TW201321520A - 用於病毒檢測的方法和系統 - Google Patents

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Abstract

提供了用於病毒檢測的方法和系統。其中，用於病毒檢測的方法包括以下步驟：針對包含病毒核酸的樣品，製備DNA測序庫；利用Ion Torrent技術對所述DNA測序庫進行DNA測序，以便獲得所述病毒核酸的序列訊息；以及基於所述病毒核酸的序列訊息確定所述病毒的類型。

Description

用於病毒檢測的方法和系統
本發明涉及分子生物學領域。具體的，本發明涉及用於病毒檢測的方法和系統。
子宮頸癌是全球女性的第二位高發癌，其發病主要與人類乳突病毒(HPV)的持續感染有關。每年全世界約有50萬新發病例，25萬死亡病例，其中發展中國家占2/3。已經表徵超過100種HPV類型會感染皮膚(皮膚類型)或呼吸道和肛門生殖道的粘膜(粘膜類型)，超過40種HPV類型會感染子子宮頸。基於誘導的良性的，惡化前的或惡性的病變，將HPV分別分為低危(例如HPV6，11，42，43和44)和高危型(例如類型16，18，31，33和45)。因此，HPV感染的及早發現和正確分型對子宮頸癌的預防至關重要。
然而，目前HPV檢測分型的方法，仍有待改進。
本發明旨在解決現有技術問題的至少之一。為此，本發明的一個方面，提出了一種能夠對病毒進行有效檢測的方法。其包括以下步驟：針對包含病毒核酸的樣品，製備DNA測序庫；利用Ion Torrent技術對所述DNA測序庫進行DNA測序，以便獲得所述病毒核酸的序列訊息；以及基於所述病毒核酸的序列訊息確定所述病毒的類 型。利用該方法，能夠借助Ion Torrent測序技術，快速準確地對待測病毒進行檢測，並且成本較低，操作簡單，易於推廣。這裡所使用的術語「檢測」應作廣義理解，既可以是診斷檢測，也可以是非診斷檢測。診斷檢測的含義是指，檢測結果可以直接作為是否罹患疾病的依據。
根據本發明又一方面，本發明還提出了一種用於病毒檢測的系統，其包括：DNA測序庫製備裝置，所述DNA測序庫製備裝置用於針對包含病毒核酸的樣品製備DNA測序庫；測序裝置，所述測序裝置與所述DNA測序庫製備裝置相連，用於對所述DNA測序庫進行測序，以便獲得所述病毒核酸的序列訊息；以及分析裝置，所述分析裝置與所述測序裝置相連，用於基於所述病毒核酸的序列訊息，確定所述病毒的類型，其中，所述測序裝置為適於實施Ion Torrent測序技術的裝置。利用該系統，能夠有效地實施本發明實施例的病毒檢測方法，從而有效地對樣品中的病毒進行檢測，並對所包含的病毒類型進行檢測。
另外，根據本發明，本發明還提出了用於構建DNA測序庫的DNA標簽(在本文中，有時也簡單地稱為「標簽」)。根據本發明的實施例，本發明提出了一組分離的DNA標簽。這些分離的DNA標簽分別由SEQ ID NO：1-56所示的核苷酸構成。在本說明書中，這些DNA標簽分別被命名為DNA IndexN，其中N=1-56的任意整數，其序列如下表1所示。利用上述根據本發明實施例的DNA標簽，通過將DNA標簽與樣本DNA或其等同物相連，可以精確地表徵DNA的樣本來源。由此，利用上述DNA標簽，可以同時構建多種 樣本的DNA測序庫(在本文中，有時也稱為「測序庫」)，從而可以通過將來源於不同樣本的DNA測序庫同時進行測序，基於DNA標簽對DNA測序庫的DNA序列進行分類，從而可以獲得多種樣本的DNA序列訊息，由此可以充分利用高通量的測序技術，例如利用Ion Torrent測序技術，同時對多種DNA測序庫進行測序，從而提高了DNA測序庫的測序效率和通量。發明人驚奇地發現，利用根據本發明實施例的DNA標簽構建DNA測序庫，能夠精確地對多種DNA測序庫進行區分，並且所得到的測序數據結果的穩定性和可重複性非常好。
根據本發明的另一方面，本發明提供了用於將上述DNA標簽引入樣本DNA或其等同物中的一組分離的PCR正向標簽引子。根據本發明的實施例的一組分離的PCR正向標簽引子的每一種獨立地包括：第一核酸序列，所述第一核酸序列為選自SEQ ID NO：57-62 的一種；和第二核酸序列，所述第二核酸序列為選自根據本發明實施例的一組分離的DNA標簽的一種，其中，所述第二核酸序列與所述第一核酸序列的5’末端相連。在本說明書中，該組PCR正向標簽引子的每一種分別包含如前所述的根據本發明實施例的DNA標簽，通過採用PCR正向標簽引子進行PCR反應，可以將PCR正向標簽引子引入到樣品的DNA或其等同物中，從而就將相應的DNA標簽引入到DNA或其等同物中。其中，構成PCR正向標簽引子的第一核酸序列如下表2所示。根據本發明的又一方面，本發明還提供了用於將上述DNA標簽引入樣本DNA或其等同物中的一組分離的PCR反向標簽引子。根據本發明的實施例的該組分離的PCR反向標簽引子的每一種獨立地包括：第三核酸序列，所述第三核酸序列為選自SEQ ID NO：63-67的一種；和第四核酸序列，所述第四核酸序列為選自根據本發明實施例的一組分離的DNA標簽的一種，其中，所述第四核酸序列與所述第三核酸序列的3’末端相連。在本說明書中，這組PCR反向標簽引子的每一種分別具有如前所述的根據本發明實施例的DNA標簽，通過採用PCR反向標簽引子進行PCR反應，可以將PCR反向標簽引子引入樣品的DNA或其等同物中，從而就將相應的DNA標簽引入到DNA或其等同物中。其中，構成PCR反向標簽引子的第三核酸序列如下表2所示。
利用上述根據本發明實施例的一組分離的PCR正向標簽引子和一組分離的PCR反向標簽引子，均能夠有效地將DNA標簽引入到樣品的DNA或其等同物中，由此能夠構建具有DNA標簽的DNA測序庫。另外，發明人驚奇地發現，當針對相同的樣品，採用具有不同標簽的PCR正向標簽引子分別構建含有各種DNA標簽的DNA測序庫時，所得到的測序數據結果的穩定性和可重複性非常好；同樣，採用具有不同標簽的PCR反向標簽引子分別構建含有各種DNA標簽的DNA測序庫時，所得到的測序數據結果的穩定性和可重複性也非常好。根據本發明的實施例，在通過採用PCR正向標簽引子和PCR反向標簽引子的至少一種進行PCR擴增反應，以便構建樣本DNA的DNA測序庫時，可以通過PCR正向標簽引子和PCR反向標簽引子向樣本DNA的DNA測序庫導入DNA標簽，從而能夠同時構建多種樣本 DNA的DNA測序庫。由此通過採用根據本發明實施例的具有DNA標簽的PCR正向標簽引子和PCR反向標簽引子的至少一種進行PCR反應，可以構建多種樣本的DNA測序庫，從而可以根據不同DNA測序庫中這些標簽的不同對DNA測序庫進行區分，最終實現對大量樣本的混合測序，以滿足高通量測序的需求，從而降低測序成本。
本發明的附加方面和優點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發明的實踐瞭解到。
