；(c)確認產物是否包含第一微小核醣核酸，第一微小核醣核酸選自由hsa-miR-4791(SEQ ID NO：1)、hsa-miR-3960(SEQ ID NO：2)及hsa-miR-4532(SEQ ID NO：3)所組成的群組至少其中之一；以及(d)當產物包含第一微小核醣核酸時，確認個體具有罹患肝臟疾病之風險。
在某些實施例中，樣本為血清樣本或組織樣本，且步驟(d)還包括：(d1)當第一微小核醣核酸為hsa-miR-4791、hsa-miR-3960和hsa-miR-4532所組成的群組其中之一時，該個體被評估為具有罹患早期肝癌 之風險。
在某些實施例中，步驟(c)還包括：(c1)確認產物是否包含第二微小核醣核酸，第二微小核醣核酸為hsa-miR-4508(SEQ ID NO：4)及hsa-miR-4492(SEQ ID NO：5)至少其中之一。
在某些實施例中，當第一微小核醣核酸為hsa-miR-3960且第二微小核醣核酸為hsa-miR-4508時，個體被評估為具有罹患肝纖維化或早期肝硬化之風險。在某些實施例中，當第一微小核醣核酸為hsa-miR-4791、hsa-miR-3960及hsa-miR-4532且第二微小核醣核酸為hsa-miR-4508及hsa-miR-4492時，個體被評估為具有罹患肝癌之風險或者為肝癌術後復發的高風險群。在某些實施例中，當第一微小核醣核酸為hsa-miR-4791及hsa-miR-4532且第二微小核醣核酸為hsa-miR-4508及hsa-miR-4492時，個體被評估為具有罹患肝癌之風險或者為肝癌術後復發的高風險群。在某些實施例中，當hsa-miR-4791、hsa-miR-3960、hsa-miR-4532、hsa-miR-4508及hsa-miR-4492中任一者存在於該產物時，該個體被評估為具有罹患肝癌之風險。在某些實施例中，當第一微小核醣核酸為hsa-miR-4532且第二微小核醣核酸為hsa-miR-4508及hsa-miR-4492時，個體的肝癌細胞被評估為具有轉移能力。在某些實施例中，步驟(b)還包括對產物進行基因定序。
本發明又揭露一種用於評估個體是否具有罹患肝臟疾病之風險的套組，包括：複數對引子組，用以對個體的樣本進行定量聚合酶鏈反應，以獲得產物，各對引子組用以與第一微小核醣核酸配對，第一微小核醣核酸選自由hsa-miR-4791(SEQ ID NO：1)、hsa-miR-3960(SEQ ID NO：2)及hsa-miR-4532(SEQ ID NO：3)所組成的群組至少其中之一；以及基因定序試劑組，用以對產物進行定序，其中當產物包含第一微小核醣核酸時，確認個體具有罹患肝臟疾病之風險。
本發明又揭露一種用於治療個體的肝臟疾病的醫藥組合物，包括：第一基因片段，其中第一基因片段可與第一微小核醣核酸互補，且第一微小核醣核酸選自由hsa-miR-4791(SEQ ID NO：1)、hsa-miR-3960(SEQ ID NO：2)及hsa-miR-4532(SEQ ID NO：3)所組成的群組至少其中之一。
在某些實施例中，醫藥組合物更包括與第二微小核醣核酸互補的第二基因片段，且第二微小核醣核酸為hsa-miR-4508(SEQ ID NO：4)及hsa-miR-4492(SEQ ID NO：5)至少其中之一。
本發明又揭露一種用於評估個體是否具有罹患癌症之風險的方法，包括：(a)提供該個體之組織切片，該組織切片來自於該個體的器官或組織；(b)施用第一微小核醣核酸及一第二微小核醣核酸至組織切片並進行原位雜交染色，其中第一微小核醣核酸選自由hsa-miR-4791(SEQ ID NO：1)、hsa-miR-3960(SEQ ID NO：2)及hsa-miR-4532(SEQ ID NO：3)所組成的群組至少其中之一，且該第二微小核醣核酸為hsa-miR-4508(SEQ ID NO：4)及hsa-miR-4492(SEQ ID NO：5)至少其中之一；以及(c)當組織切片被染色時，表明個體之器官或組織具有罹患癌症之風險。
本發明又揭露一種評估個體是否具有罹患癌症之風險的方法，包括：(a)提供個體的樣本，該樣本源自個體的血清或組織；(b)對樣本進行定量反轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)，以獲得產物；(c)確認產物是否包含第一微小核醣核酸，第一微小核醣核酸選自由hsa-miR-4791(SEQ ID NO：1)、hsa-miR-3960(SEQ ID NO：2)及hsa-miR-4532(SEQ ID NO：3)所組成的群組至少其中之一；以及(d)當產物包含第一微小核醣核酸時，確認該個體具有罹患該癌症之風險，其中癌症選自由肝癌、胃癌、大腸癌、前列腺癌、肺癌、腎癌、乳癌、子宮頸癌、食道癌、卵巢癌、膀胱癌、淋 巴癌、皮膚癌、胰臟癌、睪丸癌及舌癌所組成的群組至少其中之一。
在某些實施例中，步驟(c)更包括：(c1)確認產物是否包含第二微小核醣核酸，第二微小核醣核酸為hsa-miR-4508(SEQ ID NO：4)及hsa-miR-4492(SEQ ID NO：5)至少其中之一。
本文用語「小型核醣核酸(small RNA,sRNA)」或「小型非編碼核醣核酸(small non-coding RNA)」是指長度200個核苷酸以內的分子，其主要作用是RNA靜默，或者稱之為RNA干擾。小型核醣核酸又可細分為雙股的小型干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)以及單股的微小核醣核酸(microRNA,miRNA或miR)。
本所用語「微小核醣核酸(microRNA,miRNA或miR)」是指存在於真核生物中的長約15~25個核苷酸的非編碼RNA，用以調節其他基因的表現。miRNA來自一些從DNA初級轉錄而來但無法被轉譯成蛋白質的300~1000個鹼基的初級微小RNA(pri-miRNA)，經過加工轉變為70~90個鹼基且為莖環(stem-loop)結構的成熟前微小RNA(pre-miRNA)，經過Dicer酵素切除後成為具有功能的成熟微小RNA(miRNA)。miRNA藉由與信使RNA(mRNA)結合而調節轉錄後的基因表現。
