CN109811052A - 一种检测特发性无精症的试剂盒及基因panel - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因检测技术领域，具体地说，是一种检测特发性无精症的试剂盒及基因panel。本发明利用患者少量(3ml)外周血提取DNA，经过建库，高通量测序等过程对患者的基因突变进行检测，并通过生物信息学分析，如突变频率、突变性质、生物学危害性、保守性等进行评估，发现了30个新的患者致病的基因突变。本发明只需提取患者3ml外周血，即可进行检测，且覆盖了多达30个检测位点，提高了突变的检出率，30个位点在一个反应体系中进行，大大减少了工作量，提高了工作效率，节约了工作时间。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，具体地说，是一种检测特发性无精症的试剂盒及基因panel。
背景技术
无精子症是引起男性不育的最严重的一种状况，核心特征主要为射出精液中无精子存在，据统计大约影响着全球1％的男性。无精症在病因上具有高度的异质性，众多研究已证实遗传异常是无精子症的重要致病因素，约占所有无精症病例的15％，已知病因包括Yq微缺失及Klinefelter综合征等。2015年Yatsenko,A.N.及其同事等在散发无精症患者群中发现TEX11罕见突变引起精子发生障碍，并在医学研究顶级学术期刊《柳叶刀》发表了成果。同期，还有众多研究，例如Fakhro,Khalid A及其同事等在6个近亲婚配的家系内的无精症患者兄弟中通过高通量全外显子测序发现了SPO11,WNK3,NANOS2,TEX14及CCDC155导致生精障碍的罕见基因突变等。因此证实了部分基因的罕见突变可导致无精症的发生，并且这些突变可以通过现有的测序技术发现。而目前临床上针对无精子症的检查主要包括：精液常规，性激素检查，阴囊超声，遗传学检查主要包括：染色体核型检查，Y染色体微缺失检查。这些经典的检查方法自20年前兴起且鲜有更新，不可否认其具有良好的效力，但仍有大约72％的无精症病例无法明确其具体病因，被称为特发性无精症，亟待发现新的分子诊断标记物。
随着人类基因组测序计划完成和高通量测序技术的发展，医学领域的科研工作者对人类基因组有了更深入的认识，对疾病遗传变异、致病基因的功能及作用机制的研究也逐渐深入。目前应用较为成熟的全外显子组测序技术，是利用外显子捕获试剂盒捕捉整个基因的外显子及其周边区域的基因序列，然后进行高通量测序，因其花费小，产出数据率用率高的特点在各种遗传疾病研究中崭露头角。近几年来，因测序成本由近万元大幅下降至钱百元水平，使得其作为临床常规检测成为可能。
中国专利文献CN201580000582.6公开了一种检测与特发性无精子症相关的遗传标记的试剂盒，该试剂盒包括引物对，上述遗传标记位于AR基因的编码区，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其中，所述序列的突变位点选自c.868T>C、c.1484G>A、c.1888C>T、c.569C>T、c.616A>G和c.1149C>T中的一个或多个；上述引物对的上游引物和下游引物分别位于上述突变位点的上游和下游。通过大规模测序在特发性无精子症病人中筛选出了AR基因的6个新的突变位点，研究表明AR基因的上述突变可能导致特发性无精子症的发生，从而能够通过使用试剂盒检测上述突变来实现对特发性无精子症的诊断检测。
中国专利文献CN201510220417.3公开了一种用于男性无精症诊断的试剂盒和使用方法。该试剂盒为用于测定血浆miR-15b的不同表达水平的生物标志物检测试剂，通过miR-15b的过高表达提示无精症，发现了一种在精子发生过程中起重要作用的微小RNA基因miR-15b，miR-15b在男性不育病人中的表达差异，并且可以在血浆中检测到其表达的显著变化。试剂盒基于定量PCR的原理，结果重复性好，客观准确，易于在不同的检测机构与医院检验科，男科实验室等推广。
但是关于本发明的检测特发性无精症的试剂盒及基因panel，目前还未见报道。
发明内容
本发明利用患者少量(3ml)外周血提取DNA，经过建库，高通量测序等过程对患者的基因突变进行检测，并通过生物信息学分析，如突变频率、突变性质、生物学危害性、保守性等进行评估，发现了30个新的患者致病的基因突变。
本发明的第一个目的是，针对现有技术中的不足，提供一种检测特发性无精症的试剂盒。
本发明的第二个目的是，提供一种检测特发性无精症的基因panel。
本发明的第三个目的是，提供一种上述基因panel的用途。
为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：
一种检测特发性无精症的试剂盒，所述的试剂盒包含检测以下突变基因的试剂：
作为本发明的一个优选技术方案，所述的试剂为探针或PCR引物。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
一种检测特发性无精症的基因panel，所述的基因panel包括38个基因，所述38个基因对应的名称如下：
