CN112011624B - miR-155作为标志物在鉴定或辅助鉴定动物精液品质中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了miR‑155作为标志物在鉴定或辅助鉴定动物精液品质中的应用。检测待测动物个体SPEVs中miR‑155的表达量，如果待测动物个体SPEVs中miR‑155的表达量高于对照动物个体SPEVs中miR‑155的表达量，则动物精液品质为不良；如果待测动物个体SPEVs中miR‑155的表达量不高于对照动物个体SPEVs中miR‑155的表达量，则动物精液品质为良好；对照动物个体为精液品质优良的动物个体。因此，仅通过检测动物个体SPEVs中miR‑155的表达量就可以鉴定动物精液品质。本发明对建立精液品质优良的群体具有重大的应用价值。

Description

miR-155作为标志物在鉴定或辅助鉴定动物精液品质中的 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及miR-155作为标志物在鉴定或辅助鉴定动物精液品质中的应用。
背景技术
RNA-seq技术即转录组测序技术，为一种借助二代高通量测序方法对细胞或组织中的总RNA进行测序的技术。RNA-seq技术可以对细胞或组织中基因的表达情况进行检测，同时可以通过与参考基因组序列的比对检测到群体中存在的重要遗传变异。目前，RNA-seq技术已经广泛应用在动植物重要经济性状的研究中。
优良种公猪是养猪业中发展最重要的因素之一，公猪精液质量的优劣直接影响了猪场的经济效益。当前，人工授精技术在猪养殖生产中的应用越来越广泛。在世界许多养猪国家，人工授精已经是商品母猪繁殖的主要形式。利用人工授精技术不但可以加速群体的遗传改良，将优良基因扩展到更多的养殖场中，而且可以大幅提高劳动效率，降低养殖成本。而选择具有优良精液品质的种公猪则是实施人工授精的前提和保证。传统方法很难快速准确的选择精液质量，但通过分子标记进行辅助选择(Marker assisted selection，MAS)可以有效的加快育种进程，选留优势群体，淘汰劣势公猪，提高公猪精液品质性状。
细胞外囊泡(Extracellular vesicles，EVs)是一种细胞主动释放的由脂质双分子层包围的球形膜性囊泡，直径在30-4000nm，包括微囊泡(microvesicles，MV)、凋亡小体(apoptotic body)和胞外囊泡(exosome)、迁移体(migrasome)等。精浆中含有大量的胞外囊泡。前列腺是精浆胞外囊泡主要的分泌器官，也来源于附睾和其他副性腺等多个组织和器官，所以近年来把精浆中的这些成份复杂的胞外囊泡统称为精浆胞外囊泡(seminalplasma extracellular vesicles，SPEVs)。自SPEVs首次被发现以来，关于它功能的研究就从未停止。研究发现，SPEVs可以参与到顶体反应中，帮助精子在正确的时间点获能，有学者认为此功能是通过诱导精子酪氨酸磷酸化来实现的，也有研究发现SPEVs可以保护精子免于雌性生殖道的免疫反应，这对于精子成功穿过透明带并与卵子结合非常重要，有人推测该功能可能与其中的非编码RNA有关。SPEVs还可以促进精子活力，这一作用已被多个研究团队证实，而且在不同的物种中也得到了验证，有人推测这一功能可能是通过调节精子微环境中一些二价阳离子如钙、锌和镁的浓度从而调控精子鞭毛的摆动来实现的。还有研究表明SPEVs中的一些小的非编码RNA可以与雌性生殖道的靶细胞结合从而影响相关基因表达。关于SPEVs内容物的研究也是层出不穷，目前研究最广泛的包括蛋白质和小的非编码RNA(如microRNAs、YRNAs、tRNAs)，很多研究集中在“比较组学”方面，目的是挖掘SPEVs中某些物质作为某些疾病如一般不育症、梗阻型和非梗阻型无精子症、弱精子症、前列腺癌等疾病的生物标记，使疾病的诊断更加快速且无创。Abu-Halima等通过对12名正常男性和12名少精症患者的SPEVs中microRNAs进行测序分析，共鉴定到36个差异表达microRNAs，qPCR验证结果显示SPEVs中miR-765和miR-1275的表达在弱精子症患者中明显升高，miR-15a的表达明显降低。