CN104651352A - 一种用于高通量测序分析dna甲基化状态的文库构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于高通量测序分析DNA甲基化状态的文库构建方法。本发明公开的一组DNA分子，该组分子由如下（1）-（4）所示的四种分子组成：（1）SEQ IDNo.1所示的DNA分子；（2）SEQ ID No.2所示的DNA分子；（3）SEQ ID No.3所示的DNA分子；（4）SEQ ID No.4所示的DNA分子。本发明解决了传统方法中重亚硫酸盐修饰试剂现配现用的问题，并公开了一种用于高通量测序分析DNA甲基化状态的文库的制备方法，利用该方法可以方便，快捷地构建用于高通量测序分析DNA甲基化状态的文库。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于高通量测序分析DNA甲基化状态的文库构建方法。
背景技术
真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧啶，即在DNA甲基化转移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5’-端的胞嘧啶转变为5’-甲基胞嘧啶。
目前检测甲基胞嘧啶有多种方法，十多年前重亚硫酸盐基因组序列检测技术已成为在复杂基因组中分析DNA甲基化的方法。这个敏感而又直接的方法从根本上改了基因组DNA甲基化模式的特征，在目前使用的技术中可以得到最好的特异性结果并排除多种限制。这个技术的标准方法是基于DNA变性后用重亚硫酸氢钠处理，可将未甲基化的胞嘧啶修饰成尿嘧啶，能够将基因组中未甲基化的C碱基与甲基化的C碱基区分开来，重亚硫酸盐基因组测序已经被证实是分析DNA甲基化的有效和强有力的方法,是目前公认的DNA样品甲基化检测的“金标准”,它可以明确甲基化的确切位置及甲基化的程度。
将重亚硫酸盐修饰与高通量测序技术相结合，能够绘制单碱基分辨率的DNA甲基化图谱，因此成为表观遗传学研究的经典实验方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于高通量测序分析DNA甲基化状态的文库构建方法。
本发明提供的一组DNA分子，该组分子由如下（1）-（4）所示的四种分子组成：
（1）SEQ ID No.1所示的DNA分子；
（2）SEQ ID No.2所示的DNA分子；
（3）SEQ ID No.3所示的DNA分子；
（4）SEQ ID No.4所示的DNA分子。
一组接头分子也属于本发明的保护范围，该组分子由如下（1）-（4）所示的四种分子组成：
（1）SEQ ID No.1所示的DNA分子；
（2）SEQ ID No.2所示的DNA分子，其中3’末端的两个碱基均进行硫代修饰；
（3）SEQ ID No.3所示的DNA分子；
（4）SEQ ID No.4所示的DNA分子，其中3’末端的两个碱基均进行硫代修饰；
所述（1）-（4）所示的四种分子的dC在5位置均有甲基修饰；
其中（1）和（2）形成双链构成第一种接头分子，（3）和（4）形成双链构成第二种接头分子。
一对引物也属于本发明的保护范围，该对引物由如下（1）和（2）所示的两种分子组成：
（1）SEQ ID No.5所示的DNA分子；
该分子与SEQ ID No.3所示的分子部分序列一致；
（2）SEQ ID No.6所示的DNA分子；
该分子与SEQ ID No.1所示的分子部分序列一致。
一种重亚硫酸盐修饰试剂也属于本发明的保护范围，该试剂按照如下方法制备而成：称取1.9g Na2S2O5，加水至5mL，全部溶解后用3M氢氧化钠调节pH至5.0，真空干燥浓缩制成。
一种用于高通量测序分析DNA甲基化状态的文库构建的试剂盒也属于本发明的保护范围，该试剂盒包含上述接头分子和上述引物。
上述试剂盒中，所述试剂盒还包含牛血清白蛋白、DNA片段化酶、DNA片段化反应缓冲液、ddH2O、不含核酸酶的水、末端修复缓冲液、T4DNA聚合酶、DNA聚合酶I,(Klenow)大片段、T4多聚核苷酸激酶、T4DNA连接酶缓冲液、T4DNA连接酶、缺口平移缓冲液、Bst DNA聚合酶（大片段）、甲基化PCR扩增缓冲液和高保真DNA聚合酶；