本文用語「個體」是指哺乳類。在某些實施例中，哺乳類包括但不限於齧齒類、靈長類。齧齒類包括但不限於大鼠、小鼠。靈長類包括但不限於人。
本文實施例用語「公鼠」及「母鼠」分別是指「公小鼠」及「母小鼠」。本發明實施例是以小鼠為實施例，然而所屬技術領域中具有通常知識者可由小鼠之實驗結果推衍至其他齧齒類(例如大鼠)或者其他哺乳類。
本文用語「肝癌細胞」是以肝癌細胞中低轉移性Huh6及高 轉移性Mahlavu細胞株為實驗對象，然而所屬技術領域中具有通常知識者均理解任何哺乳類或者齧齒類之肝癌細胞或肝細胞癌均涵蓋在本發明之範圍。
本文用語「評估」是指透過檢測或實驗之手段而間接地獲知疾病之中間評估結果，醫療人員依據該評估結果評估個體是否具有罹患該疾病之風險。
本文用語「肝硬化」是指肝臟在病理學上被判斷為由輕度纖維化開始，並逐漸走向中度、重度纖維化，最終形成一圈一圈之肝纖維組織的結果。肝硬化亦表明較嚴重的肝纖維化。
本發明的上述目的及優點在參閱以下詳細說明及附隨圖式之後對那些所屬技術領域中具有通常知識者將變得更立即地顯而易見。
第1圖為在GNMT剔除鼠與野生型之公鼠與母鼠個別比較出共同的腫瘤相關miRNA數量的示意圖。
第2(A)、2(B)以及2(C)圖分別為以IPA預測miRNA目標基因的(A)標準路徑的類型、(B)疾病及功能的類型以及(C)肝臟疾病及功能的功能性分析示意圖。
第3(A)圖為以血清miR-4791、-4532及-4492評估肝硬化的ROC分析示意圖。
第3(B)、3(C)以及3(D)圖分別為以(B)miR-4508、(C)miR-3960以及(D)LC miRs panel(miR-3960+miR-4508)評估肝硬化的ROC分析示意圖。
第4(A)、4(B)、4(C)、4(D)、4(E)、4(F)以及4(G)圖分別為以(A)miR-4791、(B)miR-3960、(C)miR-4532、(D)miR-4492、(E)miR-4508、 (F)HCC-4miRs panel(miR-4791,-4532,-4492和-4508)以及(G)HCC-5miRs panel評估HCC的ROC分析示意圖。
第5(A)以及5(B)圖分別為miRNA抑制物及miRNA模擬物對肝細胞瘤細胞株Huh6進行癌化能力試驗8~72小時的(A)活細胞百分比以及(B)死細胞百分比的示意圖。**P<0.01，ns為未有統計顯著性。
第5(C)以及5(D)圖分別為miRNA抑制物及miRNA模擬物對肝細胞瘤細胞株Mahlavu進行癌化能力試驗8~72小時的(C)活細胞百分比以及(D)死細胞百分比的示意圖。**P<0.01，ns為未有統計顯著性。
第6(A)以及6(B)圖分別為miRNA抑制物及miRNA模擬物對肝細胞瘤細胞株Huh6進行癌化能力試驗的(A)活細胞百分比以及(B)死細胞百分比的示意圖。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，ns為未有統計顯著性。
第6(C)以及6(D)圖分別為miRNA抑制物及miRNA模擬物對肝細胞瘤細胞株Mahlavu進行癌化能力試驗的(A)活細胞百分比以及(B)死細胞百分比的示意圖。**P<0.01，***P<0.001，ns為未有統計顯著性。
第7(A)以及7(B)圖分別為miRNA抑制物處理Huh6細胞72小時的(A)活細胞百分比以及(B)死細胞百分比的示意圖。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
第7(C)以及7(D)圖分別為miRNA抑制物處理Mahlavu細胞72小時的(C)活細胞百分比以及(D)死細胞百分比的示意圖。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
第8(A)以及8(B)圖分別為miRNA抑制物抑制Huh6細胞48小時的(A)遷移能力以及(B)侵襲能力的示意圖。**P<0.01，***P<0.001。
第8(C)以及8(D)圖分別為miRNA抑制物抑制Mahlavu細胞12 小時的(C)遷移能力以及24小時的(D)侵襲能力的示意圖。*P<0.05，***P<0.001。
第8(E)以及8(F)圖分別為miRNA抑制Mahlavu細胞的(E)遷移能力以及(F)侵襲能力的示意圖。**P<0.01，***P<0.001。
本案所提出的發明將可由以下的實施例說明而得到充分瞭解，使得所屬技術領域中具有通常知識者可以據以完成，然而本案的實施並非可由下列實施例而被限制其實施型態，所屬技術領域中具有通常知識者仍可依據除既揭露的實施例的精神推演出其他實施例，該等實施例皆當屬於本發明的範圍。
1.動物實驗：
無特定病原(SPF)的野生型小鼠購自國家實驗動物中心。小鼠的生產、飼養及動物實驗均由高雄醫學大學實驗動物照護及使用委員會審查及批准。所使用的實驗小鼠包括：12週齡之野生型C57BL/6JNarl(B6)公鼠(WTM)及母鼠(WTF)、12週齡之B6 GNMT -/- 剔除型公鼠(KOM)及母鼠(KOF)、帶有腫瘤相鄰肝臟組織(tumor-adjacent liver tissue，又稱為癌旁組織)之B6 GNMT -/- 公鼠(KMA)及母鼠(KFA)、以及帶有肝細胞癌(HCC)組織之B6 GNMT -/- 公鼠(KMT)及母鼠(KFT)。
2.RNA製備：
以二氧化碳方式犧牲小鼠進行解剖，將組織置於液態氮中急速冷凍或是立即進行RNA分離術。使用TRIzol®試劑(Invitrogen,Carlsbad,CA,U.S.A.)分離出總RNA。以DNase I處理所分離的RNA，以移除殘留的基因體DNA的污染。以紫外光光譜測定RNA樣本的純度及濃度(NanoDrop,Wilmington,DE,U.S.A.)，並進一步在安捷倫生物分析儀(Santa Clara,CA, U.S.A.)進一步測定RNA完整性。當進行RNA定序時，所有樣本具有8或更佳的RNA完整數(RNA Integrity Number,RIN)。
