CN106480210A - 一种肿瘤循环dna甲基化检测引物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了肿瘤循环DNA甲基化PCR检测引物、探针、阻断片段和试剂盒，以及检测肿瘤循环DNA甲基化的方法。本发明具有灵敏度高，特异性强、重复性好、操作简单、安全等优点，检测结果具有较高的精密度和重复性，对大肠癌的早期检测有一定的辅助诊断作用。

Description

一种肿瘤循环DNA甲基化检测引物
技术领域
本发明涉及基因检测领域，特别是涉及一种对肿瘤循环DNA甲基化检测引物。
背景技术
肿瘤循环DNA(ctDNA)是人体血液循环系统中不断流动的、并具有某些特征(包括点突变、甲基化修饰异常、染色体的缺失、插入、重排和拷贝数异常等)的来源于肿瘤细胞基因组的DNA片段，属于游离核酸的一种，其主要来源包括：1、凋亡的肿瘤细胞；2、坏死的肿瘤细胞；3、循环肿瘤细胞；4、肿瘤细胞分泌的外排体。其含量约占整个循环DNA的0.01～1％，对血液中的肿瘤循环DNA进行检测，可作为肿瘤的早期诊断的生物标志物和预后评估指标，对肿瘤的普查、筛查和风险评估、早期诊断、分期分型及治疗监测都具有重要意义。
肿瘤循环(ct-DNA)标本包括肿瘤细胞和或癌细胞死亡或者凋亡后释放到外周血循环中的肿瘤循环DNA，所述待测肿瘤循环(ct-DNA)标本来源于人类正常细胞、肿瘤细胞、癌细胞、血清游离DNA、血浆游离DNA、体液游离DNA或者排泄物细胞DNA和游离DNA。
DNA甲基化水平和模式的改变是肿瘤发生的一个重要因素，这些变化包括CpG岛局部的高甲基化和基因组DNA低甲基化状态。由于CpG岛的局部高度甲基化要早于细胞恶性增生，故其甲基化的检测可用于肿瘤的预测，而全基因组水平的低水平甲基化状态，则随着肿瘤恶性程度的增加而进一步降低，使其可用于肿瘤的诊断以及分级。甲基化可作为肿瘤等早期诊断的生物标记物和预后评估指标，对肿瘤的筛查和风险评估、早期诊断、分期分型、预后判断及治疗监测都具有重要的意义。
Septin基因家族至少由13个基因组成，它们编码保守的GTPase结构域，可以结合细胞骨架相关的蛋白质，这些蛋白质与肿瘤发生相关。Septin基因家族蛋白质的主要功能是胞质分裂、膜泡运输、膜融合、胞外分泌、细胞凋亡。Septin9基因通过选择性剪接有5种不同的转录本，其蛋白质涉及到许多细胞过程，Septin9行为异常将引起细胞不完整分裂。已有研究表明Septin9基因的第二种转录本启动子的甲基化和大肠癌的发生有关。由此可见，检测mSEPT9基因甲基化异常修饰可作为大肠癌早期诊断的一个生物标志物。
目前，传统的甲基化检测方法包括：
直接测序法(亚硫酸氢盐测序法)，专利申请CN104046686A采用此方法，原理是：重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，PCR扩增后，尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶，最后对PCR产物进行测序并且与未经处理的序列比较，判断CpG位点是否发生甲基化。但此方法实验过程长，需要大量的克隆测序，过程较为繁琐，实验检测的费用高。甲基化特异性PCR法，用重亚硫酸盐使胞嘧啶转化为尿嘧啶，进行引物设计(每个基因设计两对引物，分别为：甲基化引物M、非基因化引物U，对应扩增甲基化和非甲基化的目的片段)，有时需设计巢式引物；PCR扩增：对甲基化和非甲基化的目的片段分别进行扩增，此时应尽可能使用梯度PCR仪，同时使用不同的退火温度，以筛选到合适的退火温度；对PCR产物电泳。该方法检测时间相对较长，不能及时获得检测结果。
甲基荧光法是基于Taqman荧光实时定量技术的甲基化检测技术。其过程如下：先用重亚硫酸盐处理待测DNA片段，设计一个能与待测位点区互补的探针，探针的5'端连接报告荧光，3'端连接淬灭荧光，随后一般采用MSP引物进行实时定量PCR。Methylight法最大的优势在于其高通量和高敏感性，且无需在PCR后再进行电泳、杂交等操作，减少了污染和操作误差。但该方法多为单重PCR检测，没有内参基因的扩增，不能确保模板DNA的硫化修饰质量。
