CN108315389B - 一种微体积细胞核酸扩增方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种微体积细胞核酸扩增方法，包括：a)包裹少量细胞的微液滴加入到预先加载油相的小型容器中，并离心使其沉降；b)细胞裂解液液滴通过油相液面以下微体积注射加入到小型容器中,并离心使其沉降与细胞液滴融合，实现细胞的裂解和核酸物质的释放；c)裂解中止液液滴通过微体积注射加入，并离心使其与裂解后细胞液滴融合，对裂解反应进行中和或终止；d)一种或一种以上扩增反应液通过微体积注射加入，并离心融合，在适当温度下，对基因组、转录组或特定核酸序列进行扩增。本发明提供的细胞核酸扩增方法操作简单、成本低、通量高，反应体积可缩小至纳升级别。

Description

一种微体积细胞核酸扩增方法

技术领域

本发明涉及微量液体生化反应和分析领域，具体涉及一种基于纳升微液滴操作的细胞核酸扩增技术领域。

背景技术

细胞是地球生命活动的基本单元。核酸广泛存在于所有动植物细胞、微生物细胞内。不同的核酸，其化学组成、核苷酸排列顺序等不同。根据化学组成不同，核酸可分为核糖核酸(简称RNA)和脱氧核糖核酸(简称DNA)。DNA是储存、复制和传递遗传信息的主要物质基础，而RNA在蛋白质合成过程中起着重要作用。单细胞的核酸扩增技术是在单细胞水平对全基因组或转录组等核酸分子进行扩增与测序的一项新技术。其原理是以分离的单个细胞的微量DNA或RNA为模板进行扩增，从而获得大量核酸物质用于后续序列和功能的分析(Gawad,C.,W.Koh and S.R.Quake,Single-cell genome sequencing:current state ofthe science.Nat Rev Genet,2016.17(3):p.175-188)。单细胞测序能够解析用组织样本测序无法揭示的细胞异质性，为深入理解单细胞行为、机制及其与机体的关系等提供了新的视角。此外，单细胞测序对于未培养微生物功能和基因资源挖掘，临床胚胎植入前筛查，干细胞与细胞分化机制等方面均具有巨大的意义。

现有的单细胞核酸扩增技术主要有两种，一种是将分离的单细胞在微升体积水平进行扩增反应(Spits,C.,et al.,Whole-genome multiple displacement amplificationfrom single cells.Nat Protoc,2006.1(4):p.1965-1970)。在微升体积水平对单细胞进行全基因组扩增反应，容易出现大量非特异扩增产物(de Bourcy,C.F.,et al.,Aquantitative comparison of single-cell whole genome amplificationmethods.PLoS One,2014.9(8):e105585)，而进行普通PCR扩增会由于模板量太低而导致扩增失败，且利用这种方式会消耗较多试剂，成本较高，通量较低。

另一种是利用微流控芯片装置，在微小的流体管路中对单细胞进行裂解扩增等过程(de Bourcy,C.F.,et al.,A quantitative comparison of single-cell wholegenome amplification methods.PLoS One,2014.9(8):e105585)。反应体积在几十至几百纳升级别，但是装置比较复杂，需要不同的压力源驱动，且需要受过一定培训的实验人员才能操作，而芯片的加工也较为复杂、成本较高、通量低，不适合普及推广。

总之，现有技术操作复杂、成本较高、通量低，不能够得到普及。

发明内容

为了解决现有技术的缺陷，本发明提供了一种基于微液滴的细胞核酸扩增方法，本发明提供的细胞核酸扩增方法操作简单、成本较低且通量较高，反应体积缩小至纳升级别，成本降低至原先的百分之一以下，能有效降低非特异扩增，提高单细胞模板浓度。

本发明的一种微体积细胞核酸扩增方法，包括以下步骤：

a)准备一个小型容器，里面预先加入油相。

优选的，小型容器底部为U型或V型，以保证沉落的液滴可以依靠重力作用，定位至管底部中央位置。容器可以是单个小型容器，如单个离心管，也可以是多个小型容器连在一起，如8联管等，还可以是96孔板、384孔板等多孔板。

