CN105695577B - 微量DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种微量DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法，包括步骤：1)将DNA样品进行亚硫酸盐处理；2)将步骤1)中获取的处理样品加入到含有引物A的PCR体系中进行线性扩增；3)向步骤2)中的PCR产物中加入具有单链DNA剪切活性的核酸外切酶，反应后使核酸外切酶失活；4)将步骤3)中的产物加入到含有引物B的PCR体系中进行线性扩增；5)将步骤4)中的产物加入含有相应接头引物C和接头引物D的PCR体系中进行扩增；6)将步骤5)中的PCR产物进行纯化获得具有特异长度的DNA文库，并进行测序。本发明采用多步PCR的方法直接富集微量DNA序列中甲基化CpG岛序列对待测目的片段进行高通量测序效率极高。

Description

微量DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法
技术领域
本发明涉及一种微量DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法，属于基因测序领域。
背景技术
DNA甲基化是DNA的一种重要修饰碱基，它主要指在胞嘧啶的5号碳原子上进行的甲基化共价修饰，基本存在于所有物种的DNA中。胞嘧啶的甲基化修饰存在于DNA中特殊结构CpG中并在双链中成对出现；在脊椎动物结构基因组中，大部分的CpG结构域主要集中在基因启动子区域，有约60％～90％的CpG区域中的胞嘧啶上发生甲基化作用。DNA的甲基化会导致DNA构象、稳定性、DNA与蛋白质相互作用的方式以及染色质结构发生改变，进而影响基因的表达调控，使其在细胞发育与分化、特征性表型基因的表达以及X染色体失活等方面发挥着巨大的作用。因而对于基因组中DNA甲基化位点的精准测序是全面理解追踪基因特征和功能的重要方面。
传统的单位点甲基化检测或者测序方法(如限制性酶切，限制新酶切-PCR，甲基化特异性PCR、焦磷酸测序、荧光定量法等方法)受限于技术方法只能一次性检测单个或者多个位点，且方法比较繁杂；基于芯片的甲基化图谱可以绘制基因组甲基化图谱，但该方法需求量较小，且成本较高，不适用于大规模使用。近些年来随着第二代测序方法的发展，人们可以通过高通量测序的方法进一步系统详尽准确的认识基因组中甲基化的分布情况。目前基于高通量测序的甲基化测序方法有三种类型：(1)免疫沉淀的方法；(2)亚硫酸氢盐测序以及(3)甲基化CpG随机扩增与测序的方法(MCTA-Seq)。免疫沉淀的方法需要购买具有特异性识别效果的抗体，并且该种测序方法只能算得上是半定量，分辨率只能到100bp。亚硫酸氢盐测序方法的测序方法则能精确到碱基，是甲基化分析的金标准。该种方法是将DNA样品用亚硫酸盐进行处理后将未发生甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，然后根据酶切，跑胶纯化等步骤富集启动子以及CpG岛区域，进一步建立文库测序；但该方法程序复杂且耗时长耗费高，性价比较低，不具有广泛的适用性。甲基化CpG随机扩增与测序的方法是基于亚硫酸盐法的改进方法。该方法首先将收集到的DNA样品进行亚硫酸氢盐处理获得转化后的样品，然后通过特定引物将特定为发生甲基化CpG富集区域(特别是CpG岛区域)进行扩增并建立DNA文库，进而通过切胶的方法将目标区域片段进行富集，进而实现特定区域的甲基化CpG岛测序分析。该方法降级成本且可以有效覆盖80％以上的CpG岛区域，对于DNA中甲基化的分布分析具有重要的意义，但是该方法仍有三个较大的缺陷：1)获得的DNA文库始终包含有极大量的引物二聚物与杂质，外加亚硫酸盐测序方法的局限性，极大的干扰到实际有效测序效果，使之测序成本加大；2)引物能够捕获的CpG岛区域范围仍不能覆盖全部启动子区域；3)该方法建库纯化步骤仍极为依赖操作者的判断和技艺，不利于自动化工业化操作。
目前尚缺少一个较为高效的商品化甲基化CpG岛高通量测序检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种微量DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法，
本发明采用了如下技术方案：
一种DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将获得的微量DNA样品进行亚硫酸盐处理，获取单链的经亚硫酸盐转换的DNA样品；
2)将步骤1)中获取的处理样品加入到含有引物A的PCR体系中，并在PCR仪器中进行线性扩增；
3)向步骤2)中的PCR产物中加入具有单链DNA剪切活性的核酸外切酶，于37℃中反应30分钟，然后升高温度使所述核酸外切酶失活；
4)将步骤3)中的酶消化产物加入到含有引物B的PCR体系中并进行线性扩增；
5)将步骤4)中的PCR产物体系再加入含有相应接头引物C和接头引物D的PCR体系中进行PCR扩增；