GTF2H3、DMC1、TDRD7、MAGEB4、DNAH6、HAUS7、SPINK2、CCDC155、NANOS2、SPO11、WNK3、AR、AK7、KLHL10、MEIOB、NANOS1、NR5A1、SYCE1、SYCP3、TAF4B、TEX11、TEX14、TEX15、USP9Y、ZMYND15、SOHLH1、TDRD9、USP26、UTP14C、ZMYND15、HSF2、MEI1、NLRP14、NPAS2、PLK4、SPATA17、STRA8、XRCC2。
为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：
上述基因panel在制备检测特发性无精症试剂中的应用。
本发明优点在于：
1、本发明只需提取患者3ml外周血，即可进行检测，且覆盖了多达30个检测位点，提高了突变的检出率，30个位点在一个反应体系中进行，大大减少了工作量，提高了工作效率，节约了工作时间。
2、本发明的38个基因panel可一次性对多个已证实可导致特发性无精症相关的基因进行检测，能够显著提特发性无精症的突变位点的阳性检出率，能够用于特发性无精症的病因学探讨和分子遗传学诊断，为特发性无精症患者遗传咨询提供重要的判断依据。对患者进行外显子捕获测序可以高效、全面、快速的检测致病突变，无疑对临床有很大指导意义。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围；此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例
本发明利用下列基因Panel对对100名特发性无精症患者及300例中国汉族无精症患者的血液样本及于上海市人类精子库捐精的合格志愿者提供的血液样本进行外显子测序，具体步骤如下：
1DNA抽提与检测
使用QIAamp DNA Blood Midi Kit(Qiagen)从EDTA-抗凝的外周全血中提取所有样品的基因组DNA。使用OD测量(NanoDrop，Thermo Scientific)对DNA进行定量，并根据Agilent的要求用于文库制备(约3μg)。
2基于Tn5转座酶的接头插入与片段化
(1)于冰上配置反应体系：
(2)吹吸混匀，点甩离心；
(3)PCR仪器中50～60℃孵育5分钟；
(4)将反应体系立即置于冰中，冰立即加入30μL 2xTn5 Digestion Mix(全式金)，移液器吹吸混匀，PCR仪器中55℃孵育5分钟，立即置于冰中。
3DNA纯化
采用MagicPureTMSize Selection DNA Beads(全式金EC401)进行产物纯化，具体操作步骤：
(1)从2-8℃取出磁珠，室温静置30分钟后备用；
(2)将上述反应产物全部转移到1.5ml灭菌离心管中；
(3)震荡磁珠使其充分混匀，吸取等体积磁珠加入上步产物中；
(4)移液枪吹吸混匀，室温静置5分钟；
(5)将1.5ml离心管置于磁力架上，室温静置至溶液澄清后弃去上清液；
(6)保持1.5ml离心管在磁力架上，向管中加入200μL新鲜配置的80％乙醇，不要吹吸磁珠，室温静置30秒，弃上清；
(7)重复步骤(6)一次；
(8)保持1.5ml离心管在磁力架上，室温晾干磁珠；
(9)将1.5ml离心管移出磁力架，加入22μL Library Elution Buffer。吹吸混匀，室温静置2分钟至溶液澄清；
(10)吸取20μL洗脱液转移到新的PCR管中，进行下一步的文库扩增反应。
4文库扩增
(1)冰上加入：
(2)吹吸混匀，点甩离心；
(3)PCR扩增程序如下：
5文库扩增产物片段分选
分选片段为400～500bp的DNA；
(1)从2-8℃取出磁珠，室温静置30分钟后备用；
(2)将上述扩增产物全部转移到1.5ml灭菌离心管中；
(3)震荡磁珠使其充分混匀，吸DNA溶液体积0.6倍的磁珠加入上步产物中；
(4)移液枪吹吸混匀，室温静置5分钟；
(5)将1.5ml离心管置于磁力架上，室温静置至溶液澄清后将上清液转移至另一干净的1.5ml离心管中；
(6)向上清液中加入初始DNA溶液体积0.15倍的磁珠，移液枪吹吸混匀，室温静置5分钟；
(7)保持1.5ml离心管在磁力架上，向管中加入200μL新鲜配置的80％乙醇，不要吹吸珠，室温静置30秒，弃上清，并重复一次；
(8)保持1.5ml离心管在磁力架上，室温晾干磁珠；
(9)将1.5ml离心管移出磁力架，加入22μL Nuclease-free Water洗脱DNA。吹吸混匀，室温静置2分钟至溶液澄清。转移洗脱液(DNA)至另一个干净的离心管中，置于-20℃保存。
6目的区段捕获
使用SureSelect Human All Exon V7(Agilent Technologies)捕获目标区域。
(1)杂交反应
a.配置杂交buffer：
65℃预热5min；
b.配置Block Mix并与文库混合：
95℃5分钟，65℃Hold；
c.配置捕获文库体系：
用nuclease-free water2:1稀释RNase Block
SureSelect Human All Exon 50M Library 5μL
Diluted SureSelect RNase Block 2μL
Total volume 7μL
65℃预热2分钟，
