CN105256018A - 一种甲基化dna检测的新方法 - Google Patents
一种甲基化dna检测的新方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105256018A CN105256018A CN201510652725.3A CN201510652725A CN105256018A CN 105256018 A CN105256018 A CN 105256018A CN 201510652725 A CN201510652725 A CN 201510652725A CN 105256018 A CN105256018 A CN 105256018A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- dna
- pcr
- degree
- methylate dna
- primer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明经优化PCR引物的设计，使每个PCR扩增区域至少包含10个C盘G位点，所累积的变性温度差异将超过5度。温度通过加热，使PCR产物部分解链变性，即加热到一个特定温度，只使非甲基化DNA的PCR产物发生变性。用对单链DNA特异的核酸外切酶消化这样处理的PCR产物，非甲基化DNA的PCR产物将被消化，而甲基化DNA的PCR产物维持不变，从而可以提高甲基化DNA的检测灵敏度。本发明的有益效果是：本发明在甲基化DNA特异性多重PCR扩增技术的基础上，通过对引物序列的选择，使甲基化DNA的检测灵敏度得到提高，通过使用毛细管电泳检测PCR产物，有效提高甲基化DNA检测的稳定性和重复性，多重PCR一次性检测多个甲基化基因，提高检测效率，提高检测的灵敏度和检测的稳定性。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及医学和分子生物学技术，即一种甲基化DNA检测的新方法。
背景技术
近年来的研究发现，细胞癌变与基因的异常甲基化改变有关，通过对样品中甲基化基因的检测，可以提示相应样品中癌细胞的存在。
甲基化DNA是在DNA链的C残基上修饰有一个甲基。人类异常的DNA甲基化多发生在基因的转录调控区，引起相应基因转录的关闭，使基因丧失功能。多种癌症的发生与DNA异常甲基化有关，通过对DNA甲基化的检测，可以提供体内是否存在癌细胞的信息。
目前，对甲基化基因的检测，通常是用重亚硫酸盐处理样品DNA，将DNA链上所有不发生甲基化的C碱基转变为U，而一般DNA聚合酶识别U为T。对经重亚硫酸钠处理过的DNA进行PCR扩增所得到的PCR产物，DNA链上所有未发生甲基化的C，均置换为T，使得非甲基化DNA的PCR产物的变性温度比甲基化DNA的PCR产物的变性温度显著降低，据测定，每个甲基化CpG位点与相应的非甲基化位点相比，经重亚硫酸钠处理之后，将导致其PCR产物的变性温度产生0.5度的差异。当对这些PCR产物加热时，非甲基化DNA的PCR产物将先于甲基化DNA的PCR产物而发生解链变性。
发明内容
本发明旨在提供一种甲基化DNA检测的新方法，其目的在于提高检测样品中的甲基化DNA的灵敏度和检测的稳定性提供一种新方法。
为了解决上述问题，本发提供的一种甲基化DNA检测的新方法采用了如下的技术方案：
本发明经优化PCR引物的设计，使每个PCR扩增区域至少包含10个C盘G位点，所累积的变性温度差异将超过5度。温度通过加热，使PCR产物部分解链变性，即加热到一个特定温度，只使非甲基化DNA的PCR产物发生变性。用对单链DNA特异的核酸外切酶消化这样处理的PCR产物，非甲基化DNA的PCR产物将被消化，而甲基化DNA的PCR产物维持不变，从而可以提高甲基化DNA的检测灵敏度。
一种甲基化DNA检测的新方法，其特征在于：
第一步：筛选出一组12个基因，根据目标检测区域甲基化DNA经重亚硫酸盐处理转化后是的序列，设计PCR引物，使每条引物序列中包含2-3个CpG位点，以提高引物对甲基化DNA的偏向性扩增；使这一组基因的每个PCR扩增产物的长度，呈梯度分布；使每个PCR扩增区域含有至少10个CpG位点；使每个PCR扩增产物的变性温度在82-84度；
第二步：从人粪便样品中提取的DNA，用重亚硫酸钠处理并纯化；
第三步：配制甲基化DNA的PCR扩增体系，包括PCR缓冲液、四种dNTP混合物，TaqDNA聚合酶；