6)将步骤5)中的PCR产物进行具有尺寸选择性的纯化方式获得具有特异长度的DNA文库，并根据测序仪要求的质控鉴定后进行高通量测序。
进一步，本发明的DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法，还可以具有这样的特征：其中，所述引物A的5’端序列可以与测序通用接头引物C(不限于illumina，ion proton，roche454，solid，BGIseq)相互退火结合；引物A在3’端有5-15个特殊的并可以与多个CpG区域(至少两个CpG)退火结合的序列。
进一步，本发明的DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法，还可以具有这样的特征：其中，引物B中5’端序列可以与接头引物D退火结合。
进一步，本发明的DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法，还可以具有这样的特征：引物B的3’端序列会包含一段相对随机的长为5-15的碱基的退火结合序列，此序列含有0-15个碱基C，0-15个碱基D与0-7个CpG。
进一步，本发明的DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法，还可以具有这样的特征：引物B的3’端最后一个碱基为D(A、T、G混合物)，第二、三个碱基紧接着一个CpG富集区，而在4～9个碱基则会包含一个碱基C，其他的碱基为D(A、T、G)。
进一步，本发明的DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法，还可以具有这样的特征：引物5’端序列和3’端序列则是由4-20个碱基D(A、T、G混合物)连接。
进一步，本发明的DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法，还可以具有这样的特征：引物B可以是单条引物，或者是多条引物的混合；
进一步，本发明的DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法，还可以具有这样的特征：其中，引物B是下述四条引物的混合物
5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCATGDDDDDDDDGCGD-3’；其中，D为A或T或G。
5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCATGDDDDDDDGDCGD-3’；其中，D为A或T或G。
5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCATGDDDDDDGDDCGD-3’；其中，D为A或T或G。
5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCATGDDDDDGDDDCGD-3’；其中，D为A或T或G。
进一步，本发明的DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法，还可以具有这样的特征：引物C的序列如下：
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’。
进一步，本发明的DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法，还可以具有这样的特征：引物D的序列如下：
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCT-3’。
上述步骤1)中，微量DNA的样品来源不局限于人、动物、植物、微生物等生命中的组织、血液、细胞、体液以及分泌液等中提取的微量DNA样品；DNA提取方法不限于现有酚氯仿、柱回收以及磁珠纯化等方式；
上述步骤1)中，亚硫酸盐处理的试剂盒不限于自配或者是现有商品化的亚硫酸盐处理试剂盒如：Zymo EZ Methylation-Direct Kit、EpiTect Bisulfite Kits、MethylampWhole Cell Bisulfite Modification Kit、EpiGnomeTMMethyl-Seq Kit等；
上述步骤2)中，DNA聚合酶优先使用热启动DNA聚合酶但也不局限于热启动DNA聚合酶，如：HS EX Taq DNA聚合酶、Pfu聚合酶、Taq DNA聚合酶、热启动Taq DNA聚合酶、Phusion聚合酶、热启动DNA聚合酶、 DNA聚合酶、 DNA聚合酶、VentR(exo–)DNA聚合酶、Deep VentRTMDNA聚合酶、Deep VentR(exo–)DNA聚合酶等；
上述步骤2)中，引物A的5’端序列可以与测序通用接头引物C(不限于illumina，ion proton，roche454，solid，BGIseq)相互退火结合；引物A在3’端有5-15个特殊的并可以与多个CpG区域(至少两个CpG)退火结合的序列；连接该引物的5’端和3’端部分的则是长度3～7个H碱基(A、T、G混合物)。例如，引物A的序列可以是：
