CN107400705A

CN107400705A - 一种高通量的单细胞全基因组扩增方法

Info

Publication number: CN107400705A
Application number: CN201710250076.3A
Authority: CN
Inventors: 王磊; 李贵波
Original assignee: BGI Shenzhen Co Ltd
Current assignee: MGI Tech Co Ltd
Priority date: 2016-05-20
Filing date: 2017-04-17
Publication date: 2017-11-28

Abstract

本发明公开了一种高通量的单细胞全基因组扩增方法，包括：采用纳升级的微量分液平台将具有预定细胞密度的细胞悬液分配到纳升级的微孔芯片的每个微孔中；采用微量分液平台将细胞裂解液分配到微孔中以裂解微孔内的细胞；采用微量分液平台将中和液分配到微孔中以进行中和反应；采用微量分液平台将全基因组扩增试剂分配到微孔中以进行全基因组扩增反应。本发明的方法具有高通量、低成本、单细胞、一体化的特点，能够实现单细胞全基因组扩增的自动化和规模化。

Description

一种高通量的单细胞全基因组扩增方法

技术领域

本发明涉及单细胞全基因组扩增技术领域，尤其涉及一种高通量的单细胞全基因组扩增方法。

背景技术

研究表明，在胚胎发育、疾病发生与肿瘤发展等过程中，由于单个细胞的遗传物质个体化差异与异质性，导致极其重要甚至是决定性的后果，因此对单细胞的基因组进行测序研究是必要的。目前，单细胞的基因组测序已经成功地应用于各种微生物及哺乳动物细胞。

在单细胞研究工作中，扩大试验规模是确保采集足够多的生物多样性信息的关键。使用微流控芯片虽然可以将单个细胞分离，并进行样品扩增，但是通量不高。其它针对单细胞的方法均存在很多缺陷，导致检测灵敏度不高、基因表达信息丢失严重、技术噪音高、操作失误率高、重复性差，而且针对数以千计甚至万计的细胞数量时，实验费用又成为了最大的瓶颈，高昂的单细胞扩增的费用导致单细胞扩增仍然处于不成熟的阶段，在技术上和成本上还远没有达到大规模应用的地步。

目前，对单个细胞基因组DNA进行扩增应用最普遍、最简单的方法是多重置换扩增(multiple displacement amplification，MDA)技术，它利用随机引物和等温扩增可以获得大量高保真的DNA片段，但是该方法存在扩增偏倚及非特异扩增等问题。另外，其它发展的方法例如简并寡核苷酸引物聚合酶链反应(the degenerate oligonucleotide-primedpolymerase chain reaction，DOP-PCR)由于其基因覆盖率比较低，不能检测单个核苷酸的变异。基于多重退火和循环的扩增循环(multiple annealing and looping-basedamplification cycles，MALBAC)方法虽然能够抑制扩增偏倚，但是保真性较差，操作步骤相对复杂，不利于进行高通量的全基因组扩增(WGA)。

目前，商业化的单细胞WGA试剂盒不仅价格昂贵，试剂成分保密，而且反应体积都在几十微升(μL)左右，扩增产物存在偏倚。

发明内容

本发明提供一种高通量的单细胞全基因组扩增方法，具有高通量、低成本、单细胞、一体化的特点，能够实现单细胞全基因组扩增的自动化和规模化。

本发明的高通量的单细胞全基因组扩增方法，包括：采用纳升级的微量分液平台将具有预定细胞密度的细胞悬液分配到纳升级的微孔芯片的每个微孔中；采用上述微量分液平台将细胞裂解液分配到上述微孔中以裂解上述微孔内的细胞；采用上述微量分液平台将中和液分配到上述微孔中以进行中和反应；采用上述微量分液平台将全基因组扩增试剂分配到上述微孔中以进行全基因组扩增反应。

进一步地，上述全基因组扩增反应的同时采用荧光定量PCR仪辅助监测单细胞扩增情况。

进一步地，上述预定细胞密度是指2-4个细胞/微升。

进一步地，分配到上述微孔中的细胞悬液、细胞裂解液、中和液和全基因组扩增试剂的体积分别是35-50纳升、35-50纳升、35-50纳升和100-150纳升；优选地，分配到上述微孔中的细胞悬液、细胞裂解液、中和液和全基因组扩增试剂的体积分别是35纳升、35纳升、35纳升和100纳升。

