CN104450707B

CN104450707B - 一种血清miRNA生物标志物的应用

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Publication number: CN104450707B
Application number: CN201410819428.9A
Authority: CN
Inventors: 曾骥孟; 李志明; 顾龙; 庄炫
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2014-12-25
Filing date: 2014-12-25
Publication date: 2017-08-29
Anticipated expiration: 2034-12-25
Also published as: CN104450707A

Abstract

一种血清miRNA生物标志物的应用，涉及生物标志物。所述血清miRNA生物标志物包括miR‑34c、miR‑1275、miR‑375、miR‑410、miR‑758中的至少一种。所述血清miRNA生物标志物可在制备少精症和无精症检测试剂中应用。所述血清miRNA生物标志物组合物包括miRNA中的至少一种以及各miRNA的反转录引物、正向引物和反向引物的序列；所述血清miRNA生物标志物组合物可在制备少精症和无精症检测试剂中应用。确定的miRNA组合与少精症和无精症的病例指标的密切相关性，能够作为生物标记物对少精症和无精症病人进行筛查和诊断，为临床个体化干预治疗提供有效依据。

Description

一种血清miRNA生物标志物的应用

技术领域

本发明涉及生物标志物，尤其是涉及一种血清miRNA生物标志物的应用。

技术背景

不孕不育是全球性医学问题，据世界卫生组织统计，全球约有5％～10％的育龄夫妻存在不孕不育问题，其中男性原因所致不育占一半左右。有90％的男性不育症是由生精障碍引起，临床上表现为无精子症或少精子症。少精症是指每毫升精液中精子少于2000万，因为精子数量少，与卵子相遇的机会就少，导致男性不育。无精症约占男性不育症患者的15％～20％。无精症是指多次精液检查(一般3次以上)均未发现精子。无精症患者必要时可做睾丸活检、精道造影、内分泌激素放免测定等，以协助鉴别阻塞性无精子或先天性无精子。目前相关研究大多从单个基因的角度探讨少精症和无精症的病因，但单个基因的改变并不能完全解释他们的致病机制。

miRNA(microRNA)是一类长约22nt的非编码小RNA，广泛存在于各种生物中，调节生物体生长、发育和凋亡等过程。由此形成的复杂遗传学网络，是生物体生长发育的基础。miRNA在人和动物睾丸发育及精子生成等过程也起着重要的调控作用。

研究报道在成年果蝇体内去除一个miRNA(let-7)，就能导致不孕不育。因为像let-7这样的miRNA承担了重要的功能，在进化中非常保守，广泛存在于人类和许多其他动物体内(Fagegaltier D,A,Gordon A,et al.A genome-wide survey of sexuallydimorphic expression of Drosophila miRNAs identifies the steroid hormone-induced miRNA let-7as a regulator of sexual identity[J].Genetics,2014,198(2):647-668.)。

miRNA在血清中可长期稳定存在，耐RNA酶降解，煮沸、反复冻融、酸碱环境、长期保存等各种处理方法均不会造成血清miRNA的损失，因此血清中的miRNA有潜力作为一种有价值的筛查或者诊断的标志物，其受外来干扰因素影响小，临床实用性强。甚至常规体检中就可以收集到的血液。由于血液会循环至全身所有组织，向细胞输送营养并清除废物，因此血液能够反映出整个机体的生理病理状况，其检测结果对人体健康具有指导意义。并且，基于血清的检测是无创的、非侵入的，因此可以适用于普查，为早期诊断服务。少精症和无精症患者血清的miRNA检查不仅可以辅助诊断，避免进行睾丸活检等创伤性检查，或者一些无效的治疗，更主要的是可以避免将这种缺陷遗传给下一代。

由于血清中miRNA的表达量较低，寻找一种灵敏度高、操作简便且成本低廉的检测方法是目前血清miRNA应用于临床检测亟待解决的问题，实时荧光定量PCR是目前检测血清miRNA的主要方法，该方法快速、便捷，精确度和灵敏度可满足临床需求。另外，在选择标志物时，应优先选择在疾病中表达上调的血清miRNA，这样也可提高检测的灵敏性和特异性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种血清miRNA生物标志物的应用。