3.小型RNA(small RNA)定序：
根據製造商使用說明書，以TruSeqTM小型RNA樣本製備套組(Illumina Inc.,San Diego,U.S.A.)從總RNA構築出小型RNA庫。簡而言之，分別使用切截的T4 RNA黏接酶2(New England Biolabs,Ipswich,MA,U.S.A.)及T4 RNA黏接酶將1~4μg的總RNA依序與RNA 3’配接子以及RNA 5’配接子黏接。使用SuperScript II(Invitrogen,Carlsbad,CA,U.S.A.)及Illumina小型RNA反轉錄-引子將5’端及3’端配接子黏接的RNA轉換為第一股cRNA。使用小型RNA引子組(Illumina Inc.,San Diego,CA,U.S.A.)將所獲得的第一股cDNA進行11個循環的PCR擴增作用。以6% Novex TBE聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)凝膠(Invitrogen,Carlsbad,CA,U.S.A.)純化經PCR擴增的擴增庫。擴增型小型RNgilent 2100生物分析儀使用高敏感度DNA晶片(安捷倫)，且在HiSeq2000(Illumina Inc.,San Diego,CA,U.S.A.)以100個核苷酸讀值長度進行雙端定序(Illumina paired-end sequencing 100 bp)。每一擴增庫是以獨一無二的索引引子製備，使得擴增庫可被集合至一流式細胞道。
4.小型RNA定序數據分析：
分析流程包括6個步驟：(1)以FASTX工具套組(http：//hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/)修剪配接子序列(adapter sequence)及品質管控；(2)以Bowtie軟體及miRDeep2軟體比對參考基因組；(3)以RNA序列期望最大化軟體(RNA-Seq by Expectation Maximization,RSEM)計算表現量；(4)以每百萬讀值(reads per million,RPM)標準化miRNA表現量；(5)使用log2倍數變化上升至1.8倍與下降0.6倍來確認具表現差異的 miRNA；以及(6)使用DNA元件百科全書(The Encyclopedia of DNA Elements,ENCODE)及癌症基因體圖譜計畫(The Cancer Genome Altas,TCGA)資料庫分析log2倍數變化P<0.05之miRNA表現圖譜。
5.功能性類別之分析：
使用Ingenuity®路徑分析(Ingenuity Pathway Analysis,IPA)及註解、視覺化及整合探索資料庫(The Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery,DAVID)網路工具(http：//david.abcc.ncifcrf.gov/)及京都基因及基因體百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)路徑資料庫(http：//www.genome.jp/kegg/pathway.htm)分析功能性類型。
6.microRNA即時聚合酶鏈式反應(microRNA RT-qPCR)：
使用Trizol(Invitrogen,Carlsbad,CA,U.S.A.)抽取細胞與組織中RNA與100μl血清，加入10 fmol(5.6 x 108copies)cel-miRNA-39 mimic(Qiagen)當作校正定量控制物至最後濃度為1 fmol，並以Direct-zol RNA微量製備套組(Zymo Research)將RNA抽出，以All-in-OneTM miRNA qRT-PCR偵測套組及引子(Genecopoeia)進行RT-qPCR。
7.細胞轉染miRNA抑制物與模擬物(Cell transfection with RNA oligonucleotides)：
使用hsa-miR-4791、-3960、-4532、-4492及-4508抑制物(與microRNA序列成互補之髮夾結構RNA)/模擬物(與microRNA序列相同之雙股結構RNA)和陰性對照cel-miR-67抑制物/模擬物(Dharmacon,USA)或scrambled siRNA序列：5’-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3’(正義股)和5’-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3’(反義股)作為陰性對照。用TransIT TKO Reagent(Mirus,USA)或lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen)進行寡核苷酸轉染，在轉染後36小時收集樣品，隨後進行分析。
8.結果：
8組小鼠的樣本包括12週齡的野生型公鼠及母鼠肝臟組織(WTM及WTF)，GNMT -/- 剔除型公鼠及母鼠肝臟組織(KOM及KOF)，GNMT -/- 公鼠及母鼠的HCC組織(KMT、及KFT)及腫瘤相鄰肝臟組織(KMA及KFA)。表1顯示出8組小鼠的小型RNA定序讀值比對以及分佈，其中原始讀值是由RNA定序所偵測的序列數目，查詢讀值是RNA經過剪輯過的序列數目，而可匹配讀值是對映至已知小鼠RNA或基因體的序列數目。大於或等於18個核苷酸之miRNA具有較佳的對映匹配讀值(結果未示出)，而序列讀值長度介於21~25個核苷酸佔了約36.8%至64.9%。接著，進行miRNA圖譜分析來分析GNMT -/- 公、母鼠從早期(12週齡)至晚期(HCC形成)的期間內HCC中新穎的miRNA。此外，並進行以下多方面的研究，以確定在組織與血清中具顯著變化的miRNA及新穎的miRNA，而這些新穎的miRNA可用以偵測肝纖維化及早期HCC，以作為具潛力的生物標誌物。