所述末端修复缓冲液由溶剂和溶质组成，溶剂为Tris-HCl缓冲液，溶质为MgCl2、DTT、ATP和dNTPs,Tris-HCl缓冲液的浓度为500mM，MgCl2在所述10×末端修复缓冲液中的浓度为100mM，DTT在所述10×末端修复缓冲液中的浓度为100mM，ATP在所述10×末端修复缓冲液中的浓度为10mM，dNTPs在所述10×末端修复缓冲液中的浓度为5mM，溶液pH为7.5；
所述缺口平移缓冲液由溶剂和溶质组成，溶剂为Tris-HCl缓冲液，溶质为(NH4)2SO4、KCl、MgSO4、Triton X-100和dNTPs，Tris-HCl缓冲液的浓度为200mM,(NH4)2SO4在所述10×缺口平移缓冲液中的浓度为100mM,KCl在所述10×缺口平移缓冲液中的浓度为100mM,MgSO4在所述10×缺口平移缓冲液中的浓度为20mM，Triton X-100在所述10×缺口平移缓冲液中的体积百分含量为1%,dNTPs在所述10×缺口平移缓冲液中的浓度为2mM，所述dNTPs包含等浓度的dATP、dm5CTP,dGTP和dTTP，溶液pH为8.8；
所述甲基化PCR扩增缓冲液由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为Tris、（NH4）2SO4、MgCl2和β-巯基乙醇，Tris在所述甲基化PCR扩增缓冲液中的浓度为670mmol/L，（NH4）2SO4在所述甲基化PCR扩增缓冲液中的浓度为166mmol/L，MgCl2在所述甲基化PCR扩增缓冲液中的浓度为67mmol/L，β-巯基乙醇在所述甲基化PCR扩增缓冲液中的浓度为100mmol/L。
上述任一所述的试剂盒中，所述DNA片段化酶的商品名称为NEBNext dsDNAFragmentase，购自NEB公司，产品目录号为M0348L；
所述DNA片段化反应缓冲液的商品名称为10×Fragmentase Reaction Buffer，购自NEB公司；
所述T4DNA聚合酶的商品名称为T4DNA Polymerase，购自NEB公司，产品目录号为M0203S；
所述DNA聚合酶I,(Klenow)大片段的商品名称为DNA Polymerase I,Large(Klenow)Fragment，购自NEB公司，产品目录号为M0210S；
所述T4多聚核苷酸激酶的商品名称为T4Polynucleotide Kinase，购自NEB公司，产品目录号为M0201；
所述T4DNA连接酶缓冲液的商品名称为10×T4DNA Ligase Buffer，购自NEB公司；
所述T4DNA连接酶的商品名称为T4DNA Ligase，购自NEB司，产品目录号为M0202S；
所述Bst DNA聚合酶（大片段）的商品名称为Bst DNA Polymerase，Large Fragment，购自NEB公司，产品目录号为M0275；
所述高保真DNA聚合酶的商品名称为Phusion High-Fidelity DNA Polymerase，购自NEB公司，产品目录号为M0530S。
一种用于高通量测序分析DNA甲基化状态的文库的构建方法也属于本发明的保护范围，包括如下步骤：
（1）提取基因组DNA；
（2）将基因组DNA进行片段化，收集长度为100-300bp的片段化DNA并纯化；
（3）将步骤（2）得到的DNA的粘性末端修复成平末端，并在5’末端进行磷酸化修饰并纯化；
（4）对步骤（3）得到的DNA片段连接上述接头分子并纯化；
（5）将步骤（4）得到的DNA片段进行缺口平移；
（6）将步骤（5）得到的DNA片段进行重亚硫酸盐修饰及脱磺酸基并纯化；
（7）以步骤（6）得到的DNA片段为模板，以上述引物为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即为富集的DNA甲基化状态的文库。
上述方法中，所述步骤（3）的具体步骤如下：