5’-TTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCATGHHHHCCGCGCG-3’。
上述步骤3)中，单链剪切的核酸外切酶不限于菌株来源，如核酸外切酶I，核酸外切酶II等；
上述步骤5)中，引物B中5’端序列可以与接头引物D退火结合；3’端序列会包含一段相对随机的长为5-15的碱基的退火结合序列，此序列含有0-15个碱基C，0-15个碱基D与0-7个CpG。3’端最后一个碱基为D(A、T、G混合物)，第二、三个碱基紧接着一个CpG富集区，而在4～9个碱基则会包含一个碱基C，其他的碱基为D(A、T、G)；引物5’端序列和3’端序列则是由4-20个碱基D(A、T、G混合物)连接；该引物可以单个使用也可同长度多个引物混合使用；
上述步骤5)中，DNA聚合酶优先使用具有链置换效果的DNA聚合酶但不局限。比如：Klenow(exo)、phi29DNA聚合酶、BstDNA聚合酶，大片段、Bst 2.0DNA聚合酶等；
上述步骤6)中，PCR体系中接头引物C和接头引物D可以分别于引物A和B的5’端序列退火结合；DNA聚合酶优先使用热启动DNA聚合酶但也不局限于热启动DNA聚合酶，如：HSEX Taq DNA聚合酶、Pfu聚合酶、Taq DNA聚合酶、热启动Taq DNA聚合酶、Phusion聚合酶、热启动DNA聚合酶、 DNA聚合酶、 DNA聚合酶、VentR(exo–)DNA聚合酶、Deep VentRTMDNA聚合酶、Deep VentR(exo–)DNA聚合酶等；
上述步骤7)中，PCR体系纯化方式不限于胶回收和磁珠纯化等方式进行DNA片段大小的筛选；
上述步骤7)中，高通量测序平台包括但不局限于Illumina公司的Hiseq、Miseq、NextSeq等测序平台；Ion proton的PGM平台；Roche454的GS Junior以及GS FLX+平台等；
数据分析方法无限制。
发明的有益效果
本发明的技术与现有技术相比，本技术采用多步PCR的方法直接富集微量DNA序列中甲基化CpG岛序列以对待测目的片段进行高通量测序，具有很高的DNA序列针对性，效率极高，避免了在测序过程中的出现数据浪费现象；并且可以直接对极微量DNA来源进行捕捉富集并建立DNA文库，准确性高，极大的扩展了甲基化测序的应用范围，比如血液、体液以及尿液中的微量DNA序列的高通量测序。
与现有技术相比，本技术在PCR过程中采用了单链剪切的核酸外切酶去除多次直接PCR体系中的引物，极大的降低了反应体系中的背景；
与现有技术相比，本技术步骤2到步骤6中PCR技术可以在单管连续进行，避免了中间纯化步骤的浪费情况，可以省时省力并且可配备使用自动化设备完成所有过程，在质量可控的条件下，极大的优化了DNA文库建立的复杂性，简化了生产工艺，降低了生产成本。
具体实施方式
以下说明本发明的具体实施方式。
实施例1：血浆循环游离DNA中甲基化CpG岛高通量测序文库的建立。
使用EDTA抗凝的抽血管从人体中抽取1～10毫升的人体血液，在4度经过两轮1350g的离心，离心时间12分钟，离心后分别取出上层液体，最后再使用13500g高速离心，离心时间12分钟，彻底去除血浆中可能存在的血细胞。紧接着使用商品化的试剂盒Zymo EZMethylation-Direct Kit从血浆中提取循环游离DNA并用适当的体积(20微升)洗脱，DNA总量为1～10ng。100ng以下的样品量都可以称之为微量。紧接着使用商品化的亚硫酸盐试剂盒对该DNA体系进行亚硫酸盐化处理，使DNA中没有进行5位修饰的胞嘧啶转化为尿嘧啶而保留DNA序列中5位甲基修饰的胞嘧啶，最终将转化后的样品洗脱至10.25微升体系。
该转化过的DNA样品先使用含有引物A的PCR体系，PCR体系共15微升。进行第一轮PCR线性扩增后使用核酸外切酶I(0.5微升，30分钟)将体系中的过量引物A消化掉；反应结束后在高温条件下(80℃，20分钟)使得核酸外切酶I失活进而避免该酶对后续反应的干扰。紧接着在反应管中直接多步加入含有引物B的PCR反应体系(共计20微升)，使之在PCR仪器中进行第二轮线性扩增。获得的样品管中直接加入第三步含有接头引物C和接头引物D的PCR反应体系(体积共50微升)在PCR仪器中进行指数扩增18至22个循环。最终PCR管样品吸取45微升体系使用商品化磁珠进行尺寸选择的多步纯化进而获得尺寸为190bp～300bp的DNA文库。将获得的DNA文库经过质检后送测高通量测序并最终进行数据分析。
具体将微量DNA样品进行亚硫酸盐处理以及后续建库分析的步骤如下：
1.1，向CT ConversionReagent管中加入790uL M-Solubilization buffer以及300uL M-DilutionBuffer；在室温条件下用剧烈震荡15s混匀样品，并且使用DNA旋转混合仪混匀10min；