Barceló等分析了正常男性、生精障碍导致的无精子症以及梗阻型无精子症患者三组样本间SPEVs中microRNAs的表达谱，发现不仅可育男性和不育男性之间microRNAs表达有差异，生精障碍型和梗阻型无精子症男性之间也有差异。Murdica等人用正常男性、弱精症患者、输精管结扎后无精男性的SPEVs与正常男性的精子共孵育，发现精子在体外仍然可以与SPEVs结合，与Du的研究结果一致。正常和输精管结扎男性的SPEVs可以影响精子运动和获能，增加精子活力并且促进顶体反应，弱精症患者的SPEVs导致精子活力降低，作者推测富含半胱氨酸的分泌蛋白1从SPEVs转移到精子可能在这些现象中起作用。2013年，Lidia等探究了猪的SPEVs在猪精子获能过程中的作用，发现其可以抑制猪精子获能所特有的14-kD磷酸化信号的消失，抑制获能过程中顶体胆固醇的损失和流动性的增加。Du等的研究发现猪的SPEVs可以在体外与成熟精子结合，并且可以促进精子运动、维持顶体完整性。
目前关于猪SPEVs转录组学的研究还未见报道，关于SPEVs如何调控成熟精子活力的文章也未见报道。因此，通过发掘猪SPEVs中miRNAs信息，对猪精子活力进行调控，将其应用于种公猪选育淘汰，可以提高种公猪的生产性能、增加精液使用率、提高母猪的受胎率，进而加快育种进程。
发明内容
本发明的目的在于鉴定或辅助鉴定动物精液品质。
本发明首先保护用于检测miR-155表达量的物质的应用，可为a1)至a4)中的至少一种：
a1)鉴定或辅助鉴定动物精液品质；
a2)制备用于鉴定或辅助鉴定动物精液品质的产品；
a3)筛选或辅助筛选具有不同精液品质的动物个体；
a4)制备用于筛选或辅助筛选具有不同精液品质的动物个体的产品。
本发明还保护用于检测miR-155表达量的物质和装置的应用，可为a1)至a4)中的至少一种：
a1)鉴定或辅助鉴定动物精液品质；
a2)制备用于鉴定或辅助鉴定动物精液品质的产品；
a3)筛选或辅助筛选具有不同精液品质的动物个体；
a4)制备用于筛选或辅助筛选具有不同精液品质的动物个体的产品；
所述装置可为装置甲和/或装置乙；
所述装置甲可包括数据输入设备1、数据记录模块1、数据比较模块1-1和结论输出模块1-1；
数据输入设备1用于输入miR-155的表达量数值；
数据记录模块1用于存储miR-155的表达量数值；
数据比较模块1-1用于将待测动物个体SPEVs中miR-155的表达量和对照动物个体SPEVs中miR-155的表达量进行比较；
结论输出模块1-1用于显示结论，即如果待测动物个体SPEVs中miR-155的表达量高于对照动物个体SPEVs中miR-155的表达量，则结论输出模块1-1显示动物精液品质为不良；如果待测动物个体SPEVs中miR-155的表达量不高于对照动物个体SPEVs中miR-155的表达量，则结论输出模块1-1显示动物精液品质为良好；
所述对照动物个体可为精液品质优良的动物个体；
所述装置乙可包括数据输入设备1、数据记录模块1、数据比较模块1-2和结论输出模块1-2；
数据比较模块1-2用于将若干动物个体SPEVs中miR-155的表达量进行比较；
结论输出模块1-2用于显示结论，即动物个体SPEVs中miR-155的表达量越低，则精液品质越优良。
所述装置甲具体可由所述数据输入设备1、所述数据记录模块1、所述数据比较模块1-1和所述结论输出模块1-1组成。
所述装置乙具体可由所述数据输入设备1、所述数据记录模块1、所述数据比较模块1-2和所述结论输出模块1-2组成。
在本发明的实施例中，所述对照动物个体具体可为实施例中编号为H11、H12、H13、H14、H15或H16的大白猪，或者，编号为H1、H2、H3或H4的杜洛克猪。
上述任一所述的应用中，所述用于检测miR-155表达量的物质可为用于反转录(即用于反转录miR-155)的引物对1和/或用于实时荧光定量PCR检测的引物对2；
所述引物对1可由SEQ ID NO：1所示的引物F1和SEQ ID NO：2所示的引物R1组成；
所述引物对2可由SEQ ID NO：3所示的引物F3和SEQ ID NO：4所示的引物R4组成。