下面詳細描述本發明的實施例，所述實施例的示例在圖式中示出，其中自始至終相同或類似的標號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考圖式描述的實施例是示例性的，僅用於解釋本發明，而不能理解為對本發明的限制。
需要說明的是，術語「第一」、「第二」僅用於描述目的，而不能理解為指示或暗示相對重要性或者隱含指明所指示的技術特徵的數量。由此，限定有「第一」、「第二」的特徵可以明示或者隱含地包括一個或者更多個該特徵。進一步地，在本發明的描述中，除非另有說明，「多個」的含義是兩個或兩個以上。
病毒檢測方法
根據本發明的實施例，本發明提出了一種病毒檢測方法，其包括：首先，針對包含病毒核酸的樣品，製備DNA測序庫。
接著，利用Ion Torrent技術對所構建的DNA測序庫進行DNA 測序，以便獲得病毒核酸的序列訊息。
最後，基於病毒核酸的序列訊息確定所述病毒的類型。根據本發明的實施例，在獲得病毒核酸的序列訊息後，確定病毒類型的方法不受特別限制，可以通過將病毒核酸序列與已知的病毒核酸數據庫，例如HPV的基因組數據庫進行比對。
在本文中所使用的術語「病毒核酸」，應作廣義理解，可以指的是直接從病毒提取的核酸，例如病毒全基因組或其部分，也可以是從受到病毒侵染的宿主細胞中提取的包含有病毒核酸訊息的宿主細胞的全基因組或其部分。另外，病毒核酸的類型也不受特別限制，可以是DNA，也可以是RNA。根據本發明的實施例，可以通過常規的反轉錄技術，將RNA轉化為DNA序列。根據本發明的一個實施例，所述病毒為人類乳突病毒(HPV)。根據具體的示例，所述包含病毒核酸的樣品是女性生物樣本的全基因DNA樣品。較佳，所述女性生物樣本是選自女性子宮頸脫落細胞和子宮頸癌組織的至少一種。發明人驚奇地發現，利用本發明的方法能夠有效地對宿主細胞中所包含的HPV核酸訊息進行檢測。本領域具有通常知識者可以通過任何已知的方法從生物樣本中提取全基因組DNA。根據本發明的具體示例，全基因組DNA樣品是使用KingFisher自動提取儀進行的。
根據本發明的實施例，可以用於構建DNA測序庫的方法不受特別限制，只要所構建的庫能夠應用於Ion Torrent測序技術即可。較佳地，採用包括下列步驟的方法進行製備(參考第1圖)：將所述包含病毒核酸的樣品進行PCR擴增反應，以便獲得擴增產物，其 中，所述PCR擴增反應使用正向引子和反向引子，所述正向引子和所述反向引子是所述病毒特異性的；將所述擴增產物進行末端修復，以便獲得經過末端修復的擴增產物；將所述經過末端修復的擴增產物與測序接頭相連，以便獲得具有測序接頭的連接產物；以及分離回收所述具有測序接頭的連接產物，所述具有測序接頭的連接產物構成所述DNA測序庫。通過使用病毒特異性的PCR正向引子和反向引子，可以獲得病毒的特定區域的序列，從而可以提高病毒檢測的效率。本領域具有通常知識者可以根據病毒核酸的序列，來確定相應的引子序列。根據本發明的實施例，針對HPV病毒。可以採用的正向引子包括第一核酸序列，所述第一核酸序列為選自SEQ ID NO：57-62的一種。可以採用的反向引子包括第三核酸序列，所述第三核酸序列為選自SEQ ID NO：63-67的一種。發明人驚奇地發現，通過採用上述引子，能夠顯著有效地對女性生物組織中的HPV病毒核酸序列進行擴增，從而進行檢測和分型。另外，根據本發明的實施例，還可以通過PCR反應，在構建測序庫中引入DNA標簽，從而可以同時對多種樣品進行病毒檢測。為此，根據本發明的實施例，正向引子可以進一步包括第二核酸序列，該第二核酸序列為選自SEQ ID NO：1-56的一種，其中，第二核酸序列與第一核酸序列的5’末端相連。根據本發明的實施例，反向引子也可以進一步包括第四核酸序列，該第四核酸序列為選自SEQ ID NO：1-56的一種，其中，所述第四核酸序列與所述第三核酸序列的3’末端相連。關於DNA標簽，後面將進行詳細描述。
根據本發明的實施例，在將擴增產物進行末端修復之前，進一 步包括對擴增產物進行純化的步驟，例如可以採用Qiagen DNA Purification試劑盒，根據製造商所提供的說明書來進行純化。由此，可以提高對擴增產物進行末端修復的效率，從而進一步提高構建測序庫的效率。本領域具有通常知識者可以選擇市售可得的試劑盒對擴增產物進行末端修復。根據本發明的一些實施例，在將經過末端修復的擴增產物與測序接頭相連之前，進一步包括對經過末端修復的擴增產物進行純化的步驟。根據本發明的一個具體示例，具有測序接頭的連接產物的長度為約180-200bp。由此，可以進一步提高構建測序庫的效率。另外，本申請的發明人驚奇地發現，當選用長度為約180-220bp的連接產物時，可以顯著提高後續測序的效率，尤其是提供應用Ion Torrent進行測序的效率。根據本發明的具體示例，通過使用2.0%的瓊脂糖凝膠在100V下電泳2小時，進行分離回收所述具有測序接頭的連接產物。根據本發明的實施例，測序接頭的類型並不受特別限制，根據具體的實施例，可以採用具有下列雙鏈核苷酸序列的測序接頭：P5接頭具有雙鏈結構，分別為：5’-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT(SEQ ID NO：68)
3’-T＊T＊GGTGATGCGGAGGCGAAAGGAGAGATACCCGTCAGCCACTA(SEQ ID NO：69)
A接頭序列具有雙鏈結構，分別為：5’-TTCCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG(SEQ ID NO：70)
3’-T＊T＊AAGGTAGAGTAGGGACGCACAGAGGCTGAGTC(SEQ ID NO：71)。
在SEQ ID NO：69和71中帶有星號標記的T表示，該T鹼基不具有磷酸基團。因而，根據本發明的實施例，在獲得具有測序接頭的連接產物之後，可以將所獲得的具有測序接頭的連接產物進行缺口平移反應，可以進一步提高構建庫的效率，和後續測序的效率。本領域具有通常知識者可以選擇任何市售可得的試劑盒來進行切口平移處理，例如可以採用Platinum® PCR SuperMix High Fidelity，來自Ion XpressTM Fragment Library Kit。
根據本發明的實施例，對所述DNA樣本的DNA測序庫進行測序進一步包括通過乳液PCR反應製備Ion Torrent測序模板的步驟。較佳在進行所述乳液PCR擴增之前進一步包括將所述DNA測序庫進行稀釋的步驟。更較佳，所述乳液PCR擴增反應體系中，所述具有測序接頭的連接產物的濃度為560＊106個分子/反應體系。發明人發現，當採用常規PCR進行擴增時，在同一反應體系中，不同長度的DNA分子的擴增效率有時會有顯著的區別。
