CN104694637A

CN104694637A - 粪便dna定量甲基化特异性pcr检测试剂盒及其用途

Info

Publication number: CN104694637A
Application number: CN201510079061.6A
Authority: CN
Inventors: 金黑鹰; 范怡梅; 杨青蓝; 邓超
Original assignee: Nanjing Hospital of TCM
Current assignee: Nanjing Hospital of TCM
Priority date: 2015-02-13
Filing date: 2015-02-13
Publication date: 2015-06-10

Abstract

本发明涉及粪便中检测结肠肿瘤发病相关抑癌基因表观突变试剂盒及其用途。试剂盒包括：(1)结肠肿瘤发病相关的抑癌基因启动子区CpG岛定量甲基化扩增引物3对及探针3条；(2)PCR扩增用试剂。通过本试剂盒得到的PCR扩增产物，可以通过定量甲基化特异性PCR(quantitative methylation specific PCR,qMSP)方法分析基因CpG岛甲基化状态。本试剂盒具有高效的CpG岛甲基化检出作用。用于粪便中结肠肿瘤发病相关抑癌基因表观突变检测。

Description

粪便DNA定量甲基化特异性PCR检测试剂盒及其用途

技术领域

本发明涉及一种粪便中结肠肿瘤发病相关抑癌基因表观突变检测试剂盒，特别涉及其在中国肠癌患病人群的表观突变分析与后果评估。

背景技术

结直肠癌是我国大中城市发病居第二、三位的主要恶性肿瘤，早期发现、早期治疗的效果比较理想。因此，寻找一种无创型的，具有高灵敏度及特异性的早期检测方法显得尤其重要。

已知抑癌基因的表观突变是癌症发生的早期事件，DNA启动子区的异常甲基化可导致相关基因的沉默或低转录活性，使相关蛋白的表达异常，引发癌症。研究发现，肠癌发病相关抑癌基因SPG20、SNCA及FBN1等特定启动子内CpG岛区域的甲基化水平在患者瘤组织和正常肠粘膜组织中差异明显，提示表观遗传标记物在结直肠癌早期诊断中的可能价值。肠黏膜的周期性脱落会随粪便排出体外，藉此，可利用粪便中相关基因qMSP及BSP方法检测DNA甲基化水平，开发一种方便快捷的结肠肿瘤早期筛查方法。

发明内容

本发明的目的是，提供一种粪便中结肠肿瘤发病相关抑癌基因表观突变检测试剂盒及其应用。

本发明的技术方案是：粪便DNA定量甲基化特异性PCR检测试剂盒，包括以下成分：

(1)肠癌发病相关的3种抑癌基因启动子区CpG岛定量甲基化扩增引物3对及探针3条，各对引物序列见表1；

(2)PCR扩增试剂，如dNTP、Ex Taq Hot Start、Premix Ex Taq^TM聚合酶等。

表1 CpG岛扩增引物及探针序列

本试剂盒扩增出的PCR产物可以采用定量甲基化特异性PCR(quantitativemethylation specific PCR,qMSP)进行基因CpG岛甲基化检测。因此，试剂盒中，还可以有亚硫酸氢盐修饰试剂和PCR扩增试剂：包括dNTP、Ex Taq Hot Start、Premix Ex Taq^TM聚合酶。

本发明所说的试剂盒用于检测粪便肠粘膜中肠癌发病相关抑癌基因启动子区CpG岛甲基化状态。

本试剂盒的检测基因启动子区CpG岛甲基化步骤包括：

(1)提取粪便样本肠粘膜组织DNA。

(2)DNA亚硫酸氢盐修饰：按照CHEMICON公司CpGenome^TM DNA修饰试剂盒说明书操作步骤，经过磺化、水解脱氨和碱性条件下去磺化三个主要步骤，将非甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶。而5-甲基-胞嘧啶不能进行该反应。

(3)基因启动子区CpG岛甲基化分析：

采用定量甲基化特异性PCR(quantitative methylation specific PCR,qMSP)，适用于基因CpG岛甲基化筛查。

针对亚硫酸氢盐修饰后的DNA序列设计引物及探针。引物及探针在CpG二联核苷处，设计为CG，只可以扩出甲基化的DNA。将待测样本DNA结果与甲基化阳性对照比较，用这种特异性扩增的方法来定量检测DNA中胞嘧啶的甲基化情况。

qMSP法的具体步骤为：

A.qPCR扩增反应体系：

引物及探针如表1所示。反应体系为10μl：TaKaRa Premix Ex Taq^TM聚合酶5μl、上

游引物(0.9μM)0.9μl、下游引物(0.9μM)0.9μl、TaqMan探针(3μM)0.4μl、亚硫酸氢盐修饰DNA(200ng/μl)2.6μl、ROX Ref 0.2μl。