本发明还保护一种试剂盒，可包括用于检测miR-155表达量的物质；所述试剂盒的功能可为a1)或a3)：
a1)鉴定或辅助鉴定动物精液品质；
a3)筛选或辅助筛选具有不同精液品质的动物个体。
所述试剂盒中，所述用于检测miR-155表达量的物质可为用于反转录(即用于反转录miR-155)的引物对1和/或用于实时荧光定量PCR检测的引物对2；
所述引物对1可由SEQ ID NO：1所示的引物F1和SEQ ID NO：2所示的引物R1组成；
所述引物对2可由SEQ ID NO：3所示的引物F3和SEQ ID NO：4所示的引物R4组成。
上述任一所述试剂盒具体可由用于检测miR-155表达量的物质组成。
本发明还保护D1)-D6)中的至少一种：
D1)miR-155作为标志物在鉴定或辅助鉴定动物精液品质中的应用；
D2)miR-155作为标志物在制备用于鉴定或辅助鉴定动物精液品质的产品中的应用；
D3)miR-155作为标志物在筛选或辅助筛选具有不同精液品质的动物个体中的应用；
D4)miR-155作为标志物在制备用于筛选或辅助筛选具有不同精液品质的动物个体的产品中的应用；
D5)miR-155作为标志物在调控动物精液品质中的应用；
D6)miR-155作为标志物在制备用于调控动物精液品质的产品中的应用。
本发明还保护降低动物个体SPEVs中miR-155的表达量的物质在提高动物精液品质中的应用。
本发明还保护提高动物个体SPEVs中miR-155的表达量的物质在降低动物精液品质中的应用。
本发明还保护一种鉴定或辅助鉴定动物精液品质的方法，可包括如下步骤：
(1-1)检测待测动物个体SPEVs中miR-155的表达量；
(1-2)根据miR-155的表达量判断动物精液品质；
根据miR-155的表达量判断精液品质的原则为：miR-155的表达量越低，则精液品质越优良。
上述方法可通过比较待测动物个体SPEVs中miR-155的表达量和精液品质优良的动物个体SPEVs中miR-155的表达量实现。当动物为猪时，所述精液品质优良的动物个体具体可为实施例中编号为H11、H12、H13、H14、H15或H16的大白猪，或者，编号为H1、H2、H3或H4的杜洛克猪。
上述方法可通过比较待测动物个体SPEVs中miR-155的表达量和精液品质不良的动物个体SPEVs中miR-155的表达量实现。当动物为猪时，所述精液品质不良的动物个体具体可为实施例中编号为L11、L12、L13、L14、L15或L16的大白猪，或者，编号为L1、L2、L3或L4的杜洛克猪。
上述任一所述动物可为b1)至b4)中的任一种；b1)人；b2)猪；b3)杜洛克猪；b4)大白猪。
上述任一所述精液品质优良可为精子总活力>90％且快速运动>70％。
上述任一所述精液品质优良可为精子总活力>90％、快速运动>70％且慢速运动<12％。
上述任一所述精液品质不良可为精子总活力<80％且快速运动<55％。
上述任一所述精液品质不良可为精子总活力<80％、快速运动<55％且慢速运动>15％。
上述任一所述miR-155的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
实验证明，杜洛克猪或大白猪中，miR-155在精液品质高组的表达量显著低于miR-155在精液品质低组的表达量。因此，仅通过检测动物个体SPEVs中miR-155的表达量就可以鉴定动物精液品质。本发明可以筛选获得精液品质优良的动物个体且具有较高的准确率，可用于种公猪的早期筛选，甚至在种公猪刚性成熟时就可准确地进行筛选，大大加快猪的育种进程，选留优势群体，淘汰劣势公猪，提高公猪精液品质性状。本发明对建立精液品质优良的种公猪群体具有重大的应用价值。
附图说明
图1为转录组测序结果中精液品质高组和精液品质低组miR-155的表达量分析。
图2为荧光定量PCR检测miR-155在大白猪SPEVs中的表达量。
图3为荧光定量PCR检测miR-155在杜洛克猪SPEVs中的表达量。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、转录组测序发现miR-155在高、低精液品质的大白猪精浆胞外囊泡中的表达具有显著差异
一、试验动物与分组