為此，發明人開發了可以適用於Ion Torrent測序技術的乳液PCR反應。根據本發明的實施例，通過乳液PCR反應製備Ion Torrent測序模板，進一步包括下列步驟：首先，形成油包水型乳液，所述油包水乳液中包括多個不連續的含水區室，所述多個不連續的含水區室的至少一部分中包含：磁性顆粒、所述DNA測序庫的一部分、用於擴增所述DNA測序庫的寡核苷酸引子，其中，所述寡核苷酸引子的至少一部分與所述磁性 顆粒相連。形成油包水型乳液的方法，可以是將含有磁性顆粒、測序庫、寡核苷酸引子以及用於進行PCR反應所需要的試劑的水溶液與油相通過高速震盪形成油包水型的乳液，每個油包水型乳液的含水區室可以作為一個PCR的反應容器，由此，多個不連續的含水區室內獨立地發生PCR擴增反應，可以有效地對測序庫的每一個DNA分子進行有效地擴增，並且由於磁性顆粒上連接有引子，因而可以在磁性顆粒上形成DNA分子的多個克隆，在回收磁性顆粒之後，通過裂解雙鏈DNA為單鏈DNA可以獲得攜帶單鏈DNA的磁性顆粒，進而可以有效地應用於Ion Torrent測序技術。根據本發明的一個實施例，多個不連續的含水區室的每一個中至多含有所述DNA測序庫的一個DNA分子。由此，可以實現，在同一個磁性顆粒上所攜帶的多個DNA分子的克隆均來自於相同的DNA分子，由此，可以進一步提高測序的效率和精確性。根據本發明的實施例，所採用的磁性顆粒的類型並不受特別限制，根據本發明的一個具體示例，可以採用Ion SphereTM顆粒。另外，根據本發明的實施例，可以根據DNA測序庫的序列來確定，例如可以通過DNA測序庫的DNA分子兩端的測序接頭的序列來確定用於擴增DNA測序庫的寡核苷酸引子的序列。根據本發明的具體示例，用於擴增所述DNA測序庫的寡核苷酸引子包括第一寡核苷酸引子和第二寡核苷酸引子，其中，所述第一寡核苷酸引子的序列為TTCCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG(SEQ ID NO：72)，並且所述第一寡核苷酸引子與所述磁性顆粒相連；所述第二寡核苷酸引子的序列為 CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAG-CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT(SEQ ID NO：73)，並且所述第二寡核苷酸引子在所述含水區室中呈游離狀態。由此，根據本發明的實施例，針對HPV，可以有效地製備用於Ion Torrent測序的其上攜帶單鏈DNA的磁性顆粒，作為Ion Torrent測序模板，從而進一步提高檢測HPV病毒的效率。
接下來，將所述油包水型乳液置於適於擴增所述DNA測序庫的熱循環條件下，以便形成其上攜帶DNA測序庫的磁性顆粒。根據本發明的實施例，進行乳液PCR以擴增所述DNA測序庫的PCR條件，即熱循環條件不受特別限制。根據本發明的具體實施例，其包括下列：
步驟1：94℃ 6min
步驟2：94℃ 30sec
步驟3：58℃ 30sec
步驟4：72℃ 90sec
重複步驟2-4，40個循環；以及
步驟5：94℃ 30sec
步驟6：68℃ 6min
重複步驟5和6，5個循環。
發明人驚奇地發現，該熱循環條件特別適用於對HPV的檢測。
然後，將其上攜帶DNA測序庫的磁性顆粒置於適於雙鏈DNA裂解的條件下，例如，可以將所述油包水型乳液與裂解液接觸，其中，所述裂解液含有NaOH和Tween-20的水溶液，所述NaOH和 Tween-20的終濃度分別為125mM和0.1重量%以便獲得其上攜帶單鏈DNA的磁性顆粒，所述其上攜帶單鏈DNA的磁性顆粒構成Ion Torrent測序模板。
在獲得其上攜帶單鏈DNA的磁性顆粒後，根據本發明的實施例，可以進一步包括這些其上攜帶單鏈DNA的磁性顆粒的步驟，從而可以進一步提高後續利用Ion Torrent測序技術進行測序的效率。本領域具有通常知識者可以根據所選用的磁性顆粒的性質，採用任何方法進行對磁性顆粒的富集。根據本發明的實施例，可以採用MyOneTM珠富集其上攜帶單鏈DNA的磁性顆粒。發明人發現，採用MyOneTM珠能夠有效地富集攜帶單鏈DNA的Ion SphereTM顆粒，並且可以有效地提高HPV檢測的效率。
DNA標簽
根據本申請的一個方面，本發明提出了一些分離的DNA標簽。根據本發明的實施例，這些分離的DNA標簽分別由SEQ ID NO：1-56所示的核苷酸序列構成。在本說明書中，這些DNA標簽分別被命名為DNA IndexN，其中N=1-56的任意整數，其序列如前面表1所示，在此不再贅述。
在本發明中所使用術語「DNA」可以是任何包含去氧核糖核苷酸的聚合物，包括但不限於經過修飾的或者未經修飾的DNA。利用根據本發明實施例的DNA標簽，通過將DNA標簽與樣本的DNA或其等同物相連，得到具有標簽的DNA測序庫，通過對DNA測序庫進行測序，可以獲得樣本DNA的DNA序列以及標簽的序列，進而基於標簽的序列可以精確地表徵DNA的樣本來源。由此，利用 上述DNA標簽，可以同時構建多種樣本DNA的DNA測序庫，從而可以通過將來源於不同樣本DNA的DNA測序庫進行混合，同時進行測序，基於DNA標簽對樣本DNA的DNA序列進行分類，獲得多種樣本DNA的DNA的序列訊息。從而可以充分利用高通量的測序技術，例如利用Ion Torrent測序技術，同時對多種樣本DNA進行測序，從而提高了通過高通量測序技術的效率和通量，降低了確定樣本DNA的序列訊息的成本。這裡所使用的表述方式「DNA標簽與樣本的DNA或其等同物相連」應做廣義理解，其包括DNA標簽可以與樣本的DNA直接相連，以構建DNA測序庫，也可以與和樣本的DNA具有相同序列的核酸(例如可以是相應的RNA序列或cDNA序列，其與DNA具有相同的序列)相連。
本申請的發明人進行了大量的篩選工作，並且選定了根據本發明實施例的適用於Ion Torrent測序技術的一組分離的DNA標簽，其分別由SEQ ID NO：1-56所示的核苷酸序列構成。其序列如前面表1所示，不再贅述。通常而言，針對不同的測序技術，需要開發不同的標簽以能夠適用於同時對多種樣本進行測序。目前尚未有關於這些標簽應用於樣本DNA的DNA測序庫構建並通過Ion Torrent測序的報道。因此，本發明還提出了上述DNA標簽在構建Ion Torrent測序庫中的應用。
PCR正向標簽引子、PCR反向標簽引子以及構建DNA測序庫
根據本發明的一些實施例，本發明提供了一組分離的PCR正向標簽引子，其用於將上述DNA標簽引入樣本DNA或其等同物中。根 據本發明的實施例，該組分離的PCR正向標簽引子的每一種獨立地包括：第一核酸序列和第二核酸序列，且第二核酸序列與第一核酸序列的5’末端相連，其中，第一核酸序列為選自SEQ ID NO：57-62的一種，第二核酸序列為選自根據本發明實施例的一組分離的DNA標簽的一種。在本文中，表達方式「第二核酸序列與第一核酸序列的5’末端相連」是指選自根據本發明實施例的DNA標簽與第一核酸序列相連，具體地，DNA標簽可以連接在第一核酸序列的5’末端，也可以通過媒介例如連接子間接地與所述第一核酸序列的5’末端連接。根據本發明的實施例，構成PCR正向標簽引子的第一核酸序列具有HPV特異性，其序列如下表2所示，在此不再贅述。在本說明書中，該組PCR正向標簽引子的每一種分別具有如前所述的根據本發明實施例的DNA標簽，通過採用PCR正向標簽引子的PCR反應，可以將PCR正向標簽引子引入樣品的DNA或其等同物中，從而就將相應的DNA標簽引入到DNA或其等同物中。