Figure 107138677-A0101-12-0012-1
此外，以小型RNA深度定序分析確認小型RNA的基因體註解及分佈，如表2所示，大部分的片段是miRNA。
Figure 107138677-A0101-12-0013-2
請參閱第1圖，其為在GNMT剔除鼠與野生型之公鼠與母鼠個別比較出共同的腫瘤相關miRNA數量的示意圖。在第1圖中，以miRdeep 2.0軟體從定序資料的未註解區域(annotated region)預測新穎的miRNA，使用等於或大於1.8倍以及等於或小於0.6倍的倍數變化作為臨界值。當將帶有肝細胞癌(HCC)組織之小鼠與野生型小鼠(控制組)進行比較時，有36個miRNA的差異表現量具有統計上顯著差異，其中24個已知資料庫(miRbase)的miRNA及10個新穎的miRNA為向上調節(在野生型控制組有等於或大於1.8倍的倍數變化，參見第1圖左上及左下小圖中由兩個圓圈交集圍起的數字)，而12個已知的miRNA及4個新穎的miRNA為向下調節(等於 或小於0.6倍的倍數變化，參見第1圖右上及右下小圖中由兩個圓圈交集圍起的數字)。亦即，在GNMT -/- 公、母鼠的HCC組織找到24個已知的向上調節miRNA及12個已知的向下調節miRNA，而且找到10個向上調節的新穎miRNA及4個向下調節的新穎miRNA。小型RNA定序分析顯示出，已知的miRNA圖譜在所有樣本中具有差異化的表現。
接著，利用miRbase第20版資料庫及加州大學聖塔克魯茲分校(The University California,Santa Cruz(UCSC))基因體資料庫，將腫瘤組織與非腫瘤組織進行比較及分析，由已知/新穎的小鼠miRNA與人類miRNA各自的BLAST對應基因間進行比對，找出與人類基因相似度高的對應miRNA之同源位置。因此，如表3所示，從3個新穎的小鼠miRNA(即KMU-“miR”-337(5’-ggg gcg gcg gcg gcg gcg gcg acu c-3’)、KMU-“miR”-422(5’-ccc ggg gag ccc ggc ggg-3’)及KMU-“miR”-708(5’-cgg ggc ugg gcg cgc gcg-3’))確認4個人類miRNA(分別為hsa-miR-3960(5’-ggc ggc ggc gga ggc ggg gg-3’；SEQ ID NO：2；簡稱為miR-3960)、hsa-miR-4532(5’-ccc cgg gga gcc cgg cg-3’；SEQ ID NO：3；簡稱為miR-4532)、hsa-miR-4492(5’-ggg gcu ggg cgc gcg cc；SEQ ID NO：5；簡稱為miR-4492)及hsa-miR-4508(5’-gcg ggg cug ggc gcg cg-3’；SEQ ID NO：4；簡稱為miR-4508))。
Figure 107138677-A0101-12-0014-3
接著，再進一步比對癌症基因體圖譜-肝癌(The Cancer Genome Atlas of Liver Cancer,TCGA-LC)資料庫，得知有11個正向調節的miRNA(包括hsa-miR-146b-5p、-132-3p、-425-5p、-140-3p、-181a-5p、-182-5p、-183-5p、-96-5p、-21a-5p、-34a-5p及-10b-5p)、7個向下調節的miRNA(包括hsa-miR-451a、-144-3p、-101-3p、-99a-5p、-125b-5p、-145a-3p及-122-5p)以及5個無資料的miRNA(包括hsa-miR-4791、-3960、-4532、-4508及-4492)(參見表4)。為了確認這些miRNA在小鼠肝癌的表現量是否與TCGA-LC資料庫的臨床發現一致，針對49對的HCC腫瘤以及腫瘤相鄰組織以及另一群HCC病患(由TCGA資料庫中的371個HCC腫瘤組織及49個非腫瘤組織組成)進行分析。結果證實，小鼠miRNA表現量與TCGA-LC資料庫的臨床肝細胞癌類似(參閱表4)。此外，亦確認了未在TCGA-LC資料庫呈現的新穎miRNA(hsa-miR-4791；5’-ugg aua uga uga cug aaa-3’；SEQ ID NO：1；簡稱為miR-4791)。
Figure 107138677-A0101-12-0015-4
Figure 107138677-A0101-12-0016-5
此外，也將第1圖所指出的GNMT -/- 小鼠14個新穎miRNA(含10個向上調節及4個向下調節的新穎miRNA)分析其表現量，結果如表5所示。
Figure 107138677-A0101-12-0016-7
Figure 107138677-A0101-12-0017-8
接著，以Ingenuity®路徑分析(IPA)及DAVID網路工具預測miRNA目標基因的功能性分析。基於miRTarbase及TargetScan 7.0的預測結果，這些11個向上調節的miRNA以及7個向下調節的miRNA被預期靶定至全部1594個基因，並分析其在(A)標準路徑的類型、(B)疾病及功能的類型以及(C)肝臟疾病及功能的功能性分析。