本实施例所用的鲜精样品来自河南精旺种猪改良有限公司，公猪品种为大白猪，月龄在24-36个月，在正常营养水平和饲养条件下饲养至性成熟。根据半年内公猪站的采精记录筛选精液品质高的公猪和精液品质低的公猪，最终选择了12个个体。所有公猪分为两组，精液品质高组(总活力>90％且快速运动>70％)和精液品质低组(总活力<80％且快速运动<55％)。12头公猪由采精员在同一时间进行收集鲜精样品。
12头公猪的编号、个体号、月龄、鲜精样品的精子总活力(％)、快速运动(％)和慢速运动(％)的信息具体见表1。
表1
编号 个体号 月龄 精子总活力(％) 快速运动(％) 慢速运动(％)
H11 Y607647 30 97.7 78.3 10.3
H12 Y803771 24 98.7 71.1 21.9
H13 Y703589 31 99.6 76.9 7.6
H14 Y700486 27 99.6 78.3 5.6
H15 Y700600 26 98.5 77.9 6.6
H16 Y700601 26 99.3 77.6 7.6
L11 Y97910 36 73.2 32.9 26.8
L12 Y702447 27 65.8 42.1 23.7
L13 Y702624 27 31.3 14.3 9.8
L14 Y700606 24 74.9 37.7 20.1
L15 Y700609 30 76.3 33.7 22.5
L16 Y700612 29 72.5 34.7 10.5
注：编号中含有H的属于精液品质高组；编号中含有L的属于精液品质低组。
二、分离猪精浆胞外囊泡(即猪SPEVs)
分别从12个鲜精样品中分离相应的猪SPEVs。每个鲜精样品分离猪SPEVs的步骤依次如下：
1、取鲜精样品，17℃平衡2h，之后17℃、800g离心15min，收集上清1。
2、完成步骤1后，取上清1，4℃、10000g离心30min，收集上清2。
3、完成步骤2后，取上清2，4℃、12000g离心60min，收集上清3。
4、完成步骤3后，取上清3，4℃、120000g离心1.5h，弃上清，用DPBS缓冲液(Gibco，美国)重悬沉淀，得到重悬液。
5、完成步骤4后，取重悬液，4℃、120000g离心1.5h，弃上清，用DPBS缓冲液重悬沉淀，然后用0.22μm滤膜过滤除菌，得到猪SPEVs。
将猪SPEVs置于-80℃保存备用。
三、猪SPEVs中总RNA提取及浓度测定
分别从步骤二分离的12个猪SPEVs中提取总RNA，得到猪SPEVs的总RNA。每个猪SPEVs提取总RNA的步骤依次如下：
1、取200μL猪SPEVs，加入700μL QIAzol裂解液(QIAGEN，德国)，涡旋混匀；室温(15-25℃)静置5min。
2、完成步骤1后，加入140μL氯仿，并盖紧盖大力晃动15s，室温静置2-3min，4℃、12000g离心15min。
3、完成步骤2后，将上清转移至新的EP管中，加入1.5倍体积的无水乙醇，混匀，得到混合液。
4、完成步骤3后，将混合液转移至RNeasy Mini柱(QIAGEN，德国)，并放入2mL的收集管中。室温、8000g离心15s，弃掉收集管中的液体。
如果步骤3得到的混合液体积较大，可以分多次转移至RNeasy Mini柱，离心收集。
5、完成步骤4后，向RNeasy Mini柱内加入700μL Buffer RWT(QIAGEN，德国)，室温、8000g离心15s，弃滤液。
6、完成步骤5后，重复如下步骤两次：向RNeasy Mini柱内加入500μL Buffer RPE(QIAGEN，德国)，室温、8000g离心15s，弃滤液。
7、完成步骤6后，将RNeasy Mini柱移入一个新的2mL收集管内，室温、12000g离心2min。
8、完成步骤7后，将RNeasy Mini柱移入一个新的1.5mL的EP管(QIAGEN，德国)内，开盖，室温静置3min。
9、完成步骤8后，向RNeasy Mini柱中加入35μL RNA free water，盖盖，室温静置2min；之后室温、12000g离心1min，弃RNeasy Mini柱，EP中即为猪SPEVs的总RNA。