根據本發明的實施例，本發明還提供了一組分離的PCR反向標簽引子，其同樣是用於將上述DNA標簽引入樣本DNA或其等同物中。根據本發明的實施例，該組分離的PCR反向標簽引子的每一種獨立地包括：第三核酸序列和第四核酸序列，且第四核酸序列與第三核酸序列的3’末端相連，其中，第三核酸序列為選自SEQ ID NO：63-67的一種，第四核酸序列為選自根據本發明實施例的一組分離的DNA標簽的一種。這裡，表達方式「第四核酸序列與第三核酸序列的3’末端相連」是指選自根據本發明實施例的DNA標簽與第三核酸序列相連，具體地，DNA標簽可以直接連接在第三核酸序列 的3’末端，也可以通過媒介例如連接子間接地與第三核酸序列的3’末端連接。根據本發明的實施例，構成PCR反向標簽引子的第三核酸序列具有HPV特異性，其序列如下表2所示，在此不再贅述。在本說明書中，這組PCR反向標簽引子分別具有如前所述的根據本發明實施例的DNA標簽，通過採用PCR反向標簽引子的PCR反應，可以將PCR反向標簽引子引入樣品的DNA或其等同物中，從而就將相應的DNA標簽引入到DNA或其等同物中。
根據本發明的實施例，通過PCR擴增反應向樣本DNA的DNA測序庫中導入DNA標簽，具體地，PCR擴增反應採用正向引子和反向引子，其中正向引子和反向引子的至少一種包含選自根據本發明實施例的一組分離的DNA標簽的一種，因此可以通過PCR正向標簽引子和PCR反向標簽引子向樣本DNA的DNA測序庫導入DNA標簽，從而能夠同時構建多種樣本DNA的DNA測序庫。由此通過採用根據本發明實施例的具有DNA標簽的PCR正向標簽引子和PCR反向標簽引子的至少一種的PCR反應，可以同時構建多種樣本的DNA測序庫，從而可以根據不同DNA測序庫中這些標簽的不同對DNA測序庫進行區分，最終實現對大量樣本的混合測序，以滿足高通量測序的需求，從而簡化操作流程，降低測序成本。
另外，發明人驚奇地發現，當針對相同的樣本，基於上述方法，採用具有不同標簽PCR正向標簽引子或PCR反向標簽引子構建含有各種DNA標簽的DNA測序庫時，所得到的測序數據結果的穩定性和可重複性非常好。
根據本發明的再一方面，本發明還提供了一種用於構建DNA 測序庫的試劑盒，根據本發明的實施例，該試劑盒包括：一組分離的PCR正向標簽引子，所述一組分離的PCR正向標簽引子的每一種獨立地包括：第一核酸序列，其為選自SEQ ID NO：57-62的一種；和第二核酸序列，其為選自根據本發明實施例的一組分離的DNA標簽的一種，其中，第二核酸序列與第一核酸序列的5’末端相連，一組分離的PCR反向標簽引子，一組分離的PCR反向標簽引子的每一種獨立地包括：第三核酸序列，其為選自SEQ ID NO：63-67的一種；和第四核酸序列，其為選自根據本發明實施例的一組分離的DNA標簽的一種，其中，第四核酸序列與第三核酸序列的3’末端相連，其中，一組分離的PCR正向標簽引子的每一種和一組分離的PCR反向標簽引子的每一種分別設置在不同的容器中。由此，利用該試劑盒，能夠方便地將根據本發明實施例的DNA標簽引入到構建的DNA測序庫中。當然，本領域具有通常知識者能夠理解，試劑盒中還可以包含其他用於構建DNA測序庫的常規組件，在此不再贅述。
對多種樣品進行病毒檢測的方法
進一步，借助DNA標簽，可以將上面檢測病毒的方法應用於多種樣品。例如，根據本發明的又一方面，本發明還提供了一種對多種包含病毒核酸的樣品進行病毒檢測的方法。根據本發明的實施例，其包括以下步驟：首先，針對所述多種包含病毒核酸的樣品，製備DNA測序庫混合物，其中，所述DNA樣本測序庫混合物由所述多種包含病毒核酸的樣品中每一種的DNA測序庫構成，並且所述多種DNA樣本 的每一種採用相互不同並且已知序列的DNA標簽，所述DNA標簽為選自SEQ ID NO：1-56的一種。根據本發明的實施例，製備DNA測序庫混合物的方法不受特別限制，可以分別製備各種DNA測序庫，然後，將其混合，也可以先分別進行部分步驟引入各自的標簽，然後進行混合，最後共同完成構建測序庫的通用步驟。因而針對所述多種包含病毒核酸的樣品，製備DNA測序庫混合物進一步包括以下步驟：將所述多種包含病毒核酸的樣品的每一種分別獨立地進行PCR擴增反應，以便獲得多種擴增產物，其中所述PCR擴增反應使用正向引子和反向引子，所述正向引子和反向引子是所述病毒特異性的，並且所述正向引子和反向引子的至少一種包含已知序列的DNA標簽，所述DNA標簽為選自SEQ ID NO：1-56的一種，並且所述多種包含病毒核酸的樣品的每一種採用相互不同並且已知序列的DNA標簽；將所述多種擴增產物進行混合，以便獲得擴增產物混合物；將所述擴增產物混合物與測序接頭相連，以便獲得具有測序接頭的連接產物混合物；以及分離回收所述具有測序接頭的連接產物混合物，所述具有測序接頭的連接產物混合物構成所述DNA測序庫。可選地，根據本發明的一些具體示例，製備所述多種DNA樣本的DNA測序庫混合物進一步包括以下步驟：針對所述多種包含病毒核酸的樣品的每一種，分別獨立地製備DNA測序庫，其中，不同的DNA樣本採用相互不同並且已知序列的DNA標簽；以及將所述多種樣本的DNA測序庫進行組合，以便獲得所述DNA測序庫混合物，其中，所述DNA庫是通過下列步驟製備的：將所述包含病毒核酸的樣品進行PCR擴增反應，以便獲得擴增產物，其中，所 述PCR擴增反應使用正向引子和反向引子，所述正向引子和所述反向引子是所述病毒特異性的；將所述擴增產物進行末端修復，以便獲得經過末端修復的擴增產物；將所述經過末端修復的擴增產物與測序接頭相連，以便獲得具有測序接頭的連接產物；以及分離回收所述具有測序接頭的連接產物，所述具有測序接頭的連接產物構成所述DNA測序庫。這裡，所使用的術語「多種」為至少2種。其中，表達方式「相互不同並且已知序列的DNA標簽」是指針對一種樣本DNA構建的DNA測序庫中，其包含的DNA標簽與其它樣本DNA的DNA測序庫的標簽不同，且各標簽序列是已知的，其中，一個DNA測序庫中可以包含1個DNA標簽，也可以包含2個DNA標簽。當其包含1個DNA標簽時，術語「相互不同」容易理解；當其包含2個DNA標簽時，這兩個DNA標簽可以看做是一個組合，這裡我們就稱之為「標簽組合」，這時術語「相互不同」就是指不同的DNA樣本中所含的標簽組合不同。根據本發明的實施例，一個DNA測序庫中的構成標簽組合的這2種標簽可以相同，也可以不同。
其次，利用Ion Torrent測序技術，對所述DNA測序庫混合物進行測序，以獲得所述多種樣品的病毒核酸序列訊息以及所述DNA標簽的序列訊息。
