CN106047861A - 一种快速修复损伤dna的试剂、及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速修复损伤DNA的试剂、及其制备方法与应用。所述快速修复损伤DNA的试剂包含10×NEB缓冲液2、寡核苷酸、三磷酸碱基脱氧核苷酸、大肠杆菌DNA聚合酶I和T4 DNA连接酶。所述快速修复损伤DNA试剂的制备方法包括：将10×NEB缓冲液2、寡核苷酸、三磷酸碱基脱氧核苷酸、大肠杆菌DNA聚合酶I和T4 DNA连接酶混合，之后用超纯水定容。本发明提供的快速修复损伤DNA的试剂能大大提高DNA的修复成功率，而使用本发明的快速修复损伤DNA的试剂及方法，与市面上的修复试剂盒相比，将成本降低50％，将操作时间由1.5小时以上缩短至40分钟以内，与常规DNA修复方法相比，修复率提高2倍以上，并且操作时间由5小时以上缩短至40分钟以内。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，更具体地，涉及用于DNA技术领域，特别是指一种快速修复损伤DNA的试剂、及其制备方法与应用。
背景技术
DNA是人类遗传的物质基础，为了弄清DNA在人类遗传和发育过程中的功能和结构，DNA序列的检测成为了研究DNA最重要的手段。1977年Sanger发明了具有里程碑意义的末端终止测序法，同年A.M.Maxam和W.Gilbert发明了化学降解法。Sanger法因为既简便又快速，并经过后续的不断改良，成为了第一代DNA测序的主流。随着科学技术的不断革新，第一代DNA测序技术(Sanger)已无法满足测序的需求，1990年，美国正式启动跨世纪的"人类基因组计划"，计划历时15年，斥资30亿美元，破译人类自身遗传秘密，人类步入了后基因组时代。随着对DNA信息的海量需求，二代测序诞生了，该技术基于一项边合成边测序技术，代表公司有Roche(454)，Illumina(Solexa)，ABI(SOLID)。二代测序技术最基本的技术就是二代测序文库的构建，文库构建起始首先将待测样本的基因组DNA进行破碎和片段化，主要手段有剪切力，超声波，氮气，酶切等，在获得片段化DNA之后，为了方便加上不对称的测序接头，必须先将片段化DNA做末端补平和尾端加单个腺嘌呤，经典文库构建流程中末端补平和尾部加腺嘌呤的步骤是独立完成的。
随着二代测序技术的飞速发展，该技术也被广泛用于遗传性突变，疾病发病机理，遗传机理等多种医学，遗传学等医疗领域。
在医疗领域中，科研人员需从各种不同的组织标本中提取DNA，但新鲜组织标本来源有限，所以通常临床样本都采用石蜡包埋方式处理组织，导致获得的DNA都会产生于RNA及蛋白质的交联反应，并且产生很多氧化及切断损伤，而DNA质量往往是文库构建成功的一个关键影响因素，所以损伤的DNA进行文库构建一般会导致失败，因此福尔马林处理导致的DNA损伤成为了影响二代测序技术应用于临床样本处理的关键制约因素之一，因此将损伤的DNA进行修复也就成为了迫在眉睫的需要解决的问题。
发明内容
本发明的主要目的就是针对以上现状，解决限制二代测序技术在临床样本处理上的关键问题，提供一种快速修复损伤DNA的试剂、及其制备方法与应用，该试剂成分简单，制备操作方便，成本低廉，不需特殊设备，并能显著提高修复成功率和降低成本消耗。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例提供了一种快速修复损伤DNA的试剂，其包含10×NEB缓冲液2、寡核苷酸、三磷酸碱基脱氧核苷酸、大肠杆菌DNA聚合酶I和T4DNA连接酶。
在一些实施方案之中，所述的快速修复损伤DNA的试剂，其包含：
10×NEB缓冲液2 5-25体积份，
浓度为10mM的寡核苷酸溶液 1-5体积份，
浓度为100mM的三磷酸碱基脱氧核苷酸溶液 0.5-2.5体积份，