采用Nanodrop核酸分析仪(Thermo Scientific，美国)检测12个猪SPEVs的总RNA的纯度和浓度。利用Agilent2100(Agilent，美国)检测12个猪SPEVs的总RNA的完整性。
结果表明，12个猪SPEVs的总RNA的浓度均大于8ng/μL，RIN值均为2.6。可以进行后续实验。
四、microRNAs文库构建及测序
1、分别取步骤三提取的12个猪SPEVs的总RNA，由北京恩泽康泰生物有限公司进行microRNAs建库，得到猪SPEVs的microRNAs文库。
每个猪SPEVs的microRNAs文库采用QIAseq miRNA Library Kit试剂盒(QIAGEN，德国)制备，简化的建库步骤如下：①3’和5’端adaptor连接；②Biotinylated RandomPrimers和mRNA混合逆转录；③通过磁珠捕获mRNA，洗脱后进行cDNA纯化；④PCR扩增。建库完成后，使用Agilent Bioanalyzer 2100进行质检，质检合格后使用Illumina Hiseq2500进行双末端测序，测序读长为单端10×150bp，得到猪SPEVs的microRNAs文库。
2、每个猪SPEVs的microRNAs文库的数据进行如下分析：
取测序后的原始序列(Raw reads)，用CutAdapt软件进行过滤，去除建库时加入的接头序列和低质量reads，形成Clean reads；使用Bowtie软件将Clean reads与Silva数据库、GtRNAdb数据库、Rfam数据库和Repbase数据库进行序列比对，过滤掉核糖体RNA(rRNA)、转运RNA(tRNA)、核内小RNA(snRNA)、核仁小RNA(snoRNA)以及重复序列，过滤后得到unannotated reads用于后续分析，之后借助BWA软件将Clean reads比对到猪的参考基因组序列sscrofa11.1(网址为：ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-97/fasta/sus_scrofa/)和相应的基因注释文件(sscrofa11.1)。
12头公猪精浆胞外囊泡的测序数据量和质控结果(即Q30)见表2。碱基质量值Q30为碱基匹配精度达到99.9％的水平，Q30＝质量值达到Q30及以上的碱基/总碱基。
表2
个体编号 Raw_reads Clean_reads Q30(％)
H11 44155157 20067012 96.59
H12 46366912 23420398 96.52
H13 23748043 18369054 95.42
H14 20947680 16895273 95.02
H15 26116417 20417434 95.1
H16 24827825 19415765 94.99
L11 27845405 17545399 95.17
L12 29454499 23098445 95.22
L13 26418304 19695810 95.61
L14 26048993 15842954 95.66
L15 37537379 22145574 95.84
L16 30986979 11728462 95.02
五、转录组测序中差异microRNA的筛选
1、根据步骤四获得的测序数据，使用miRDeep2将比对到参考基因组上的reads与已知microRNAs数据库miRBase中的成熟microRNAs序列进行比对，获得已知microRNAs和预测新microRNAs。对各个样本中的microRNAs进行表达量统计，并用TPM(Transcripts PerMillion，TPM)算法对表达量进行归一化处理。
归一化公式为：TPM＝(Read counts×1000000)/Mapped Reads
公式中，read counts表示比对到某一microRNA的reads数目，Mapped Reads表示比对到所有microRNAs上的reads数目。
另外，考虑到低表达的microRNAs生物学意义不大，假阳性高，同时也为了获得更有意义的功能注释分析结果，本研究中只选取在各样本中平均表达量(TPM)高于10的microRNAs进行差异表达分析。
2、使用edgeR软件进行高低组间差异microRNAs分析。本研究设定差异显著阈值为P-value≤0.05。