1.2，向体系中再加入160uL M-Reaction Buffer，并再多混1min(溶液配好后是透明状态，但是稍微有点沉淀)；
1.3，取20uL的cfDNA样品(体积不够用水补足)置于1.5mL低吸附离心管中，然后向管中中加入130uL CT Conversion Reagent用移液器吹打混匀后分装到PCR管中。
1.4，将PCR管放在PCR热循环仪上并按照下面的热循环进行前期反应：98℃，8min；64℃，3.5h；4℃，保温；
1.5，将600uL M-Binding Buffer加入到Zymo-SpinTM IC Column中，加入1uLCarrier RNA并将Column放入到Collection Tube中；
1.6，将从第二步中取出的反应液加入到含有M-Binding Buffer的Column中，盖上Column的盖子并颠倒6次；
1.7，将Column放在离心机上用10000g离心30s，并吸取滤过液丢弃；
1.8，向Column中加入100uL M-Wash Buffer，在使用14000rpm的离心力离心30s；
1.9，向Column中加入200uL M-Desulphonation Buffer，并让其在室温(20℃-30℃)里静置反应15～20min。紧接着使用14000rpm的离心力离心30s。
1.10，向Column中加入200uL M-Wash Buffer，在离心机上用14000rpm的离心力上离心30s；并重复加入200uL M-Wash Buffer，使用14000rpm的离心力离心60s。
10)将Column加入到一个新的1.5mL低吸附离心管中加入12.5uL的Low TE，室温下静置60s后，在14000rpm的离心力下离心60s洗脱DNA样品。
步骤2，将步骤1中获取的处理样品加入到含有引物A的PCR体系中。
将步骤1中获取的处理样品加入到含有引物A的PCR体系中(含有热启动DNA聚合酶)并在PCR仪器中进行线性扩增。
2.1，将步骤1中的洗脱液(11.2ul，体积不足部分用DNase-free ddH2O补足)转移至PCR管中，并按照下表格加入PCR扩增体系，该步骤在冰上操作并使用移液器混匀。
试剂或者样品 体积(ul)
DNA样品 11.2
引物A* 0.5
dNTP 1.5
Ex Taq buffer 1.5
Ex HS Taq(Takara) 0.3
Total 20.0
注：*引物A的序列为
5’-TTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCATGHHHHCCGCGCG-3’(H＝A/C/T)，其浓度为5uM。
2.2，将PCR体系放在PCR仪器上按照下述温度变化进行第一轮线性扩增：95℃，3min(第一次)；95℃，30s；50℃，2min；72℃，1min；4℃，保温；
步骤3，将步骤2中的PCR产物中加入核酸外切酶去除体系中的单链引物；
3.1，将样品管从PCR仪器中拿出后置于冰上；
3.2，直接向体系中加入0.5uL的核酸外切酶I(NEB：)并吹打混匀；
3.3，将PCR管放在PCR仪器上按照下述温度变化进行操作：37℃，30min；80℃，20min；4℃，保温；
步骤4，将步骤3中的酶消化产物加入到含有引物B的PCR体系中并进行线性扩增；
4.1，将PCR样品管从PCR仪上去下后直接加入1.0uL的引物B(混合物)**并吹打混匀；
**：引物B为混合物，混合引物浓度共为5.0uM，每条为1.25uM，其序列见下：
5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCATGDDDDDDDDGCGD-3’；(D＝A/T/G)
5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCATGDDDDDDDGDCGD-3’；(D＝A/T/G)
5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCATGDDDDDDGDDCGD-3’；(D＝A/T/G)
5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCATGDDDDDGDDDCGD-3’；(D＝A/T/G)
4.2，将PCR仪器预热到95℃，迅速将样品管插入到PCR仪器孔中持续两分钟后，迅速将样品管取下插入冰水浴上保持3分钟；
4.3，按照下表格配置第二轮PCR扩增混合物体系；
试剂 体积(ul)
NEBuffer2 0.5
Klenow(exo) 0.5
ddH<sub>2</sub>O 3.0
Total 4.0
4.4，取4.0ul的PCR扩增体系加入到PCR样品管中并吹打混匀，在冰上操作；
4.5，将PCR仪器操作孔中温度预先预冷到4℃，将样品管放到仪器孔中。然后按照下述温度变化进行第二轮扩增：4℃，50s；10℃，1min；20℃，4min；30℃，4min；37℃，4min；75℃，20min；4℃，forever***；