大肠杆菌DNA聚合酶I溶液 2-5体积份，
T4DNA连接酶溶液 2.5-7.5体积份。
在一些较为优选的实施方案之中，所述的快速修复损伤DNA的试剂包含：
10×NEB缓冲液2 10体积份，
浓度为10mM的寡核苷酸溶液 2.5体积份，
浓度为100mM的三磷酸碱基脱氧核苷酸溶液 1.5体积份，
大肠杆菌DNA聚合酶I溶液 3体积份，
T4DNA连接酶溶液 5体积份。
在一些实施方案之中，所述的快速修复损伤DNA的试剂包含：
10×NEB缓冲液2 5-25体积份，
浓度为10mM的寡核苷酸溶液 1-5体积份，
浓度为100mM的三磷酸碱基脱氧核苷酸溶液 0.5-2.5体积份，
大肠杆菌DNA聚合酶I溶液 2-5体积份，
T4DNA连接酶溶液 2.5-7.5体积份，
超纯水 47-77体积份。
在一些较为优选的实施方案之中，所述的快速修复损伤DNA的试剂包含：
10×NEB缓冲液2 10体积份，
浓度为10mM的寡核苷酸溶液 2.5体积份，
浓度为100mM的三磷酸碱基脱氧核苷酸溶液 1.5体积份，
大肠杆菌DNA聚合酶I溶液 3体积份，
T4DNA连接酶溶液 5体积份，
超纯水 68体积份。
本发明实施例还提供了一种所述快速修复损伤DNA试剂的制备方法，其包括：先将10×NEB缓冲液2、寡核苷酸、三磷酸碱基脱氧核苷酸、大肠杆菌DNA聚合酶I和T4DNA连接酶混合，之后用超纯水定容。
在一些较为具体的实施方案中，所述制备方法包括：先将10×NEB缓冲液2、寡核苷酸、三磷酸碱基脱氧核苷酸、大肠杆菌DNA聚合酶I和T4DNA连接酶混合，之后用超纯水定容。
本发明实施例还提供了一种快速修复损伤DNA的方法，包括：将损伤的DNA和前述的任一种快速修复损伤DNA的试剂混合均匀，之后进行PCR扩增。
较为优选的，所述PCR扩增的条件包括：温度为37℃-42℃，时间为3-10min。
尤为优选的，所述PCR扩增的条件包括：温度为37℃，时间为3min。
较为优选的，所述损伤的DNA与所述的快速修复损伤DNA的试剂的用量比为100ng：90微升。
本发明实施例还提供了所述的快速修复损伤DNA的试剂于构建基因文库中的应用。
本发明实施例还提供了一种快速修复损伤DNA的试剂盒，其包括前述的任一种快速修复损伤DNA的试剂。
本发明实施例还提供了所述快速修复损伤DNA的试剂盒于构建基因文库中的应用。
与现有技术相比，本发明的优点包括：
(1)本发明提供的一种快速修复损伤DNA的试剂能够大大提高DNA修复成功率，且使用本发明快速修复损伤DNA的方法，与市面上的修复试剂盒相比，将成本降低50％，作时间由1.5小时缩短至40分钟，与常规DNA修复方法相比，修复率提高2倍，并且操作时间由5小时缩短至40分钟。
(2)本发明提供的快速修复损伤DNA试剂的制备方法的原料廉价易得，有利于推广应用；且配置本发明的快速修复损伤DNA试剂只需将上述原料溶于超纯水，制备简单、难度低，无需专门技术培训及特殊仪器设备。
附图说明
图1是本发明中实施例与对照组的修复合格率与实验耗时的示意图；
图2是本发明中实施例与对照组的成本消耗示意图。
具体实施方式
下文将对本发明的技术方案作更为详尽的解释说明。但是，应当理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
在对实例描述前，有必要提供一些备注说明：
采用不同厂家、不同批次的试剂会造成实验结果的差异，属于正常现象。在进行小规模实验室，为保证平行实验间的重复性，建议配置试剂后，充分混匀并分装，以保证每次实验试剂的均一性。
本发明公开了一种快速修复损伤DNA的试剂，其包含10×NEB缓冲液2、寡核苷酸、三磷酸碱基脱氧核苷酸、大肠杆菌DNA聚合酶I和T4DNA连接酶。
在一些实施方案之中所述的快速修复损伤DNA的试剂，其包含：
10×NEB缓冲液2 5-25体积份，