第四步：加入步骤1所设计的引物混合，加入经重亚硫酸钠处理并纯化的样品DNA，进行第一次PCR扩增；
第五步：步骤四的PCR产物加热至80度，使PCR产物获得部分变性；
第六步：用单链DNA特异性外切酶对步骤5的PCR产物进行消化处理；
第七步：以步骤六的经消化处理的PCR产物为模板，与步骤一设计的PCR引物混合物，在步骤三的PCR扩增体系中，进行第二次PCR反应；
第八步：将步骤七的反应产物，用全自动毛细管电泳分析系统进行检测，根据DNA片段出现的时间，判断甲基化DNA的存在。
优选的，所述的第一步中一组12个基因，具体如下：SNCA、SPG20、ADAMTS1、SFRP5、SLC5A8、IGFBP3、GALR2、SLC16A12、SPOCK2、TLX2、HLTF、HPP1。
优选的，所述第四步中PCR反应条件是：预变性95度10分；热循环95度30秒，62度30秒，72度60秒，42个循环。
优选的，所述的第六步中单链DNA特异性外切酶是绿豆核酸酶。
优选的，所述绿豆核酸酶的反应条件是：1x绿豆核酸酶反应缓冲液，0.05u/ul绿豆核酸酶，反应温度为37度，30分。
优选的，所述第七步中PCR反应条件是：预变性95度10分；热循环95度30秒，62度30秒，72度60秒，25个循环。
本发明的有益效果是：本发明在甲基化DNA特异性多重PCR扩增技术的基础上，通过对引物序列的选择，使设计的引物不仅保证PCR产物的长度呈梯度分布，各PCR产物的退火温度保持接近，实现多重PCR条件下的非甲基化DNA的PCR产物在特定温度下的部分变性，从而可以被单链DNA特异性外切核酸酶消化移除，使甲基化DNA的检测灵敏度得到提高，通过使用毛细管电泳检测PCR产物，有效提高甲基化DNA检测的稳定性和重复性，多重PCR一次性检测多个甲基化基因，提高检测效率，提高检测的灵敏度和检测的稳定性。
附图说明
图1人通用甲基化DNA和非甲基化DNA标准品的PCR扩增产物在毛细管电泳检测系统的迁移时间图。
图2大肠癌患者粪便中甲基化DNA检测实例。
具体实施方式
为了更清楚的理解本发明提供的技术方案,下面结合具体的实施例对技术方案做进一步的说明。
实施例
近年来的研究发现，细胞癌变与基因的异常甲基化改变有关，通过对样品中甲基化基因的检测，可以提示相应样品中癌细胞的存在。对甲基化基因的检测，通常是用重亚硫酸盐处理样品DNA，将DNA链上所有不发生甲基化的C碱基转变为U，而一般DNA聚合酶识别U为T。对经重亚硫酸钠处理过的DNA进行PCR扩增所得到的PCR产物，DNA链上所有未发生甲基化的C，均置换为T，使得非甲基化DNA的PCR产物的变性温度比甲基化DNA的PCR产物的变性温度显著降低，据测定，每个甲基化CpG位点与相应的非甲基化位点相比，经重亚硫酸钠处理之后，将导致其PCR产物的变性温度产生0.5度的差异。当对这些PCR产物加热时，非甲基化DNA的PCR产物将先于甲基化DNA的PCR产物而发生解链变性。本发明经优化PCR引物的设计，使每个PCR扩增区域至少包含10个C盘G位点，所累积的变性温度差异将超过5度。温度通过加热，使PCR产物部分解链变性，即加热到一个特定温度，只使非甲基化DNA的PCR产物发生变性。用对单链DNA特异的核酸外切酶消化这样处理的PCR产物，非甲基化DNA的PCR产物将被消化，而甲基化DNA的PCR产物维持不变，从而可以提高甲基化DNA的检测灵敏度。
本发明的实施例的技术方案是：
第一步：筛选出一组12个基因，根据目标检测区域甲基化DNA经重亚硫酸盐处理转化后是的序列，设计PCR引物，使每条引物序列中包含2-3个CpG位点，以提高引物对甲基化DNA的偏向性扩增；使这一组基因的每个PCR扩增产物的长度，呈梯度分布；使每个PCR扩增区域含有至少10个CpG位点；使每个PCR扩增产物的变性温度在82-84度；
第二步：从人粪便样品中提取的DNA，用重亚硫酸钠处理并纯化；
第三步：配制甲基化DNA的PCR扩增体系，包括PCR缓冲液、四种dNTP混合物，TaqDNA聚合酶；
第四步：加入步骤1所设计的引物混合，加入经重亚硫酸钠处理并纯化的样品DNA，进行第一次PCR扩增；
第五步：步骤四的PCR产物加热至80度，使PCR产物获得部分变性；
第六步：用单链DNA特异性外切酶对步骤5的PCR产物进行消化处理；
第七步：以步骤六的经消化处理的PCR产物为模板，与步骤一设计的PCR引物混合物，在步骤三的PCR扩增体系中，进行第二次PCR反应；
第八步：将步骤七的反应产物，用全自动毛细管电泳分析系统进行检测，根据DNA片段出现的时间，判断甲基化DNA的存在。