***：每次变温时升温速度为1℃/s。
步骤5，将步骤4)中的PCR产物进行磁珠纯化；
5.1，将Beckman产品的Ampure XP磁珠从4℃取出后放置在室温15min后，震荡混匀；
5.2，吸取20ul的磁珠加入到样品管中，用移液器吹打混匀，室温条件下静置10min；
5.3，将样品管放在磁架中保持5min，待磁珠都被吸附在靠近磁架的样品管壁上；现配80％的乙醇溶液；
5.4，打开样品管，用移液器吸出管中所有的液体并丢弃；
5.5，用移液器向管中加入200ul 80％的乙醇溶液，并静置30s，吸出管中的乙醇溶液；重复该操作，并最终用10ul移液器彻底吸出管中的液体；
5.6，将样品管开盖在室温中静置5min，使管中的乙醇挥发彻底；
5.7，从磁架上取下样品管，向其中加入40.0ul的ddH2O用移液器将管壁上的磁珠吹打重新混匀并静置5min；
5.8，将样品管置于磁架中并保持5min使磁珠彻底贴与样品管壁，然后吸取38.5ul的液体置于新的PCR管中；
步骤6，将步骤5中的PCR产物体系再加入含有相应接头引物C和接头引物D的PCR体系中进行PCR扩增，进行15～25个循环。
6.1，从步骤按照下表配置PCR体系混合物；
试剂或者样品 体积(ul)
DNA样品 38.5
引物C**** 0.5
引物D***** 0.5
dNTP 5.0
Ex Taq buffer 5.0
Ex HS Taq(Takara) 0.5
Total 50.0
****：引物C的浓度为50uM，序列见下：
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’
*****：引物D的浓度为50uM，序列见下：
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCT-3’
6.2，将上述配制好的PCR体系置于PCR仪器上，按照下述温度变化进行第三轮指数扩增，反应15～25个循环:95℃，3min(第一次)；95℃，30s；65℃，30s；72℃，1min(n个循环)；4℃，forever；
步骤7，将步骤6)中的PCR产物进行(如磁珠纯化等)获得具有特异长度(DNA片段大小为200-350bp)的DNA文库，并根据测序仪要求的质控鉴定后进行高通量测序；
7.1，PCR反应结束前15分钟将Ampure XP磁珠取出置于室温中并剧烈震荡混匀；
7.2，PCR结束后将样品管取出，吸取其中45.0ul的样品于新的PCR反应管中，向该管中加入31.5ul的Ampure XP磁珠，并用移液器吹打混匀，室温静置10min；
7.3，将反应管置于磁架中，静置5min使管中的磁珠彻底贴壁后，吸取74ul的澄清液并转移至新的PCR反应管中；
7.4，向新的反应管中加入13.2ul的Ampure XP磁珠，并用移液器吹打混匀，再次室温静置10min；
7.5，将反应管置于磁架中，静置5min使管中的磁珠彻底贴壁。配置新鲜的80％的乙醇溶液；
7.6，打开样品管，用移液器吸出管中所有的液体并丢弃；
7.7，用移液器向管中加入200ul 80％的乙醇溶液，并静置30s，吸出管中的乙醇溶液；重复该操作，并最终用10ul移液器彻底吸出管中的液体；
7.8，将样品管开盖在室温中静置5min，使管中的乙醇挥发彻底；
7.9，从磁架上取下样品管，向其中加入20.0ul的Low TE(0.1mM EDTA，10mM Tris-HCl，pH＝7.5用移液器将管壁上的磁珠吹打重新混匀并静置5min；
7.10，将样品管置于磁架中并保持5min使磁珠彻底贴与样品管壁，然后吸取17.0ul的液体测定浓度，至此获得高通量测序文库；
7.11，使用AgilentBioanalyser_2100分析系统对获取文库进行DNA片段大小进行鉴定；
7.12，将分析过的文库在IlluminaHiseq 2500或者Illumina Hiseq X10系统平台上利用双末端测序的方法进行高通量测序，获得高通量测序数据；
步骤8，将步骤7中的测序数据进行分析获得所需甲基化CpG岛的数据信息并与之应用于科研或医疗诊断等方向。具体步骤如下：
8.1，将测序数据进行初步处理，去除其中的接头引物；然后将所获取的高通量测序数据利用数据分析软件Biomark将数据与人类基因组数据(如Hg19)进行比对；
8.2，将甲基化CpG岛的分布情况进行深入的生物信息学分析。
实施例2：尿液中DNA中甲基化CpG岛高通量测序文库的建立
使用医用尿液收集器直接收集人早晨第一管尿液(体积100毫升至500毫升)，使用13500g高速离心(12分钟)彻底去除尿液中可能存在的细胞和沉淀杂质。紧接着使用商品化的试剂盒从尿液中提取循环游离DNA并用适当的体积(20微升)洗脱(DNA总量为1～10ng)。紧接着使用商品化的亚硫酸盐试剂盒对该DNA体系进行亚硫酸盐化处理，使DNA中没有进行5位修饰的胞嘧啶转化为尿嘧啶而保留DNA序列中5位甲基修饰的胞嘧啶，最终将转化后的样品洗脱至10.25微升体系。