分析结果见图1。结果表明，在猪精液的精浆胞外囊泡中，miR-155是一个差异极显著的miRNAs，miR-155在精液品质高组的表达量显著低于miR-155在精液品质低组的表达量。
miR-155的核苷酸序列为：5’-AUUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGG-3’(SEQ ID NO：5)。
实施例2、实时荧光定量PCR检测miR-155在高、低精液品质的大白猪SPEVs的总RNA(实施例1中步骤三获得)中的表达量
一、引物对的制备
根据miR-155的核苷酸序列设计并合成用于反转录的引物对1(由引物F1和引物R1组成)和用于实时荧光定量PCR检测的引物对2(由引物F2和引物R2组成)。
各个引物的核苷酸序列见表3。
表3
Figure BDA0002658591050000091
二、猪SPEVs的cDNA的获得
分别取实施例1中步骤三获得的猪SPEVs的总RNA，采用引物对1进行反转录，得到猪SPEVs的cDNA。
反应体系均为15μL，包括5μL猪SPEVs的总RNA、0.15μL 100mM dNTP、1μLMultiScribe Reverse Transcriptase、1.5μL 10×Reverse Transcription Buffer、1.5μL引物F1水溶液(浓度为10μM)、1.5μL引物R1水溶液(浓度为10μM)和4.35μL Nuclease-freeH2O。
反应程序为：16℃30min；42℃30min；85℃5min。
MultiScribe Reverse Transcriptase和10×Reverse Transcription Buffer均为
Figure BDA0002658591050000092
Transcription Kit 200Reactions试剂盒(ABI，美国)中的组件。
三、实时荧光定量PCR检测miR-155的表达量
实时荧光定量分别检测12个猪SPEVs的cDNA中miR-155的表达量。
实时荧光定量检测每个猪SPEVs的cDNA中miR-155的表达量的步骤依次如下：
1、取猪SPEVs的cDNA，用水稀释至300ng/μL，得到猪SPEVs cDNA的稀释液。
2、以猪SPEVs cDNA的稀释液为模板，采用引物对2进行实时荧光定量检测，之后按组取平均值，得到猪精液品质高组和猪精液品质低组中miR-155的表达量。
反应体系为20μL，包括2.0μL猪SPEVs cDNA的稀释液、1.0μL引物F2水溶液(浓度为10μM)、1.0μL引物R2水溶液(浓度为10μM)、10.0μL SYBR PCR buffer和6.0μL ddH2O(请核实反应体系，现在不够20μL)。
SYBR PCR buffer为瑞士Roche公司的
Figure BDA0002658591050000103
SYBR GreenⅠMaster产品。
反应程序见表4。
表4
Figure BDA0002658591050000101
检测结果见图2。结果表明，大白猪中，miR-155在精液品质高组的表达量显著低于miR-155在精液品质低组的表达量(P<0.001)。
实施例3、实时荧光定量PCR检测miR-155在高、低精液品质的杜洛克猪SPEVs的总RNA中的表达量
一、引物对的制备
同实施例2中步骤一。
二、猪SPEVs的cDNA的获得
1、本实施例所用的鲜精样品来自河南精旺种猪改良有限公司，公猪品种为杜洛克，月龄在24-36个月，在正常营养水平和饲养条件下饲养至性成熟。根据半年内公猪站的采精记录筛选精液品质高的公猪和精液品质低的公猪，最终选择了8个个体。所有公猪分为两组，精液品质高组(总活力>90％、快速运动>70％且慢速运动<12％)和精液品质低组(总活力<80％、快速运动<55％且慢速运动>15％)。8头公猪由采精员在同一时间进行收集鲜精样品。
8头公猪的编号、个体号、月龄、鲜精样品的精子总活力(％)、快速运动(％)和慢速运动(％)的信息具体见表5。
表5
Figure BDA0002658591050000102