进一步地，上述微孔芯片的每个微孔的容积为不小于250纳升。

进一步地，将上述细胞悬液、细胞裂解液、中和液和全基因组扩增试剂分配到上述微孔中后，通过离心去除气泡。

进一步地，上述荧光定量PCR仪辅助监测单细胞扩增情况中，以溶解曲线为单峰，同时Ct值介于阳性对照与阴性对照的数值之间，作为单细胞扩增产物的标志；其中上述阳性对照是总DNA，上述阴性对照是不含细胞的等渗溶液。

进一步地，上述方法还包括：去除最低和最高10％Ct值的样品。

进一步地，上述细胞裂解液包含200mM的KOH，100mM的DTT和5mM的EDTA；上述中和液包含333mM的Tris-HCl和125mM的HCl。

进一步地，上述方法还包括：吸取符合单细胞扩增产物的标志的样品，使用看家基因的引物进行PCR扩增检测，选择PCR扩增结果显示多条带的样品进行建库上机测序。

本发明的方法，以纳升级的微量分液平台为基础实现单细胞的分配，进而实现一系列的原位细胞裂解、中和反应和全基因组扩增反应等，而完成单细胞全基因组扩增，具有高通量、低成本、单细胞、一体化的特点，能够实现单细胞全基因组扩增的自动化和规模化。

附图说明

图1为本发明一个实施例中部分样品的WGA扩增溶解曲线，示出了荧光强度与循环数(Ct值)的关系，其中曲线P显示10pg DNA阳性对照，曲线N显示阴性对照及不含细胞的样品，其它曲线显示为单细胞WGA扩增样品；

图2为本发明一个实施例中的部分样品的看家基因(house-keeping gene)的PCR检测结果，其中M表示100bp ladder，P表示100ng DNA阳性对照，N表示阴性对照，其它泳道表示单细胞WGA扩增产物的PCR检测结果；

图3为本发明一个实施例中的部分单细胞样品经BGI-SEQ500测序仪低深度全基因组测序(WGS)与多个混合细胞WGS比较结果图；其中，WGS窗口数目20K，混合细胞由20个HelaS3细胞组成，经hiseq2000低深度测序。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。

本发明的高通量的单细胞全基因组扩增方法是基于微量分液平台实现的，因为要实现单细胞的分配，样品的微量化非常关键。目前，微量分液平台的分液能力已经实现了纳升级的突破，相比传统的微升级的微量分液平台，是质的飞跃。本发明正是以纳升级的微量分液平台为基础实现单细胞的分配，进而实现一系列的原位细胞裂解、中和反应和全基因组扩增反应等，而完成单细胞全基因组扩增。

相比现有技术而言，本发明的显著优势体现在高通量、低成本、单细胞和一体化。所谓高通量是指，相比现有技术尤其是基于微流控芯片的技术，本发明能够一次性获得大量的单细胞，已经证实单个芯片一次即可完成大于500个单细胞全基因组扩增。所谓低成本是指，由于本发明方法的简单易行及高通量的特点，而显著降低了每个单细胞全基因组扩增的平均成本。所谓一体化是指，单细胞分配完成以后的所有步骤都集成于一块芯片上进行。

可用于本发明中的纳升级的微量分液平台，例如Wafergen Biosystems公司的SmartChip^TM MultiSample NanoDispenser(MSND)，可以称作SmartChip^TM多样品纳升级分配器。

本发明中配合使用的微孔芯片是纳升级的微孔芯片，这对于单细胞的分离以及其后的各种反应的进行至关重要。可以采用的纳升级的微孔芯片，例如Wafergen Biosystems公司的SmartChip，可以定制成各种纳升级(例如225纳升、250纳升、300纳升、350纳升或500纳升等)的容量，可用于本发明的典型的微孔芯片的每个微孔具有250纳升的容积。

荧光定量PCR仪用于辅助监测单细胞全基因组扩增情况，根据扩增情况来判断单细胞微孔。可用于本发明的荧光定量PCR仪，例如Wafergen Biosystems公司的SmartChip^TMReal-Time PCR Cycler，可以称作SmartChip^TM实时PCR循环仪。

