CN104531866B - 用于结肠直肠癌中使用的生物标志物 - Google Patents

用于结肠直肠癌中使用的生物标志物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于结肠直肠癌中使用的生物标志物，更特别地提供了可用于使用血液样品来在诊断、预后和治疗评价方面评估受试者中的结肠直肠癌(CRC)的测定、方法和试剂盒。

Description

用于结肠直肠癌中使用的生物标志物
技术领域
本发明总体上提供了可用于通过检测生物标志物概况中基因的改变甲基化水平而诊断、预后和治疗评价结肠直肠癌、特别是早期诊断、预后和治疗评价的组合物和方法。
背景技术
结肠直肠癌(CRC)可以大致分为遗传性(或家族性)形式和单个发生形式(sporadic form)。遗传性非息肉病性结肠直肠癌(HNPCC)或Lynch综合征在美国仅占结肠癌病例的2至3％。家族性腺瘤性息肉病(FAP)发生在1/20,000的活新生儿中，且占结肠癌病例的少于1％。相反，结肠癌的单个发生形式，其不具有强烈的基因或遗传性组分，占所有病例的超过80％。工业化国家似乎在它们的人口中具有CRC的最大风险，而癌症发病率仍在增加。CRC现在是全球癌症死亡的最主要原因之一。在美国，它是第三大常见癌症，且是所有癌症患者中癌症死亡的第二大常见原因。原因之一是缺乏有效的测试方法用于检测肿瘤和确定肿瘤对治疗的响应。
此外，一旦已经诊断结肠癌，则将癌症分期以便相应地计划治疗也是重要的。结肠癌的阶段包括0期、I期、II期、III期和IV期。CT扫描、MRI(磁共振成像)、PET扫描(正电子发射断层扫描)、胸部X光、手术、淋巴结活检、红和白血细胞的全血计数、血小板、血红蛋白等或癌胚抗原(CEA)测定是经常用于分期的测试和程序。
无论各种可用治疗的效率，已经显示CRC的早期阶段或者甚至癌前病变的筛选通常是最有效的，特别是用于降低疾病相关的死亡率和成本。然而，最常用的早期筛选方法不具有足够的灵敏度和特异性，并且它们经常是侵入且复杂的，因此患者接受度较差。尽管最近的研究进展已经显示，表观遗传甲基化大量存在于各种癌症中，且已经广泛研究了甲基化在癌症中的作用，然而，许多基于与结肠直肠癌相关的表观遗传甲基化的测试仅可适用于肿瘤活检组织中。因此，这些测试使用有限，因为，如众所周知，用于结肠直肠癌的传统手术活检和成像技术具有许多限制，因为它们是侵入性的，对经历所述程序的患者造成感染和持续不利影响的风险。因此，非常需要以灵敏和依从的方式诊断和评价CRC及其易患性的筛选测试。
发明内容
本发明的一个方面提供了使用生物标志物概况的方法，对于所述生物标志物概况而言，甲基化水平在评估CRC阶段、发展和对治疗响应中是重要且显著的。更重要地，基于这种标志物概况的测试方法允许检测全血、血清或血浆中的循环甲基化生物标志物，这提供了用于诊断CRC和监测癌症进展和对治疗的响应的非侵入性的期望方法。在本发明中，获得可用血液样品操作的测定不仅对于临床环境中此类方法的各种优点、而且同样对于克服行业面临的困难是至关重要的，所述困难为：因为可能的降解，不是所有生物标志物在血液中是完整的，以及不是所有生物标志物对于不同类型的样品都具有类似令人满意的表现。
本发明总体上提供了评价受试者中的结肠直肠癌(CRC)的方法。所述方法包括：(1)从所述受试者获得血液样品；(2)使所述血液样品经受一定条件，所述条件允许核酸扩增以产生对于血液样品中可操作的CRC生物标志物概况中至少一种生物标志物的甲基化状态特异性的扩增产物；和(3)鉴定对于血液样品中可操作的甲基化CRC生物标志物特异性的扩增产物，其中此类扩增产物的存在表明所述受试者中存在CRC，并且其中此类扩增产物的不存在表明所述受试者中不存在CRC。在该方法中，血液样品中可操作的CRC生物标志物概况包含PROM1、SARP1、MSF1及其组合。因此，在一个实施方案中，可以产生对于PROM1的甲基化状态特异性的扩增产物，以便评价患者中的CRC。在另一个实施方案中，可以产生对于SARP1的甲基化状态特异性的扩增产物，以便评价患者中的CRC。在又一个实施方案中，可以产生对于MSF1的甲基化状态特异性的扩增产物，以便评价患者中的CRC。在又一个实施方案中，可以产生对于PROM1的甲基化状态特异性的扩增产物和对于SARP1的甲基化状态特异性的扩增产物，以便评价患者中的CRC。在又一个实施方案中，可以产生对于PROM1的甲基化状态特异性的扩增产物和对于MSF1的甲基化状态特异性的扩增产物，以便评价患者中的CRC。在一个其他实施方案中，可以产生对于MFS1的甲基化状态特异性的扩增产物和对于SARP1的甲基化状态特异性的扩增产物，以便评价患者中的CRC。在又一个实施方案中，可以产生对于PROM1的甲基化状态特异性的扩增产物、对于SARP1的甲基化状态特异性的扩增产物和对于MFS1的甲基化状态特异性的扩增产物，以便评价患者中的CRC。
