CN105177155A - 一种人类粪便甲基化dna的pcr检测引物体系 - Google Patents

一种人类粪便甲基化dna的pcr检测引物体系 Download PDF

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Abstract

一种人类粪便甲基化DNA的PCR检测引物体系，筛选出一组12个基因，根据目标检测区域甲基化DNA经重亚硫酸盐处理转化后是的序列，设计PCR引物。使每条引物序列中包含2-3个CpG位点，以提高引物对甲基化DNA的偏向性扩增；使这一组基因的每个PCR扩增产物的长度，呈梯度分布；使每个PCR扩增产物的变性温度在82-84度。本发明的有益效果在于：本发明设计独特的甲基化基因PCR扩增引物，克服目前的甲基化基因检测技术灵敏度不够高、检测稳定性差缺点，提供一种人类粪便甲基化DNA的PCR检测引物体系，该引物体系及用该引物体系进行的鉴定方法可快速准确的检测人类粪便的DNA是否发生变化。

Description

一种人类粪便甲基化DNA的PCR检测引物体系
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和分子生物学技术，即人类粪便甲基化DNA的PCR检测引物体系。
背景技术
DNA甲基化是指DNA链上CpG位点的胞嘧啶（C）残基的5’碳上被修饰了一个甲基。DNA甲基化是最早发现的DNA修饰之一，是表观遗传学的重要组成部分。DNA甲基化特征性地发生在DNA链上的CpG二核苷酸的胞嘧啶（C）残基上，这常见于基因5’端表达调控序列。DNA甲基化在基因表达的调控中具有重要作用，参与了动物胚胎发育、基因印记和X染色体失活等过程。研究表明，DNA甲基化的改变能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及蛋白质互相作用方式的改变，从而控制基因表达。
人类异常的DNA甲基化多发生在基因的转录调控区，引起相应基因转录的关闭，使基因丧失功能。多种癌症的发生与DNA异常甲基化有关，通过对DNA甲基化的检测，可以提供体内是否存在癌细胞的信息。一般的，粪便中甲基化DNA的存在，可能与大肠癌的发生有关。目前已发现许多个与大肠癌发生有关的甲基化基因。这些甲基化基因的改变，发生在细胞癌变的早期，其中一些基因的甲基化只发生在癌变的细胞，因而可用于检测癌症的基因标志。对粪便中这些甲基化基因的检测，将有助于发现大肠癌的早期信号。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明旨在提供一种人类粪便甲基化DNA的PCR检测引物体系，该引物体系及用该引物体系进行的鉴定方法可快速准确的检测人类粪便的DNA是否发生变化。
为了解决上述问题，本发明提供的一种人类粪便甲基化DNA的PCR检测引物体系采用了如下的技术方案：
一种人类粪便甲基化DNA的PCR检测引物体系，其特征在于：所述的引物体系由以下12个甲基化DNA的PCR扩增引物对组成：
（1）SNCA基因引物对Ⅰ:
正向引物：5’-TGCGGGTTGTAGCGTAGATTTCG-3’
反向引物：5’-CCGCTATAAACCGACGACGC-3’；
（2）SPG20基因引物对Ⅱ:
正向引物：5’-TGACGCGAAGCGTTCGAGAG-3’
反向引物：5’-ACGCTCGCCGAAAACCGATC-3’；
（3）ADAMTS1基因引物对Ⅲ:
正向引物：5’-AGGATCGTTCGGTTGTTCGGT-3’
反向引物：5’-AAACGCTCTAAAACGCCTCCG-3’；
（4）SFRP5基因引物对Ⅳ:
正向引物：5’-GCGTACGGCGAGGTTCGGGT-3’
反向引物：5’-CTCGATACCCGACGACCCAAAT-3’；
（5）SLC5A8基因引物对Ⅴ：
正向引物：5’-TAGCGGGTCGATTTTTCGAGG-3’
反向引物：5’-CTAACGCGCAAACGTAACGTC-3’；
（6）IGFBP3基因引物对Ⅵ：
正向引物：5’-GTTTTCGTAGTCGTGTTTGCGT-3’
反向引物：5’-ACTCGCATCTAAACGACCCGA-3’；
（7）GALR2基因引物对Ⅶ：