优选为384孔板，其通量高且与实时荧光PCR仪器匹配，可进行扩增过程的实时监控。

容器中预先装载油相，可以是矿物油、液态烷烃、酯类、硅油等与水相互不相溶且比重小于水的液体，优选为矿物油，其生物兼容性好，耐高温、成本低。

b)利用任何一种单细胞分离提取技术，将少量细胞以纳升液滴包裹的形式加载到小型容器中，被油相覆盖，放置在a)中所述小型容器的油相中，使之沉于容器底部。

细胞可以是动物、植物、微生物等细胞，优选为活细胞并处理细胞悬液状态。

细胞数量是单细胞，多个细胞，或细胞团聚体。

单细胞分离提取技术可以使用目前采用的方法，包括显微切割、微量吸取、梯度稀释、流式分选、光镊、微流控芯片分选等。

优选为流式分选法，该方法通量高，速度快，且与多孔板小型容器匹配。

c)以微体积注射的方法，将细胞裂解液通过插入小型容器中油相表面以下的第一微管道加入小型容器中，被油相覆盖，并与细胞液滴融合，在一定温度、时间等条件下裂解细胞，释放核酸物质。

微管道可以是特氟龙软管、毛细管、移液器吸头、玻璃管等，优选为特氟龙软管，内径为30-300μm。

微体积注射的驱动装置优选为微量注射泵驱动的注射器，能够精确控制加注液体的量与速度。加注液滴精度在1nL-1μL。

细胞裂解液根据细胞类型不同，可以采用不同配方，如强酸、强碱、表面活性剂、低渗溶液、含有蛋白酶、溶菌酶等。

优选为强碱溶液。

使细胞裂解的方法需要根据细胞类型不同，选择不同的温度、时间、方法等条件，可以选用的裂解方式有:物理法、化学法、生物法等。

优选为高温裂解法。

d)以微体积注射的方法，将裂解中止液通过第二微管道加载到小型容器中，被油相覆盖，并步骤c)的液滴融合，实现细胞裂解步骤的中和或终止；

反应中止液或中止方法需要根据步骤c)中采用的细胞裂解方法进行选择和搭配，原则上使细胞裂解过程中止并且不影响后续扩增过程。

优选为酸性溶液，使步骤c)中的裂解液得到中和，pH呈中性，避免释放的核酸物质在强碱性溶液中暴露时间过长而被破坏。

e)以步骤c)所述的微体积注射的方法，将一种或多种不同的扩增反应液分别通过第三或第四微管道等，分别注入到小型容器中，被油相覆盖，并与前一步骤的液滴融合，在一定温度和时间条件下，实现少量细胞微体积核酸扩增。

扩增反应液可以是全基因组扩增反应液，根据不同全基因组扩增方案采用相应试剂，如多重置换扩增(Multiple Displacement Amplification，MDA)，退化寡核苷酸引物PCR(Degenerate Oligonucleotide Primed PCR，DOC-PCR)，多次退火环状循环扩增(Multiple Annealing and Looping-Based Amplification Cycles，MALBAC)等；反应扩增液也可以是普通PCR反应液或其它恒温扩增反应液，如环介导核酸等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，滚环扩增技术(rolling circle DNAamplification，RCA)等。

优选为MDA全基因组扩增，反应液体积可以为200-500nL。

反应优选为在实时荧光PCR仪中对扩增反应进行实时荧光监测，扩增反应时间为1-16小时。

f)反应产物可以用于后续实验。

反应产物为经扩增之后的核酸物质，后续对其进行的实验包括产物的纯化、鉴定、核酸扩增、建库测序等。

纯化是对扩增产物中的引物、短片段、酶、缓冲液等进行去除，提高扩增产物纯度。

鉴定是对扩增产物进行质量检测，可以进行凝胶电泳，也可以用相关分析仪器对其质量和浓度进行测定。

核酸扩增是指以扩增产物为模板，进行第二次核酸扩增，可以是全基因组扩增，也可以是由特异引物引导的靶基因特异扩增。

建库测序是对扩增产物进行核酸序列分析，获取核酸信息。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1单细胞扩增流程示意图。

图2注射1至100纳升体积的微液滴图。

图3两个纳升体积微液滴融合效果图。

图4总反应体积为360nL MDA反应扩增曲线及阴性对照扩增曲线。

图1中：

1为石英毛细管，2为小型容器，3为矿物油，4为微液滴包裹细胞裂解液，5为包裹单细胞的微液滴，6为注入的细胞裂解液，7为注入的终止液，8为微液滴包裹终止液，9为4、5两个微液滴相遇后形成的融合微液滴，10为注入的扩增反应液，11为微液滴包裹扩增反应液，12为8、9两个微液滴相遇后形成的融合微液滴，13为11、12两个微液滴相遇后形成的融合微液滴。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，不能将它们理解为对本申请保护范围的限定。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