在本实施例中，所述的第一步中一组12个基因，具体如下：SNCA、SPG20、ADAMTS1、SFRP5、SLC5A8、IGFBP3、GALR2、SLC16A12、SPOCK2、TLX2、HLTF、HPP1。
在本实施例中，所述第四步中PCR反应条件是：预变性95度10分；热循环95度30秒，62度30秒，72度60秒，42个循环。
在本实施例中，所述的第六步中单链DNA特异性外切酶是绿豆核酸酶。
在本实施例中，所述绿豆核酸酶的反应条件是：1x绿豆核酸酶反应缓冲液，0.05u/ul绿豆核酸酶，反应温度为37度，30分。
在本实施例中，所述第七步中PCR反应条件是：预变性95度10分；热循环95度30秒，62度30秒，72度60秒，25个循环。
在本实施例中，所述PCR反应体系为：1xPCR缓冲液，含2mM的MgCl2，NTP各0.3mM，引物混合物0.1-1uM，TaqDNA聚合酶0.04u/ul，模板DNA为经重亚硫酸钠处理并纯化的大肠癌患者粪便DNA样品，或人通用甲基化/非甲基化DNA标准品。
在本实施例中，所述全自动毛细管电泳分析系统是美国AdvancedAnalogicTechnologies,Inc.(AATI)公司的产品。
如图1所示，甲基化DNA和非甲基化DNA标准品的PCR扩增产物在毛细管电泳检测系统的迁移时间不同，甲基化DNA的PCR产物在毛细管电泳检测系统中的迁移率比非甲基化DNA的要快，本发明优化甲基化DNA的PCR扩增效率，非甲基化DNA模板通常不能被扩增。
如图2所示，大肠癌患者粪便中甲基化DNA检测过程中，甲基化DNA的PCR产物在毛细管电泳检测系统中的迁移率比非甲基化DNA的要快，本发明优化甲基化DNA的PCR扩增效率，非甲基化DNA模板通常不能被扩增。
Claims (6)
1.一种甲基化DNA检测的新方法，其特征在于：
第一步：筛选出一组12个基因，根据目标检测区域甲基化DNA经重亚硫酸盐处理转化后是的序列，设计PCR引物，使每条引物序列中包含2-3个CpG位点，以提高引物对甲基化DNA的偏向性扩增；使这一组基因的每个PCR扩增产物的长度，呈梯度分布；使每个PCR扩增区域含有至少10个CpG位点；使每个PCR扩增产物的变性温度在82-84度；
第二步：从人粪便样品中提取的DNA，用重亚硫酸钠处理并纯化；
第三步：配制甲基化DNA的PCR扩增体系，包括PCR缓冲液、四种dNTP混合物，TaqDNA聚合酶；
第四步：加入步骤1所设计的引物混合，加入经重亚硫酸钠处理并纯化的样品DNA，进行第一次PCR扩增；
第五步：步骤四的PCR产物加热至80度，使PCR产物获得部分变性；
第六步：用单链DNA特异性外切酶对步骤5的PCR产物进行消化处理；
第七步：以步骤六的经消化处理的PCR产物为模板，与步骤一设计的PCR引物混合物，在步骤三的PCR扩增体系中，进行第二次PCR反应；
第八步：将步骤七的反应产物，用全自动毛细管电泳分析系统进行检测，根据DNA片段出现的时间，判断甲基化DNA的存在。
2.根据权利要求1所述的一种甲基化DNA检测的新方法，其特征在于：所述的第一步中一组12个基因，具体如下：SNCA、SPG20、ADAMTS1、SFRP5、SLC5A8、IGFBP3、GALR2、SLC16A12、SPOCK2、TLX2、HLTF、HPP1。
3.根据权利要求1所述的一种甲基化DNA检测的新方法，其特征在于：所述第四步中PCR反应条件是：预变性95度10分；热循环95度30秒，62度30秒，72度60秒，42个循环。
4.根据权利要求1所述的一种甲基化DNA检测的新方法，其特征在于：所述的第六步中单链DNA特异性外切酶是绿豆核酸酶。
5.根据权利要求4所述的一种甲基化DNA检测的新方法，其特征在于：所述绿豆核酸酶的反应条件是：1x绿豆核酸酶反应缓冲液，0.05u/ul绿豆核酸酶，反应温度为37度，30分。
6.根据权利要求1所述的一种甲基化DNA检测的新方法，其特征在于：所述第七步中PCR反应条件是：预变性95度10分；热循环95度30秒，62度30秒，72度60秒，25个循环。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510652725.3A CN105256018A (zh) | 2015-10-11 | 2015-10-11 | 一种甲基化dna检测的新方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510652725.3A CN105256018A (zh) | 2015-10-11 | 2015-10-11 | 一种甲基化dna检测的新方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105256018A true CN105256018A (zh) | 2016-01-20 |
