CN105506133A - 用于检测sept9基因甲基化的组合物、试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于检测SEPT9基因甲基化的组合物、试剂盒及方法。用于检测SEPT9基因甲基化的组合物，包括上游检测引物和下游检测引物构成的引物对；所述上游检测引物包括SEQ？ID？NO.1所示的核苷酸序列；所述下游检测引物包括SEQ？ID？NO.2所示的核苷酸序列。还包括检测探针以及阻拦序列。本发明提供的利用一对引物、一条阻拦序列和一条探针检测患者血液中SEPT9基因V2拼接体启动子甲基化水平的简易方法，具有成本低廉、检测方便、灵敏性高的优点。

Description

用于检测SEPT9基因甲基化的组合物、试剂盒及方法

技术领域

本发明属于基因甲基化快速分子诊断领域，具体涉及用于检测SEPT9基因甲基化的组合物与试剂盒以及方法。

背景技术

结直肠癌(CRC)是世界第三常见恶性肿瘤，每年新发病例数约120万，约死亡病例数约61万人(2008年)。近20多年来，世界上多数国家结直肠癌(主要是结肠癌)发病率呈上升趋势。在美国每年约有15.4万新发直结肠癌患者，其中每年死亡人数超过5.2万。中国结直肠癌发病率上升趋势也十分明显。中国每年有超过40万新发直结肠癌患者，直结肠癌死亡19.5万，平均增速为4.2％远超过国际平均水平的2％。

根据世界卫生组织统计表明，北美国家直结肠癌患者5年生存率约为60％，而中国对应仅有32％。直结肠癌生存期与疾病的严重程度、分期相关，由于我国在直结肠癌的诊断水平，民众早诊意识等方面薄弱，80％以上为中晚期患者，早期诊断比例仅为11.8％。而有效的早期直结肠癌患者可使直结肠癌发病率降低60％，病死率降低80％。

目前，直结肠癌非侵入式检测方法用于疾病的筛查有效力非常低下，因为需要患者每年收集粪便样本便潜血试验或粪便免疫化学荧光检测，假阳性比率高，结果稳定性差，总体受检率小于3％。尽管乙状结肠镜检查或结肠镜检查检出率较高，是直结肠癌检查的金标准，但是需要患者做清理肠道准备、依靠麻醉并且侵犯隐私，患者会产生恐惧心理，检查出血或者感染等情况，总体依从性较差，受检率小于5％。因此，高特异性、高灵敏度、依从性好、非侵入式的直结肠癌早期诊断技术亟待解决。

DNA甲基化是调节基因表达转录的表观遗传方式之一，普遍存在与哺乳动物中。DNA甲基化主要发生在基因上游启动子CpG到的胞嘧啶上，形成CpG基因岛，关闭下游基因的表达。异常的DNA甲基化对基因表达的调控是肿瘤发生发展中的重要特点之一，并且在直结肠癌中被广泛验证。近年来，研究者发现患者血浆中大量基因甲基化包括p16、BMP3、NDRG4、SEPT9等与直结肠癌的发生、发展相关。其中，SEPT9(或成为septin9)是广泛存在于真核生物中的进化上保守的细胞骨架GTPase蛋白，参与多项细胞生命活动包括细胞分裂、极化、细胞凋亡等。血浆中SEPT9基因V2拼接体启动子甲基化与直结肠癌的发生和发展密切相关，基因甲基化情况能有效区分直结肠癌患者与健康人群，可单独作为直结肠癌诊断、预后的指标。

针对SEPT9基因V2拼接体启动子甲基化水平有CN201410452285.2、CN201410030771.5和CN201510264501.5。CN201410452285.2根据甲基化与非甲基化亚硫酸氢盐处理后序列不同，PCR扩增的温度溶解曲线不同而产生不同的荧光峰值，来对SEPT9基因甲基化进行检测与定量。然而高分辨溶解曲线仅能在如LightCyclerTM480PCR或LightScanner等少量仪器可以使用，并且技术要求高，不利于广泛推广。CN201410030771.5采用五对引物、五条Blocker和五条探针对SEPT9基因甲基化，检测成本较高，扩增反应复杂，易出现引物、探针干扰导致检测结果不稳定。CN201510264501.5通过引入脱氧次黄嘌呤核苷酸碱基(I)，检测时需同步进行两个反应体系，检测结果由两个反应体系进行比较获得，检测成本较高且结果判读复杂。