浓度为10mM的寡核苷酸溶液 1-5体积份，
浓度为100mM的三磷酸碱基脱氧核苷酸溶液 0.5-2.5体积份，
大肠杆菌DNA聚合酶I溶液 2-5体积份，
T4DNA连接酶溶液 2.5-7.5体积份。
在一些较为优选的实施方案之中，所述的快速修复损伤DNA的试剂包含：
10×NEB缓冲液2 10体积份，
浓度为10mM的寡核苷酸溶液 2.5体积份，
浓度为100mM的三磷酸碱基脱氧核苷酸溶液 1.5体积份，
大肠杆菌DNA聚合酶I溶液 3体积份，
T4DNA连接酶溶液 5体积份。
在一些实施方案之中，所述的快速修复损伤DNA的试剂包含：
10×NEB缓冲液2 5-25体积份，
浓度为10mM的寡核苷酸溶液 1-5体积份，
浓度为100mM的三磷酸碱基脱氧核苷酸溶液 0.5-2.5体积份，
大肠杆菌DNA聚合酶I溶液 2-5体积份，
T4DNA连接酶溶液 2.5-7.5体积份，
超纯水 47-77体积份。
在一些较为优选的的实施方案之中，所述的快速修复损伤DNA的试剂，其包含：
10×NEB缓冲液2 10体积份，
浓度为10mM的寡核苷酸溶液 2.5体积份，
浓度为100mM的三磷酸碱基脱氧核苷酸溶液 1.5体积份，
大肠杆菌DNA聚合酶I溶液 3体积份，
T4DNA连接酶溶液 5体积份，
超纯水 68体积份。
本发明提出了一种所述快速修复损伤DNA试剂的制备方法，其包括：先将10×NEB缓冲液2、寡核苷酸、三磷酸碱基脱氧核苷酸、大肠杆菌DNA聚合酶I和T4DNA连接酶混合，之后用超纯水定容。
本发明还提出了一种快速修复损伤DNA的方法，其包括以下步骤：
a、将损伤的DNA和所述快速修复损伤DNA的试剂放入PCR管内混合均匀，备用；
b、将步骤a处理后的、装有混合物的PCR管置于PCR仪中进行扩增。
进一步的，步骤a中，100ng损伤DNA对应的快速修复损伤DNA试剂的体积为90μL。
进一步的，步骤a中混合损伤的DNA和所述快速修复损伤DNA试剂的方法是用移液器吸头将PCR管内的混合物均匀吹打混合10次以上。
优选的，步骤b在PCR仪中扩增的条件为在温度37℃-42℃下反应3-10min。
下面结合具体实施例对本发明的内容予以详细说明。
实施例1
1.配置试剂：
准确使用移液器量取10×NEB缓冲液2 10μL，10mM寡核苷酸2.5μL，100mM三磷酸碱基脱氧核苷酸1.5μL，大肠杆菌DNA聚合酶I 3μL，T4DNA连接酶5μL，并使用超纯水定容至90μL。
2.实验操作过程：
A.取8个0.2mL PCR管，将损伤DNA 100ng(8个样本100ng/个)准确定容至10μL加入对应PCR管内，再准确加入快速修复损伤DNA试剂90μL。
B.使用移液器吸头将该管内混合物均匀吹打混合10次以上。
C.将装有混合均匀的混合物PCR管放置于PCR仪上。
D.运行正确的反应程序。
反应程序是：37℃30分钟。
3.检验方法：
将所得产物取出5μL，直接加入电泳上样缓冲液1μL，并使用移液器充分混匀，加入至0.7％琼脂糖凝胶中，放置于电泳缓冲液中，并开启电泳仪选择30伏特电压，电泳16小时后，小心将凝胶从电泳仪中取出，放置于成像仪上，拍照并记录结果，根据最大条带不小于10000个碱基对为合格标准，统计修复合格率和记录实验耗时。
修复合格率87.5％，实验总耗时36min。
实施例2
1.配置试剂：
准确使用移液器量取10×NEB缓冲液2 10μL，10mM寡核苷酸2.5μL，100mM三磷酸碱基脱氧核苷酸1.5μL，大肠杆菌DNA聚合酶I 3μL，T4DNA连接酶5μL，并使用超纯水定容至90μL。
2.实验操作过程：
A.取8个0.2mL PCR管，将损伤DNA 100ng(8个样本100ng/个)准确定容至10μL加入对应PCR管内，再准确加入快速修复损伤DNA试剂90μL。
B.使用移液器吸头将该管内混合物均匀吹打混合10次以上。
