CN116694736A - 一种多重置换扩增反应液、扩增方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种多重置换扩增反应液、扩增方法及试剂盒，所述反应液的制备原料包括：10X DNA扩增缓冲液、引物、2.5mM脱氧核糖核苷酸三磷酸、扩增酶、胎牛血清、灭菌水、扩增用核酸染料，针对目前液滴内调节全基因组扩增方法操作复杂、检测浓度有下限、对单微生物包裹率不明确等问题，本发明采用生物酶及染料共同扩增的方法，研发了一套操作简洁、成本低的观察单个微生物扩增后DNA浓度的技术，其扩增效率高、原料易得、便于操作。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种多重置换扩增反应液、扩增方法及试剂盒。
背景技术
全基因组扩增技术是一种对全基因组序列进行非选择性扩增的技术，可扩增单细胞的全基因组，且扩增无序列偏差。多重置换扩增(MDA)是近几年发展的一种全基因组扩增方式，该方法扩增方式为链取代等温扩增，主要使用高保真且链置换能力强的DNA聚合酶及引物N6。相对如DOP-PCR等其他的扩增方式，MDA扩增具有基因覆盖率高、扩增产物用途广泛、扩增均匀性高等优势，是一种良好的扩增手段。
微流控是利用微纳米级别尺度的管道来操作流体的一种方式，利用微流控技术可精准控制液滴并实现液滴间融合。微流控技术目前已应用于航空、材料、微机电、化学、物理、生物、医学等领域，其芯片具有体积小，易于携带等优势，因此受到各领域的青睐。
微生物裂解后对微生物全基因组扩增是获取微生物丰富遗传信息的重要步骤。在液滴内进行微生物全基因组扩增，可获得单个微生物的遗传信息，而合适的全基因组扩增浓度可以大大提高工作效率，节约成本，目前DNA检测方法主要为Qubit和qPCR法，这两种方法均无法直接在液滴中检测DNA扩增情况，此外，Qubit检测浓度存在下限，对微生物具体单包率不明确；qPCR检测操作复杂，需设计相应引物探针，及专用设备且qPCR实验操作要求高，对实验操作人员有一定技术要求。因此，开发一款易于操作、成本低的检测方法十分具有应用前景。
发明内容
本发明采用生物酶及染料共同扩增的方法，研发了一套操作简洁、成本低的观察单个微生物扩增后DNA浓度的技术。
本发明的第一个方面提供了一种多重置换扩增反应液，所述反应液的制备原料包括：10X DNA扩增缓冲液、引物、2.5mM脱氧核糖核苷酸三磷酸、扩增酶、胎牛血清、灭菌水、扩增用核酸染料。
在一些实施方式中，所述引物的序列为NNNNNN。
在一些实施方式中，按重量份，所述反应液的制备原料包括：10X DNA扩增缓冲液10-20份、引物1-4份、2.5mM脱氧核糖核苷酸三磷酸1-5份、扩增酶5-10份、胎牛血清1-5份、灭菌水50-80份、扩增用核酸染料5-10份。
在一些实施方式中，所述扩增酶包括phi29 DNA聚合酶、kod聚合酶、DNA聚合酶i、T7 DNA聚合酶、taq DNA聚合酶、T4DNA聚合酶、9°n聚合酶、pfuDNA聚合酶和bsmDNA聚合酶中的至少一种。
进一步地，所述扩增酶为phi29 DNA聚合酶。
申请人发现，相较其他酶来说，phi29 DNA聚合酶的扩增效果更好，这可能是因为phi29 DNA聚合酶具有连续合成能力及优越置换活性，更适合等温扩增。
进一步地，所述反应液的制备方法包括：将制备原料混匀即得。
本发明的第二个方面提供了一种多重置换扩增反应方法，所述方法包括如下步骤：
S1.将反应液与裂解液融合，形成新液滴；
S2.将新液滴通过PCR反应程序进行微生物全基因组扩增；
S3.扩增效果检测。
在一些实施方式中，所述反应液与裂解液的质量比为1：(1-1.5)。
在一些实施方式中，所述反应液的浓度为25-100wt％，溶剂为水。
在一些实施方式中，所述反应液与裂解液融合的方法为微流控电压调节法，具体包括：通过外部施加电场使液滴表面电荷发生改变，让相互靠近的两个液滴达到融合效果。
在一些实施方式中，所述扩增后的DNA浓度为扩增前DNA浓度的7-95倍。