将步骤（2）的片段化的DNA与ddH2O、末端修复缓冲液、T4DNA聚合酶、DNA聚合酶I,(Klenow)大片段、T4多聚核苷酸激酶混合，得体系1；将体系1置于20℃30分钟，得DNA片段末端修复以及5’末端磷酸化修饰后的产物并纯化；
所述体系1的总体积为100ul，所述ddH2O的体积为29ul，所述末端修复缓冲液的体积为10ul，所述T4DNA聚合酶的酶活为150U，所述DNA聚合酶I,(Klenow)大片段的酶活为5U，所述T4多聚核苷酸激酶的酶活为50U；
所述末端修复缓冲液由溶剂和溶质组成，溶剂为Tris-HCl缓冲液，溶质为MgCl2、DTT、ATP和dNTPs,Tris-HCl缓冲液的浓度为500mM，MgCl2在所述10×末端修复缓冲液中的浓度为100mM，DTT在所述10×末端修复缓冲液中的浓度为100mM，ATP在所述10×末端修复缓冲液中的浓度为10mM，dNTPs在所述10×末端修复缓冲液中的浓度为5mM，溶液pH为7.5；
所述T4DNA聚合酶的商品名称为T4DNA Polymerase，购自NEB公司，产品目录号为M0203S；
所述DNA聚合酶I,(Klenow)大片段的商品名称为DNA Polymerase I,Large(Klenow)Fragment，购自NEB公司，产品目录号为M0210S；
所述T4多聚核苷酸激酶的商品名称为T4Polynucleotide Kinase，购自NEB公司，产品目录号为M0201。
上述任一所述的方法中，所述步骤（4）的具体步骤如下：
（1）将dC在5位置均有甲基修饰的SEQ ID No.1所示的DNA分子与dC在5位置均有甲基修饰且3’末端的两个碱基进行硫代修饰的SEQ ID No.2所示的DNA分子进行退火，形成接头分子1；
（2）将dC在5位置均有甲基修饰的SEQ ID No.3所示的DNA分子与dC在5位置均有甲基修饰且3’末端的两个碱基进行硫代修饰的SEQ ID No.4所示的DNA分子进行退火，形成接头分子2；
（3）将接头分子1和接头分子2等体积等浓度混合，得到接头混合物；
（4）将不含核酸酶的水、步骤（3）的产物、T4DNA连接酶缓冲液、T4DNA连接酶、接头混合物进行混合，得体系2；将体系2置于22℃连接2小时，得到连接有甲基化接头的DNA片段并纯化；
所述体系2的总体积为50ul，所述不含核酸酶的水的体积为12ul，所述步骤（3）的产物的体积为30ul，所述T4DNA连接酶缓冲液的体积为5ul，所述T4DNA连接酶的酶活为5U，所述接头混合物的浓度为1uM；
所述T4DNA连接酶缓冲液的商品名称为10×T4DNA Ligase Buffer，购自NEB公司；
所述T4DNA连接酶的商品名称为T4DNA Ligase，购自NEB司，产品目录号为M0202S。
上述任一所述的方法中，所述步骤（5）的具体步骤如下：
将ddH2O、步骤（4）的产物、缺口平移缓冲液和Bst DNA聚合酶（大片段）混合，得体系3；将体系3置于65℃30min，80℃20min，得到缺口平移后的DNA片段；
所述体系3的总体积为50ul，所述ddH2O的体积为14ul，所述步骤（4）的产物的体积为30ul，所述缺口平移缓冲液的体积为5ul，所述Bst DNA聚合酶（大片段）的酶活为8U；
所述缺口平移缓冲液由溶剂和溶质组成，溶剂为Tris-HCl缓冲液，溶质为(NH4)2SO4、KCl、MgSO4、Triton X-100和dNTPs，Tris-HCl缓冲液的浓度为200mM,(NH4)2SO4在所述10×缺口平移缓冲液中的浓度为100mM,KCl在所述10×缺口平移缓冲液中的浓度为100mM,MgSO4在所述10×缺口平移缓冲液中的浓度为20mM，Triton X-100在所述10×缺口平移缓冲液中的体积百分含量为1%,dNTPs在所述10×缺口平移缓冲液中的浓度为2mM，所述dNTPs包含等浓度的dATP、dm5CTP,dGTP和dTTP，溶液pH为8.8；
所述Bst DNA聚合酶（大片段）的商品名称为Bst DNA Polymerase，Large Fragment，购自NEB公司，产品目录号为M0275。