請參閱第2(A)圖，其為以IPA預測miRNA目標基因的標準路徑的類型示意圖。第2(A)圖橫座標第1-34個項目依序為：(1)癌症的分子機制、(2)p53訊息傳導、(3)細胞週期：G1/S查核點調節作用、(4)芳基碳氫化合物受體訊息傳導、(5)STAT3路徑、(6)PTEN訊息傳導、(7)NF-κB訊息傳導、(8)上皮-間皮轉變機制的調節、(9)HGF訊息傳導、(10)糖皮質素受體訊息傳導、(11)Wnt/β-連環蛋白訊息傳導、(12)IL-8訊息傳導、(13)IL-6訊息傳導、(14)LPS刺激的MAPK訊息傳導、(15)ERK/MAPK訊息傳導、(16)RAR活化作用、(17)EGF訊息傳導、(18)PPARα/RXRα活化作用、(19)Myc調控的細胞凋亡訊息傳導、(20)由TSP1進行的血管生成之抑制作用、(21)肝臟纖維化/肝星狀細胞活化作用、(22)PPAR訊息傳導、(23)T細胞受體訊息傳導、(24)類鐸(toll-like)受體訊息傳導、(25)IL-17訊息傳導、(26)急性時相反應訊息傳導、(27)HIF1α訊息傳導、(28)TGF-β訊息傳導、(29)胰島素受體訊息傳導、(30)mTOR訊息傳導、(31)IGF-1訊息傳導、(32)第II型糖尿病訊息傳導、(33)脂肪生成作用路徑、(34)緊密連接訊息傳導。由第2(A)圖可知，11個向上調節的miRNA以及7個向下調節的miRNA都主要指向了與癌症訊息傳導路徑相關的癌症分子機制、p53訊息傳導以及細胞週期。
請參閱第2(B)圖，其為以IPA預測miRNA目標基因的疾病及功能的類型的示意圖。第2(B)圖橫座標第1~27個項目依序為：(1)RNA表現、(2)細胞存活率、(3)細胞移動、(4)細胞侵襲、(5)細胞的聚落形成作用、(6)細胞型態、(7)轉移、(8)DNA合成、(9)細胞轉型作用、(10)蛋白質代謝作用、(11)腫瘤細胞株的細胞毒殺作用、(12)關節發炎作用、(13)細胞骨架的組織化、(14)細胞的DNA損傷反應、(15)細胞溝通、(16)誘導性多潛能幹細胞的發育、(17)細胞糖解作用、(18)肝醣合成作用、(19)DNA片段作用、(20)自噬作用、(21)粒腺體功能異常、(22)細胞恆定、(23)腫瘤細胞株的抗藥性、(24)活性含氧物的產生、(25)病毒感染、(26)脂質形成、(27)蛋白質分解作用。由第2(B)圖可知，11個向上調節的miRNA以及7個向下調節的miRNA主要指向了與癌細胞的功能(例如RNA表現、細胞存活率、細胞移動、細胞侵襲、細胞的聚落形成作用)有關。
請參閱第2(C)圖，其為以IPA預測miRNA目標基因的肝臟疾病及功能的功能性分析示意圖。由第2(C)圖可知，11個向上調節的miRNA以及7個向下調節的miRNA主要指向了與肝細胞癌、肝細胞凋亡增加的鹼性磷酸酶活性、惡化的肝轉移有關。因此，整合第2(A)-2(C)圖之結果，進一步評估5個新穎miRNA與細胞增生及轉移的功能性角色及訊息傳導路徑。具潛力目標的功能與細胞週期的負向調控、免疫反應、發炎作用轉移有關。
接著，使用來自台灣肝癌網群組(Taiwan Liver Cancer Network(TLCN)cohort)的60個配對的HCC樣本來驗證5個新穎miRNA(miR-4791、-3960、-4532、-4508及-4492)。這5個miRNA的表現量是在配對的HCC樣本之腫瘤相鄰肝臟樣本(TA)及肝臟組織(T)之間進行比較，且表現量是以樣本的定量反轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)確定。每一樣本的表現量是對腫瘤相鄰肝臟組織的樣本平均值進行標準化。觀察5個新穎 miRNA在肝臟組織的顯著上升程度。與小鼠動物模式之結果一致的是，在60個配對的病患中，在其肝癌腫瘤組織發現這5個miRNA(miR-4791、-3960、-4532、-4508及-4492)的表現量是上升的(結果未示出)。
接著，檢驗這5個miRNA在健康人(控制組，n=36)、肝硬化病患(n=51)及HCC病患(n=55)中的表現。5個miRNA的表現量是以血清樣本的qRT-PCR確認，且表現量是對cel-miR-39(對照組)進行標準化。觀察5個miRNA在HCC病患均有顯著的上升程度，而且miR-3960及miR-4508在肝硬化病患的表現量比健康人(控制組)顯著地高(結果未示出)。
接著，以操作者操作特性(receiver operating characteristic，ROC)曲線評估5個miRNA(miR-4791、-3960、-4532、-4508及-4492)是否具有成為評估個體是否罹患HCC及/或肝硬化風險的非侵入式評估標誌物。如第3(A)、3(B)、3(C)及3(D)圖所示，miR-4508及miR-3960顯示出ROC的曲線下面積(Area under curve,AUC)分別為0.73及0.79(參見第3(B)及3(C)圖)，而這2個miRNA的合併組(miR-4508及miR-3960之混合，又稱為LC miRs panel)在肝硬化病患具有相當高的AUC值0.84(參見第3(D)圖)。因此，當個體之血清被檢驗出具有miR-3960及miR-4508時，表明該個體被評估為具有罹患肝纖維化或早期肝硬化之風險。
請參閱第4(A)~4(G)圖，其分別為以(A)miR-4791、(B)miR-3960、(C)miR-4532、(D)miR-4492、(E)miR-4508、(F)HCC-4miRs panel以及(G)HCC-5miRs panel評估HCC的ROC分析示意圖。這5個miRNA單獨的AUC分別為0.79(miR-4791，第4(A)圖)、0.74(miR-3960，第4(B)圖)、0.81(miR-4532，第4(C)圖)、0.76(miR-4492，第4(D)圖)、0.88(miR-4508，第4(E)圖)，而4個miRNA的合併組(HCC-4miRs panel，含miR-4791、miR-4532、miR-4492及miR-4508，不含miR-3960，參見第4(F)圖)之AUC 為0.95，5個miRNA的合併組(HCC-5miRs panel，參見第4(G)圖)為0.96。進一步而言，如表6所示，敏感度及特異性之總和所在的最佳臨界值對於肝硬化及HCC是最大值，而約登指數(生物標誌物的最大潛力功效)為ROC曲線的一般總和測量。4個miRNA的合併組(HCC-4miRs panel)以及5個miRNA的合併組(HCC-5miRs panel)可區分HCC病患以及健康人(控制組)而當作HCC的具潛力生物標誌物，而2個miRNA的合併組(LC miRs panel)可作為肝硬化的生物標誌物(參見表7)。因此，當個體之血清被檢驗出具有miR-4791、miR-3960、miR-4532、miR-4508及miR-4492時，表明該個體被評估為具有罹患肝硬化及肝癌之風險。