本发明的第三个方面提供了一种液滴内的浓度调节方法，所述调节方法包括将多重置换扩增反应液滴加在液滴内。
现有技术中一般是通过调节添加反应液中的dNTP和N6的量实现调节，在试剂中添加EvaGreen荧光染料，通过荧光显微镜观察扩增后液滴亮度，亮度越亮，代表扩增后DNA浓度越高。
本发明的第四个方面提供了一种用于多重置换扩增的试剂盒，所述试剂盒包括多重置换扩增反应液。
本发明的第五个方面提供了所述的多重置换扩增反应方法或所述的试剂盒在微生物全基因组扩增浓度调节中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.针对目前液滴内调节全基因组扩增方法操作复杂、检测浓度有下限、对单微生物包裹率不明确等问题，本发明采用生物酶及染料共同扩增的方法，研发了一套操作简洁、成本低的观察单个微生物扩增后DNA浓度的技术，其扩增效率高、原料易得、便于操作。
2.本发明采用等温扩增法，相较于现有技术，不需要多次升降温，在扩增过程中液滴稳定性更加好(图9-10所示)。
3.相比于现有技术，本发明实现了在液滴内进行调节浓度的操作，通过微流控系统制备MDA试剂，同时通过电压调节，将MDA试剂与裂解融合，形成一个既有裂解DNA、又有MDA试剂的新液滴，该操作方法简单易操作，具有较高的推广价值和应用前景。
附图说明
图1为本发明微生物的扩增方法的流程图；
图2为本发明的技术路线图；
图3为实施例1中增前荧光图；
图4为实施例1中扩增后荧光图；
图5为实施例1中25％扩增后2100峰图；
图6为实施例1中100％扩增2100峰图；
图7为实施例2中扩增前荧光图；
图8为实施例2中扩增后荧光图；
图9为实施例1中扩增前电镜图；
图10为实施例1中扩增后电镜图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例第一个方面提供了多重置换扩增反应液，按重量份，制备原料见下表。
| 原料名称 | 来源 | 重量份 |
| 10X DNA扩增缓冲液 | Lucigen | 16 |
| 引物 | Thermofisher | 1.25 |
| 2.5mM脱氧核糖核苷酸三磷酸 | Thermofisher | 2 |
| phi29 DNA聚合酶 | Lucigen | 8 |
| 胎牛血清(20mg/mL) | Thermofisher | 2 |
| 灭菌水 | Thermofisher | 62.75 |
| 扩增用核酸染料 | Biotium | 8 |
所述引物的序列为NNNNNN。
所述反应液的制备方法包括：将制备原料按重量份混匀，即得。
本实施例第二个方面提供了一种多重置换扩增反应方法，所述方法包括如下步骤：
S1.将反应液与裂解液融合，形成新液滴；所述反应液与裂解液的质量比为1：1.5，融合的方法包括：通过外部施加电场使液滴表面电荷发生改变，让相互靠近的两个液滴达到融合效果；
S2.将新液滴通过PCR反应程序进行微生物全基因组扩增；反应程序为30℃，4-8h；65℃，10min，4℃，+∞；
S3.扩增效果检测。
所述反应液的浓度分别为25wt％和100wt％。
Qubit浓度检测结果
扩增效果参见图3-图6，由图可知扩增后液滴亮度变亮，浓度上升。
实施例2
本实施例第一个方面提供了多重置换扩增反应液，按重量份，制备原料见下表。
所述引物的序列为NNNNNN。
所述反应液的制备方法同实施例1。
本实施例第二个方面提供了一种多重置换扩增反应方法，所述方法包括如下步骤：
S1.将反应液与裂解液融合，形成新液滴；所述反应液与裂解液的质量比为1：1，融合的方法包括：通过外部施加电场使液滴表面电荷发生改变，让相互靠近的两个液滴达到融合效果；
S2.将新液滴通过PCR反应程序进行微生物全基因组扩增；反应程序为30℃，4-8h；65℃，10min，4℃，+∞；
S3.扩增效果检测。
所述反应液的浓度分别为25wt％和100wt％。
Qubit浓度检测结果
| 扩增前浓度 | 25％多重置换扩增反应试剂扩增后浓度 | 100％多重置换扩增反应试剂扩增后浓度 |