然後，基於所述DNA標簽的序列訊息，對所述病毒核酸序列訊息進行分類，以便確定所述多種樣品中病毒的類型。
根據本發明實施例的上述方法，可以充分利用高通量的測序技術，例如利用Ion Torrent測序技術，同時對多種樣本DNA的DNA 測序庫進行測序，從而提高DNA測序庫的測序效率和通量，同時可以提高確定多種樣本DNA的DNA序列訊息的效率。關於測序的方法和採用的測序引子，前面已經進行了詳細描述，此處不再贅述。
用於病毒檢測的系統
根據本發明的又一方面，本發明還提供了一種用於對病毒進行檢測的系統。參考第4圖，根據本發明的實施例，該用於對病毒進行檢測的系統1000包括：DNA測序庫製備裝置100、測序裝置200以及分析裝置300。根據本發明的實施例，DNA測序庫製備裝置100用於製備待測樣本的DNA測序庫，例如可以採用適於前面所述的DNA測序庫構建方法的任意裝置作為DNA測序庫製備裝置100。測序裝置200與DNA測序庫製備裝置100相連，可以從DNA測序庫製備裝置100接收所製備的DNA測序庫，並對所接收的DNA測序庫進行測序，從而可以獲得待測樣本的DNA序列訊息，其中，測序裝置為適於實施Ion Torrent測序技術的裝置。分析裝置300與測序裝置200相連，可以從測序裝置200接收所獲得的待測樣本的DNA序列訊息，從而基於DNA序列訊息對待測樣本中的病毒進行檢測和分型，具體地，是將DNA序列訊息與病毒數據庫例如HPV數據庫進行比對，從而基於比對結果實現對待測樣本的病毒進行準確的病毒檢測和分型。根據本發明的實施例，所述DNA測序庫製備裝置中可以設置有一組分離的PCR正向標簽引子，該組分離的PCR正向標簽引子的每一種獨立地包括：第一核酸序列，其為選自SEQ ID NO：57-62的一種；和第二核酸序列，其為選自根據本發明實施例的一組分離的DNA標簽的一種，其中，第二核酸序列與第一核酸序列的5’末端相 連，一組分離的PCR反向標簽引子，該組分離的PCR反向標簽引子的每一種獨立地包括：第三核酸序列，其為選自SEQ ID NO：63-67的一種；和第四核酸序列，其為選自根據本發明實施例的一組分離的DNA標簽的一種，其中，第四核酸序列與第三核酸序列的3’末端相連。本領域具有通常知識者能夠理解的是，可以採用本領域中已知的任何適於進行上述操作的裝置作為上述各個裝置的組成部件。另外，這裡所使用的術語「相連」應作廣義理解，可以是直接相連，也可以通過中間媒介間接相連，對於本領域的普通具有通常知識者而言，可以根據具體情況理解上述術語的具體含義。
利用根據本發明實施例的用於對病毒進行檢測分型的系統，能夠方便準確地同時對多個待測樣本的病毒進行檢測分型，該系統製作成本較低，操作簡單、快速，有利於普遍推廣，從而可以應用於更多女性的HPV檢測，以便實現更多的女性真正得到定期科學規範的篩查。
需要說明的是，根據本發明實施例的對待病毒進行檢測的方法，以及對病毒進行檢測的系統，是本申請的發明人經過艱苦的創造性勞動和優化工作才完成的。
下面將結合實施例對本發明的方案進行解釋。本領域具有通常知識者將會理解，下面的實施例僅用於說明本發明，而不應視為限定本發明的範圍。實施例中未注明具體技術或條件的，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實驗指南》，第三版，科學出版社)或者按照產 品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品，例如可以採購自Life Technology公司。
實施例1 1.樣本提取
使用KingFisher自動提取儀，按照製造商所提供的說明書，從56份已知測序分型結果的子宮頸脫落細胞中提取DNA。
2. PCR擴增
將樣本提取步驟中所得的56份DNA依次編號，以56組分別帶有標簽的正向引子和反向引子分別擴增所得到的56份DNA樣本。
需要說明的是，針對不同的DNA樣本採用不同的標簽序列，這裡所使用的標簽序列均選自表1所示的56種標簽。另外，在這56組帶有標簽的引子中的每一組中，均包含6條帶有標簽的正向引子和5條帶有標簽的反向引子，其中帶有標簽的正向引子和帶有標簽的反向引子分別由表2中所列出的第一核酸序列與標簽和第三核酸與標簽構成，在相同組中使用相同的選自表1所示的標簽。
PCR反應在96孔板中進行，每板設置一個不添加模板的陰性對照，陰性對照所用引子與樣品1的引子相同。
反應體系25微升，其組成是：
PCR反應在Bio-Rad公司的PTC-200 PCR儀上運行。
PCR程序如下：95℃ 30s→48℃ 30s→72℃ 30s→(40個循環)72℃ 10min→12℃ ∞
PCR完成後，取3微升PCR產物經2.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結果如第2圖所示，根據第2圖，PCR產物條帶大小為約170bp。
3. PCR產物混合和純化
將剩餘的PCR產物混合在一個3ml的EP管中，震盪混勻，從中取500微升DNA混合物，使用Qiagen DNA純化試劑盒，根據製造商提供的說明書進行純化，純化所得的200微升DNA，標記為HPV-L。經Nanodrop 8000(Thermo Fisher Scientific公司)測定HPV-L的DNA濃度是59.6納克/微升。
4.末端修復反應
將所得到的測序庫HPV-L進行DNA末端修復反應，末端修復的反應體系如下，在本實施例中使用Ion XpressTM Fragment Library Kit的緩衝液和酶，通過參照將Ion XpressTM Fragment Library Kit的全部說明書並入本文：反應體系200微升，其組成是：
反應條件為：利用Thermomixer(Eppendorf公司)，在20℃下溫浴20 min。
反應結束後，使用QIAquick PCR純化試劑盒回收純化反應產物，將反應產物溶於50微升的EB(QIAGEN Elution Buffer)中。
5、3’連接接頭(adapter)反應
使用Ion XpressTM Fragment Library Kit，通過下述反應體系為庫DNA的連接接頭(adapter)：反應體系200微升，其組成是：
反應條件為：利用Thermomixer(Eppendorf公司)，在37℃下溫浴30 min。
所採用的接頭DNA序列為：P5接頭序列：5’-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT
3’-T＊T＊GGTGATGCGGAGGCGAAAGGAGAGATACCCGTCAGCCACTA
A接頭序列：5’-TTCCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG
3’-T＊T＊AAGGTAGAGTAGGGACGCACAGAGGCTGAGTC
反應結束後，使用1.8倍體積Ampure Beads(Beckman Coulter Genomics)純化回收反應產物，並將純化後的反應產物溶於40微升的EB中。