发明内容

本发明针对现有的不足，提供了一种利用一对引物、一条阻拦序列(即Blocker)和一条探针检测患者血液中SEPT9基因V2拼接体启动子甲基化水平的简易方法，具有成本低廉、检测方便、灵敏性高的特点。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

SEPT9基因V2拼接体启动子甲基化的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示，为GCGCGATTCGTTGTTTATTAGTTATTATGATTTGTTAATAGTTGGATGGGATTATTTCGG，其中，加粗部分核苷酸为SEPT9基因V2拼接体启动子甲基化位点。

本发明提供一种用于检测SEPT9基因甲基化的组合物，包括上游检测引物和下游检测引物构成的引物对；

所述上游检测引物包括SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，所述SEQIDNO.1所示的核苷酸序列为5'-AAATAATCCCATCCAACTA-3'；

所述下游检测引物包括SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，所述SEQIDNO.2所示的核苷酸序列为5'-TTAACCGCGAAATCCGAC-3'。

用上述引物对扩增的PCR产物的尺寸均在40bp至200bp的范围中，这可以使得能够在短时间内特异性基因。

利用本发明提供的上述引物检测人直结肠癌基因基因甲基化时，与传统检测方法相比，本发明具有检测方便、灵敏度高和特异性好等优点。

进一步，还包括具有阻拦序列的DNA片段，所述阻拦序列的DNA片段用于结合非甲基化SEPT9基因，在甲基化SEPT9基因经过亚硫酸氢盐转化后的产物中，该阻拦序列的DNA片段在PCR反应退火过程中优先于上述的引物对结合非甲基化SEPT9基因。

进一步，所述阻拦序列包括SEQIDNO.3所示的核苷酸序列，优选地，所述阻拦序列为SEQIDNO.3所示的核苷酸序列，并在3'端具有3'-SpacerC3，为5'-GTTATTATGTTGGATTTTGTGGTTAATGTGTAG-C3-3'。

C3(即3'-SpacerC3，dSpC3)主要用于模仿核糖的3'和5'羟基间的三碳间隔，或“替代”一个序列中未知的碱基。C3用于引进一个3'间臂从而阻止3'端外切酶和3'端聚合酶发挥作用。

上述序列可以阻拦上游检测引物与非甲基化SEPT9基因结合。

进一步，还包括检测探针，所述检测探针与引物对中的上游检测引物或下游检测引物匹配。

进一步，所述检测探针包括SEQIDNO.4所示的核苷酸序列；优选地，所述检测探针为SEQIDNO.4所示的核苷酸序列。

进一步，所述检测探针的5'端标记有荧光基团，所述检测探针的3'端标记有淬灭基团。

上述探针可选用下述任一荧光基团在其5'端标记：FAM、VIC、TET、JOE、HEX、CY3、CY5、ROX、RED610、TEXASRED、RED670、NED，选用下述任一淬灭基团在其3'端标记：6-TAMRA、BHQ-1～3、和结合分子沟的非荧光淬灭剂(MinorGrooveBindernonfluorescentquencher,MGBNFQ)。优选地，荧光标记物选择FAM，淬灭剂选择BHQ-1。

进一步，还包括内标引物对和内标探针；

所述内标引物对包括上游内标引物和下游内标引物，为用于扩增β-actin基因；

上游内标引物包括SEQIDNO.5所示的核苷酸序列，所述SEQIDNO.5所示的核苷酸序列为5'-TTTTTGATTAGGTGTTTAAGA-3'，

下游内标引物包括SEQIDNO.6所示的核苷酸序列，所述SEQIDNO.6所示的核苷酸序列为5'-CACCAACCTCATAACCTTATC-3'；

内标探针，即β-actin探针，该探针包括SEQIDNO.7所示的核苷酸序列，所述SEQIDNO.7所示的核苷酸序列为5'-CCACGGACGATAGTGTTGTGG-3'，内标探针的5'端标记有荧光基团，所述内标探针的3'端标记有淬灭基团。