Family
ID=55095943
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510652725.3A Pending CN105256018A (zh) | 2015-10-11 | 2015-10-11 | 一种甲基化dna检测的新方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105256018A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017147946A1 (zh) * | 2016-03-02 | 2017-09-08 | 上海易毕恩基因科技有限公司 | 微量DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法 |
| CN111118140A (zh) * | 2020-01-13 | 2020-05-08 | 首都医科大学宣武医院 | 一种引物探针组合物及检测方法和用途 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101646783A (zh) * | 2007-02-21 | 2010-02-10 | 奥斯陆大学医院Hf | 新型癌症标记物 |
| CN102399862A (zh) * | 2010-09-16 | 2012-04-04 | 上海迦美生物科技有限公司 | 一种基于解链曲线的甲基化dna检测方法 |
| CN102399861A (zh) * | 2010-09-16 | 2012-04-04 | 上海迦美生物科技有限公司 | 基于核酸内切酶消化的甲基化dna检测方法 |
| CN102399865A (zh) * | 2010-09-16 | 2012-04-04 | 上海迦美生物科技有限公司 | 基于核酸内切酶消化的甲基化dna定量检测方法 |
-
2015
- 2015-10-11 CN CN201510652725.3A patent/CN105256018A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101646783A (zh) * | 2007-02-21 | 2010-02-10 | 奥斯陆大学医院Hf | 新型癌症标记物 |
| CN102399862A (zh) * | 2010-09-16 | 2012-04-04 | 上海迦美生物科技有限公司 | 一种基于解链曲线的甲基化dna检测方法 |
| CN102399861A (zh) * | 2010-09-16 | 2012-04-04 | 上海迦美生物科技有限公司 | 基于核酸内切酶消化的甲基化dna检测方法 |
| CN102399865A (zh) * | 2010-09-16 | 2012-04-04 | 上海迦美生物科技有限公司 | 基于核酸内切酶消化的甲基化dna定量检测方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| MELINA-THEONI GYPARAKI等: "DNA methylation biomarkers as diagnostic and prognostic tools in colorectal cancer", 《J MOL MED》 * |
| MICHAEL SCHNEKENBURGER等: "Epigenetics Offer New Horizons for Colorectal Cancer Prevention", 《CURR COLORECTAL CANCER REP》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017147946A1 (zh) * | 2016-03-02 | 2017-09-08 | 上海易毕恩基因科技有限公司 | 微量DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法 |