Figure BDA0002658591050000111
注：编号中含有H的属于精液品质高组；编号中含有L的属于精液品质低组。
2、分离猪精浆胞外囊泡(即猪SPEVs)
分别从8个鲜精样品中分离相应的猪SPEVs。每个鲜精样品分离猪SPEVs的步骤见实施例1中步骤二。
3、猪SPEVs中总RNA提取及浓度测定
分别从步骤2分离的8个猪SPEVs中提取总RNA，得到猪SPEVs的总RNA。每个猪SPEVs提取总RNA的步骤见实施例1中步骤三。
采用Nanodrop核酸分析仪检测8个猪SPEVs的总RNA的纯度和浓度。利用Agilent2100检测8个猪SPEVs的总RNA的完整性。
结果表明，8个猪SPEVs的总RNA的浓度均大于8ng/μL，RIN值均为2.6。可以进行后续实验。
4、猪SPEVs的cDNA的获得
分别取步骤3获得的猪SPEVs的总RNA，采用引物对1进行反转录，得到猪SPEVs的cDNA。
反应体系与实施例2中步骤二的反应体系完全一致。
反应程序与实施例2中步骤二的反应程序完全一致。
三、实时荧光定量PCR检测miR-155的表达量
实时荧光定量分别检测8个猪SPEVs的cDNA中miR-155的表达量。
实时荧光定量检测每个猪SPEVs的cDNA中miR-155的表达量的步骤依次如下：
1、取猪SPEVs的cDNA，用水稀释至300ng/μL，得到猪SPEVs cDNA的稀释液。
2、以猪SPEVs cDNA的稀释液为模板，采用引物对2进行实时荧光定量检测，之后按组取平均值，得到猪精液品质高组和猪精液品质低组中miR-155的表达量。
反应体系与实施例2中步骤三的反应体系完全一致。
反应程序与实施例2中步骤三的反应程序完全一致。
检测结果见图3。结果表明，杜洛克猪中，miR-155在精液品质高组的表达量显著低于miR-155在精液品质低组的表达量(P<0.001)。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
<110> 中国农业大学
<120> miR-155作为标志物在鉴定或辅助鉴定动物精液品质中的应用
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacccccta 50
<210> 2
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
gtgcagggtc cgaggt 16
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
agcccgttaa tgctaattgt ga 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
tcgcactgga tacgaccccc ta 22
<210> 5
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 5
auuaaugcua auugugauag ggg 23

Claims (8)

1.用于检测精浆胞外囊泡中miR-155表达量的物质的应用，为A1或A2：
A1、制备用于鉴定或辅助鉴定杜洛克猪精液品质的产品；
A2、制备用于筛选或辅助筛选具有不同精液品质的杜洛克猪的产品；
所述精液品质为精液品质优良或精液品质不良；
所述精液品质优良为精子总活力>90％、快速运动>70％且慢速运动<12％；
所述精液品质不良为精子总活力<80％、快速运动<55％且慢速运动>15％；
如果待测杜洛克猪精浆胞外囊泡中miR-155的表达量高于对照杜洛克猪精浆胞外囊泡中miR-155的表达量，则待测杜洛克猪精液品质为不良；如果待测杜洛克猪精浆胞外囊泡中miR-155的表达量不高于对照杜洛克猪精浆胞外囊泡中miR-155的表达量，则待测杜洛克猪精液品质为优良；
所述对照杜洛克猪为精液品质优良的杜洛克猪。
2.用于检测精浆胞外囊泡中miR-155表达量的物质的应用，为B1或B2：
B1、制备用于鉴定或辅助鉴定大白猪精液品质的产品；
B2、制备用于筛选或辅助筛选具有不同精液品质的大白猪的产品；
所述精液品质为精液品质优良或精液品质不良；
所述精液品质优良为精子总活力>90％且快速运动>70％；