优选地，上游内标引物为SEQIDNO.5所示的核苷酸序列，下游内标引物为SEQIDNO.6所示的核苷酸序列，内标探针为SEQIDNO.7所示的核苷酸序列。

用上述引物对扩增的PCR产物的尺寸均在40bp至200bp的范围中，这可以使得能够在短时间内扩增特异性基因。上述内标探针可选用下述任一荧光基团在其5'端标记：FAM、VIC、TET、JOE、HEX、CY3、CY5、ROX、RED610、TEXASRED、RED670、NED，选用下述任一淬灭基团在其3'端标记：6-TAMRA、BHQ-1～3、和结合分子沟的非荧光淬灭剂(MinorGrooveBindernonfluorescentquencher,MGBNFQ)。优选地，荧光标记物选择HEX，淬灭剂选择BHQ-1。

本发明还提供一种用于检测SEPT9基因甲基化的试剂盒，包括上述的用于检测SEPT9基因甲基化的组合物，以及PCR反应试剂、基因组提取液、基因组甲基化处理液、阳性对照品、阴性对照品中的一种或者多种。

可以将用于检测SEPT9基因甲基化的组合物以及PCR反应试剂预先配制成PCR反应液，具体可以按照下列反应体系配制：

组分	体积(摩尔)
		Buffer 10×	8μL
SEPT9上游检测引物	0.6μM
		SEPT9下游检测引物	0.6μM
SEPT9检测探针	0.2μM
		上游内标引物	0.9μM
下游内标引物	0.9μM
		内标探针	0.2μM
阻拦序列	2μM
		dNTP	0.8mM
双蒸水	补足24.4μl

所述基因组提取液至少包含细胞裂解液体、磁珠溶液、磁珠清洗液、基因组洗脱液的一种或者多种；

细胞裂解液体:3.6mol/LGuHCl,10mmol/LTris-HCl,1mmol/LEDTA,1/4体积异丙醇,0.1％SDS,2％TritonX-100,1％的β-巯基乙醇,800mmol//LNaCl,200mmol/L柠檬酸纳,pH＝6.8；

磁珠溶液:氧化硅磁珠悬浮液

磁珠清洗液:800mmol/LLiCl,100mmol/LNaCl,50mmol/LMOPS,60％乙醇,pH＝7.0；

洗脱缓冲液:10mmolTis-HCl,1mmolEDTA,pH＝8.0；

所述基因组甲基化处理液包括亚硫酸氢盐溶液、DME自由基清除液、poly(A)溶液、结合缓冲液的一种或者多种。

实施例中的亚硫酸氢盐溶液采用的是亚硫酸钠和亚硫酸氢钠的混合溶液，具体配制方法如下：分别称取4.71mg亚硫酸氢钠和1.13mg亚硫酸钠溶解在10毫升去离子水中，通过剧烈振动与加热(50℃)，pH调整为5.4-5.5。

DME自由基清除液配制：称取188mg奎诺二甲基丙烯酸酯溶解于二甘醇二甲醚(DME)溶液，涡旋混匀。

poly(A)溶液：500ng/Lpoly(A)溶液。

结合缓冲液：0.5MEDTA，10％BSA的PBS溶液。

洗涤缓冲液：0.05％Tween-20的PBS缓冲溶液。

基因组洗脱液:10mmolTis-HCl,1mmolEDTA,pH＝8.0。

阳性对照品为包括SEQIDNO.9所示的核苷酸序列的DNA片段或者载体，SEQIDNO.9所示的核苷酸序列为：GCGCGATTCGTTGTTTATTAGTTATTATCGGATTTCGCGGTTAACGCGTAGTTGGATGGGATTATTTCGG。

阴性对照品可以为0.9％(m/v)生理盐水。

本发明还提供一种用于检测SEPT9基因甲基化的方法，包括如下步骤：

1)取患者静脉血液，分离血浆，提取血浆中游离的DNA，作为待检测样本的DNA；

2)利用亚硫酸氢盐转化甲基化区域；

3)在检测体系中加入待检测样本的DNA、所检测基因对应的检测引物对和检测探针、阻拦序列、用于扩增内标基因的内标引物对和内标探针以及PCR反应试剂进行扩增，同时设阳性对照、阴性对照，通过荧光定量PCR的结果分析SEPT9基因甲基化清况；或者，在检测体系中加入待检测样本的DNA、所检测基因对应的检测引物对、用于扩增内标基因的内标引物对、PCR反应试剂和荧光嵌入剂进行扩增，同时设阳性对照、阴性对照，通过荧光定量PCR的结果分析SEPT9基因甲基化清况。