上述任一所述的方法中，所述步骤（6）的重亚硫酸盐修饰的试剂为上述重亚硫酸盐修饰试剂。
上述任一所述的方法中，所述步骤（7）的PCR中所用的PCR扩增缓冲液由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为Tris、（NH4）2SO4、MgCl2和β-巯基乙醇，Tris在所述PCR扩增缓冲液中的浓度为670mmol/L，（NH4）2SO4在所述PCR扩增缓冲液中的浓度为166mmol/L，MgCl2在所述PCR扩增缓冲液中的浓度为67mmol/L，β-巯基乙醇在所述PCR扩增缓冲液中的浓度为100mmol/L。
上述接头分子和上述引物在构建用于高通量测序分析DNA甲基化状态的文库中的应用也属于本发明的保护范围；
和/或，
上述重亚硫酸盐修饰试剂在构建用于高通量测序分析DNA甲基化状态的文库中的应用也属于本发明的保护范围。
上述任一所述的试剂盒在构建用于高通量测序分析DNA甲基化状态的文库中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明提供的一种重亚硫酸盐修饰试剂解决了传统方法中重亚硫酸盐修饰试剂现配现用的问题，并提供了一种用于高通量测序分析DNA甲基化状态的文库的制备方法，利用该方法可以方便，快捷地构建可用于高通量测序分析DNA甲基化状态的文库。
附图说明
图1为文库构建技术路线。
图2为DNA片段化的电泳检测。
图3为富集产物的电泳检测。
图4为单克隆测序结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例仅为本发明的较佳实施例，并不用以限定本发明。
293T细胞购自中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所，产品目录号为SCSP-q04。
NEBNext dsDNA Fragmentase购自NEB公司，产品目录号为M0348L。
10×Fragmentase Reaction Buffer购自NEB公司。
T4DNA Polymerase购自NEB公司，产品目录号为M0203S。
QIA quick PCR Purification Kit购自Qiagen公司，产品目录号为28104。
QIA quick Gel Extraction Kit购自Qiagen公司，产品目录号为28704。
10×末端修复缓冲液:该缓冲液由溶剂和溶质组成，溶剂是Tris-HCl缓冲液，溶质为MgCl2、DTT、ATP和dNTPs,Tris-HCl缓冲液的浓度为500mM，MgCl2在10×末端修复缓冲液中的浓度为100mM，DTT在10×末端修复缓冲液中的浓度为100mM，ATP在10×末端修复缓冲液中的浓度为10mM，dNTPs在10×末端修复缓冲液中的浓度为5mM，调节溶液pH至7.5。
Bst DNA Polymerase，Large Fragment购自NEB公司，产品目录号为M0275。
DNA Polymerase I,Large(Klenow)Fragment购自NEB公司，产品目录号为M0210S。
T4Polynucleotide Kinase购自NEB公司，产品目录号为M0201。
T4DNA Ligase购自NEB公司，产品目录号为M0202S。
10×T4DNA Ligase Buffer购自NEB公司。
10×缺口平移缓冲液:该缓冲液由溶剂和溶质组成，溶剂为Tris-HCl缓冲液，溶质为(NH4)2SO4、KCl、MgSO4、Triton X-100和dNTPs（包括等浓度的dATP、dm5CTP,dGTP，dTTP），Tris-HCl缓冲液的浓度为200mM,(NH4)2SO4在10×缺口平移缓冲液中的浓度为100mM,KCl在10×缺口平移缓冲液中的浓度为100mM,MgSO4在10×缺口平移缓冲液中的浓度为20mM，Triton X-100在10×缺口平移缓冲液中的体积百分含量为1%,dNTPs在10×缺口平移缓冲液中的浓度为2mM，调节溶液pH至8.8。