专利申请CN103732759A提到可以使用甲基化特异性PCR法和甲基荧光法，但是其通过测量Septin9、甲基化RASSF2A和HB14基因的三重测定方法测定Septin9和甲基化RASSF2A的水平。可以以单重、二重、三重、四重或多重(multiplex)方式进行类似的测定。其方法既操作繁琐也没有显示具体可行的实验结果，限制了其在临床实验室的广泛应用。
甲基化敏感性解链曲线分析法是将PCR扩增和溶解曲线分析结合在一起，由于目的片段的微小序列差异引起PCR溶解温度的改变，从而可以对基因突变、基因分型、基因甲基化等进行检测。国内专利申请CN104164516A即采用此方法。但该方法需要不同甲基化程度的标准品，实验结果读取复杂繁琐。并且该方法用的荧光染料为饱和荧光染料，结果只能检测一个荧光信号通道，不能同时分析样本内参基因的扩增情况，不能推断硫化修饰的效果，容易出现重亚硫酸盐处理不完全的问题以及假阴性。
甲基化敏感性限制性内切酶(methylation-sensitive restriction Endonuclease，MS-RE法)。这种方法利用甲基化敏感性限制性内切酶对甲基化区的不切割的特性，将DNA消化为不同大小的片段后再进行分析。缺点是：1.由于CG不仅仅限于CCGG序列中，因此非该序列中的CG将被忽略；2.只有检测与转录相关的关键性位点的甲基化状态时,该检测方法的结果才有意义；3.相对而言，Southern方法较复杂，且需要样本的量大；4.存在着酶不完全消化引起的假阳性的问题；5.不适用于混合样本。
总之，目前肿瘤循环DNA甲基化检测技术由于提取游离核酸的回收率不高，区分基因位点CpG岛甲基化修饰技术的局限性和后续荧光定量PCR检测ctDNA标本低浓度(50pg以下)低纯度、高背景的非靶点DNA(100倍)等原因，导致目前检测灵敏度50％左右，特异性75％左右并且检测重复性不高。而甲基化程度的检测结果并不能直接诊断结直肠癌或大肠癌，必须结合有效的对检测结果进行判断分析的方法才能对结直肠癌或大肠癌进行有效诊断。开发出特异性和灵敏地扩增目标区域含甲基化DNA片段的方法是进行后续癌症早期诊断的前提之一。要特异性和灵敏地扩增目标区域含甲基化DNA片段，对于开发能够特异性和灵敏地扩增目标区域含甲基化DNA片段的引物是关键之一。目前，尽管对于Septin基因的序列已经知道，但是如何找到影响基因转录的CpG甲基化位点并设计出能够特异性识别该位点且能够有效应用于相应的检测方法的引物仍然是本领域技术人员面临的难题。在甲基化特异性PCR检测中，一个重要的环节是阻断片段的选择，阻断片段在PCR扩增反应的退火阶段发挥作用，其能够阻断未甲基化修饰DNA序列扩增，目前的阻断片段的选择通常基于经验，但是本发明人基于特殊算法设计开发出的阻断片段能有效保证特定甲基化修饰DNA序列的扩增，阻断其他多种可能的未甲基化或者不完全甲基化修饰DNA序列的扩增，从而完成本发明可有效区分检测靶点与非靶点序列。本申请的发明人针对特定的CpG甲基化位点开发了特异性引物和简单有效的PCR检测方法，同时，精确调整PCR反应体系中的引物和探针的用量，合理选择能够有效阻碍非靶点序列的扩增反应的阻断片段，以及能够非常灵敏且特异的检出靶点序列的探针可以进一步增加检测的灵敏度和特异性，确保能够在100倍以上的背景非靶点中检出浓度低于50pg/反应靶点序列，例如本发明实施例中所用的阳性质控品PC即为此类标本，其甲基化修饰异常DNA含量小于1％，背景DNA即未发生甲基化修饰异常的DNA含量大于99％，相对灵敏度高于100：1。目前，尚未报道能够在100倍以上的背景非靶点中检出浓度低于50pg/反应靶点序列的灵敏度的方法。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种肿瘤循环DNA甲基化检测的引物，其能够特异性扩增甲基化的mSEPT9基因。
本发明的另一个目的是提供一种肿瘤循环DNA检测的探针，其能够特异性检测扩增出的mSEPT9基因。
本发明的另一个目的是提供一种肿瘤循环DNA检测的阻断片段，其能够有效降低在肿瘤循环DNA的PCR检测中的非特异性信号，从而大大提高灵敏度。