所述荧光嵌入剂为能够与双链DNA结合而发出荧光的试剂，包括Taqman探针、SYBRGreenI、SYBRGreenII、SYBRGold、噁唑黄、噻唑橙、溴化乙锭、PICOGREEN等。

PCR扩增时，可以按照下面的程序进行：

结果分析可以采用以下方法：以FAM/HEX达到设定的阈值所需的循环数Ct作为判断标准，且呈现S型扩增曲线为阳性，否则为阴性。

所述的甲基化是指在CpG甲基化结合蛋白和DNA甲基化转移酶的作用下，使基因上游启动子CpG二核苷酸5'端的胞嘧啶转变成为5'甲基胞嘧啶。

所述的CpG甲基化或CpG岛是指CpG甲基化或CpG岛是基因启动子甲基化的主要存在形式。

所述的亚硫酸氢盐转化是指样本经亚硫氢酸盐处理后,甲基化的胞嘧啶(C)保持不变,但非甲基化的胞嘧啶被转化成脲嘧啶，因此在利用该处理产物进行PCR检测，可以区分特定CpG岛甲基化情况。

与现有SEPT9基因甲基化检测方法相比，本发明所述的检测方法，仅需要一个反应(反应体系包括一对引物、一条Blocker和一条探针检)测患者血液中SEPT9基因V2拼接体启动子甲基化水平的简易方法，具有反应检测方法简单、成本低廉、灵敏度高的特点，适合对直结肠癌患者进行早期诊断筛查。

本发明所述的扩增原理如图3所示。如图3A所示，当DNA为非甲基化状态时，阻拦序列与DNA模板结合，占据引物与探针结合位置，无PCR产物与荧光信号产生；如图3B所示，当DNA序列为甲基化状态时，阻拦序列不能与DNA模版结合，留出引物和探针与模板结合，扩增模版DNA并产生荧光信号，因此通过检测荧光信号反映DNA序列甲基化。

附图说明

图1为利用本发明所述的试剂盒检测甲基化重组质粒的结果；

图2为利用本发明所述的试剂盒检测非甲基化重组质粒的结果；

图3为本发明的扩增原理图，图3A为未甲基化SEPT9基因的扩增原理图，图3B为甲基化SEPT9基因的扩增原理图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为常规商业获得。

实施例1用于检测SEPT9基因甲基化的试剂盒的制备

本发明所提供的用于SEPT9基因甲基化的试剂盒组成如下：

1、PCR反应混合液

PCR反应混合液各组分与浓度组成如下：Buffer10×缓冲液8μL、SEPT9上游检测引物0.6μM、SEPT9下游检测引物0.6μM、SEPT9检测探针0.2μM、上游内标引物0.9μM、下游内标引物0.9μM、内标探针0.2μM、阻拦序列2μM、dNTP各组分0.8mM，双蒸水补足24.4μL。