將所得到的純化後的反應產物，在2.0%的瓊脂糖凝膠中進行電泳。條件為100V，2h。選擇180-200bp的片段進行切膠回收。重新溶解於43微升EB中，得到連接有接頭的DNA片段。
6、缺口平移(Nick-translate)及擴增庫
缺口平移是指以限量的DNase I在待標記的雙鏈DNA的每一條鏈上產生若干個單鏈缺口；再利用E.coli DNA多聚酶I的5’-3’外切酶活性和5’-3’多聚酶活性，在缺口處的5’末端每切除一個核苷酸，則在3’末端添加一個核苷酸，以修補缺口，隨著缺口在DNA鏈上的移動，標記的核苷酸就摻入到新合成的DNA鏈中。
在本發明中，Ion torrent的接頭中有一條鏈是不含磷酸基團的(帶有缺口，防止接頭自連)，缺口平移的作用是使接頭中帶缺口的這條鏈以其互補鏈為模板，重新合成帶缺口的鏈。所用酶試劑是酶和buffer的混合液(Platinum® PCR SuperMix High Fidelity，源自Ion XpressTM Fragment Library Kit)
因為上一步反應中接頭一端沒有磷酸基團，因而連接有接頭的DNA片段需要進行缺口平移反應，同時可以對DNA庫進行擴增。在本實施例中使用Ion Fragment Library Kit，其體系如下：反應體系為：
反應條件是：
反應結束後，使用1.5倍體積Ampure Beads(Beckman Coulter Genomics)純化反應產物，並將純化產物溶於30微升去離子水中，得到DNA測序庫。
使用Agilent 2100 Bioanalyser DNA 1000 chip(Aglient Technologies,Palo Alto,CA)和螢光定量PCR(QPCR)對所得到的DNA測序庫進行檢測，DNA測序庫的濃度結果分別是40.6納摩和38.4納摩。通常而言，Agilent 2100 Bioanalyser DNA 1000 chip(Aglient Technologies,Palo Alto,CA)的結果更可信。
7、製備Ion Torrent測序模板 7.1確定合適的庫濃度
以Agilent 2100 Bioanalyser DNA 1000 chip(Aglient Technologies,Palo Alto,CA)。檢測結果為准，將上一步製備好的DNA測序庫進行稀釋，最終濃度達到每18微升中含有560＊106個分子，即滿足560＊106個分子/反應體系(280＊106 ISP/反應體系)
7.2製備油包水型乳液
參照Ion XpressTM Template Kit說明書，分別製備IKA DT-20油相(9ml)、Ion SphereTM顆粒、DNA測序庫以及PCR水相MIX。 PCR水相MIX組成是：
最後將稀釋合格的DNA測序庫(18微升/反應)與PCR水相MIX混勻，進行乳液PCR反應。
反應程序如下：
通過上述乳液PCR反應，實現了將DNA測序庫中DNA分子與Ion SphereTM顆粒連接並複製，其連接後的結構示意圖如第3圖所示。如第3圖所示，DNA片段的5’端和3’端分別連接有接頭1和接頭2，並且通過接頭2與離子磁性顆粒相連。接頭1和接頭2的序列分別如下：
7.3製備攜帶單鏈DNA的Ion Sphere TM 顆粒
在完成乳液PCR後，分離回收Ion SphereTM顆粒，並通過與裂解液(含有NaOH和Tween-20的水溶液，所述NaOH和Tween-20的終濃度分別為125mM和0.1重量%)，將Ion SphereTM顆粒上的DNA模板由雙鏈變為單鏈。
然後利用帶有生物素的MyOneTM珠，借助MyOneTM珠與擴增產物的特異性結合，富集其上攜帶單鏈DNA的Ion SphereTM顆粒，由此獲得用於Ion Torrent測序技術的測序模板。
經Qubit 2.0(Invitrogen公司)檢測合格滿足上機測序要求。
6. Ion Torrent測序
測序操作流程詳見Ion Torrent操作說明書。安裝對應的測序晶片，本是實施例中採用314晶片，在晶片上加入酶和製備好的攜帶單鏈DNA的Ion SphereTM顆粒進行測序，測序過程約2.5小時即可完成，得到可靠的基因序列訊息。
7.結果分析
通過對測序結果中標簽序列以及引子的序列訊息篩選，可獲得每個樣本的DNA序列訊息，將所得DNA序列訊息與HPV數據庫比對，最終可實現對每一份樣本的HPV檢測以及分型，得到的結果與原已知結果完全一致，具體結果如下：
如上表所示，採用本發明的技術路線，對56份已知測序分型結果的樣本進行HPV基因分型，結果發現：採用本發明的技術方案，對病毒即HPV進行分析，所得的結果與已知的分型結果一致，從而證明了本發明的技術方案能夠有效地應用於對病毒尤其是HPV的檢測，同時相對於現有的測序分型方法，本發明的技術方法要快速地多。另外，如上表所示，本發明的技術方案可以有效地適用於病毒的多種型別，即可以有效地對多種HPV型別進行檢測。
工業實用性
本發明的用於構建DNA測序庫的DNA標簽、PCR正向標簽引子、PCR反向標簽引子、DNA測序庫及其製備方法、用於構建DNA測序庫的試劑盒、確定DNA樣本的DNA序列訊息的方法、確定多種DNA樣本的DNA序列訊息的方法、對樣本的HPV進行分型的方法、對多種樣本的HPV進行分型的方法以及用於對HPV進行檢測分型的系統，能夠應用於HPV檢測分型，可有效地提高對多個待測樣本進行HPV檢測分型的效率，並且結果準確，成本較低，操作簡單、快速。
儘管本發明的具體實施方式已經得到詳細的描述，本領域具有通常知識者將會理解。根據已經公開的所有教導，可以對那些細節進行各種修改和替換，這些改變均在本發明的保護範圍之內。本發 明的全部範圍由所附申請專利範圍及其任何等同物給出。
在本說明書的描述中，參考術語「一個實施例」、「一些實施例」、「示意性實施例」、「示例」、「具體示例」、或「一些示例」等的描述意指結合該實施例或示例描述的具體特徵、結構、材料或者特點包含於本發明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術語的示意性表述不一定指的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特徵、結構、材料或者特點可以在任何的一個或多個實施例或示例中以合適的方式結合。
以上所述僅為本發明之較佳實施例，凡依本發明申請專利範圍所做之均等變化與修飾，皆應屬本發明之涵蓋範圍。
100‧‧‧DNA測序庫製備裝置
200‧‧‧測序裝置
300‧‧‧分析裝置
1000‧‧‧用於對病毒進行檢測的系統
本發明的上述和/或附加的方面和優點從結合下面圖式對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中：第1圖：顯示了根據本發明一個實施例的構建DNA測序庫的方法的流程示意圖。