本发明的另一个目的是提供一种肿瘤循环DNA甲基化检测的试剂盒，其包括靶基因的引物、探针和阻断片段，所述的靶基因为mSEPT9。本发明试剂盒的优点是：1、灵敏度高，本方法的绝对灵敏度50pg即可检出10-15个基因组拷贝数，相对灵敏度高于100:1，即可在100个非靶点序列中，有效扩增1个靶点序列。2、特异性强。3、重复性好，每个检测批次间的精密度CV≤5％。4、操作简单，安全，这个反应体系无任何有毒有害物质，无需开管检测PCR扩增产物，对实验操作人员及环境都无危害。
本发明的一个目的是提供一种肿瘤循环DNA甲基化检测方法，其检测灵敏度高、特异性强。所述方法包括：将待测肿瘤循环(ct-DNA)标本、内参基因、阳性质控品和阴性质控品进行荧光定量PCR反应，其中PCR反应中DNA标本是经过亚硫酸氢盐处理的、转化后的DNA标本，所述PCR扩增反应体系中包括3`端进行了去羟基化修饰的阻断片段，根据PCR的结果测量所述待测肿瘤循环(ct-DNA)标本、所述阳性质控品和所述阴性质控品的Ct值或者CP值。本发明的另一个目的是提供一种大肠癌或结肠癌的诊断方法，所述诊断方法可以根据对肿瘤循环DNA甲基化检测的结果对大肠癌或结肠癌进行有效诊断。
本发明的一个目的是提供用于确定Septin9的基因或基因组序列的表达水平的引物在制备用于检测和/或分类个体中癌症的方法的试剂盒中的用途。
优选地，mSEPT9基因的正向引物mS9-F、反向引物mS9-R序列如下：
名称 序列
mS9-F cctctacatacgccgaat
mS9-R tttttttttcggacgtcg
优选地，所述的肿瘤循环DNA甲基化检测试剂盒还包括阻断片段和内参基因的引物、探针。
所述的内参基因为ACTB(Beta-actin)。优选地，内参基因ACTB的正向引物ACTB-F、反向引物ACTB-R、探针ACTB-P的序列如下：
名称 序列
ACTB-F gaggaggtttagtaagtt
ACTB-R ccaataaaacctactcct
ACTB-P acccaacacacaataaca
优选地，所述的阻断片段为寡核苷酸链，更优选地，所述的阻断片段的3`端修饰为：磷酸化处理、脱羟基化处理或者间臂：C3Spacer、C6Spacer、C12Spacer中的一种或者多种。最优选地，所述阻断片段的序列为C3Spacer修饰。
优选地，所述的靶基因和内参基因的探针的5`端报告荧光基团为FAM、JOE、TAMRA、HEX、Texas Red、Cy3、Cy5中的一种或者多种，所述靶基因和内参基因的探针的3`端猝灭基团为BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、DABCYL中的一种或者多种。
优选地，所述的肿瘤循环DNA甲基化检测试剂盒还包括阳性质控品和阴性质控品。
更优选地，所述的阳性质控品为甲基化人类基因组DNA，所述阴性质控品为未甲基化人类基因组DNA。
优选地，所述的肿瘤循环DNA甲基化检测试剂盒还包括：1-10×PCR反应缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚合酶、镁离子溶液和无核酸酶纯净水。更优选地，所述的1-10×PCR反应缓冲液包含Tris-HCL和氯化钾。
所述的待测肿瘤循环(ct-DNA)标本为人类基因组DNA，包括肿瘤细胞和或癌细胞死亡或者凋亡后释放到外周血循环中的肿瘤循环DNA，所述待测肿瘤循环(ct-DNA)标本来源于人类正常细胞、肿瘤细胞、癌细胞、血清游离DNA、血浆游离DNA、体液游离DNA或者排泄物细胞DNA和游离DNA。所述引物序列含有部分CpG甲基化修饰异常位点，探针序列含有部分CpG甲基化修饰异常位点，阻断片段序列不含有CpG甲基化修饰异常位点。
优选地，所述的所述PCR反应体系终浓度组成为：1-10×PCR反应缓冲液(无Mg2+)、0.1-2mM dNTPs、0.1-2uM靶基因引物序列、0.1-2uM内参基因引物序列、0.2-4uM阻断片段、0.025-35ng/ul模板DNA、0.1-2uM m靶基因TaqMan水解探针、0.1-2uM内参基因TaqMan水解探针、0.02-0.2U/ul DNA聚合酶、0.5-5mM镁离子。
优选地，所述PCR反应扩增的具体过程为：93-95℃活化15-25分钟，扩展阶段，92-94℃变性15-35秒，60-65℃退火2-10秒，52-58℃延伸20-40秒(收集信号)，并进行30-55个循环，94-95℃变性30-60秒，35-45℃降温25-35秒。