10mM对苯二酚的配制：称取0.011g对苯二酚，加水至10mL使固体全部溶解。
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase购自NEB公司，产品目录号为M0530S。
双链DNA变性缓冲液按照如下方法制备：
称取0.4克NaOH固体，加5mL水溶解，取500μL分装于离1.5mL旋盖离心管中，真空干燥浓缩后备用，使用前每管加入500μL不含核酸酶的水。
重亚硫酸盐修饰缓冲液按照如下方法制备：
称取1.9g Na2S2O5，加水至5mL，固体全部溶解后用3M氢氧化钠调节pH至5.0，取1mL分装于离1.5mL旋盖离心管，真空干燥浓缩后备用，使用前每管加入1mL不含核酸酶的水。
脱磺酸基缓冲液按照如下方法制备：
称取0.6克NaOH固体，加水5mL溶解，取500μL分装于离1.5mL旋盖离心管中，真空干燥浓缩后备用，使用前每管加入500μL不含核酸酶的水。
10×甲基化PCR Buffer按照如下方法制备：670mmol/L Tris、166mmol/L（NH4）2SO4, 67 mmol/L MgCl2，100mmol/Lβ-巯基乙醇，余量为水。
pTG19-T载体购自上海捷瑞生物工程有限公司，产品目录号为GV0101。
实施例1、用于高通量测序分析DNA甲基化状态的文库的构建
用于高通量测序分析DNA甲基化状态的文库构建技术路线如图1所示。
一、基因组DNA片段化
（一）提取293T细胞的基因组DNA。
（二）按照表1配制酶切反应体系（注意：此步骤先不加NEBNext dsDNAFragmentase，其余按照表1配制）。
表1基因组DNA片段化反应体系
| 试剂 | 加入体积（μl） |
| 10×Fragmentase Reaction Buffer | 4 |
| 100×BSA | 0.4 |
| 人基因组DNA（500ng/uL） | 4 |
| NEBNext dsDNA Fragmentase | 4 |
| DEPC水 | 补足体系至40μl |
（三）将表1的体系冰浴5分钟，涡旋NEBNext dsDNA Fragmentase，向体系中加入4μl NEBNext dsDNA Fragmentase。
（四）根据所需要的片段大小按照表2，设定37℃温育的时间，本实施例中设定37℃温育40min。
表2 DNA片段化长度与时间对照表
| 片段大小（bp） | 温育时间（min） |
| 600-800 | 15 |
| 300-600 | 30 |
| 100-300 | 40 |
（五）将温育后的体系立即冰浴，得片段化的基因组DNA。
二、片段化的基因组DNA的纯化
（一）用TE将步骤一的体系补足至100μL。
（二）用QIA quick PCR Purification Kit纯化片段化的基因组DNA。
（三）用50μL Buffer EB洗脱片段化DNA，得洗脱的DNA片段。
（四）将纯化后的基因组DNA进行2%的琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示。
图2中，M为DNA Marker；1和2为两个片段化的基因组DNA样品。
图2表明，经过片段化处理以后基因组DNA主要条带位于100-500bp之间。
分别切下200-250bp,250-300bp之间的条带。用QIAquick Gel Extraction Kit纯化，用50μL Buffer EB分别洗脱两种不同长度范围的片段化DNA，进行如下实验，用于构建片段大小不同的两个文库。
三、DNA片段的末端修复
（一）在0.2mL灭菌的低吸附性离心管中按照表3配制DNA片段末端修复体系。
表3DNA片段末端修复体系
（二）将表3的体系在20℃孵育30分钟，得DNA片段末端修复产物，末端修复的目的是将粘性末端修复成平末端，并在5’末端进行磷酸化修饰，才能与下述的甲基化接头连接。
四、DNA片段末端修复产物的纯化
（一）用QIA quick PCR Purification Kit纯化步骤三的产物。