第2圖：顯示了根據本發明一個實施例的構建樣本DNA的DNA測序庫的方法構建DNA測序庫過程中，部分PCR擴增產物的電泳圖。
第3圖：顯示了根據本發明的一個實施例的應用於Ion Torrent測序的模板結構示意圖。
第4圖：顯示了根據本發明一個實施例的用於對HPV進行基因 分型的系統的示意圖。
<110> 深圳華大基因科技有限公司
<120> 用於病毒檢測的方法和系統
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<210> 44
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<223> DNA標簽
<400> 44
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<223> DNA標簽
<400> 45
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<223> DNA標簽
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<223> DNA標簽
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<223> DNA標簽
<400> 48
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<223> DNA標簽
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<223> DNA標簽
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<223> DNA標簽
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<223> DNA標簽
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<223> DNA標簽
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<223> DNA標簽
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<223> DNA標簽
<400> 56
<210> 57
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<212> DNA
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<223> 第一核酸序列
<400> 57
<210> 58
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<212> DNA
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<223> 第一核酸序列
<400> 58
<210> 59
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<212> DNA
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<220>
<223> 第一核酸序列
<400> 59
<210> 60
<211> 25
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<213> Artificial
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<223> 第一核酸序列
<400> 60
<210> 61
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
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<223> 第一核酸序列
<400> 61
<210> 62
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<212> DNA
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<220>
<223> 第一核酸序列
<400> 62
<210> 63
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 第三核酸序列
<400> 63
<210> 64
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 第三核酸序列
<400> 64
<210> 65
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 第三核酸序列
<400> 65
<210> 66
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 第三核酸序列
<400> 66
<210> 67
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
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<223> 第三核酸序列
<400> 67
<210> 68
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<212> DNA
<213> Artificial
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<223> P5接頭第一鏈
<400> 68
<210> 69
<211> 43
<212> DNA
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<220>
<223> P5接頭第二鏈
<400> 69
<210> 70
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> A接頭第一鏈
<400> 70
<210> 71
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> A接頭第二鏈
<400> 71
<210> 72
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 第一寡核苷酸引子
<400> 72
<210> 73