与现有技术相比，本发明的有益结果是：本发明的对肿瘤循环DNA甲基化检测的方法具灵敏度高，特异性强、重复性好、操作简单、安全等优点，检测结果具有较高的精密度和重复性。
附图说明
图1是mSEPT9基因(红色)及内参基因ACTB(绿色)的扩增曲线。
图2是本发明涉及到的探针与诊断片段(P-B)工作系统，对靶序列(甲基化异常、M)进行有效的PCR扩增，而阻断非靶序列(无甲基化异常、U)的PCR扩增。
图3是阻断片段在靶序列(甲基化异常、M)与非靶序列(无甲基化异常、U)中的作用。
具体实施方式
1、一种PCR检测引物，其特征在于，所述引物序列为
2、一种PCR检测探针，其特征在于，所述探针序列为
3、一种PCR检测阻断片段mS9-B，其特征在于，阻断片段mS9-B序列为
4、一种肿瘤循环DNA甲基化检测试剂盒，其特征在于，其包括实施方案1的引物。
5、如实施方案4所述的肿瘤循环DNA甲基化检测试剂盒，其特征在于，所述的肿瘤循环DNA甲基化检测试剂盒还包括靶基因的探针，优选地所述探针是权利要求2的探针。
6、如实施方案4或5所述的肿瘤循环DNA甲基化检测试剂盒，其特征在于，所述的肿瘤循环DNA甲基化检测试剂盒还包括阻断片段，优选地，所述阻断片段是权利要求3的阻断片段。
7、如实施方案4-6所述的肿瘤循环DNA甲基化检测试剂盒，其特征在于，所述的肿瘤循环DNA甲基化检测试剂盒还包括内参基因的引物、探针，优选所述的内参基因为ACTB(Beta-actin)，更优选内参基因ACTB的正向引物ACTB-F、反向引物ACTB-R、探针ACTB-P的序列如下：
8、如实施方案4-7所述的肿瘤循环DNA甲基化检测试剂盒，其特征在于，所述的阻断片段为寡核苷酸链，优选所述的阻断片段存在3`端修饰，更优选所述3`端修饰为：磷酸化处理、脱羟基化处理或者间臂：C3Spacer、C6Spacer、C12Spacer。
9、如实施方案4-8所述的肿瘤循环DNA甲基化检测试剂盒，其特征在于，所述的靶基因和内参基因的探针的5`端报告荧光基团为FAM、JOE、TAMRA、HEX、Texas Red、Cy3、Cy5中的一种或者多种，所述靶基因和内参基因的探针的3`端猝灭基团为BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、DABCYL中的一种或者多种。
10、如实施方案4-9任一项所述的肿瘤循环DNA甲基化检测试剂盒，其特征在于，所述的肿瘤循环DNA甲基化检测试剂盒还包括阳性质控品和阴性质控品，优选所述的阳性质控品为甲基化人类基因组DNA，所述阴性质控品为未甲基化人类基因组DNA。
11、一种肿瘤循环DNA甲基化检测方法，其特征在于，所述方法包括(1)对待测肿瘤循环(ct-DNA)标本进行亚硫酸氢盐修饰处理；(2)将处理后的待测肿瘤循环(ct-DNA)标本、靶基因引物、靶基因探针、内参基因、内参基因引物和探针进行荧光定量PCR反应；(3)测量所述待测肿瘤循环(ct-DNA)标本、阳性质控品和阴性质控品的Ct值或者CP值。
12、如实施方案11所述方法，其特征在于，所述方法使用实施方案1的引物进行PCR扩展反应。
13、如实施方案11或12所述方法，其特征在于，所述方法还包括实施方案2的探针和/或实施方案3的阻断片段。
14、如实施方案11-13所述方法，其特征在于，所述方法还包括内参基因的引物、探针，优选所述的内参基因为ACTB(Beta-actin)，更优选内参基因ACTB的正向引物ACTB-F、反向引物ACTB-R、探针ACTB-P的序列如下：
15、如实施方案11-14所述方法，其特征在于，所述的阻断片段为寡核苷酸链，优选所述的阻断片段存在3`端修饰，更优选所述3`端修饰为：磷酸化处理、脱羟基化处理或者间臂：C3Spacer、C6Spacer、C12Spacer。
16、如实施方案11-15所述方法，其特征在于，所述的靶基因和内参基因的探针的5`端报告荧光基团为FAM、JOE、TAMRA、HEX、Texas Red、Cy3、Cy5中的一种或者多种，所述靶基因和内参基因的探针的3`端猝灭基团为BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、DABCYL中的一种或者多种。