本发明的方法整合在单一芯片孔内一步连续完成微量细胞(单细胞、微生物)分离、细胞裂解、中和反应以及全基因组扩增反应等步骤，大约只需1天时间。使用本发明的方法，单个微孔芯片一次即可完成大于500个单细胞全基因组扩增。而且每个反应的试剂用量能够限制在纳升级，例如在本发明的一个实施例中，每个反应的试剂用量只有200纳升左右，大大减少了试剂用量，节省高昂的试剂费用。该方法同时有效减小了MDA扩增中产生的偏倚，实现了单细胞建库的自动化，规模化使得大规模单细胞WGA扩增、建库、测序成为可能。

在本发明中，控制细胞悬液的密度，对于高效率地将单细胞分配到微孔芯片的微孔中是比较关键的。发明人发现，在细胞均匀分布的情况下，当细胞密度小于等于4个/μL时，98％以上的微孔中细胞数是不多于1个。

在本发明的一个优选的实施例中，细胞密度为2-4个细胞/微升，如果细胞密度小于2个细胞/微升，可能有太多微孔中分配不到细胞，降低单细胞的有效分配率；当细胞密度大于4个细胞/微升，可能太多微孔中分配到不止一个细胞，也会相应地降低单细胞的有效分配率。

在本发明中，细胞悬液、细胞裂解液、中和液和全基因组扩增试剂均是通过纳升级的微量分液平台分配到微孔中的，经过大量的实验研究发现，几十纳升级别的用量能够取得较好的效果，比如分配到微孔中的细胞悬液、细胞裂解液、中和液和全基因组扩增试剂的体积分别是35-50纳升、35-50纳升、35-50纳升和100-150纳升。

在本发明的一个优选的实施例中，采用Wafergen Biosystems公司的MSND作为微量分液平台，其最低分液体积为35纳升，因此在该优选的实施例中，分配到微孔中的细胞悬液、细胞裂解液、中和液和全基因组扩增试剂的体积分别是35纳升、35纳升、35纳升和100纳升。同时，考虑到足够容纳所有反应试剂同时又能尽可能缩小微孔芯片上每个微孔的容积，我们将微孔芯片的每个微孔的容积定制为250纳升。本领域技术人员可以理解，在一定范围内调整微孔的容积，定制不同规格的微孔芯片对实现本发明也是可行的，例如微孔的容积不小于250纳升均可以，例如250纳升、300纳升、350纳升或500纳升等。我们分析，上述试剂的用量可以在几十纳升级别的用量范围内波动，然而太多或太少的试剂用量可能导致本发明的有效性降低，比如细胞悬液、细胞裂解液和中和液分别超过50纳升的用量可能不但单细胞分离效果不好，随后的各步反应试剂用量也会增大，从而提高了成本；还可能带来扩增产物存在偏移的问题。因此，本发明中，对于细胞悬液、细胞裂解液和中和液，不推荐50纳升以上的试剂用量。

由于本发明是对极微量的试剂进行分液操作，其中可能含有气泡，而气泡在极微量的试剂中可能难以除去，因此最好在将细胞悬液、细胞裂解液、中和液和全基因组扩增试剂分配到微孔中后，通过离心去除气泡。如果全基因组扩增反应完成以后，还进行其它反应，也最好通过离心去除气泡。

本发明采用荧光定量PCR仪辅助监测单细胞扩增情况。如果以总DNA作为阳性对照，以不含细胞的等渗溶液(即用于悬浮细胞以形成细胞悬液的缓冲液)作为阴性对照，典型的单细胞扩增产物的标志是，溶解曲线为单峰，同时Ct值介于阳性对照与阴性对照的数值之间。为了进一步提高单细胞选择的准确性，可以去除Ct值偏高或偏低的情况，例如去除最低和最高10％Ct值的样品。

本发明还专门研究了能够有效地用于本发明的方法中的细胞裂解液和相应的中和液，虽然本发明并不局限于在此公开的细胞裂解液和相应的中和液的具体成分和含量，然而发明人发现本发明所公开的细胞裂解液和相应的中和液具有良好的实验效果，因此，作为本发明的进一步改进的方案，本发明的细胞裂解液包含200mM的KOH，100mM的DTT和5mM的EDTA；中和液包含333mM的Tris-HCl和125mM的HCl。

虽然经过细胞裂解、中和反应和全基因组扩增反应以后，已经实现了单细胞全基因组扩增。但是，在实际应用中，通常还会进行后续检测。例如，在本发明的一个优选的实施例中，在全基因组扩增反应之后：吸取符合单细胞扩增产物的标志的样品，使用看家基因的引物进行PCR扩增检测，选择PCR扩增结果显示多条带的样品进行建库上机测序。