| 0.12ng/uL | 1.12ng/uL | 4.14ng/uL |
扩增效果参见图7-8，由图可知100％扩增后液滴亮度变高。
对比例1
一种多重置换扩增反应方法，具体实施方式同实施例1，不同之处在于，按重量份，制备原料见下表。
| 原料名称 | 来源 | 重量份 |
| 10X DNA扩增缓冲液 | Lucigen | 16 |
| 引物 | Thermofisher | 7.25 |
| 2.5mM脱氧核糖核苷酸三磷酸 | Thermofisher | 8 |
| kod聚合酶 | Lucigen | 8 |
| 胎牛血清(20mg/mL) | Thermofisher | 2 |
| 灭菌水 | Thermofisher | 50.75 |
| 扩增用核酸染料 | Biotium | 8 |
Qubit浓度检测结果
| 扩增前浓度 | 25％多重置换扩增反应试剂扩增后浓度 | 100％多重置换扩增反应试剂扩增后浓度 |
| 0.13ng/uL | 0.22ng/uL | 0.45ng/uL |
对比例2
一种多重置换扩增反应方法，具体实施方式同实施例1，不同之处在于，所述反应液与裂解液的质量比为1：0.8。
Qubit浓度检测结果
| 扩增前浓度 | 25％多重置换扩增反应试剂扩增后浓度 | 100％多重置换扩增反应试剂扩增后浓度 |
| 0.17ng/uL | 0.87ng/uL | 3.22ng/uL |
对比例3
一种多重置换扩增反应方法，具体实施方式同实施例1，不同之处在于，所述反应液的浓度为15wt％。
Qubit浓度检测结果
| 扩增前浓度 | 15％多重置换扩增反应试剂扩增后浓度 |
| 0.14ng/uL | 0.64ng/uL |
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种多重置换扩增反应液，其特征在于，所述反应液的制备原料包括：10XDNA扩增缓冲液、引物、2.5mM脱氧核糖核苷酸三磷酸、扩增酶、胎牛血清、灭菌水、扩增用核酸染料。
2.根据权利要求1所述的多重置换扩增反应液，其特征在于，按重量份，所述反应液的制备原料包括：10X DNA扩增缓冲液10-20份、引物1-4份、2.5mM脱氧核糖核苷酸三磷酸1-5份、扩增酶5-10份、胎牛血清1-5份、灭菌水50-80份、扩增用核酸染料5-10份。
3.根据权利要求2所述的多重置换扩增反应液，其特征在于，所述扩增酶包括phi29DNA聚合酶、kod聚合酶、DNA聚合酶i、T7 DNA聚合酶、taq DNA聚合酶、T4DNA聚合酶、9°n聚合酶、pfuDNA聚合酶和bsmDNA聚合酶中的至少一种。
4.一种多重置换扩增反应方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1.将权利要求1-3任一项所述的反应液与裂解液融合，形成新液滴；
S2.将新液滴通过PCR反应程序进行微生物全基因组扩增；
S3.扩增效果检测。
5.根据权利要求4所述的多重置换扩增反应方法，其特征在于，所述反应液与裂解液的质量比为1：(1-1.5)。
6.根据权利要求4所述的多重置换扩增反应方法，其特征在于，所述反应液的浓度为25-100wt％。
7.根据权利要求4所述的多重置换扩增反应方法，其特征在于，所述扩增后的DNA浓度为扩增前DNA浓度的7-95倍。
8.一种液滴内的浓度调节方法，其特征在于，所述调节方法包括将权利要求1-3任一项所述的多重置换扩增反应液滴加在液滴内。
9.一种用于多重置换扩增的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1-3任一项所述的多重置换扩增反应液。
10.根据权利要求4所述的多重置换扩增反应方法或根据权利要求9所述的试剂盒在微生物全基因组扩增浓度调节中的应用。
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