| CN111118140A (zh) * | 2020-01-13 | 2020-05-08 | 首都医科大学宣武医院 | 一种引物探针组合物及检测方法和用途 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2382746T3 (es) | Método para determinar la metilación de ADN en muestras de sangre u orina | |
| CN103103624B (zh) | 高通量测序文库的构建方法及其应用 | |
| EP3318645A1 (en) | A novel ligase activity | |
| CN107922941A (zh) | 在自动化反应盒中DNA甲基化的整合的纯化和测量以及突变和/或mRNA表达水平的共同测量 | |
| EP2825675A1 (en) | Measurement of nucleic acid variants using highly-multiplexed error-suppressed deep sequencing | |
| WO2012067830A3 (en) | Methylation assay | |
| WO2018093898A1 (en) | Ultraspecific nucleic acid sensors for low-cost liquid biopsies | |
| ATE325895T1 (de) | Quantitativer nachweis der methylierung in dna proben | |
| CN110267744A (zh) | 在自动化反应盒中DNA甲基化的整合的纯化和测量以及突变和/或mRNA表达水平的共同测量 | |
| RU2730622C2 (ru) | Улучшенное выявление коротких гомополимерных повторов | |
| Gomes et al. | Genetic markers for body fluid and tissue identification in forensics | |
| WO2011139920A2 (en) | Methylation-specific competitive allele-specific taqman polymerase chain reaction (cast-pcr) | |
| EP2438184B1 (en) | A method of nucleic acid amplification | |
| WO2017143866A1 (zh) | 用于定量检测rprm基因dna甲基化试剂盒及方法 | |
| ES2693133T3 (es) | Método de amplificación de ácidos nucleicos usando cebador reactivo específico de alelo | |
| CN104789667A (zh) | 一种基于无偏识别与恒温扩增的小rna检测试剂盒及定量方法 | |
| CN109423518A (zh) | 检测Septin9基因的甲基化DNA的组合物和方法 | |
| CN102399862B (zh) | 一种基于解链曲线的甲基化dna检测方法 | |
| CN105177155A (zh) | 一种人类粪便甲基化dna的pcr检测引物体系 | |
| CN105256018A (zh) | 一种甲基化dna检测的新方法 | |
| WO2010099378A3 (en) | Assay for detection of human parvovirus nucleic acid | |
| CN104263827A (zh) | 一种用于连接酶反应的新型探针设计方法 | |
| CN105441558A (zh) | Mgmt基因甲基化检测引物探针体系及其试剂盒 | |
| JPWO2020149301A1 (ja) | Ｐｖａスポンジを用いるリキッドバイオプシーの調製方法 | |
| CN107988334B (zh) | 口腔拭子直接pcr进行snp分型的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20160120 |