17、如实施方案11-16所述方法，其特征在于，所述的肿瘤循环DNA甲基化检测试剂盒还包括阳性质控品和阴性质控品，优选所述的阳性质控品为甲基化人类基因组DNA，所述阴性质控品为未甲基化人类基因组DNA。
18、如实施方案11-17所述方法，其特征在于，所述方法还包括PCR结果的判读步骤：优选地，单个PCR反应按照下表进行判读：
PCR结果 mSEPT9Ct值 ACTB Ct值
+ Ct值≤45 Ct值≤32.5
- 无扩增信号 Ct值≤32.5
无效 任何结果 Ct值≥32.5
19、如实施方案11-18所述方法，其特征在于，所述方法还包括判读标本中是否存在甲基化DNA的步骤，优选地，所述步骤为根据待测标本三次PCR结果按照下表进行判定：
20、实施方案1的引物或实施方案2的探针或实施方案3的阻断片段在制备用于检测和/或分类个体中癌症的试剂盒中的用途。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1肿瘤循环DNA甲基化检测引物的设计
靶基因的引物和探针针对所述mSEPT9基因的位点为启动子区的CpG岛，定位于17q25染色体，序列为77281410-77500596区
mS9-F 5`CCT CTA CAT ACG CCG AAT 3`引物长度为18nt，GC％为50％，理论Tm值为50.3℃；mS9-R 5`TTT TTT TTT CGG ACG TCG 3`引物长度为18nt，
GC％为38.88，理论Tm值为48.9℃。
实施例2肿瘤循环DNA甲基化检测引物灵敏度测试
1、材料与试剂
(1)靶基因的引物、探针和阻断片段，内参基因的引物、探针和阻断片段，
其中所述的靶基因为mSEPT9，mSEPT9的正向引物mS9-F、反向引物mS9-R、探针mS9-P、阻断片段mS9-B的序列以及所述的内参基因为ACTB(Beta-actin)的正向引物ACTB-F、反向引物ACTB-R和探针ACTB-P的序列如下表1所示：
表1
(2)进行荧光定量PCR所需的一般试剂：Taq DNA聚合酶(Roche)、10×PCR反应缓冲液(无Mg2+)(Roche)、100mM dNTPs(Roche)、Mg2+(Sigma)无核酸酶纯净水，所述PCR反应缓冲液(无Mg2+)包含Tris-HCL和氯化钾。所述100mM dNTPs中包括25mM dATP、25mM dUTP、25mMdCTP、25mM dGTP。
(3)阳性质控品和阴性质控品，所述的阳性质控品为甲基化人类基因组DNA，其甲基化修饰异常DNA含量小于1％，背景DNA即未发生甲基化修饰异常的DNA含量大于99％，相对灵敏度高于100：1，所述阴性质控品为未甲基化人类基因组DNA，未甲基化人类基因组DNA和甲基化人类基因组DNA均购自NEB。每个PCR反应含有甲基化人类基因组DNA 45pg，每个PCR反应含有未甲基化人类基因组DNA 750pg。
2、仪器：AB 7500/7500Fast/7500Fast Dx、NanoDrop 2000、离心机、涡旋仪、量程可调100ul、1000ul移液器、100ul 8道移液器、超净工作台和冰箱。
3、检测方法：
(1)待测肿瘤循环DNA(ct-DNA)标本为EDTA抗凝的血浆标本，通过富集与亚硫酸氢盐转化处理。
(2)将阳性质控品、阴性质控品和步骤(1)中处理得到的待测肿瘤循环DNA标本分别作为模板DNA，一式三份配制PCR反应体系。
(3)进行荧光定量PCR扩增反应，其中
(a)阴性质控品中mSEPT9无扩增信号，内参基因ACTB有扩增信号，扩增曲线呈S型，内参基因ACTB的Ct值应≤35；阳性质控品中靶基因mSEPT9基因与内参基因ACTB均有扩增信号，扩增曲线呈S型，靶基因mSEPT9基因Ct值应≤40并且内参基因ACTB的Ct值应≤30；质控品检测符合标准后，证明实验结果有效，可对待测标本的实验结果进行分析与判读。
(b)待测标本实验结果分析与判读：待测标本的内参基因ACTB有扩增信号，且扩增曲线呈S型，单个PCR反应按照下表2进行判读：
表2
PCR结果 mSEPT9Ct值 ACTB Ct值
+ Ct值≤45 Ct值≤32.5
- 无扩增信号 Ct值≤32.5
无效 任何结果 Ct值≥32.5
4、判断方法
根据待测标本三次PCR结果按照下表3进行判定：
表3
待测标本判定结果 + - 无效