（二）用32μL Buffer EB洗脱DNA片段末端修复产物，得到纯化后的DNA片段末端修复产物。
五、连接甲基化接头
（一）将序列中的dC在5位置进行甲基修饰的寡核苷酸接头P1a,P1b和A1a,A1b，分别用1×TE溶解至100μM。
（二）各取20μL接头P1a,P1b于0.2mLPCR管中，另各取20μL A1a,A1b接头于另一PCR管按照表4所示的程序退火。
P1a：5’-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3’；（SEQ ID No.1）
P1b：5’-ATCACCGACTGCCCATAGAGAGGAAAGCGGAGGCGTAGTGGT*T*-3’；（SEQ IDNo.2）
A1a：5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG-3’；（SEQ ID No.3）
A1b：5’-CTGAGTCGGAGACACGCAGGGATGAGATGGT*T*-3’。（SEQ ID No.4）
*标记为硫代修饰。
表4退火程序
将两个PCR管中的退火产物进行等体积等浓度混合得到浓度为25μM接头混合液，将此混合液标记为AP Mix。置于-20℃冰箱保存备用。
（三）按照表5配制接头连接体系。
表5接头连接体系
（四）将表5的体系置于22℃连接两个小时，得到连接有甲基化接头的DNA片段。
六、连接甲基化接头的DNA片段的纯化
（一）将步骤五的产物进行2%琼脂糖凝胶电泳。
（二）分别切下300bp±20bp,350±20bp的目的条带并转移至微型离心管中。
（三）用QIA quick Gel Extraction Kit分别纯化目的产物。
（四）用30μL Buffer EB洗脱目的产物，得到纯化的连接甲基化接头的DNA片段末端修复产物。
七、缺口平移
（一）按照表6配制缺口平移体系。
表6缺口平移体系
| 试剂 | 加入体积（μL） |
| ddH2O | 14 |
| 步骤六的产物 | 30 |
| 10×缺口平移缓冲液 | 5 |
| Bst DNA Polymerase，Large Fragment（8U/μL） | 1 |
| 总体积 | 50 |
（二）将表5的体系置于65℃30min，80℃20min，得到缺口平移（置换掉接头分子中未连接至步骤六的产物的其中一条链，以连接至步骤六的产物的链为模板合成互补链，最终得到与接头分子没有连接缺口的双链DNA片段）后的连接甲基化接头的DNA片段。
八、重亚硫酸盐修饰
（一）取双链DNA变性缓冲液1管，使用前加入500uL不含核酸酶的水溶解。
（二）取重亚硫酸盐修饰缓冲液1管加不含核酸酶的水至1mL溶解。
（三）转移步骤七得到的产物分别取50μL至1.5mL离心管中，加入5.6μl双链DNA变性缓冲液42℃水浴30min，充分变性。
（四）然后加入30μl10mM对苯二酚，520μl重亚硫酸盐修饰缓冲液，覆盖200μl石蜡油，50℃水浴过夜。
（五）用QIA quick PCR Purification Kit纯化步骤（四）的DNA片段。
（六）用50μL Buffer EB洗脱DNA片段。
（七）取1管脱磺酸基缓冲液，加入500μL不含核酸酶的水。
（八）向洗脱得到的DNA片段中加入步骤（七）配制的5.6μl脱磺酸基缓冲液，37℃水浴30min，充分脱磺酸基。
（九）向步骤（八）的体系中加55μl6M乙酸铵，1μl20mg/mL的糖原，270μl无水乙醇，-20℃放置30min。
（十）将样品置于4℃12000rpm离心30min，去上清。
（十一）向步骤（十）的体系中加1mL体积百分含量为70%的乙醇的水溶液，12000rpm离心5min，去上清，室温风干，得DNA沉淀，用20μl TE重悬DNA沉淀，得到用于甲基化文库富集的模板DNA。
九、甲基化文库富集
（一）按照表7配制甲基化文库富集体系。
表7甲基化文库富集体系
上游引物：5’-ccatctcatccctgcgtgtc-3’；（SEQ ID No.5）