其中，10×ExTaqBuffer(Mg²⁺plus)缓冲液购自TAKARA宝生物工程(大连)有限公司，型号9152A。

SEPT9上游检测引物的序列如SEQIDNO.1所示，SEPT9下游检测引物如SEQIDNO.2所示，SEPT9检测探针的序列如SEQIDNO.4所示；

阻拦序列如SEQIDNO.3所示，并在3'端具有3'-SpacerC3，为5'-GTTATTATGTTGGATTTTGTGGTTAATGTGTAG-C3-3'；

上游内标引物如SEQIDNO.5所示，下游内标引物如SEQIDNO.6所示，内标探针如SEQIDNO.7所示；

上述各引物、探针以及阻拦序列均在南京金斯瑞生物技术公司合成。

2、Taq酶：购自TAKARA的HSTaq酶。

3、基因组提取液至少包含细胞裂解液体、磁珠溶液、磁珠清洗液、基因组洗脱液的一种或者多种。

4、基因组甲基化处理液包括亚硫酸氢盐溶液、DME自由基清除液、poly(A)溶液、结合缓冲液的一种或者多种。

5、阳性对照品为SEQIDNO.9所示的核苷酸序列的DNA片段，其序列为：

GCGCGATTCGTTGTTTATTAGTTATTATCGGATTTCGCGGTTAACGCGTAGTTGGATGGGATTATTTCGG，由南京金斯瑞生物技术公司合成。

6、阴性对照品为0.9％(m/v)生理盐水。

实施例2用于检测SEPT9基因甲基化的试剂盒的使用方法

1、配制PCR反应体系

组分	体积
		PCR反应混合液	24.4μL
Taq酶	0.6μL
		样本DNA	15μL
总体积	40μL

取22.4μL的PCR反应混合液、0.6μLTaq酶和15μL样本DNA混合成为50μL反应溶液，涡旋震荡均匀后离心。

2、荧光实时定量PCR反应与检测

荧光定量PCR反应条件如上表所示：第一阶段：94℃5min；第二阶段：94℃20s、63℃30s，5循环；第三阶段：94℃20s、63℃30s，40环，收集FAM/HEX信号。

3、结果判断

反应结束后，根据各反应腔中样本的扩增曲线与循环数Ct作为SEPT9基因甲基化存在与否的判断依据。

第一步，样本的内标的检测信号呈现S扩增曲线且Ct值小于40，说明本次扩增有效，否则说明本次扩增无效。

第二步，在扩增有效的前提下：

若待测样本产生S型扩增曲线且Ct值小于40，则所述样本中存在SEPT9基因甲基化；

若待测样本产生S型扩增曲线且Ct值大于或等于40且小于45，重复实验1次；若重复实验的结果为Ct值小于40，则待测样本中存在SEPT9基因甲基化，否则，待测样本中不存在SEPT9基因甲基化；

若Ct值大于或等于45，则待测样本中不存在SEPT9基因甲基化。

实施例3.用于检测SEPT9基因甲基化的试剂盒的灵敏度分析

一、参考品DNA核酸的制备

构建包含SEPT9基因甲基化或非甲基化的质粒

1、含有SEPT9基因甲基化的质粒构建

以SEPT9基因甲基化为模板，由南京金斯瑞生物技术公司合成SEQIDNO.9标准品1。将SEQIDNO.9连接到pUC57载体，并测序校对。

标准品1具有SEQIDNO.9所示的核苷酸序列：

GCGCGATTCGTTGTTTATTAGTTATTATGATTTGTTAATAGTTGGATGGGATTATTTCGG。

2、含有SEPT9基因非甲基化的质粒构建

以SEPT9基因非甲基化为模板，由南京金斯瑞生物技术公司合成SEQIDNO.10标准品2。将SEQIDNO.10连接到pUC57载体，并测序校对。

标准品2具有SEQIDNO.10示的核苷酸列：

GCGCGATTCGTTGTTTATTAGTTATTATGATTTGTTAATAGTTGGATGGGATTATTTCGG。

标准品1和标准品2中的黑色加粗部分为二者有区别的碱基。

二、用于检测SEPT9基因甲基化的试剂盒的灵敏度分析

1、不同浓度的参考品制备

将上述步骤合成的质粒进行定量，并定量为10¹⁰拷贝/μL，并梯度稀释，得到10⁵拷贝/μL、10⁴拷贝/μL、10³拷贝/μL、10²拷贝/μL、10¹拷贝/μL、10⁰拷贝/μL等不同浓度梯度稀释液,作为样本DNA。

2、反应体系配制

组分	体积
		PCR反应混合液	24.4μL
Taq酶	0.6μL
		样本DNA	15μL
总体积	40μL

取22.4μL的PCR反应混合液、0.6μLTaq酶和15μL样本DNA，混合成为50μL反应溶液，涡旋震荡均匀后离心。

3、荧光实时定量PCR反应与检测

荧光定量PCR反应条件如上表所示：第一阶段：94℃5min；第二阶段：94℃20s、63℃30s，5循环；第三阶段：94℃20s、63℃30s，40循环，收集FAM/HEX信号。