该转化过的DNA样品先使用含有引物A的PCR体系(共15微升)进行第一轮PCR线性扩增后使用核酸外切酶I(0.5微升，30分钟)将体系中的过量引物A消化掉；反应结束后在高温条件下(80℃，20分钟)使得核酸外切酶I失活进而避免该酶对后续反应的干扰。紧接着在反应管中直接多步加入含有引物B的PCR反应体系(共计20微升)，使之在PCR仪器中进行第二轮线性扩增。获得的样品管中直接加入第三步含有接头引物C和接头引物D的PCR反应体系(体积共50微升)在PCR仪器中进行指数扩增18至22个循环。最终PCR管样品吸取45微升体系使用商品化磁珠进行尺寸选择的多步纯化进而获得尺寸为190bp～300bp的DNA文库。将获得的DNA文库经过质检后送测高通量测序并最终进行数据分析。
本实施方式中从DNA的亚硫酸盐处理以及后续文库构建测序的步骤同实施例一。

Claims (9)

1.一种微量DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将获得的微量DNA样品进行亚硫酸盐处理，获取单链的经亚硫酸盐转换的DNA样品；
2)将步骤1)中获取的处理样品加入到含有引物A的PCR体系中，并在PCR仪器中进行线性扩增；
3)向步骤2)中的PCR产物中加入具有单链DNA剪切活性的核酸外切酶，于37℃中反应30分钟，然后升高温度使所述核酸外切酶失活；
4)将步骤3)中的酶消化产物加入到含有引物B的PCR体系中并进行线性扩增；
5)将步骤4)中的PCR产物体系再加入含有相应接头引物C和接头引物D的PCR体系中进行PCR扩增；
6)将步骤5)中的PCR产物进行具有尺寸选择性的纯化方式获得具有特异长度的DNA文库，并根据测序仪要求的质控鉴定后进行高通量测序，
其中，所述引物B的3’端最后一个碱基为D，第二、三个碱基紧接着一个CpG富集区，而在4～9个碱基则会包含一个碱基C，其他的碱基为D，D为A或T或G。
2.如权利要求1所述的微量DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法，其特征在于：
其中，所述引物A的5’端序列可以与测序通用接头引物C相互退火结合。
3.如权利要求1所述的微量DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法，其特征在于：
其中，所述引物B中5’端序列可以与接头引物D退火结合。
4.如权利要求1所述的微量DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法，其特征在于：
其中，所述引物B的3’端序列包含一段随机的长为5-15的碱基的退火结合序列，此序列含有0-15个碱基C，0-15个碱基D与0-7个CpG。
5.如权利要求1所述的微量DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法，其特征在于：
其中，所述引物B的5’端序列和3’端序列则是由4-20个碱基D连接形成。
6.如权利要求1所述的微量DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法，其特征在于：
其中，所述引物B是单条引物，或者是多条引物的混合。
7.如权利要求1所述的微量DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法，其特征在于：
其中，引物B是下述四条引物的混合物：
5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCATGD DDDDDDDGCGD-3’；其中，D为A或T或G。
5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCATGDD DDDDDGDCGD-3’；其中，D为A或T或G。
5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCATGDD DDDDGDDCGD-3’；其中，D为A或T或G。
5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCATGDD DDDGDDDCGD-3’；其中，D为A或T或G。
8.如权利要求1所述的微量DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法，其特征在于：
引物C的序列如下：
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTAC ACGACGCTCTTCCGATCT-3’。
9.如权利要求1所述的微量DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法，其特征在于：
引物D的序列如下：
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGA GTTCAGACGTGTGCT-3’。
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