图1中，石英毛细管1的内径为50微米、外径为150微米、长度为5厘米。石英毛细管1的上端通过特氟龙(Teflon)细管(内径为300微米，外径为600微米)与注射泵(HarvardApparatus,Pico Elite，未在图1中示出)连接，连接的缝隙用蜡封闭，保证气密性。所述注射泵上配备一支体积为10微升的注射器。在使用之前，将注射器充满矿物油、特氟龙细管和石英毛细管1充满细胞裂解液，并检查液体流路无泄漏。小型容器2为U型底96孔板中的一个离心管，最大容量为200微升，矿物油3的体积为40微升，离心管底部预先装有2纳升体积的微液滴5，液滴内包裹待分析的单细胞。

将石英毛细管1垂直插入矿物油3液面以下5毫米并保持静止，用注射泵注射30纳升裂解液，注射完毕后关闭注射泵，此时在矿物油液面以下5毫米，毛细管出口形成了一个微液滴，其体积为30纳升。然后，将毛细管垂直向上拔出液面，当毛细管脱离矿物油液面时，由于表面张力作用，毛细管口的液滴脱离毛细管，留在矿物油中，形成微液滴4包裹细胞裂解液。由于液滴比矿物油重，液滴沉入容器底部与微液滴5相遇并融合成微液滴9，两个微液滴的内容物混合，单细胞遇到细胞裂解液而发生裂解，释放核酸。为避免交叉污染，换一根新的特氟龙管和石英毛细管，使其充满终止液，重复以上过程，加注终止液7，生成微液滴8。微液滴8沉入容器底部与微液滴9相遇并融合成微液滴12，两个微液滴的内容物混合，细胞裂解液被终止液中和而使细胞裂解过程终止。

为避免交叉污染，换一根新的特氟龙管和石英毛细管，使其充满扩增反应液，重复以上过程，加注扩增反应液10，生成微液滴11。微液滴11沉入容器底部与微液滴12相遇并融合成微液滴13，两个微液滴的内容物混合，给定相应反应条件，释放的核酸在扩增反应液中得到扩增。

实施例2

为了展示本发明所采用的微量注射的精确性，我们测试了使用微量注射泵向油相中注射1至100纳升体积水相液滴的可靠性。如图2，按照实施例1的微量注射加注方法，在预先填装矿物油的小型容器的底部，获得le不同纳升级别体积的微液滴。1为1纳升，2为5纳升，3为10纳升，4为20纳升，5为50纳升，6为100纳升。相应地，注射泵的流速为1纳升/秒，5纳升/秒，10纳升/秒，20纳升/秒，50纳升/秒，100纳升/秒。标尺为200微米。

实施例3

为了展示本发明所采用的离心微液滴融合的可靠性，如图3，按照实施例1的微液滴加注方法，在同一个容器底部分别依次生成两个5纳升的微液滴。微液滴1内容物为0.1MFeCl₃溶液，微液滴2内容物为0.1M KSCN溶液，两个微液滴相遇并融合形成微液滴3，内容物混合，两种溶液发生反应生成红棕色Fe(SCN)₃溶液。标尺为200微米。

实施例4

按照实施例1的单细胞核酸扩增流程，预先用流式细胞仪分选单个SulfolobusA20细胞至96孔板的孔中，其中有12个孔中不加入细胞做为阴性对照，其余所有的孔均为单细胞微液滴。孔中装有40微升矿物油，包裹单细胞的微液滴沉入管底。先用MDA全基因组扩增方法，按照实施例1的液滴加注方法将30纳升包裹有细胞裂解液的微液滴加入到每一个孔中，微液滴沉入管底与单细胞微液滴相遇并融合，将96孔板置于65℃金属浴中加热10分钟，使单细胞充分裂解释放核酸。随后，按照实施例1的液滴加注方法将30纳升包裹有终止液的微液滴加入到每一个孔中，微液滴沉入管底与先前的微液滴相遇并融合，终止裂解反应。最后，按照实施例1的液滴加注方法将300纳升包裹有MDA扩增反应液的微液滴加入到每一个孔中，扩增反应液中加入1×SYBR Green荧光染料，微液滴沉入管底与先前的微液滴相遇并融合，使先前释放的核酸与扩增反应液充分混合。将96孔板放在实时荧光定量PCR仪中，设置37℃孵育10小时，每10分钟为一个循环，采集一次荧光信号。如图4，1为单细胞组的其中三条扩增曲线，2为阴性对照组的其中三条扩增曲线。单细胞组扩增曲线出峰早，约为1.5小时，而阴性对照组只有一条非特异扩增曲线，且曲线出峰时间晚，约为5小时，且单细胞组扩增曲线荧光强度高于阴性对照组。这说明该方法进行单细胞全基因组扩增可行且能有效区分和控制非特异扩增。