考虑到后续还可能进行混库(pooling)，即将不同单细胞全基因组扩增反应产物混合在一起。为了使混库之后的不同单细胞全基因组扩增反应产物能够区别开来，可以在全基因组扩增过程中，针对不同的微孔(即不同的单细胞)采用不同的引物对。在实际应用中，不同微孔中的两条引物只要其中一条序列不同即可。基于这样的思想，在本发明的一个优选实施方案中，引物对包括5’端引物和3’端引物，不同5’端引物之间的差别或不同3’端引物之间的差别仅在于各自具有一段专一性的标签序列，而其它部分的序列相同。具体地，标签序列可以是一段具有特定长度N(比如N为6-10的自然数，优选8)的随机序列。标签序列可以位于引物的各个位置，优选位于引物的中段位置。

经过上述全基因组扩增过程，不同的单细胞全基因组扩增产物的两端具有了不同的引物序列。为了实现高通量测序等操作需求，可以将不同单细胞全基因组扩增产物混合在一起。

综上所述，本发明基于纳升级的微量分液平台(例如，Wafergen Biosystems公司的SmartChip^TM MultiSample NanoDispenser(MSND))，以纳升级的微孔芯片(例如WafergenBiosystems公司的SmartChip)为容器，荧光定量PCR仪(例如Wafergen Biosystems公司的SmartChip^TM Real-Time PCR Cycler)辅助监测，选用合适的细胞密度以及细胞裂解液和中和液，在芯片微孔中实现纳升(nL)级微量细胞(单细胞、微生物)分离、细胞裂解、WGA扩增反应等所有步骤。利用本发明的系统，单个芯片一次即可完成大于500个单细胞的WGA扩增反应，每个反应DNA产物约50ng，可以应用于二代测序的文库构建。由于反应体积降至只有200纳升左右，比单管体积减少了200多倍，因此大大减小了扩增偏倚，而且试剂成本也降低了10倍以上。因此，本发明有效提高了单细胞水平的WGA扩增反应，节省了高昂的试剂费用，实现了单细胞和微生物WGA扩增的自动化、规模化，为高通量大规模的单细胞水平测序研究奠定了重要的技术基础。

以下通过实施例详细说明本发明的技术方案，需要说明的是，实施例用于说明本发明方法的可行性，不应当理解为对本发明保护范围的限制。

本实施例包括单细胞制备、单细胞裂解、中和反应和全基因组扩增反应等一系列步骤。试剂加样操作按照Wafergen Biosystems公司相关仪器说明进行操作。

1.使用Hela S3细胞系进行单细胞WGA扩增，使用胰酶对贴壁型Hela细胞进行消化。将Percoll原液与10×PBS按体积比9:1混合成细胞的等渗溶液。将1×PBS清洗的单细胞群加入配置的20％的等渗溶液中，细胞密度调节至4个/μL，混合均匀，完成细胞样品制备。使用10pg总DNA作为阳性对照，20％的等渗溶液作为阴性对照。MSND平台进行加样，芯片中每孔加样35nL。

2.细胞裂解及中和

2.1裂解液及中和液配置

裂解液包含200mM KOH，100mM DTT，5mM EDTA。中和液包含333mM Tris-HCl，125mMHCl。

2.2细胞裂解

使用MSND平台进行加样，芯片中每孔加样35nL裂解液；2600rcf，12℃离心5min；65℃反应10min。

2.3中和反应

使用MSND平台进行加样，芯片中每孔加样35nL中和液。2600rcf，12℃离心5min。

3.WGA反应

3.1试剂配置

按下表1配置反应液，加入对应的384孔中。

表1 WGA反应液

3.2 WGA反应

使用MSND平台进行加样，芯片中每孔加样100nL。2600rcf，12℃离心5min。置于荧光定量PCR仪(SmartChip^TM Real-Time PCR Cycler，WafergenBiosystems)中，37℃反应5h，每10min设置拍照一次，对应显示Ct值为1。

图1示出了本实施例中部分样品的WGA扩增溶解曲线，示出了荧光强度与循环数(Ct值)的关系，其中曲线P显示10pg DNA阳性对照，曲线N显示阴性对照及不含细胞的样品，其它曲线显示为单细胞WGA扩增样品。

结果显示，以总DNA作为阳性对照，以不含细胞的等渗溶液(即用于悬浮细胞以形成细胞悬液的缓冲液)作为阴性对照，显示出多个单细胞扩增产物，其溶解曲线为单峰，Ct值介于阳性对照与阴性对照的数值之间。