B.qPCR反应条件：

95℃预变性30 sec；95℃变性10 sec，60℃左右复性30 sec(ACTIN50℃，ALU55℃，SNCA60℃或55℃，SPG2055℃)。

(4)统计分析

I.百分甲基化参考值(Percent methylated reference，PMR)计算:

采用2^-ΔΔCT法以[(待测样本的基因:ACTIN)/(甲基化阳性对照样本的基因:ACTIN)]×100计算PMR值。

II.接收者工作特征曲线(Receiver operating characteristic，ROC)分析标志基因的诊断价值：将肠癌患者及正常对照粪便肠粘膜DNA各标志基因PMR值带入计算，获得多对灵敏度及1-特异度值，绘制ROC曲线。

III.采用卡方检验及费歇尔确切概率法检验分析分类资料间差异。

本发明的有益效果：本试剂盒具有高效的基因启动子区CpG岛甲基化状态检测作用。实施实例，粪便中肠粘膜DNA中针对SPG20、SNCA及FBN1等基因启动子区CpG岛分析甲基化状态，采用试剂盒的qMSP检测方法提出，SPG20、SNCA及FBN1等基因甲基化率在结直肠癌患者及正常对照中差异显著。SPG20、SNCA及FBN1等基因甲基化用于结直肠癌检测的灵敏度及特异度为88.9％及64.7％、63.6％及89.5％、83.3％及91.7％。ROC分析提示SPG20、SNCA及FBN1等基因单独或联合甲基化对于肠癌均具有诊断价值，可以作为早期筛查的标志物。本试剂盒在肠癌患者粪便肠粘膜抑癌基因甲基化状态分析上具有重要作用，有望发展成为肠癌早期筛查试剂盒。

附图说明

图1是肠癌患者及正常对照粪便肠粘膜DNA各标志基因启动子区CpG岛甲基化状态的PMR值散点图：图示结直肠癌患者及正常对照中PMR值差异显著。

图2是肠癌患者及正常对照粪便肠粘膜DNA启动子区CpG岛qMSP结果的ROC曲线分析：图示结直肠癌患者相对正常对照比较，三种基因单独以及联合甲基化的ROC曲线下面积均接近1，P<0.05；提示这三种基因单独以及联合甲基化对于结直肠癌形成可能具有病因学意义，可以作为早期筛查的标志物。

图2中a、b、c、d分别对应SNCA、SPG20、FBN1三种基因及联合甲基化的ROC曲线。

具体实施方式

如下附表说明：表2显示qMSP法检测肠癌患者及正常对照粪便肠粘膜DNA甲基化率结果：显示三种基因启动子区CpG岛甲基化率在结直肠癌患者及正常对照中差异显著。

^*设定PMR值≥1.27(SNCA)、≥0.85(SPG20)、≥2.995(FBN1)为甲基化阳性

如下表3显示各基因qMSP法筛查肠癌的灵敏度和特异度：

实施例1：中国结直肠癌患者及正常对照SPG20、SNCA及FBN1等基因启动子区CpG岛甲基化状态分析：中国结直肠癌患者及正常对照各11及19名，收取粪便，分离提取粪便中脱落的肠粘膜，提取肠粘膜DNA。按照CHEMICON公司CpGenome^TMDNA修饰试剂盒说明书操作步骤进行DNA的亚硫酸氢盐修饰。修饰后的DNA行定量甲基化特异性PCR(qMSP)，引物及探针如表1所示。反应体系为10μl：TaKaRa PremixEx Taq^TM聚合酶5μl、上游引物(0.9μM)0.9μl、下游引物(0.9μM)0.9μl、TaqMan探针(3μM)0.4μl、亚硫酸氢盐修饰DNA(200ng/μl)2.6μl、ROX Ref 0.2μl。PCR反应条件：95℃预变性30 sec；95℃变性10 sec，60℃左右复性30 sec(ACTIN50℃，ALU55℃，SNCA60℃或55℃，SPG2055℃)。在ABI StepOne Plus实时定量PCR仪(AppliedBiosystems)上完成。采用2^-ΔΔCT法以[(待测样本的基因:ALU)/(甲基化阳性对照样本的基因:ALU)]×100计算PMR值。图1是肠癌患者及正常对照粪便肠粘膜DNA各标志基因启动子区CpG岛甲基化状态的PMR值散点图，由图可见结直肠癌患者及正常对照中PMR值差异显著。表2显示qMSP法检测肠癌患者及正常人粪便肠粘膜DNA甲基化率结果：显示三种基因启动子区CpG岛甲基化率在结直肠癌患者及正常对照中差异显著。图2是肠癌患者及正常人粪便肠粘膜DNA启动子区CpG岛qMSP结果的ROC曲线分析，提示SPG20、SNCA及FBN1等基因单独或联合甲基化对于肠癌均具有诊断价值，可以作为早期筛查的标志物。表3显示各基因qMSP法筛查肠癌的灵敏度和特异度。SPG20、SNCA及FBN1等基因甲基化用于结直肠癌检测的灵敏度及特异度为88.9％及64.7％、63.6％及89.5％、83.3％及91.7％。