4、结果判断

结果如图1所示：

对于甲基化重组质粒而言，反应体系最低检出10⁰拷贝/μL的模板，扩增结果均有明显的S型扩增曲线。以上结果说明该试剂盒具有较高的扩增灵敏度。

结果如图2所示：

对于非甲基化重组质粒而言，扩增结果未有明显的S型扩增曲线。以上结果说明该试剂盒具有较高的扩增特异性。

实施例4用于检测SEPT9基因甲基化的试剂盒检测临床血液样本

1、患者要求

分别在两家三甲医院收集60例患者，男女比例约为1：1.14，涵盖不同发展阶段的直结肠癌病人，对照患者包括经结肠镜检查证实的无结肠疾病患者，其他疾病的控制和数与腺瘤性息肉的患者。所有癌症患者和健康对照者要求至少40岁，最优选择50岁以上患者并且主要来源于同一家诊所。所有受试者没有艾滋病毒，乙肝病毒或癌症病史，并且无严重急性加重的症状慢性病。

2、血液样本采集与处理

用EDTA真空采血管静脉采集患者血液，血液收集4小时内，1500g离心10分钟分离血浆，接下来轻轻转移血浆(注意不能破坏白细胞层)于15毫升离心管中，再次1500g离心10分钟。如果每位患者血液样本收集多管，将血浆汇合到同离心管中并放置于-80℃储存。

3、DNA提取

(1)在56℃条件下，用蛋白酶裂解样品10分钟。

(2)加入100uL磁性颗粒和15mL的结合缓冲液；并室温条件下，在旋子上结合60分钟；

(3)磁性粒子捕获4分钟后，弃上清液，用3毫升洗涤缓冲液重悬沉淀；

(4)将1.5mL的悬液转移至2mL的离心管中，磁性粒子捕获后弃上清液。

(5)重复(4)步骤1次。

(6)离心后移除洗涤液。将试管通风处晾干5分钟，

(7)加入100uL的洗脱缓冲液，65℃震动混合在15分钟。

(8)将洗脱的DNA转移到0.5mL试管中。

(9)对提取的基因组DNA进行定量检测。

4、亚硫酸氢盐转化

亚硫酸氢盐转化是指样本经亚硫酸氢盐处理后,甲基化的胞嘧啶(C)保持不变,但非甲基化的胞嘧啶被转化成脲嘧啶,因此在利用该处理产物进行PCR检测，可以区分特定CpG岛甲基化情况，具体可以采用以下操作。

(1)取95-100uL上述提取的基因组于0.5mL的EP管中；

(2)分别加入100uL亚硫酸氢盐溶液和30uLDME自由基清除液；

(3)执行亚硫酸氢盐转化程序

温度	时间
		99℃	5min
50℃	25min
		99℃	5min
50℃	1h 25min
		99℃	5min
50℃	4h 55min
		20℃	hold

5、亚硫酸氢盐纯化

(1)将320μL上述反应液转移到2mLEP管中，加入1μLployA(50ng/uL)和1.5mL结合缓冲液；

(2)加入10μL磁珠涡旋；

(3)室温条件下，离心1000rpm，60min；

(4)分离磁珠，弃上清；

(5)用洗涤缓冲液洗涤2次；70％酒精洗涤1次

(6)晾干EP管，加入55μL洗脱缓冲液；

(7)55℃震动混合在15分钟；

(8)将洗脱的DNA转移到0.5mL试管中。

6、加样体系

组分	体积
		PCR反应混合液	24.4μl
Taq酶	0.6μL
		步骤5处理过的基因组DNA	15μL
总体积	40μL

其中，反应混合液包括：Buffer10×缓冲液8μL、SEPT9上游检测引物0.6μM、SEPT9下游检测引物0.6μM、SEPT9检测探针0.2μM、上游内标引物0.9μM、下游内标引物0.9μM、内标探针0.2μM、阻拦序列2μM、dNTP各组分0.8mM，双蒸水补足24.4μL。

7、扩增程序

荧光定量PCR反应条件如上表所示：第一阶段：94℃5min；第二阶段：94℃20s、63℃30s，5循环；第三阶段：94℃20s、63℃30s，40环，收集FAM/HEX信号。以FAM/HEX达到设定的阈值所需的循环数Ct作为判断标准，且呈现S型扩增曲线则SEPT9基因甲基化为阳性，否则为阴性。

8、检测结果

如表1所示，60例已确诊为直结肠癌患者，该检测试剂盒检测SEPT9甲基化阳性为53例，总体检出率为88.3％；如表2所示，60例确诊为健康患者，有58例患者显示SEPT9甲基化为阴性，总体特异性为96.7％。