上游引物与A1a的部分序列一致；
下游引物：5’-ccactacgcctccgctttcctctctatg-3’。（SEQ ID No.6）
下游引物与P1a的部分序列一致。
PCR程序：94℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，15个循环；72℃5min；10℃∞。
将表7的体系进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
（二）将PCR扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，条件为120V电泳60分钟，结果如图3所示。
图3中，M1为长度为400bp左右的甲基化文库扩增产物；M2为长度为300bp左右的甲基化文库扩增产物。
图3表明，步骤二得到的200-250bp,250-300bp的条带分别成功扩增出300bp，400bp左右的用于分析DNA甲基化状态的文库。
（三）分别切下M1的400bp、M2的300bp目的条带并转移至离心管中，用QIAquick Gel Extraction Kit纯化目的片段。
（四）用30μL EB buffer洗脱目的片段，得到纯化后的文库。
十、文库的质检
将步骤九得到的长度为300bp左右的甲基化文库扩增产物加A尾后连接至pTG19-T载体，转化DH5α大肠杆菌后，挑单克隆进行测序。
测序结果如图4所示。
图4中，A和B为两个克隆。
图4表明，两个克隆插入片段的未甲基化的C-T转换率为100%，表明用于分析DNA甲基化状态的文库构建成功。
Claims (10)
1.一组DNA分子，该组分子由如下（1）-（4）所示的四种分子组成：
（1）SEQ ID No.1所示的DNA分子；
（2）SEQ ID No.2所示的DNA分子；
（3）SEQ ID No.3所示的DNA分子；
（4）SEQ ID No.4所示的DNA分子。
2.一组接头分子，该组分子由如下（1）-（4）所示的四种分子组成：
（1）SEQ ID No.1所示的DNA分子；
（2）SEQ ID No.2所示的DNA分子，其中3’末端的两个碱基均进行硫代修饰；
（3）SEQ ID No.3所示的DNA分子；
（4）SEQ ID No.4所示的DNA分子，其中3’末端的两个碱基均进行硫代修饰；
所述（1）-（4）所示的四种分子的dC在5位置均有甲基修饰；
其中（1）和（2）形成双链构成第一种接头分子，（3）和（4）形成双链构成第二种接头分子。
3.一对引物，该对引物由如下（1）和（2）所示的两种分子组成：
（1）SEQ ID No.5所示的DNA分子；
该分子与SEQ ID No.3所示的分子部分序列一致；
（2）SEQ ID No.6所示的DNA分子；
该分子与SEQ ID No.1所示的分子部分序列一致。
4.一种重亚硫酸盐修饰试剂，该试剂按照如下方法制备而成：称取1.9g Na2S2O5，加水至5mL，全部溶解后用3M氢氧化钠调节pH至5.0，真空干燥浓缩制成。
5.一种用于高通量测序分析DNA甲基化状态的文库构建的试剂盒，该试剂盒包含权利要求2所述的接头分子和权利要求3所述的引物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包含牛血清白蛋白、DNA片段化酶、DNA片段化反应缓冲液、ddH2O、不含核酸酶的水、末端修复缓冲液、T4DNA聚合酶、DNA聚合酶I,(Klenow)大片段、T4多聚核苷酸激酶、T4DNA连接酶缓冲液、T4DNA连接酶、缺口平移缓冲液、Bst DNA聚合酶（大片段）、甲基化PCR扩增缓冲液和高保真DNA聚合酶；
所述末端修复缓冲液由溶剂和溶质组成，溶剂为Tris-HCl缓冲液，溶质为MgCl2、DTT、ATP和dNTPs,Tris-HCl缓冲液的浓度为500mM，MgCl2在所述10×末端修复缓冲液中的浓度为100mM，DTT在所述10×末端修复缓冲液中的浓度为100mM，ATP在所述10×末端修复缓冲液中的浓度为10mM，dNTPs在所述10×末端修复缓冲液中的浓度为5mM，溶液pH为7.5；