所述血清miRNA生物标志物包括以下所列miRNA中的至少一种：

miR-34c：aggcaguguaguuagcugauugc；

miR-1275：gugggggagaggcuguc；

miR-375：uuuguucguucggcucgcguga；

miR-410：agguugucugugaugaguucg；

miR-758：gaugguugaccagagagcacac。

所述血清miRNA生物标志物可在制备少精症和无精症检测试剂中应用。

所述血清miRNA生物标志物组合物包括miRNA中的至少一种以及各miRNA的反转录引物、正向引物和反向引物的序列；

所述miRNA包括：

miR-34c：aggcaguguaguuagcugauugc；

miR-1275：gugggggagaggcuguc；

miR-375：uuuguucguucggcucgcguga；

miR-410：agguugucugugaugaguucg；

miR-758：gaugguugaccagagagcacac；

所述各miRNA的反转录引物、正向引物和反向引物的序列如下表所示：

所述血清miRNA生物标志物组合物可在制备少精症和无精症检测试剂中应用。

所述少精症和无精症检测试剂用于检测少精症和无精症的方法采用茎环的反转录-荧光定量PCR方法，即SYBR Green染料法，具体步骤如下：

1)血清样本采集和临床分组：从医院采集血清样本，同时系统收集患者的病理学资料；

2)用Qiagen公司商品化的总RNA提取试剂盒miRNeasy Serum/Plasma kit(cat.no.217184)从受试样本血清中提取总RNA，通过Agilent miRNA microarray高通量筛选出候选miRNA；

3)采用实时荧光定量PCR方法筛选可用作检测标志物的miRNA。

本发明使用的检测方法可以选自：RT-PCR方法、Microarray技术、Real-time PCR方法等中的至少一种。

本发明具有以下技术效果：

首先，血清相对其它组织样本较易获得，与睾丸活检或者睾丸穿刺相比，来源方便性能稳定，而且属于无创性检查检，极大地方便了医疗人员的使用，减轻了患者的痛苦。

其次，本发明确定的miRNA组合与少精症和无精症的病例指标的密切相关性，能够作为生物标记物对少精症和无精症病人进行筛查和诊断，为临床个体化干预治疗提供有效依据。

最后，通过实时荧光定量PCR技术对少精症和无精症病人的血清水平miRNA的检测，定量准确，方便可靠。

本发明确定的miRNA组合与少精症和无精症的病例指标的密切相关性，能够作为生物标记物对少精症和无精症病人进行筛查和诊断，为临床个体化干预治疗提供有效依据。为今后少精症和无精症血清miRNA的研究提供了理论依据，并为少精症和无精症的分子诊断提供了新思想，具有一定的理论意义和潜在的实用价值。

本发明还同时提供了一种用于少精症和无精症检测的荧光定量检测引物组合物，该引物组合物包括所述血清miRNA组合物中各miRNA的检测引物。

附图说明

图1是本发明miRNA生物标志物筛选的主要流程图。

图2是显示miR-34c在少精症患者、无精症患者和正常对照组中表达存在明显差异对比图。

图3是显示miR-1275在少精症患者、无精症患者和正常对照组中表达存在明显差异对比图。

图4是显示miR-375在少精症患者、无精症患者和正常对照组中表达存在明显差异对比图。

图5是显示miR-410在少精症患者、无精症患者和正常对照组中表达存在明显差异对比图。

图6是显示miR-758在少精症患者、无精症患者和正常对照组中表达存在明显差异对比图。

具体实施方式

以下通过附图和实施例对本发明作进一步的阐述。

实施例1、临床样本的搜集和临床资料的整理

按世界卫生组织标准(“人类精液及精子-宫颈粘液相互作用实验室检验手册[M]”(第4版),世界卫生组织编,谷群等译,北京:人民卫生出版社,2001.5.1)确定为无精或严重少精。精液检查至少分析2次以上(包括离心沉淀厚片分析)。所有研究对象婚龄年限2～13年，女方检查正常，婚后同居2年以上，未采取避孕措施。经过严格筛选，排除了各种感染后遗症、输精管阻塞及下丘脑——垂体疾患等原因引起的不育者。未进行过内分泌治疗。细胞遗传学分析染色体核型正常。