所述精液品质不良为精子总活力<80％且快速运动<55％；
如果待测大白猪精浆胞外囊泡中miR-155的表达量高于对照大白猪精浆胞外囊泡中miR-155的表达量，则待测大白猪精液品质为不良；如果待测大白猪精浆胞外囊泡中miR-155的表达量不高于对照大白猪精浆胞外囊泡中miR-155的表达量，则待测大白猪精液品质为优良；
所述对照大白猪为精液品质优良的大白猪。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述用于检测精浆胞外囊泡中miR-155表达量的物质为用于反转录的引物对1和用于实时荧光定量PCR检测的引物对2；
所述引物对1由SEQ ID NO：1所示的引物F1和SEQ ID NO：2所示的引物R1组成；
所述引物对2由SEQ ID NO：3所示的引物F3和SEQ ID NO：4所示的引物R4组成。
4.用于检测精浆胞外囊泡中miR-155表达量的物质和装置的应用，为A1或A2：
A1、制备用于鉴定或辅助鉴定杜洛克猪精液品质的产品；
A2、制备用于筛选或辅助筛选具有不同精液品质的杜洛克猪的产品；
所述精液品质为精液品质优良或精液品质不良；
所述装置包括数据输入设备1、数据记录模块1、数据比较模块1-1和结论输出模块1-1；
数据输入设备1用于输入miR-155的表达量数值；
数据记录模块1用于存储miR-155的表达量数值；
数据比较模块1-1用于将待测杜洛克猪精浆胞外囊泡中miR-155的表达量和对照杜洛克猪精浆胞外囊泡中miR-155的表达量进行比较；
结论输出模块1-1用于显示结论，即如果待测杜洛克猪精浆胞外囊泡中miR-155的表达量高于对照杜洛克猪精浆胞外囊泡中miR-155的表达量，则结论输出模块1-1显示杜洛克猪精液品质为不良；如果待测杜洛克猪精浆胞外囊泡中miR-155的表达量不高于对照杜洛克猪精浆胞外囊泡中miR-155的表达量，则结论输出模块1-1显示杜洛克猪精液品质为优良；
所述对照杜洛克猪为精液品质优良的杜洛克猪；
所述精液品质优良为精子总活力>90％、快速运动>70％且慢速运动<12％；
所述精液品质不良为精子总活力<80％、快速运动<55％且慢速运动>15％。
5.用于检测精浆胞外囊泡中miR-155表达量的物质和装置的应用，为B1或B2：
B1、制备用于鉴定或辅助鉴定大白猪精液品质的产品；
B2、制备用于筛选或辅助筛选具有不同精液品质的大白猪的产品；
所述精液品质为精液品质优良或精液品质不良；
所述装置包括数据输入设备1、数据记录模块1、数据比较模块1-2和结论输出模块1-2；
数据输入设备1用于输入miR-155的表达量数值；
数据记录模块1用于存储miR-155的表达量数值；
数据比较模块1-2用于将待测大白猪精浆胞外囊泡中miR-155的表达量和对照大白猪精浆胞外囊泡中miR-155的表达量进行比较；
结论输出模块1-2用于显示结论，即如果待测大白猪精浆胞外囊泡中miR-155的表达量高于对照大白猪精浆胞外囊泡中miR-155的表达量，则结论输出模块1-2显示大白猪精液品质为不良；如果待测大白猪精浆胞外囊泡中miR-155的表达量不高于对照大白猪精浆胞外囊泡中miR-155的表达量，则结论输出模块1-2显示大白猪精液品质为优良；
所述对照大白猪为精液品质优良的大白猪；
所述精液品质优良为精子总活力>90％且快速运动>70％；
所述精液品质不良为精子总活力<80％且快速运动<55％。
6.如权利要求4或5所述的应用，其特征在于：所述用于检测miR-155表达量的物质为用于反转录的引物对1和用于实时荧光定量PCR检测的引物对2；
所述引物对1由SEQ ID NO：1所示的引物F1和SEQ ID NO：2所示的引物R1组成；
所述引物对2由SEQ ID NO：3所示的引物F3和SEQ ID NO：4所示的引物R4组成。
7.miR-155作为标志物在制备用于鉴定或辅助鉴定杜洛克猪或大白猪精液品质的产品中的应用。
8.miR-155作为标志物在制备用于筛选或辅助筛选具有不同精液品质的杜洛克猪或大白猪的产品中的应用。
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