C.将装有混合均匀的混合物PCR管放置于PCR仪上。
D.运行正确的反应程序。
反应程序是：37℃30分钟。
3.检验方法：
将所得产物取出5μL，直接加入电泳上样缓冲液1μL，并使用移液器充分混匀，加入至0.7％琼脂糖凝胶中，放置于电泳缓冲液中，并开启电泳仪选择30伏特电压，电泳16小时后，小心将凝胶从电泳仪中取出，放置于成像仪上，拍照并记录结果，根据最大条带不小于10000个碱基对为合格标准，统计修复合格率和记录实验耗时。
修复合格率100％，实验总耗时33min。
实施例3：
1.配置试剂：
准确使用移液器量取10×NEB缓冲液2 10μL，10mM寡核苷酸2.5μL，100mM三磷酸碱基脱氧核苷酸1.5μL，大肠杆菌DNA聚合酶I 3μL，T4DNA连接酶5μL，并使用超纯水定容至90μL。
2.实验操作过程：
A.取8个0.2mL PCR管，将损伤DNA 100ng(8个样本100ng/个)准确定容至10μL加入对应PCR管内，再准确加入快速修复损伤DNA试剂90μL。
B.使用移液器吸头将该管内混合物均匀吹打混合10次以上。
C.将装有混合均匀的混合物PCR管放置于PCR仪上。
D.运行正确的反应程序。
反应程序是：37℃30min。
3.检验方法：
将所得产物取出5μL，直接加入电泳上样缓冲液1μL，并使用移液器充分混匀，加入至0.7％琼脂糖凝胶中，放置于电泳缓冲液中，并开启电泳仪选择30伏特电压，电泳16小时后，小心将凝胶从电泳仪中取出，放置于成像仪上，拍照并记录结果，根据最大条带不小于10000个碱基对为合格标准，统计修复合格率和记录实验耗时。
修复合格率100％，实验总耗时35min。
实施例4：
1.配置试剂：
准确使用移液器量取10×NEB缓冲液2 10μL，10mM寡核苷酸2.5μL，100mM三磷酸碱基脱氧核苷酸1.5μL，大肠杆菌DNA聚合酶I 3μL，T4DNA连接酶5μL，并使用超纯水定容至90μL。
2.实验操作过程：
A.取8个0.2mL PCR管，将损伤DNA 100ng(8个样本100ng/个)准确定容至10μL加入对应PCR管内，再准确加入快速修复损伤DNA试剂90μL。
B.使用移液器吸头将该管内混合物均匀吹打混合10次以上。
C.将装有混合均匀的混合物PCR管放置于PCR仪上。
D.运行正确的反应程序。
反应程序是：37℃30min。
3.检验方法：
将所得产物取出5μL，直接加入电泳上样缓冲液1μL，并使用移液器充分混匀，加入至0.7％琼脂糖凝胶中，放置于电泳缓冲液中，并开启电泳仪选择30伏特电压，电泳16小时后，小心将凝胶从电泳仪中取出，放置于成像仪上，拍照并记录结果，根据最大条带不小于10000个碱基对为合格标准，统计修复合格率和记录实验耗时。
修复合格率87.5％，实验总耗时38min。
对照组实例1：
1.配置试剂：(使用市面上已有试剂盒)
试剂盒已完成试剂配制。
2.实验操作过程：
A.取1个0.2mL PCR管，将片段化DNA 100ng准确定容至30μL加入该PCR管内，再准确加入修复试剂170μL。
B.使用移液器吸头将该管内混合物均匀吹打混合10次以上。
C.将装有混合均匀的混合物PCR管放置于PCR仪上，12℃30分钟，37℃30分钟，42℃20min。
3.检验方法：
将所得产物取出5μL，直接加入电泳上样缓冲液1μL，并使用移液器充分混匀，加入至0.7％琼脂糖凝胶中，放置于电泳缓冲液中，并开启电泳仪选择30伏特电压，电泳16小时后，小心将凝胶从电泳仪中取出，放置于成像仪上，拍照并记录结果，根据最大条带不小于10000个碱基对为合格标准，统计修复合格率和记录实验耗时。
修复合格率100％，实验总耗时99min。
对照组实例2
1.配置试剂：
准确使用移液器量取10×NEB缓冲液2 10μL，10mM寡核苷酸2.5μL，Bst聚合酶3μL，T4DNA聚合酶3μL，核酸外切酶V 1μL，T4DNA连接酶3μL，并使用超纯水定容至90μL，配制成修复试剂