实施例2、少精症和无精症血清特异性miRNA表达芯片初筛

(1)芯片样本的筛选

从搜集的临床血清样本中选取了9例无精症，年龄23～29岁，平均年龄26±3岁，二次以上常规精液检查均未发现精子。少精症组9例，少精症患者的年龄22～30岁，平均年龄26±4岁，二次以上常规精液检查精子计数均少于20×10⁶/mL。对照组9例，有生育史的健康男性自愿者，年龄24～29岁，平均年龄26±3岁，精液常规正常。

(2)血清样本的收集

收集三组待检者2ml外周血，迅速转入采血管中，在室温下静置15～30min，4℃1900×g离心10min，小心吸取上清液至离心管中，4℃，16000×g离心10min，留取上清，置于-80℃冰箱中保存待用。

(3)参照Qiagen公司商品化的总RNA提取试剂盒miRNeasy Serum/Plasma kit说明书提取各组血清样本的总RNA，然后将各组总RNA均匀混合成3份。

(4)参照Agilent公司miRNA芯片说明书进行少精症、无精症和对照组的miRNA表达谱检测。

(5)根据miRNA芯片的检测结果，发现少精症血清和无精症血清的miR-34c，miR-1275，miR-375，miR-410和miR-758的表达都高于正常人，具有表达差异。

实施例3、少精症和无精症血清特异性miRNA的实时荧光定量PCR方法验证

(1)验证样本的筛选

从搜集的临床血清样本中选取了20例无精症，年龄23～35岁，平均年龄29±6岁，二次以上常规精液检查均未发现精子。少精症组20例，少精症患者的年龄22～34岁，平均年龄28±6岁，二次以上常规精液检查精子计数均少于20×10⁶/mL。对照组20例，有生育史的健康男性自愿者，年龄24～36岁，平均年龄30±6岁，精液常规正常。

(2)血清样本的收集

(3)血清中总RNA的提取

取上述血清样本，每份400μL，按Qiagen miRNeasy Serum/Plasma kit试剂盒说明书抽提血清中的总RNA，通过分光光度计测量血清RNA的浓度，将提取的RNA置于-80℃冰箱中保存待用。

(4)反转录合成cDNA

根据ABI公司商品化的MicroRNA Reverse Transcription试剂盒说明书在无RNase的0.2ml PCR管中依次加入6.387μL H₂O，0.063μL RNAase抑制剂(20U/μL)，0.05μLdNTPs(100mM)，0.03μL Multiscribe反转录酶(50U/μL)，1uL特异性茎环结构反转录引物(2μM)，1.67μL血清中的RNA(10ng/μL)。反应条件：16℃30min，42℃30min，85℃5min。本发明我们对每种miRNA设计了各自的特异性茎环结构反转录引物，单独进行如上操作，单管合成cDNA。

茎环是指反转录过程中使用的茎环结构反转录引物，其由以下核苷酸序列组成：

miR-34c：

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGCAATC；

miR-1275：

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGACAGC；

miR-375：

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCACGC；

miR-410：

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGAACT；

miR-758：

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGTGTGC。

(5)实时定量PCR

取反转录cDNA产物1μL，4.5μL H₂O，2.5μL Universal PCR Master Mix with NoAmpErase UNG Universal PCR Master Mix，10μL SYBR Green qPCR SuperMix-UDG，1μL正向引物(5μM)和1μL反向引物(5μM)，在Agilent StrataGene Mx3005P仪上进行实时荧光定量PCR反应，以miR-16小核RNA为内参照。反应条件为95℃10min，然后95℃15s，60℃30s，45个循环。反应结束后由配套的计算机软件计算各反应管内的CT值。血清miRNA的表达水平采用相对定量方法，以2^-ΔCT表示miRNA的相对表达量，其中ΔCT＝CT miRNA-CT miR-16(以此表示相对表达量)，ΔΔCT＝ΔCT(病人)-ΔCT(正常人)。

PCR正向引物：

miR-34c：GCGGCGGAGGCAGTGTAGTTAG；

miR-1275：GCGGCGGGTGGGGGAGAGGCTG；

miR-375：GCGGCGGTTTGTTCGTTCGGCTC；

miR-410：GCGGCGGAGGTTGTCTGTGATG；

miR-758：GCGGCGGGATGGTTGACCAGAG。

PCR反向引物均为：ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG。

(4)统计学处理

应用SPSS 20.0软件对实时荧光定量PCR检测结果进行分析，计量数据以均数±标准差表示，组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义，以*表示。