阳性 3 0 0
阳性 2 1 0
阳性 1 2 0
阴性 0 3 0
阳性 2 0 1
阳性 1 1 1
阴性 0 2 1
无效 1 0 2
无效 0 1 2
无效 0 0 3
无效检测结果，须重新检测。
上述实验操作中，未注明具体条件的，均按照常规方法，例如分子克隆实验指南(第三版)中所述进行或者按照制造厂商提供条件进行实验操作。
5、结果
如下表4所示：在实验批次名称为“20151224MK-A3 19 27 33 H1-2 4.sds”中PC和NC质控品检测结果符合判定标准，H1标本ACTB基因Ct值显示PCR扩增有效，Septin9基因Ct值为单次PCR反应39.15，根据判定标准该标本最终检测结果为阳性。
表4
在实验批次名称为“20160105MK 6+2+2.sds”中PC和NC质控品检测结果符合判定标准，H2标本ACTB基因Ct值显示PCR扩增有效，Septin9基因Ct值未检出，根据判定标准该标本最终检测结果为阴性。H3标本ACTB基因Ct值显示PCR扩增有效，Septin9基因Ct值未检出，根据判定标准该标本最终检测结果为阴性。
在实验批次名称为“20160116-H4H5A21～24.sds”中PC和NC质控品检测结果符合判定标准，H4标本ACTB基因Ct值显示PCR扩增有效，Septin9基因Ct
值检出3次PCR阳性，根据判定标准该标本最终检测结果为阳性。H5标本ACTB基因Ct值显示PCR扩增有效，Septin9基因Ct值检出两次PCR阳性，根据判定标准该标本最终检测结果为阳性。
在实验批次名称为“20160119H6H7H8.sds”中PC和NC质控品检测结果符合判定标准，H6-1和H6-2标本ACTB基因Ct值显示PCR扩增有效，Septin9基因Ct值检出3次PCR阳性，根据判定标准该标本最终检测结果为阳性。H7标本ACTB基因Ct值显示PCR扩增有效，Septin9基因Ct值检出一次PCR阳性，根据判定标准该标本最终检测结果为阳性。H8标本ACTB基因Ct值显示PCR扩增有效，Septin9基因Ct值检出一次PCR阳性，根据判定标准该标本最终检测结果为阳性。
在实验批次名称为“20160126-H9C3mix.sds”中PC和NC质控品检测结果符合判定标准，H9标本ACTB基因Ct值显示PCR扩增有效，Septin9基因Ct值检出两次PCR阳性，根据判定标准该标本最终检测结果为阳性。
在实施例1中，包括标本H1～H9(H6重复一次)共计检测10例大肠癌标本，检出8例阳性结果，即Septin9基因检测大肠癌的灵敏度为80％。并且全部5批次实验中所用PC质控品ACTB基因Ct平均值27.41、CV％为0.44％，Septin9基因Ct平均值36.87、CV％为2.11％；NC质控品ACTB基因Ct平均值31.66、CV％为1.8％，批次间变异系数均＜5％，说明反应体系重复性高。在实施例1中，PC质控品ACTB基因平均Ct值为27.41，Septin9基因平均Ct值为36.87，相差9.46个循环，表示两者浓度相差约为100倍，Septin9基因甲基化修饰异常DNA含量小于1％，且PC和NC质控品的批间差均低于5％。
如下表5所示：在实验批次名称为“20160621-B7-1PC1-6.sds”中使用对照引物mS9-R050(
mS9-R050 ttttttttttcggacgtcg 19nt
)检测PC质控品ACTB基因Ct平均值27.66，与实施例1中ACTB基因Ct平均值27.41无明显差别，表示PCR扩增反应体系正常工作；而Septin9基因Ct平均值39.66，与实施例1中Septin9基因Ct平均值36.87相差2.79，且C8孔未检出，充分说明因使用mS9-R050引物扩增微量DNA模板时,扩增效率不高，有Ct值滞后明显，且扩增反应重复性不好存在个别反应孔未检出信号情况，导致PC质控品检测异常，同时说明本专利所述实施例1中所用引物适用于微量DNA模板的检测情况，其扩增效率高，重复性好。
表5
如下表6所示：在实验批次名称为“20160621-B7-1PC1-6.sds”中使用对照引物mS9-R150(
mS9-R150 tttttttttttcggacgtcg 20nt