Claims

1.一种粪便中结肠肿瘤发病相关抑癌基因表观突变检测试剂盒，其特征在于包括以下成分：

（1）结肠肿瘤发病相关的抑癌基因启动子区CpG岛定量甲基化扩增引物3对、探针3条；（2）PCR扩增用试剂；

所说的3对定量甲基化扩增引物序列如下：

第1对：SPG20基因qMSP分析引物SPG20-qMSP，用于扩增SPG20基因启动子区CpG位点处胞嘧啶甲基化的片段；

F: 5'- TGACGCGAAGCGTTCGAGAGCGCG-3'

R: 5'- CGCTCGCCGAAAACCGATCCCGAA-3'；

第2对：SNCA基因qMSP分析引物SNCA-qMSP，用于扩增SNCA基因启动子区CpG位点处胞嘧啶甲基化的片段；

F: 5'- TTTTTGTTTTTTTATTTTCGTGAGC-3'

R: 5'- AAAAAAAACCGCTATAAACCGAC-3'；

第3对：FBN1基因qMSP分析引物FBN1-qMSP，用于扩增FBN1基因启动子区CpG位点处胞嘧啶甲基化的片段

F: 5'- GGTAGAGATTGTGGGTGTTATAAGC -3'

R: 5'- ACTAAAAAAACGACGACTCCG -3'；

所说的3条定量甲基化分析探针序列如下：

第1条：SPG20基因qMSP分析探针SPG20-probe，用于分析SPG20基因启动子区CpG位点处胞嘧啶甲基化的片段；

5'-6FAM-CGTAACAACCAAAACGTTCCACG -TAMRA -3' ；

第2条：SNCA基因qMSP分析探针SNCA-probe，用于分析SNCA基因启动子区CpG位点处胞嘧啶甲基化的片段；

5'-6FAM-CGCTAACCTATCGTCGAATAACC -TAMRA -3'；

第3条：FBN1基因qMSP分析探针FBN1-probe，用于分析FBN1基因启动子区CpG位点处胞嘧啶甲基化的片段

5'-6FAM-CGACGACGACTACTCCCAATCG-TAMRA -3'。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，包括亚硫酸氢盐修饰试剂、PCR扩增试剂为dNTP、Ex Taq Hot Start、Premix Ex Taq^TM 聚合酶。

3.权利要求1-2之一所述的试剂盒用于检测粪便中结肠肿瘤发病相关抑癌基因表观突变。

4.根据权利要求3所述的试剂盒的应用，其特征是检测基因启动子区CpG岛甲基化步骤如下：

提取粪便样本肠粘膜组织DNA；

（2）DNA亚硫酸氢盐修饰：经过磺化、水解脱氨和碱性条件下去磺化三个主要步骤，将非甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶；而5-甲基-胞嘧啶不能进行该反应；

（3）基因启动子区CpG岛甲基化分析：

采用定量甲基化特异性PCR，适用于基因CpG岛甲基化筛查；

针对亚硫酸氢盐修饰后的DNA序列设计引物及探针；引物及探针在CpG二联核苷处，设计为CG，只能扩出甲基化的DNA；将待测样本DNA结果与甲基化阳性对照比较，用这种特异性扩增的方法来定量检测DNA中胞嘧啶的甲基化情况；

qMSP法的具体步骤为：

A. qPCR扩增反应体系，

根据所述引物及探针，反应体系为10μl ：TaKaRa Premix Ex Taq^TM聚合酶5μl、上

游引物（0.9μM）0.9μl、下游引物（0.9μM）0.9μl、TaqMan探针（3μM）0.4μl、亚硫酸氢盐修饰DNA (200ng/μl) 2.6μl、ROX Ref 0.2μl；

B. qPCR反应条件：

95℃预变性30 sec；95℃变性10 sec，60℃左右复性30 sec，其中ACTIN50℃，ALU55℃，SNCA60℃或55℃，SPG20 55℃；在实时定量PCR仪上完成。