Figure 107138677-A0101-12-0020-9
Figure 107138677-A0101-12-0021-10
Figure 107138677-A0101-12-0021-11
Figure 107138677-A0101-12-0022-12
接著，以臨界值來測定血清miRNA合併組的監測值，以比較未復發組及復發組病患之手術前及手術後情形。在此，將5個miRNA個別、4個miRNA的合併組及5個miRNA的合併組分為低及高兩組。如表8所示，5個miRNA個別、4個miRNA的合併組及5個miRNA的合併組在手術處理後之復發組及未復發組具有關聯性。而且在非復發組的腫瘤組織手術切除後，5各別個miRNA及合併組們表現量顯著地降低。
Figure 107138677-A0101-12-0022-13
從手術前至手術後時期分析在未復發及復發病患中5個 miRNA的表現量：
此是分析在手術前至手術後1.58~7.25年之未復發病患(n=9)、以及在手術前至在手術後0.25~6.00年之復發病患(n=24)的5個miRNA表現量，並以曼-惠特尼U檢定(Mann Whitney U test)以及魏克生檢定(Wilcoxon test)來確定。在這33個HCC病患中，其血清中的miRNA表現量在手術後並未降低(結果未示出)。接著分析HCC病患在手術前及手術後之未復發組及復發組的5個miRNA表現量。與手術前樣本的未復發組相較，在手術後樣本中，2個miRNA的合併組(miR-4508及miR-3960之混合)的表現量顯著地降低(結果未示出)。再者，與復發樣本的手術前及手術後的miRNA表現量相較，3個miRNA(miR-3960、-4532及-4508)各自的表現量在未復發樣本中顯著地降低(結果未示出)。
5個miRNA抑制物及miR-4791模擬物誘導肝癌細胞死亡：
此試驗是以活細胞螢光染劑Calcein AM(Invitrogen,Carlsbad,CA,U.S.A.)偵測活細胞，以染劑Ethidium homodimer(EthD-III)偵測死細胞，所使用的肝癌細胞株為Huh6及Mahlavu。
首先，以miRNA之抑制物或者模擬物(共50nM)轉染Huh6及Mahlavu細胞(3000 well/96 well盤)8、24、48至72小時。再以Calcein AM染色Huh6及Mahlavu細胞中的活細胞，以EthD-III染色Huh6及Mahlavu細胞中的死細胞，將活細胞與死細胞各自對8小時之負控制組(NC，為秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)的miRNA)進行標準化。
如第5(A)~5(D)及6(A)~6(D)圖所示，與負控制組相較，這5個新穎miRNA(miR-4791、-3960、-4532、-4508及-4492)的抑制物各自都能有效降低肝癌細胞Huh6及Mahlavu中的活細胞，並增加其死細胞，而這5個新穎miRNA(miR-4791、-3960、-4532、-4508及-4492)的模擬物 相較於抑制物，並未顯著地增加肝癌細胞Huh6及Mahlavu中的活細胞。因此，這5個新穎miRNA(miR-4791、-3960、-4532、-4508及-4492)的抑制物可有效抑制肝癌細胞的生長，可作為用抑制治療肝癌的醫藥組合物。
5個miRNA抑制物誘導肝癌細胞死亡：
在此試驗中，將miRNA抑制物(10nM)與C.elegans miRNA(40nM)進行混合，將各別的miRNA5抑制物(50nM)，或者將5個miRNA抑制物(各10nM，共50nM)進行混合，分別轉染Huh6及Mahlavu細胞72小時。再以Calcein AM染色Huh6及Mahlavu細胞中的活細胞，以EthD-III染色Huh6及Mahlavu細胞中的死細胞，將活細胞與死細胞各自對8小時之負控制組(NC，C.elegans miRNA)進行標準化。如第7(A)~7(D)圖所示，與負控制組相較，這5個miRNA(miR-4791、-3960、-4532、-4508及-4492)分別或者低劑量共同合併可達增強方式抑制肝癌細胞Huh6及Mahlavu的生長。因此，再次證明，這5個新穎miRNA(miR-4791、-3960、-4532、-4508及-4492)的抑制物可有效抑制肝癌細胞的生長，可作為用抑制治療肝癌的醫藥組合物。
5個miRNA抑制物對肝癌細胞的遷徙及侵襲之抑制效果：
本試驗是以穿孔遷徙試驗及侵襲試驗來研究5個miRNA抑制物或模擬物對肝癌細胞Huh6及Mahlavu的遷徙及侵襲12、24及48小時之抑制效果。所有試驗獨立重複3次，數據以三重複之平均值計算，並以平均值±標準差呈現。
在第8(A)及8(C)圖的穿孔遷移試驗中，miR-4532、miR-4492及miR-4508對Huh6及Mahlavu細胞的轉移有高度影響，抑制物對低轉移性Huh6細胞的轉移不影響而低轉移性Mahlavu細胞的轉移明顯抑制。在第8(B)及8(D)圖的侵襲能力試驗中，miR-4352及miR-4508均能增強Huh6及 Mahlavu細胞的侵襲能力，而抑制物均能減弱。miR-4492對肝癌細胞的侵襲能力並無統計上顯著影響。此外，第8(E)及8(F)圖的結果顯示，以轉染總濃度均為45nM各條件下，於單獨的抑制物15nM miR-4532、15nM miR-4492、15nM miR-4508、2個miRNA抑制物混合(miR-4352及miR-4508各5nM加上35nM C.elegans miRNA負控制組，共45nM)、3個miRNA抑制物混合(各5nM的miRNA加上30nM C.elegans miRNA負控制組，共45nM)、抑制物45nM miR-4532、45nM miR-4492、45nM miR-4508、2個miRNA抑制物混合(15nM miR-4352、15nM miR-4508及15nM C.elegans miRNA負控制組)或者3個miRNA抑制物混合(15nM miR-449、15nM miR-4532及15nM miR-4508)，3個miRNA抑制物混合顯著地抑制肝癌細胞的遷徙及侵襲能力。