2.实验操作过程：
A.取1个0.2mL PCR管，将片段化DNA100ng准确定容至30μL加入该PCR管内，再准确加入修复试剂170μL。
B.使用移液器吸头将该管内混合物均匀吹打混合10次以上。
C.将装有混合均匀的混合物PCR管放置于PCR仪上，12℃1.5小时，37℃3小时，65℃20min。
3.检验方法：
将所得产物取出5μL，直接加入电泳上样缓冲液1μL，并使用移液器充分混匀，加入至0.7％琼脂糖凝胶中，放置于电泳缓冲液中，并开启电泳仪选择30伏特电压，电泳16小时后，小心将凝胶从电泳仪中取出，放置于成像仪上，拍照并记录结果，根据最大条带不小于10000个碱基对为合格标准，统计修复合格率和记录实验耗时。
修复合格率50％，实验总耗时302min。
从图1和图2可以看出，本发明使用的快速修复损伤DNA试剂比对照组1使用的市面以后修复试剂盒有着成本低和耗时短的特点，并且在与对照组2(其他修复方法)比较，有着修复合格率高且耗时短的优势。
本发明的技术内容及技术特征已揭示如上，然而熟悉本领域的技术人员仍可能基于本发明的教示及揭示而作种种不背离本发明精神的替换及修饰，因此，本发明保护范围应不限于实施例所揭示的内容，而应包括各种不背离本发明的替换及修饰，并为本专利申请权利要求所涵盖。
Claims (10)
1.一种快速修复损伤DNA的试剂，其特征在于包含10×NEB缓冲液2、寡核苷酸、三磷酸碱基脱氧核苷酸、大肠杆菌DNA聚合酶I和T4DNA连接酶。
2.根据权利要求1所述的快速修复损伤DNA的试剂，其特征在于包含：
10×NEB缓冲液2 5-25体积份，
浓度为10mM的寡核苷酸溶液 1-5体积份，
浓度为100mM的三磷酸碱基脱氧核苷酸溶液 0.5-2.5体积份，
大肠杆菌DNA聚合酶I溶液 2-5体积份，
T4DNA连接酶溶液 2.5-7.5体积份，
其余部分包括超纯水。
3.根据权利要求2所述的快速修复损伤DNA的试剂，其特征在于包含：
10×NEB缓冲液2 5-25体积份，
浓度为10mM的寡核苷酸溶液 1-5体积份，
浓度为100mM的三磷酸碱基脱氧核苷酸溶液 0.5-2.5体积份，
大肠杆菌DNA聚合酶I溶液 2-5体积份，
T4DNA连接酶溶液 2.5-7.5体积份，
超纯水 47-77体积份。
4.根据权利要求3所述的快速修复损伤DNA的试剂，其特征在于包含：
10×NEB缓冲液2 10体积份，
浓度为10mM的寡核苷酸溶液 2.5体积份，
浓度为100mM的三磷酸碱基脱氧核苷酸溶液 1.5体积份，
大肠杆菌DNA聚合酶I溶液 3体积份，
T4DNA连接酶溶液 5体积份，
超纯水 68体积份。
5.如权利要求1-4中任一项所述快速修复损伤DNA的试剂的制备方法，其特征在于包括：先将10×NEB缓冲液2、寡核苷酸、三磷酸碱基脱氧核苷酸、大肠杆菌DNA聚合酶I和T4DNA连接酶混合，之后用超纯水定容。
6.一种快速修复损伤DNA的方法，其特征在于包括：将损伤的DNA和权利要求1-4中任一项所述的快速修复损伤DNA的试剂混合均匀，之后进行PCR扩增。
7.根据权利要求6所述快速修复损伤DNA的方法，其特征在于，所述PCR扩增的条件包括：温度为37℃-42℃，时间为3-10min。
8.根据权利要求6所述快速修复损伤DNA的方法，其特征在于，所述PCR扩增的条件包括：温度为37℃，时间为3min。
9.根据权利要求6所述快速修复损伤DNA的方法，其特征在于，所述损伤的DNA与所述的快速修复损伤DNA的试剂的用量比为100ng：90微升。
10.一种试剂盒，其特征在于包含权利要求1-4中任一项所述的快速修复损伤DNA的试剂。
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