正向引物：5’-GATTTCGGATTTTGCGTGTGCG-3’
反向引物：5’-CTCGACGATCCCGAAATATCC-3’；
（8）SLC16A12基因引物对Ⅷ：
正向引物：5’-AGTTTTCGGCGGAGTTGGCG-3’
反向引物：5’-CGAACTAAACGAAAACGCCGAC-3’；
（9）SPOCK2基因引物对Ⅸ：
正向引物：5’-TGCGGATTTACGTTTCGGAAGCG-3’
反向引物：5’-TAACCGCGACAACCCTAACCGA-3’；
（10）TLX2基因引物对X：
正向引物：5’-TGTATTCGGAGTAGTCGCGTTCG-3’
反向引物：5’-ACCCGAACCGATCCGTCAATCA-3’；
（11）HLTF基因引物对XI：
正向引物：5’-GTTTTTGATTCGGCGTTCGGAA-3’
反向引物：5’-TCCAAACCGTTAAACCGAACGC-3’；
（12）HPP1基因引物对XII：
正向引物：5’-GTTTTTCGCGTTTTCGGCGTAG-3’
反向引物：5’-AACATCCCGCGAACGACGAC-3’。
优选的，所述的每条引物序列中包含2-3个CpG位点。
优选的，所述的引物体系的基因的每个引物序列的长度，呈梯度分布。
优选的，所述的每条引物PCR扩增产物的变性温度在82-84℃。
优选的，提供了一种人类粪便甲基化DNA的PCR检测试剂盒，其特征在于：包括一组甲基化DNA的PCR扩增引物和相应的PCR扩增体系。
本发明的有益效果在于：本发明设计独特的甲基化基因PCR扩增引物，克服目前的甲基化基因检测技术灵敏度不够高、检测稳定性差缺点，提供一种人类粪便甲基化DNA的PCR检测引物体系，该引物体系及用该引物体系进行的鉴定方法可快速准确的检测人类粪便的DNA是否发生变化。本发明在甲基化DNA特异性多重PCR扩增技术的基础上，通过对引物序列的选择，使设计的引物不仅保证PCR产物的长度呈梯度分布；各PCR产物的退火温度保持接近，实现多重PCR条件下的非甲基化DNA的PCR产物在特定温度下的部分变性，从而可以被单链DNA特异性外切核酸酶消化移除，使甲基化DNA的检测灵敏度得到提高；通过使用毛细管电泳检测PCR产物，有效提高甲基化DNA检测的稳定性和重复性；多重PCR一次性检测多个甲基化基因，提高检测效率；本试剂盒包括一组甲基化DNA的PCR扩增引物和相应的PCR扩增体系。由于人粪便DNA含有大量人类肠道细菌DNA，一般的PCR扩增体系不能满足人源性DNA的PCR扩增的条件需要，所以本试剂盒的检测体系是为检测人粪便甲基化DNA所优化的。
附图说明
图1大肠癌患者粪便中甲基化DNA检测实例。
具体实施方式
为了更清楚的理解本发明提供的技术方案,下面结合具体的实施例对技术方案做进一步的说明。
实施例
近年来的研究发现，细胞癌变与基因的异常甲基化改变有关，通过对样品中甲基化基因的检测，可以提示相应样品中癌细胞的存在。对甲基化基因的检测，通常是用重亚硫酸盐处理样品DNA，将DNA链上所有不发生甲基化的C碱基转变为U，而一般DNA聚合酶识别U为T。根据重亚硫酸盐处理过的DNA序列，可以设计甲基化DNA特异的PCR扩增引物。本发明设计独特的甲基化基因PCR扩增引物，克服目前的甲基化基因检测技术灵敏度不够高、检测稳定性差缺点，提供一种人类粪便甲基化基因检测新方法和相应的试剂盒。
本发明旨在提供一种人类粪便甲基化DNA的PCR检测引物体系，该引物体系及用该引物体系进行的鉴定方法可快速准确的检测人类粪便的DNA是否发生变化。甲基化基因PCR扩增引物的设计，是根据相应基因的序列，经重亚硫酸钠处理转化后的DNA序列。
本发明的技术方案具体方案如下：
筛选出一组12个基因，根据目标检测区域甲基化DNA经重亚硫酸盐处理转化后是的序列，设计PCR引物。使每条引物序列中包含2-3个CpG位点，以提高引物对甲基化DNA的偏向性扩增；使这一组基因的每个PCR扩增产物的长度，呈梯度分布；使每个PCR扩增产物的变性温度在82-84度。各个基因启动子区域的甲基化DNA扩增PCR引物序列如下：
（1）SNCA基因引物对Ⅰ:
正向引物：5’-TGCGGGTTGTAGCGTAGATTTCG-3’
反向引物：5’-CCGCTATAAACCGACGACGC-3’；