綜合上述，這些結果證明，miRNA-3960、miRNA-4532、miRNA-4492及/或miRNA-4508的過度表現使肝癌細胞進入細胞停滯時期，且miR-4532、miR-4492及/或miR-4508的過度表現促進了肝癌細胞的遷徙及侵襲能力。因此，運用與miR-4532、miR-4492及/或miR-4508相互補的miRNA抑制物，及該miRNA抑制物所製備的醫藥組成物能夠抑制肝癌細胞的遷徙及侵襲能力，進而使肝癌細胞生長停滯並進入細胞凋亡。
以miRNA原位雜交進行多重器官腫瘤差異進行評估：
本試驗是以miRNA原位雜交(in situ hybridization)技術來染色福馬林固定之石蠟包埋(formalin-fixed paraffin embedded,FFPE)切片，以評估對多個器官腫瘤(癌組織矩陣片，BCN962a，Bioman)。本試驗是以原位雜交技術(in situ hybridization,ISH)染色石蠟包埋切片，以確認不同癌症組織中miR-4791、miR-3960、mir-4532、miR-4492及miR-4508的表現。首先，以ISH DIG標示的鎖核酸(LNA)為基礎的探針為miR-4791探 針(5’-TTT CAG TCA TCA TAT CCA-3’)、miR-3960探針(5’-CCC CCG CCT CCG CCG CCG CC-3’)、mir-4532(microRNA前驅物)探針(5’-CAG GAT ACC AGG AGC TTC ACC GC-3’)、miR-4492探針(5’-GGC GCG CGC CCA GCC CC-3’)、及miR-4508探針(5’-CGC GCG CCC AGC CCC GC-3’)。控制組探針包括負控制組探針(雜燴miRNA)及正控制組探針(U6小核RNA(snRNA))。(H)miRNA細胞正向性的總積分是以隨機選擇的顯微鏡視野決定。平均值是對U6 snRNA積分標準化，且原始放大倍數為200X及400X。LNA U6 snRNA(0.75nM)、LNA miRNA探針及雜燴miRNA探針(每一探針為40nM)在45℃雜交16小時。具有癌症相鄰組織的多重組織腫瘤或相鄰正常組織包括17個具有匹配或不匹配的相鄰正常組織的癌症器官(肝、胃、大腸、前列腺、肺、腎、乳房、子宮頸、食道、卵巢、膀胱、淋巴結、皮膚、胰臟、睪丸、舌頭、及胎盤)，包括惡性腫瘤的腫瘤-結節-轉移(tumor-node-metastasis,TNM)分類、臨床期及病理學等級(60案例/96核心)。每一種器官或組織取自三個正常人類個體，每個案例單一核心。T為腫瘤，包括肝細胞瘤、食道鱗狀細胞癌、胃腺癌、大腸腺癌、前列腺腺癌、肺腺癌、腎亮細胞癌、侵入性乳管癌(breast invasive ductal carcinoma)、子宮頸鱗狀細胞癌、卵巢高度嚴重乳突腺癌(ovary high grade serious papillary adenocarcinoma)、膀胱低度泌尿上皮癌、右下顎淋巴結擴散大型B細胞淋巴瘤、頭皮鱗狀細胞癌、胰管腺癌、睪丸胚胎性癌、以及舌胚胎橫紋肌肉瘤(tongue embryonal rhabdomyosarcoma)。TA為：正常相鄰組織、肝臟癌鄰組織、食道正常相鄰組織、胃正常相鄰組織、大腸正常相鄰組織、前列腺增生、肺臟正常相鄰組織、腎正常相鄰組織、乳房正常相鄰組織(帶有乳管擴張之乳房腺病)、子宮頸正常相鄰組織、卵巢正常相鄰組織、膀胱正常相鄰組織、淋巴結反應性增生、頭皮正常相鄰組織、胰臟正常相鄰組 織、睪丸正常相鄰組織及胎盤組織。
如表9所示，相較於腫瘤相鄰組織(TA)，miRNA-4791表現量在肝、前列腺、肺、乳房、子宮頸、卵巢、膀胱、淋巴結、皮膚、胰臟及睪丸腫瘤組織(T)顯著地較高，而在胃、大腸及食道腫瘤組織(T)顯著地較低。相較於腫瘤相鄰組織(TA)，miR-3960表現量在肝、乳房、子宮頸、食道、膀胱、淋巴結及皮膚腫瘤組織(T)顯著地較高，而在胃、大腸、腎、睪丸腫瘤組織(T)顯著地較低。相較於腫瘤相鄰組織(TA)，mir-4532表現量在肝、前列腺、乳房、膀胱、淋巴結、皮膚及胰臟腫瘤組織(T)顯著地較高，而在胃、大腸、腎、子宮頸、食道、卵巢及睪丸腫瘤組織(T)顯著地較低。相較於腫瘤相鄰組織(TA)，miR-4492表現量在肝、肺、乳房、子宮頸、皮膚、胰臟及睪丸腫瘤組織(T)顯著地較高，而在胃、大腸、前列腺、腎、食道、卵巢、膀胱及淋巴結腫瘤組織(T)顯著地較低。相較於腫瘤相鄰組織(TA)，miR-4508表現量在肝、前列腺、腎、乳房、子宮頸、卵巢、淋巴結、皮膚、胰臟及睪丸腫瘤組織(T)顯著地較高，而在胃、大腸、肺、食道腫瘤組織(T)顯著地較低。
Figure 107138677-A0101-12-0027-14
Figure 107138677-A0101-12-0028-15
Figure 107138677-A0101-12-0028-16
Figure 107138677-A0101-12-0029-17
本發明實屬難能的創新發明，深具產業價值，援依法提出申請。此外，本發明可以由所屬技術領域中具有通常知識者做任何修改，但不脫離如所附申請專利範圍所要保護的範圍。
<110> 高雄醫學大學
<120> 甘胺酸N-甲基轉移酶剔除小鼠應用高通量定序法建立新穎微小核醣核酸血清標誌物及肝臟疾病套組
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> RNA
<213> hsa-miR-4791
<400> 1