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 第二寡核苷酸引子
<400> 73

Claims (28)

  1. 一種病毒檢測方法，其中，包括以下步驟：針對包含病毒核酸的樣品，製備DNA測序庫；利用Ion Torrent技術對該DNA測序庫進行DNA測序，以便獲得該病毒核酸的序列訊息；以及基於該病毒核酸的序列訊息確定該病毒的類型。
  2. 根據申請專利範圍第1項該的病毒檢測方法，其中，該DNA測序庫是通過下列步驟製備的：將該包含病毒核酸的樣品進行PCR擴增反應，以便獲得擴增產物，其中，該PCR擴增反應使用正向引子和反向引子，該正向引子和該反向引子是該病毒特異性的；將該擴增產物進行末端修復，以便獲得經過末端修復的擴增產物；將該經過末端修復的擴增產物與測序接頭相連，以便獲得具有測序接頭的連接產物；以及分離回收該具有測序接頭的連接產物，該具有測序接頭的連接產物構成該DNA測序庫。
  3. 根據申請專利範圍第2項的病毒檢測方法，其中，該病毒為人類乳突病毒。
  4. 根據申請專利範圍第3項的病毒檢測方法，其中，該包含病毒核酸的樣品是女性生物樣本的全基因DNA樣品。
  5. 根據申請專利範圍第4項的病毒檢測方法，其中，該女性生物樣 本是選自女性子宮頸脫落細胞和子宮頸癌組織的至少一種。
  6. 根據申請專利範圍第5項的病毒檢測方法，其中，該全基因組DNA樣品是使用KingFisher自動提取儀進行的。
  7. 根據申請專利範圍第2項的病毒檢測方法，其中，該正向引子包括第一核酸序列，該第一核酸序列為選自SEQ ID NO：57-62的一種。
  8. 根據申請專利範圍第7項的病毒檢測方法，其中，該正向引子進一步包括第二核酸序列，該第二核酸序列為選自SEQ ID NO：1-56的一種，其中，該第二核酸序列與該第一核酸序列的5’末端相連。
  9. 根據申請專利範圍第2項的病毒檢測方法，其中，該反向引子包括第三核酸序列，該第三核酸序列為選自SEQ ID NO：63-67的一種。
  10. 根據申請專利範圍第9項的病毒檢測方法，其中，該反向引子進一步包括第四核酸序列，該第四核酸序列為選自SEQ ID NO：1-56的一種，其中，該第四核酸序列與該第三核酸序列的3’末端相連。
  11. 根據申請專利範圍第2項的病毒檢測方法，其中，在將該擴增產物進行末端修復之前，進一步包括對該擴增產物進行純化的步驟。
  12. 根據申請專利範圍第2項的病毒檢測方法，其中，在將該經過末端修復的擴增產物與測序接頭相連之前，進一步包括對該經過末端修復的擴增產物進行純化的步驟。
  13. 根據申請專利範圍第2項的病毒檢測方法，其中，該具有測序接頭的連接產物的長度為約180-200bp。
  14. 根據申請專利範圍第2項的病毒檢測方法，其中，通過使用2.0% 的瓊脂糖凝膠在100V下電泳2小時，進行分離回收該具有測序接頭的連接產物。
  15. 根據申請專利範圍第2項的病毒檢測方法，其中，進一步包括將該具有測序接頭的連接產物進行缺口平移反應。
  16. 根據申請專利範圍第15項的病毒檢測方法，其中，進一步包括對經過切口平移處理的連接產物進行PCR擴增反應。
  17. 根據申請專利範圍第1項的方法，其中，對該DNA樣本的DNA測序庫進行測序進一步包括通過乳液PCR反應製備Ion Torrent測序模板的步驟。
  18. 根據申請專利範圍第17項的方法，其中，通過乳液PCR反應製備Ion Torrent測序模板進一步包括以下步驟：形成油包水型乳液，該油包水乳液中包括多個不連續的含水區室，該多個不連續的含水區室的至少一部分中包含：磁性顆粒、該DNA測序庫的一部分、用於擴增該DNA測序庫的寡核苷酸引子，其中，該寡核苷酸引子的至少一部分與該磁性顆粒相連；將該油包水型乳液置於適於擴增該DNA測序庫的熱循環條件下，以便形成其上攜帶DNA測序庫的磁性顆粒；以及將其上攜帶DNA測序庫的磁性顆粒置於適於雙鏈DNA裂解的條件下，以便獲得其上攜帶單鏈DNA的磁性顆粒，該其上攜帶單鏈DNA的磁性顆粒構成Ion Torrent測序模板。
  19. 根據申請專利範圍第18項的方法，其中，該多個不連續的含水區室的每一個中至多含有該DNA測序庫的一個DNA分子。
  20. 根據申請專利範圍第18項的方法，其中，該磁性顆粒為Ion SphereTM顆粒。
  21. 根據申請專利範圍第18項的方法，其中，該用於擴增該DNA測序庫的寡核苷酸引子包括第一寡核苷酸引子和第二寡核苷酸引子，其中，該第一寡核苷酸引子的序列為TTCCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG，並且該第一寡核苷酸引子與該磁性顆粒相連；該第二寡核苷酸引子的序列為CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAG-CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT，並且該第二寡核苷酸引子在該含水區室中呈游離狀態。
  22. 根據申請專利範圍第18項的方法，其中，該適於擴增該DNA測序庫的熱循環條件包括下列：步驟1：94℃ 6min步驟2：94℃ 30sec步驟3：58℃ 30sec步驟4：72℃ 90sec重複步驟2-4，40個循環；以及步驟5：94℃ 30sec步驟6：68℃ 6min重複步驟5和6，5個循環。
  23. 根據申請專利範圍第18項的方法，其中，將該油包水型乳液置於適於擴增該DNA測序庫的熱循環條件下為將該油包水型乳液與 裂解液接觸，其中，該裂解液含有NaOH和Tween-20的水溶液，該NaOH和Tween-20的終濃度分別為125mM和0.1重量%。
  24. 根據申請專利範圍第18項的方法，其中，進一步包括富集該其上攜帶單鏈DNA的磁性顆粒，以便獲得該Ion Torrent測序模板。
  25. 根據申請專利範圍第24項的方法，其中，富集該其上攜帶單鏈DNA的磁性顆粒是通過採用MyOneTM珠進行的。
  26. 根據申請專利範圍第17項的方法，其中，在進行該乳液PCR擴增之前進一步包括將該DNA測序庫進行稀釋的步驟。
  27. 根據申請專利範圍第26項的方法，其中，該乳液PCR擴增反應體系中，該具有測序接頭的連接產物的濃度為560＊106個分子/反應體系。
  28. 一種用於病毒檢測的系統，其包括：DNA測序庫製備裝置，該DNA測序庫製備裝置用於針對包含病毒核酸的樣品製備DNA測序庫；測序裝置，該測序裝置與該DNA測序庫製備裝置相連，用於對該DNA測序庫進行測序，以便獲得該病毒核酸的序列訊息；以及分析裝置，該分析裝置與該測序裝置相連，用於基於該病毒核酸的序列訊息，確定該病毒的類型，其中，該測序裝置為適於實施Ion Torrent測序技術的裝置。
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