（2）SPG20基因引物对Ⅱ:
正向引物：5’-TGACGCGAAGCGTTCGAGAG-3’
反向引物：5’-ACGCTCGCCGAAAACCGATC-3’；
（3）ADAMTS1基因引物对Ⅲ:
正向引物：5’-AGGATCGTTCGGTTGTTCGGT-3’
反向引物：5’-AAACGCTCTAAAACGCCTCCG-3’；
（4）SFRP5基因引物对Ⅳ:
正向引物：5’-GCGTACGGCGAGGTTCGGGT-3’
反向引物：5’-CTCGATACCCGACGACCCAAAT-3’；
（5）SLC5A8基因引物对Ⅴ：
正向引物：5’-TAGCGGGTCGATTTTTCGAGG-3’
反向引物：5’-CTAACGCGCAAACGTAACGTC-3’；
（6）IGFBP3基因引物对Ⅵ：
正向引物：5’-GTTTTCGTAGTCGTGTTTGCGT-3’
反向引物：5’-ACTCGCATCTAAACGACCCGA-3’；
（7）GALR2基因引物对Ⅶ：
正向引物：5’-GATTTCGGATTTTGCGTGTGCG-3’
反向引物：5’-CTCGACGATCCCGAAATATCC-3’；
（8）SLC16A12基因引物对Ⅷ：
正向引物：5’-AGTTTTCGGCGGAGTTGGCG-3’
反向引物：5’-CGAACTAAACGAAAACGCCGAC-3’；
（9）SPOCK2基因引物对Ⅸ：
正向引物：5’-TGCGGATTTACGTTTCGGAAGCG-3’
反向引物：5’-TAACCGCGACAACCCTAACCGA-3’；
（10）TLX2基因引物对X：
正向引物：5’-TGTATTCGGAGTAGTCGCGTTCG-3’
反向引物：5’-ACCCGAACCGATCCGTCAATCA-3’；
（11）HLTF基因引物对XI：
正向引物：5’-GTTTTTGATTCGGCGTTCGGAA-3’
反向引物：5’-TCCAAACCGTTAAACCGAACGC-3’；
（12）HPP1基因引物对XII：
正向引物：5’-GTTTTTCGCGTTTTCGGCGTAG-3’
反向引物：5’-AACATCCCGCGAACGACGAC-3’。
其使用方法如下：
第一步：从大肠癌患者粪便样品中提取的DNA，用重亚硫酸钠处理并纯化；
第二步：配制甲基化DNA的PCR扩增体系，包括PCR缓冲液、四种dNTP混合物，TaqDNA聚合酶；
第三步：加入本发明的试剂盒所设计的引物混合，加入经重亚硫酸钠处理并纯化的样品DNA，进行第一次PCR扩增；
第四步：步骤三的PCR产物加热至80度，使PCR产物获得部分变性；
第五步：用单链DNA特异性外切酶绿豆核酸酶对步骤5的PCR产物进行消化处理，
第六步：以步骤五的经消化处理的PCR产物为模板，用本发明的试剂盒设计的PCR引物混合物，在步骤二的PCR扩增体系中，进行第二次PCR反应；
第七步：将步骤六的反应产物，用全自动毛细管电泳分析系统进行检测，甲基化DNA和非甲基化DNA的PCR扩增产物在毛细管电泳检测系统的迁移时间不同，甲基化DNA的PCR产物在毛细管电泳检测系统中的迁移率比非甲基化DNA的要快，根据DNA片段出现的时间，判断甲基化DNA的存在。
本发明的有益效果在于：本发明设计独特的甲基化基因PCR扩增引物，克服目前的甲基化基因检测技术灵敏度不够高、检测稳定性差缺点，提供一种人类粪便甲基化DNA的PCR检测引物体系，该引物体系及用该引物体系进行的鉴定方法可快速准确的检测人类粪便的DNA是否发生变化。本发明在甲基化DNA特异性多重PCR扩增技术的基础上，通过对引物序列的选择，使设计的引物不仅保证PCR产物的长度呈梯度分布；各PCR产物的退火温度保持接近，实现多重PCR条件下的非甲基化DNA的PCR产物在特定温度下的部分变性，从而可以被单链DNA特异性外切核酸酶消化移除，使甲基化DNA的检测灵敏度得到提高；通过使用毛细管电泳检测PCR产物，有效提高甲基化DNA检测的稳定性和重复性；多重PCR一次性检测多个甲基化基因，提高检测效率；本试剂盒包括一组甲基化DNA的PCR扩增引物和相应的PCR扩增体系。由于人粪便DNA含有大量人类肠道细菌DNA，一般的PCR扩增体系不能满足人源性DNA的PCR扩增的条件需要，所以本试剂盒的检测体系是为检测人粪便甲基化DNA所优化的。