实施例5

按照实施例1的单细胞核酸扩增流程和实施例4的单细胞MDA全基因组扩增流程，对大肠杆菌E.Coli K12的两个单细胞进行全基因组扩增。流程与实施例4一致，区别在于用大肠杆菌E.Coli K12细胞替换了Sulfolobus A20细胞，选取两个细胞的扩增产物进行测序。测序结果分析，覆盖率能达到90％以上，说明该方法能够有效获取微生物单细胞的基因组信息。测序结果：

由以上实施例可知，本申请基于微液滴对单细胞进行核酸扩增，用于后续实验和分析。本申请提供的单细胞核酸扩增方法具有简单易行、低成本、通量高、效果较好等优点，具有广阔的应用前景。

Claims (11)

1.一种微体积细胞核酸扩增方法，其特征在，包括以下步骤：

(a)小型容器中加入油相；

(b)将少量细胞以纳升液滴包裹的形式加载到小型容器中，被油相覆盖；

(c)以微体积注射方法，将细胞裂解液通过插入小型容器中油相表面以下的第一微管道注入小型容器中，被油相覆盖，并与细胞液滴离心融合，在一定温度和时间条件下，实现少量细胞的裂解，所述的微体积注射方法，采用一端开口的微管道，管道内充满被注射液体，通过注射泵从位于油相液面以下的微管道管口推出微量液体，再提升微管道管口脱离油相液面，使推出的微量液体以油包水的形式留在油相中；

(d)以步骤c中所述的微体积注射方法，将裂解中止液通过第二微管道注入小型容器中，被油相覆盖，并与所述步骤c的液滴离心融合，在一定温度和时间条件下，实现细胞裂解步骤的中和或终止；

(e)以步骤c所述的微体积注射方法，将一种或多种不同的扩增反应液分别通过第三或第四微管道，分别注入到小型容器中，被油相覆盖，并与前一步骤的液滴离心融合，在一定温度和时间条件下，实现少量细胞微体积核酸扩增。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的液滴融合，在小型容器内借助离心机的离心作用，使液滴沉降并汇集在小型容器的底部并发生融合反应。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的微管道是内径为30-300微米的特氟龙软管、毛细管、微量移液器吸头或玻璃管。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的微体积注射是指裂解液、中和液、扩增液中至少有一种溶液的注射体积在1纳升至500纳升的体积范围。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的将少量细胞以纳升液滴包裹的形式加载到小型容器中，包括：

用微管道进行细胞悬液的微体积注射；

或用流式细胞仪的分选功能生成直接定向落入小型容器的包裹细胞的微液滴；

或用喷墨打印的方法生成直接落入小型容器的包裹细胞的微液滴；

或用微流控芯片生成油包水液滴；

或用显微注射方法注入包裹细胞液滴。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的少量细胞微体积核酸扩增包括全基因组扩增、转录组扩增、外显子扩增、PCR扩增、等温核酸扩增及其组合。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的全基因组扩增反应包括多重置换扩增反应、退化寡核苷酸引物PCR扩增反应、多次退火环状循环扩增反应。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞裂解液为强酸溶液、强碱溶液、表面活性剂溶液、低渗溶液、蛋白酶溶液或溶菌酶溶液。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的少量细胞是单细胞、多个离散细胞或多细胞团聚体。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的小型容器为离心管，或8联管，或96孔、384孔的PCR板，其底部为U型或V型。

11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的油相，其比重低于水溶液，包括矿物油、液态烷烃、酯类或硅油及其组合。

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