将13μl杂交buffer体系(a)和样本文库体系(b)加入到捕获文库体系(c)中，65℃反应24小时；
(2)洗涤
将上述杂交体系加入到磁珠溶液中，震荡3-5次。将混合液防止在垂直旋转仪上，常温放置30分钟。将1.5ml离心管置于磁力架上，室温静置至溶液澄清后将上清液弃去。将离心管从磁力架上去下，加入500μl Wash buffer 1,静置15分钟。重新将离心管放入磁力架至溶液澄清，弃去上清液。将离心管从磁力架上去下，加入500μl Wash buffer 2,60℃静置10分钟。重新将离心管放入磁力架至溶液澄清，弃去上清液。重复使用Wash buffer 2的步骤三次。加入50μl SureSelect Elution Buffer,室温静置10分钟。将洗脱液转入新的1.5ml离心管。加入50μl SureSelect Neutralization Buffer,过柱纯化。
(3)使用Library Amplification SuperMix再次进行扩增，条件不变。
7文库质检
通过使用Themo Qubit和Aglient 2100bioanalyzer分别对文库的总核酸定量及文库分布片段进行检测。使用qPCR的方法对有效文库进行绝对定量。Qubit定量需求的样品量为25μl,浓度>15ng/μl；最终获得的DNA片段大小分布在300～600bp，主峰430bp；qPCR定量需求的样品量为25μl,浓度>10nM。
8上机测序
经过富集的目标片段使用Novaseq 6000高通量测序仪(illumina)进行150bppaired-end测序。
9数据分析
数据分析采用本实验室建立的数据分析流程，简单来说，即使用BurrowsWheelerAlignment Tool(BWA)进行测序的DNA片段与人参考基因组(hg19)的比对。使用GenomeAnalysis Toolkit(GATK)软件(版本3.7)根据GATK最佳实践进一步处理序列读数。使用GATK HaplotypeCaller寻找SNV/indel。最后，应用ANNOVAR注释原始的VCF。
10实验结果
结果发现11个出现于无精症患者且不出现于生育力正常的捐精志愿者中的，可导致精子发生障碍的基因，包含突变位点30个，展示如下。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种检测特发性无精症的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含检测以下突变基因的试剂：
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂为探针或PCR引物。
3.一种检测特发性无精症的基因panel，其特征在于，所述的基因panel包括38个基因，所述38个基因对应的名称如下：
GTF2H3、DMC1、TDRD7、MAGEB4、DNAH6、HAUS7、SPINK2、CCDC155、NANOS2、SPO11、WNK3、AR、AK7、KLHL10、MEIOB、NANOS1、NR5A1、SYCE1、SYCP3、TAF4B、TEX11、TEX14、TEX15、USP9Y、ZMYND15、SOHLH1、TDRD9、USP26、UTP14C、ZMYND15、HSF2、MEI1、NLRP14、NPAS2、PLK4、SPATA17、STRA8、XRCC2。
4.权利要求3所述的基因panel在制备检测特发性无精症试剂中的应用。
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| CN201910257581.XA CN109811052A (zh) | 2019-04-01 | 2019-04-01 | 一种检测特发性无精症的试剂盒及基因panel |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112094897A (zh) * | 2020-09-07 | 2020-12-18 | 武汉大学 | Meiob基因或meiob编码蛋白表达水平在特发性不孕不育症中的应用 |
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| CN106170562A (zh) * | 2015-07-01 | 2016-11-30 | 深圳市第二人民医院 | 一种检测与特发性无精子症相关的遗传标记的试剂盒 |
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| CN106701925A (zh) * | 2016-12-08 | 2017-05-24 | 福建医科大学 | 一种白内障致病基因检测试剂盒及其检测方法 |
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2019
- 2019-04-01 CN CN201910257581.XA patent/CN109811052A/zh active Pending
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