)检测PC质控品ACTB基因Ct平均值28.39，表示PCR扩增反应正常；而Septin9基因Ct平均值39.09，与实施例1中Septin9基因Ct平均值36.87相差2.22，且C9孔未检出，充分说明因使用mS9-R150引物扩增微量DNA模板时,扩增效率不高，有Ct值滞后明显，且扩增反应重复性不好存在个别反应孔未检出信号情况，导致PC质控品检测异常，同时说明本专利所述实施例1中所用引物mS9-F和mS9-R适用于微量DNA模板的检测情况，其扩增效率高，重复性好。
表6
实施例3验证阳性标本中Septin9基因甲基化修饰异常的检测
试剂盒、仪器、检测方法、判断方法同实施例2
样品来源，阳性DNA标本来自人肿瘤细胞系基因组DNA(注：CpG岛发生甲基化修饰)，阴性DNA标本来自另一种人肿瘤细胞系基因组DNA(注：CpG岛无甲基化修饰)均购自NEB。
检测结果如下：
阳性DNA标本
如下表7所示：阳性DNA标本可同时检出Septin9基因和ACTB基因，线性拟合：Septin9基因Ct值与检测浓度的对数值，R值为0.9999。ACTB基因Ct值与检测浓度的对数值，R值为0.9925。
表7
阴性DNA标本
如下表8所示：阴性DNA标本只检出ACTB基因(内参基因)，未检出靶点基因(Septin9基因)无非特异性扩增，线性拟合：ACTB基因Ct值与检测浓度的对数值，R值为0.9882。
表8
上述实验操作中，未注明具体条件的，均按照常规方法，例如分子克隆实验指南(第三版)中所述进行或者按照制造厂商提供条件进行实验操作。
实施例4验证Septin9基因甲基化修饰异常是否于手术后在外周血中清除
试剂盒、仪器、检测方法、判断方法同实施例2
样品来源，为同一大肠癌确诊患者大肠癌术前与术后血浆标本。
实验结果如下：
验证Septin9基因甲基化修饰异常是否于手术后在外周血中清除，将大肠癌术前与术后标本进行检测。在实验批次名称为“20151214Mk-4Sample test，PC 1-4NC1-4.sds”中检测术前标本10#其ATCB基因Ct值为：27.58、27.75、27.69；Septin9基因Ct值为：34.10、35.46、34.78；三重复PCR反应为阳性，在实验批次名称为“20160105MK6+2+2.sds”中检测术后标本B2其Septin9基因Ct值为：未检出、未检出、未检出；三重复PCR反应为阴性。
上述检测结果说明：患者体内的肿瘤组织释放的ct-DNA进入外周血循环，并且可以检出；手术后，因肿瘤组织移除，已经释放到外周血中的ct-DNA将被被清除。即ct-DNA肿瘤标志物可实时反应受检者情况，并且提示此检测在手术评估及预后的应用潜力。
实施例5验证非大肠癌标本检测是否为阴性
试剂盒、仪器、检测方法、判断方法同实施例2
样品来源，为经肠镜检查后，确诊为非大肠癌的健康人血浆标本。
实验结果如下：
在实验批次名称为“20151214MK-4Sampletest，PC1-4NC1-4.sds”中PC和NC质控品检测结果符合判定标准，9#标本ACTB基因Ct值显示PCR扩增有效，Septin9基因Ct值未检出，根据判定标准该标本最终检测结果为阴性。11#标本ACTB基因Ct值显示PCR扩增有效，Septin9基因Ct值未检出，根据判定标准该标本最终检测结果为阴性。12#标本ACTB基因Ct值显示PCR扩增有效，Septin9基因Ct值未检出，根据判定标准该标本最终检测结果为阴性。
在实验批次名称为“20151207MK-PCNC4Sampletest.sds”中PC和NC质控品检测结果符合判定标准，1#标本ACTB基因Ct值显示PCR扩增有效，Septin9基因Ct值未检出，根据判定标准该标本最终检测结果为阴性。2#标本ACTB基因Ct值显示PCR扩增有效，Septin9基因Ct值未检出，根据判定标准该标本最终检测结果为阴性。3#标本ACTB基因Ct值显示PCR扩增有效，Septin9基因Ct值未检出，根据判定标准该标本最终检测结果为阴性。4#标本ACTB基因Ct值显示PCR扩增有效，Septin9基因Ct值未检出，根据判定标准该标本最终检测结果为阴性。
上述标本均为非大肠癌标本，检测结果中都未检出Septin9信号，可检出ACTB基因Ct值，证明PCR扩增反应有效，各标本检测结果为阴性，即Septin9检测大肠癌的特异性为100％，假阳性结果出现率为零。