选20例少精症病人，20例无精症病人和20例正常人的血清样本进行荧光定量PCR实验，求得各样本的CT值，分别利用miR-34c，miR-1275，miR-375，miR-410和miR-758的CT值比miR-16的CT值做图。病例组相对于正常对照组样品血浆miRNA的表达倍数的变化公式为RQ＝2－^ΔΔCt，RQ代表相对表达变量，其中ΔCt＝Ct(样本)－Ct(内参)，ΔΔCt＝ΔCt病例－ΔCt对照。对照组中ΔΔCt为0，所以对照组的RQ默认为1。试验设计阴性对照组和重复试验，阴性对照组为反应体系中不加cDNA模板，以ddH₂O代替，所有荧光定量PCR均做三次。依据实时定量PCR结果，在少精症组和无精症组候选的5条miRNA相对于正常人表达差异明显，均为高表达，且与芯片初筛结果吻合。实验证明5条miRNA的聚集性良好，在少精症组和无精症组的表达趋势相同，虽然二者之间没有统计学意义，但是相对于精子生成的正常人的血清miRNA，miR-34c，miR-1275，miR-375，miR-410和miR-758都有明显差异，且具有统计学意义。

(1)ROC分析与诊断价值评估

为了评估miRNA，miR-34c，miR-1275，miR-375，miR-410和miR-758在少精症和无精症检测中能力，本发明对少精症，无精症和精子生成正常对照组的荧光定量PCR结果进行了风险评估，通过ROC来评价miRNA标记物在少精症和无精症在诊断中的价值。以敏感性为纵坐标代表真阳性率，1-特异性为横坐标代表假阳性率，做ROC曲线分析。曲线下面积(AUC)越大，诊断准确性越高。在ROC曲线上，最靠近坐标图左上方的点为敏感性和特异性均较高的临界值。本试验中呈现有意义的miR-34c，miR-1275，miR-375，miR-410和miR-758，其ROC曲线下的面积在0.7～0.9之间，如下表所示。说明该5个血清miRNA标志物有一定准确性，最靠近坐标图左上方的点的截断点可作为诊断参考值。

miR-34c，miR-1275，miR-375，miR-410和miR-758诊断少精症的ROC分析参见表1，miR-34c，miR-1275，miR-375，miR-410和miR-758诊断无精症的ROC分析参见表2。

表1

表2

本发明miRNA生物标志物筛选的主要流程图参见图1，显示miR-34c、miR-1275、miR-375、miR-410、miR-758在少精症患者、无精症患者和正常对照组中表达存在明显差异对比图参见图2～6。

Claims

1.一种血清miRNA生物标志物在制备少精症和无精症检测试剂中的应用，其特征在于所述血清miRNA生物标志物包括以下所列miRNA中的至少一种：

miR-375：uuuguucguucggcucgcguga；

miR-410：agguugucugugaugaguucg；

miR-758：gaugguugaccagagagcacac。

2.一种血清miRNA生物标志物组合物在制备少精症和无精症检测试剂中的应用，其特征在于所述血清miRNA生物标志物组合物包括miRNA中的至少一种以及各miRNA的反转录引物、正向引物和反向引物；

所述miRNA为：

miR-375：uuuguucguucggcucgcguga；

miR-410：agguugucugugaugaguucg；

miR-758：gaugguugaccagagagcacac；

3.一种筛选如权利要求1所述的与少精症和无精症相关的miRNA生物标志物的方法，其特征在于所述少精症和无精症检测试剂用于检测少精症和无精症的方法采用茎环的反转录-荧光定量PCR方法，即SYBR Green染料法，具体步骤如下：

2)用Qiagen公司商品化的总RNA提取试剂盒miRNeasy Serum/Plasma kit从受试样本血清中提取总RNA，通过Agilent miRNA microarray高通量筛选出候选miRNA；

3)采用实时荧光定量PCR方法筛选可用作检测标志物的miRNA。