Figure 107138677-A0101-12-0030-18
<210> 2
<211> 20
<212> RNA
<213> hsa-miR-3960
<400> 1
Figure 107138677-A0101-12-0030-19
<210> 3
<211> 17
<212> RNA
<213> hsa-miR-4532
<400> 1
Figure 107138677-A0101-12-0030-20
<210> 4
<211> 17
<212> RNA
<213> hsa-miR-4508
<400> 1
Figure 107138677-A0101-12-0031-21
<210> 5
<211> 17
<212> RNA
<213> has-miR-4492
<400> 1
Figure 107138677-A0101-12-0031-22

Claims (12)

  1. 一種評估一個體是否具有罹患一肝臟疾病之風險的方法，包括：(a)提供該個體的一樣本；(b)對該樣本進行一定量反轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)，以獲得一產物；(c)確認該產物是否包含一第一微小核醣核酸，該第一微小核醣核酸選自由hsa-miR-4791(SEQ ID NO：1)、hsa-miR-3960(SEQ ID NO：2)及hsa-miR-4532(SEQ ID NO：3)所組成的群組至少其中之二；以及(d)當該產物包含該第一微小核醣核酸時，確認該個體具有罹患該肝臟疾病之風險。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該樣本為一血清樣本或一組織樣本，且步驟(d)還包括：(d1)當該第一微小核醣核酸為hsa-miR-4791、hsa-miR-3960和hsa-miR-4532所組成的群組其中之一時，該個體被評估為具有罹患早期肝癌之風險。
  3. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中步驟(c)還包括：(c1)確認該產物是否包含一第二微小核醣核酸，該第二微小核醣核酸為hsa-miR-4508(SEQ ID NO：4)及hsa-miR-4492(SEQ ID NO：5)至少其中之一。
  4. 如申請專利範圍第3項所述的方法，其中當該第一微小核醣核酸為hsa-miR-3960且該第二微小核醣核酸為hsa-miR-4508時，該個體被評估為具有罹患肝纖維化或早期肝硬化之風險。
  5. 如申請專利範圍第3項所述的方法，其中當該第一微小核醣核酸為hsa-miR-4791、hsa-miR-3960及hsa-miR-4532且該第二微小核醣核酸為 hsa-miR-4508及hsa-miR-4492時，該個體被評估為具有罹患肝癌之風險或者為肝癌術後復發的高風險群。
  6. 如申請專利範圍第3項所述的方法，其中當該第一微小核醣核酸為hsa-miR-4791及hsa-miR-4532且該第二微小核醣核酸為hsa-miR-4508及hsa-miR-4492時，該個體被評估為具有罹患肝癌之風險或者為肝癌術後復發的高風險群。
  7. 如申請專利範圍第3項所述的方法，其中，當hsa-miR-4791、hsa-miR-3960、hsa-miR-4532、hsa-miR-4508及hsa-miR-4492中任一者存在於該產物時，該個體被評估為具有罹患肝癌之風險或者為肝癌術後復發的高風險群。
  8. 如申請專利範圍第3項所述的方法，其中當該第一微小核醣核酸為hsa-miR-4532且該第二微小核醣核酸為hsa-miR-4508及hsa-miR-4492時，該個體的肝癌細胞被評估為具有轉移能力。
  9. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中步驟(b)還包括對該產物進行基因定序。
  10. 一種用於評估一個體是否具有罹患癌症之風險的方法，包括：(a)提供該個體之一組織切片，該組織切片來自於該個體的一器官或一組織；(b)施用一第一微小核醣核酸及一第二微小核醣核酸至該組織切片並進行原位雜交染色，其中該第一微小核醣核酸選自由hsa-miR-4791(SEQ ID NO：1)、hsa-miR-3960(SEQ ID NO：2)及hsa-miR-4532(SEQ ID NO：3)所組成的群組至少其中之一，且該第二微小核醣核酸為hsa-miR-4508(SEQ ID NO：4)及hsa-miR-4492(SEQ ID NO：5)至少其中之二；以及(c)當該組織切片被染色時，表明該個體之該器官或該組織具有罹患 癌症之風險。
  11. 一種評估一個體是否具有罹患一癌症之風險的方法，包括：(a)提供該個體的一樣本，該樣本源自該個體的一血清或一組織；(b)對該樣本進行一定量反轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)，以獲得一產物；(c)確認該產物是否包含一第一微小核醣核酸，該第一微小核醣核酸選自由hsa-miR-4791(SEQ ID NO：1)、hsa-miR-3960(SEQ ID NO：2)及hsa-miR-4532(SEQ ID NO：3)所組成的群組至少其中之二；以及(d)當該產物包含該第一微小核醣核酸時，確認該個體具有罹患該癌症之風險，其中該癌症選自由肝癌、胃癌、大腸癌、前列腺癌、肺癌、腎癌、乳癌、子宮頸癌、食道癌、卵巢癌、膀胱癌、淋巴癌、皮膚癌、胰臟癌、睪丸癌及舌癌所組成的群組至少其中之一。
  12. 如申請專利範圍第11項所述的方法，其中步驟(c)更包括：(c1)確認該產物是否包含一第二微小核醣核酸，該第二微小核醣核酸為hsa-miR-4508(SEQ ID NO：4)及hsa-miR-4492(SEQ ID NO：5)至少其中之一。
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