所述缺口平移缓冲液由溶剂和溶质组成，溶剂为Tris-HCl缓冲液，溶质为(NH4)2SO4、KCl、MgSO4、Triton X-100和dNTPs，Tris-HCl缓冲液的浓度为200mM,(NH4)2SO4在所述10×缺口平移缓冲液中的浓度为100mM,KCl在所述10×缺口平移缓冲液中的浓度为100mM,MgSO4在所述10×缺口平移缓冲液中的浓度为20mM，Triton X-100在所述10×缺口平移缓冲液中的体积百分含量为1%,dNTPs在所述10×缺口平移缓冲液中的浓度为2mM，所述dNTPs包含等浓度的dATP、dm5CTP,dGTP和dTTP，溶液pH为8.8；
所述甲基化PCR扩增缓冲液由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为Tris、（NH4）2SO4、MgCl2和β-巯基乙醇，Tris在所述甲基化PCR扩增缓冲液中的浓度为670mmol/L，（NH4）2SO4在所述甲基化PCR扩增缓冲液中的浓度为166mmol/L，MgCl2在所述甲基化PCR扩增缓冲液中的浓度为67mmol/L，β-巯基乙醇在所述甲基化PCR扩增缓冲液中的浓度为100mmol/L。
7.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于：所述DNA片段化酶的商品名称为NEBNext dsDNA Fragmentase，购自NEB公司，产品目录号为M0348L；
所述DNA片段化反应缓冲液的商品名称为10×Fragmentase Reaction Buffer，购自NEB公司；
所述T4DNA聚合酶的商品名称为T4DNA Polymerase，购自NEB公司，产品目录号为M0203S；
所述DNA聚合酶I,(Klenow)大片段的商品名称为DNA Polymerase I,Large(Klenow)Fragment，购自NEB公司，产品目录号为M0210S；
所述T4多聚核苷酸激酶的商品名称为T4Polynucleotide Kinase，购自NEB公司，产品目录号为M0201；
所述T4DNA连接酶缓冲液的商品名称为10×T4DNA Ligase Buffer，购自NEB公司；
所述T4DNA连接酶的商品名称为T4DNA Ligase，购自NEB司，产品目录号为M0202S；
所述Bst DNA聚合酶（大片段）的商品名称为Bst DNA Polymerase，Large Fragment，购自NEB公司，产品目录号为M0275；
所述高保真DNA聚合酶的商品名称为Phusion High-Fidelity DNA Polymerase，购自NEB公司，产品目录号为M0530S。
8.一种用于高通量测序分析DNA甲基化状态的文库的构建方法，包括如下步骤：
（1）提取基因组DNA；
（2）将基因组DNA进行片段化，收集长度为100-300bp的片段化DNA并纯化；
（3）将步骤（2）得到的DNA的粘性末端修复成平末端，并在5’末端进行磷酸化修饰并纯化；
（4）对步骤（3）得到的DNA片段连接权利要求2所述的接头分子并纯化；
（5）将步骤（4）得到的DNA片段进行缺口平移；
（6）将步骤（5）得到的DNA片段进行重亚硫酸盐修饰及脱磺酸基并纯化；
（7）以步骤（6）得到的DNA片段为模板，以权利要求3所述的引物为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即为富集的DNA甲基化状态的文库。
9.权利要求2所述的接头分子和权利要求3所述的引物在构建用于高通量测序分析DNA甲基化状态的文库中的应用；
和/或，
权利要求4所述的重亚硫酸盐修饰试剂在构建用于高通量测序分析DNA甲基化状态的文库中的应用。
10.权利要求5-7任一所述的试剂盒在构建用于高通量测序分析DNA甲基化状态的文库中的应用。
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