Claims (5)

1.一种人类粪便甲基化DNA的PCR检测引物体系，其特征在于：所述的引物体系由以下12个甲基化DNA的PCR扩增引物对组成：
（1）SNCA基因引物对Ⅰ:
正向引物：5’-TGCGGGTTGTAGCGTAGATTTCG-3’
反向引物：5’-CCGCTATAAACCGACGACGC-3’；
（2）SPG20基因引物对Ⅱ:
正向引物：5’-TGACGCGAAGCGTTCGAGAG-3’
反向引物：5’-ACGCTCGCCGAAAACCGATC-3’；
（3）ADAMTS1基因引物对Ⅲ:
正向引物：5’-AGGATCGTTCGGTTGTTCGGT-3’
反向引物：5’-AAACGCTCTAAAACGCCTCCG-3’；
（4）SFRP5基因引物对Ⅳ:
正向引物：5’-GCGTACGGCGAGGTTCGGGT-3’
反向引物：5’-CTCGATACCCGACGACCCAAAT-3’；
（5）SLC5A8基因引物对Ⅴ：
正向引物：5’-TAGCGGGTCGATTTTTCGAGG-3’
反向引物：5’-CTAACGCGCAAACGTAACGTC-3’；
（6）IGFBP3基因引物对Ⅵ：
正向引物：5’-GTTTTCGTAGTCGTGTTTGCGT-3’
反向引物：5’-ACTCGCATCTAAACGACCCGA-3’；
（7）GALR2基因引物对Ⅶ：
正向引物：5’-GATTTCGGATTTTGCGTGTGCG-3’
反向引物：5’-CTCGACGATCCCGAAATATCC-3’；
（8）SLC16A12基因引物对Ⅷ：
正向引物：5’-AGTTTTCGGCGGAGTTGGCG-3’
反向引物：5’-CGAACTAAACGAAAACGCCGAC-3’；
（9）SPOCK2基因引物对Ⅸ：
正向引物：5’-TGCGGATTTACGTTTCGGAAGCG-3’
反向引物：5’-TAACCGCGACAACCCTAACCGA-3’；
（10）TLX2基因引物对X：
正向引物：5’-TGTATTCGGAGTAGTCGCGTTCG-3’
反向引物：5’-ACCCGAACCGATCCGTCAATCA-3’；
（11）HLTF基因引物对XI：
正向引物：5’-GTTTTTGATTCGGCGTTCGGAA-3’
反向引物：5’-TCCAAACCGTTAAACCGAACGC-3’；
（12）HPP1基因引物对XII：
正向引物：5’-GTTTTTCGCGTTTTCGGCGTAG-3’
反向引物：5’-AACATCCCGCGAACGACGAC-3’。
2.根据权利要求1所述的一种人类粪便甲基化DNA的PCR检测引物体系，其特征在于：所述的每条引物序列中包含2-3个CpG位点。
3.根据权利要求1所述的一种人类粪便甲基化DNA的PCR检测引物体系，其特征在于：所述的引物体系的基因的每个引物序列的长度，呈梯度分布。
4.根据权利要求1所述的一种人类粪便甲基化DNA的PCR检测引物体系，其特征在于：所述的每条引物PCR扩增产物的变性温度在82-84℃。
5.提供了一种人类粪便甲基化DNA的PCR检测试剂盒，其特征在于：包含权利要求1所述的人类粪便甲基化DNA的PCR检测引物体系和相应的PCR扩增体系。
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