在实验批次名称为“20160126-H9C3mix.sds”中使用mS9-P-C3探针检测PC和NC质控品结果：PC质控品ACTB基因Ct值为27.33、27.22、27.28；Septin9基因Ct值为36.75、36.391、38.62；结果符合判定标准。NC质控品ACTB基因Ct值为31.18、31.32、31.92；Septin9基因Ct值为未检出、未检出、43.55，结果不符合判定标准，未能有效区分阴性DNA，特异性不好。

Claims (10)

1.一种PCR检测引物，其特征在于，所述引物序列为
2.一种PCR检测探针，其特征在于，所述探针序列为
3.一种PCR检测阻断片段mS9-B，其特征在于，阻断片段mS9-B序列为
4.一种肿瘤循环DNA甲基化检测试剂盒，其特征在于，其包括实施方案1的引物和/或权利要求2的探针和/或权利要求3的阻断片段，优选所述的阻断片段存在3`端修饰，更优选所述3`端修饰为：磷酸化处理、脱羟基化处理或者间臂：C3Spacer、C6Spacer、C12Spacer。
5.如权利要求4所述的肿瘤循环DNA甲基化检测试剂盒，其特征在于，所述的肿瘤循环DNA甲基化检测试剂盒还包括内参基因的引物、探针，优选所述的内参基因为ACTB(Beta-actin)，更优选内参基因ACTB的正向引物ACTB-F、反向引物ACTB-R、探针ACTB-P的序列如下：
名称 序列 ACTB-F gaggaggtttagtaagtt ACTB-R ccaataaaacctactcct ACTB-P acccaacacacaataaca
进一步优选地，所述的靶基因和内参基因的探针的5`端报告荧光基团为FAM、JOE、TAMRA、HEX、Texas Red、Cy3、Cy5中的一种或者多种，所述靶基因和内参基因的探针的3`端猝灭基团为BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、DABCYL中的一种或者多种。
6.一种肿瘤循环DNA甲基化检测方法，其特征在于，所述方法包括(1)对待测肿瘤循环(ct-DNA)标本进行亚硫酸氢盐修饰处理；(2)将处理后的待测肿瘤循环(ct-DNA)标本、靶基因引物、靶基因探针、内参基因、内参基因引物和探针进行荧光定量PCR反应；(3)测量所述待测肿瘤循环(ct-DNA)标本、阳性质控品和阴性质控品的Ct值或者CP值。
7.如权利要求6所述方法，其特征在于，所述方法使用权利要求1的引物进行PCR扩展反应，和/或使用权利要求2的探针和/或权利要求3的阻断片段，优选所述的阻断片段存在3`端修饰，更优选所述3`端修饰为：磷酸化处理、脱羟基化处理或者间臂：C3Spacer、C6Spacer、C12Spacer。
8.如权利要求6-7所述方法，其特征在于，所述方法还包括内参基因的引物、探针，优选所述的内参基因为ACTB(Beta-actin)，更优选内参基因ACTB的正向引物ACTB-F、反向引物ACTB-R、探针ACTB-P的序列如下：
名称 序列 ACTB-F gaggaggtttagtaagtt ACTB-R ccaataaaacctactcct ACTB-P acccaacacacaataaca
进一步优选地，所述的靶基因和内参基因的探针的5`端报告荧光基团为FAM、JOE、TAMRA、HEX、Texas Red、Cy3、Cy5中的一种或者多种，所述靶基因和内参基因的探针的3`端猝灭基团为BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、DABCYL中的一种或者多种。
9.如权利要求6-8所述方法，其特征在于，所述方法还包括PCR结果的判读步骤：优选地，单个PCR反应按照下表进行判读：
PCR结果 mSEPT9Ct值 ACTB Ct值 + Ct值≤45 Ct值≤32.5 - 无扩增信号 Ct值≤32.5 无效 任何结果 Ct值≥32.5
更优选地，所述方法还包括判读标本中是否存在甲基化DNA的步骤，优选地，所述步骤为根据待测标本三次PCR结果按照下表进行判定：
10.权利要求1的引物或权利要求2的探针或权利要求3的阻断片段在制备用于检测和/或分类个体中癌症的试剂盒中的用途。
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