4.使用直径小于200μm的玻璃针或者特定的吸量仪吸取，使用人看家基因(house-keeping gene)引物进行PCR扩增检测。

a)多重PCR反应(Multiplex PCR)，引物配成工作液浓度(10μM)后按如下(表2)比例配制引物混合物(Primer Mix)：

表2

b)配置PCR体系(表3)：

表3

配置完成后，按照下述条件(表4)进行扩增：

表4

c)电泳检测

PCR完成后电泳检测，采用2％琼脂糖凝胶，取10μL产物，120V电泳1小时。

图2示出了本实施例中的部分样品的看家基因的PCR检测结果，其中M表示100bpladder，P表示100ng DNA阳性对照，N表示阴性对照，其它泳道表示单细胞WGA扩增产物的PCR检测结果。

结果显示，代表单细胞WGA扩增产物的泳道均显示多条带，表明WGA扩增较好，可以进行建库上机测序。如果扩增条带少于3条，则表明该孔扩增效果较差，偏向性较大，不适于上机测序。

5.将检测结果较好的产物，进行建库，高通量测序仪测序。

图3示出了实施例中的部分单细胞样品经BGI-SEQ500测序仪低深度全基因组测序(WGS)与多个混合细胞WGS比较结果图。结果表明，该本实施例检测的单细胞CNV与混合细胞检测的CNV高度一致(例如4号染色体、15号染色体)，同时也体现了单个细胞存在异质性。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳华大基因研究院

<120> 一种高通量的单细胞全基因组扩增方法

<130> 16P23015-A22348

<160> 17

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 8

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(8)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 1

nnnnnnnn 8

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggcaacgctt agactctgtg tg 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctgcccttgg cctaactaac ct 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gttcctcaag aagctgcacg ag 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cgttagactc tggatctggc gt 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ccagccaatt catgagtcgg tg 22

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cctgacaact cgcaagtagc ac 22

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gctcaatggg gtacttcagg gt 22

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gtggacgtta cgtaaaaggc cc 22

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tgctctggat gtgaagatgc ca 22

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ttccaggtaa atccagccca gg 22

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cagccagtca gcatcatcca ac 22

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gaaagccgga ttgcggtaac at 22

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ggatagctct gcaaggggag ag 22

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

tcgtcgcagt agaaatacgg ct 22

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

agaagtcagg cacgtagctc ag 22

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ggcacgttgg tgtttacgat ga 22

Claims

1.一种高通量的单细胞全基因组扩增方法，其特征在于，所述方法包括：

采用纳升级的微量分液平台将具有预定细胞密度的细胞悬液分配到纳升级的微孔芯片的每个微孔中；

采用所述微量分液平台将细胞裂解液分配到所述微孔中以裂解所述微孔内的细胞；

采用所述微量分液平台将中和液分配到所述微孔中以进行中和反应；

采用所述微量分液平台将全基因组扩增试剂分配到所述微孔中以进行全基因组扩增反应。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述全基因组扩增反应的同时采用荧光定量PCR仪辅助监测单细胞扩增情况。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预定细胞密度是指2-4个细胞/微升。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，分配到所述微孔中的细胞悬液、细胞裂解液、中和液和全基因组扩增试剂的体积分别是35-50纳升、35-50纳升、35-50纳升和100-150纳升；

优选地，分配到所述微孔中的细胞悬液、细胞裂解液、中和液和全基因组扩增试剂的体积分别是35纳升、35纳升、35纳升和100纳升。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述微孔芯片的每个微孔的容积为不小于250纳升。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述细胞悬液、细胞裂解液、中和液和全基因组扩增试剂分配到所述微孔中后，通过离心去除气泡。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR仪辅助监测单细胞扩增情况中，以溶解曲线为单峰，同时Ct值介于阳性对照与阴性对照的数值之间，作为单细胞扩增产物的标志；其中所述阳性对照是总DNA，所述阴性对照是不含细胞的等渗溶液。

8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：去除最低和最高10% Ct值的样品。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞裂解液包含200mM的KOH，100mM的DTT和5mM的EDTA；所述中和液包含333mM的Tris-HCl和125mM的HCl。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：吸取符合单细胞扩增产物的标志的样品，使用看家基因的引物进行PCR扩增检测，选择PCR扩增结果显示多条带的样品进行建库上机测序。