表1其中一家医院采集的样本的检测结果

注：病理分期参考TNM分期系统

表2另外一家医院采集的样本的检测结果

有上述结果及操作过程可见，本发明提供的SEPT9甲基化检测试剂盒操作简便、成本低廉，并且对直结肠癌检测的灵敏度与特异性较高。

本发明所述的用于检测人直结肠癌基因基因甲基化的引物、探针、检测方法和试剂盒。与传统检测方法相比，本发明方法具有检测方便、灵敏度高和特异性好的特点；与现有SEPT9基因甲基化检测方法相比，本发明仅需要一个反应(反应体系包括一对引物、一条Blocker和一条探针检)测患者血液中SEPT9基因V2拼接体启动子甲基化水平的简易方法，具有反应检测方法简单、成本低廉、灵敏度高的特点，适合对直结肠癌患者进行早期诊断筛查。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.用于检测SEPT9基因甲基化的组合物，其特征在于，包括上游检测引物和下游检测引物构成的引物对；

所述上游检测引物包括SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，所述SEQIDNO.1所示的核苷酸序列为5′-AAATAATCCCATCCAACTA-3′；

所述下游检测引物包括SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，所述SEQIDNO.2所示的核苷酸序列为5′-TTAACCGCGAAATCCGAC-3′。

2.根据权利要求1所述用于检测SEPT9基因甲基化的组合物，其特征在于，还包括阻拦序列，所述阻拦序列用于结合非甲基化SEPT9基因，在甲基化SEPT9基因经过亚硫酸氢盐转化后的产物中，该阻拦序列在PCR反应退火过程中优先于权利要求1所述的引物对结合非甲基化SEPT9基因。

3.根据权利要求2所述用于检测SEPT9基因甲基化的组合物，其特征在于，所述阻拦序列包括SEQIDNO.3所示的核苷酸序列，并在3′端具有3′-SpacerC3。

4.根据权利要求1至3任一项所述用于检测SEPT9基因甲基化的组合物，其特征在于，还包括检测探针，所述检测探针与引物对中的上游检测引物或下游检测引物匹配。

5.根据权利要求4所述用于检测SEPT9基因甲基化的组合物，其特征在于，所述检测探针包括SEQIDNO.4所示的核苷酸序列。

6.根据权利要求5所述用于检测SEPT9基因甲基化的组合物，其特征在于，所述检测探针的5′端标记有荧光基团，所述检测探针的3′端标记有淬灭基团。

7.根据权利要求1、2、3、5或6任一项所述用于检测SEPT9基因甲基化的组合物，其特征在于，还包括内标引物对和内标探针；

所述内标引物对包括上游内标引物和下游内标引物，

上游内标引物包括SEQIDNO.5所示的核苷酸序列，所述SEQIDNO.5所示的核苷酸序列为5′-TTTTTGATTAGGTGTTTAAGA-3′，

下游内标引物包括SEQIDNO.6所示的核苷酸序列，所述SEQIDNO.6所示的核苷酸序列为5′-CACCAACCTCATAACCTTATC-3′；

内标探针包括SEQIDNO.7所示的核苷酸序列，所述SEQIDNO.7所示的核苷酸序列为5′-CCACGGACGATAGTGTTGTGG-3′，内标探针的5′端标记有荧光基团，所述内标探针的3′端标记有淬灭基团。

8.用于检测SEPT9基因甲基化的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1至7任一项所述的用于检测SEPT9基因甲基化的组合物，以及PCR反应试剂、基因组提取液、基因组甲基化处理液、阳性对照品、阴性对照品中的一种或者多种。

9.用于检测SEPT9基因甲基化的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)取患者静脉血液，分离血浆，提取血浆DNA，作为待检测样本DNA；

2)利用亚硫酸氢盐转化甲基化区域；

3)在检测体系中加入待检测样本的DNA、所检测基因对应的检测引物对和检测探针、阻拦序列、用于扩增内标基因的内标引物对和内标探针以及PCR反应试剂进行扩增，同时设阳性对照、阴性对照，通过荧光定量PCR的结果分析SEPT9基因甲基化清况；或者，在检测体系中加入待检测样本的DNA、所检测基因对应的检测引物对、用于扩增内标基因的内标引物对、PCR反应试剂和荧光嵌入剂进行扩增，同时设阳性对照、阴性对照，通过荧光定量PCR的结果分析SEPT9基因甲基化清况。