在本文提供的方法中，PROM1的甲基化状态可通过包含至少一个对于甲基化的PROM1特异性的引物对的引物混合物来检测，并且此类引物混合物可以进一步包含对于未甲基化的PROM1特异性的引物对。如本文所提供，对于甲基化的PROM1特异性的引物对选自具有一个包含SEQ ID NO.1的引物和另一个包含SEQ ID NO.3的引物的引物对；具有一个包含SEQ ID NO.5的引物和另一个包含SEQ ID NO.7的引物的引物对；和具有一个包含SEQ IDNO.9的引物和另一个包含SEQ ID NO.11的引物的引物对。此外，对于未甲基化的PROM1特异性的引物对选自具有一个包含SEQ ID NO.2的引物和另一个包含SEQ ID NO.4的引物的引物对；具有一个包含SEQ ID NO.6的引物和另一个包含SEQ ID NO.8的引物的引物对；和具有一个包含SEQ ID NO.10的引物和另一个包含SEQ ID NO.12的引物的引物对。
在本文提供的方法中，SARP1的甲基化状态可通过包含至少一个对于甲基化的SARP1特异性的引物对的引物混合物来检测，并且此类引物混合物可以进一步包含对于未甲基化的SARP1特异性的引物对。如本文所提供，对于甲基化的SARP1特异性的引物对选自具有一个包含SEQ ID NO.13的引物和另一个包含SEQ ID NO.15的引物的引物对；具有一个包含SEQ ID NO.17的引物和另一个包含SEQ ID NO.19的引物的引物对；具有一个包含SEQID NO.21的引物和另一个包含SEQ ID NO.23的引物的引物对；和具有一个包含SEQ IDNO.25的引物和另一个包含SEQ ID NO.27的引物的引物对。此外，对于未甲基化的SARP1特异性的引物对选自具有一个包含SEQ ID NO.14的引物和另一个包含SEQ ID NO.16的引物的引物对；具有一个包含SEQ ID NO.18的引物和另一个包含SEQ ID NO.20的引物的引物对；具有一个包含SEQ ID NO.22的引物和另一个包含SEQ ID NO.24的引物的引物对；和具有一个包含SEQ ID NO.26的引物和另一个包含SEQ ID NO.28的引物的引物对。
在本文提供的方法中，MSF1的甲基化状态可通过包含至少一个对于甲基化的MSF1特异性的引物对的引物混合物来检测，并且此类引物混合物可以进一步包含对于未甲基化的MSF1特异性的引物对。如本文所提供，对于甲基化的MSF1特异性的引物对选自具有一个包含SEQ ID NO.29的引物和另一个包含SEQ ID NO.31的引物的引物对；具有一个包含SEQID NO.33的引物和另一个包含SEQ ID NO.35的引物的引物对；具有一个包含SEQ ID NO.37的引物和另一个包含SEQ ID NO.39的引物的引物对；具有一个包含SEQ ID NO.41的引物和另一个包含SEQ ID NO.45的引物的引物对；和具有一个包含SEQ ID NO.41的引物和另一个包含SEQ ID NO.47的引物的引物对。此外，对于未甲基化的MSF1特异性的引物对选自具有一个包含SEQ ID NO.30的引物和另一个包含SEQ ID NO.32的引物的引物对；具有一个包含SEQ ID NO.34的引物和另一个包含SEQ ID NO.36的引物的引物对；具有一个包含SEQ IDNO.38的引物和另一个包含SEQ ID NO.40的引物的引物对；具有一个包含SEQ ID NO.42的引物和另一个包含SEQ ID NO.44的引物的引物对；和具有一个包含SEQ ID NO.46的引物和另一个包含SEQ ID NO.48的引物的引物对。
当使用上述方法来关于CRC评估受试者时，甲基化的PROM1或SARP1或MSF1或其任何组合表明受试者中存在某一阶段的CRC。使用本方法确定的CRC的存在可以通过临床和/或病理观察进一步验证。然而，当受试者中没有CRC的任何可检测的临床和/或病理存在时，受试者中CRC的存在是发展CRC的增加风险。通过使用如本文提供的方法评估受试者中的CRC，还可以评价所述受试者经历的治疗的有效性，其中血液中可操作的CRC生物标志物概况中的一种或多种生物标志物的甲基化状态随着治疗进程的变化，例如从甲基化变为未甲基化的，从较高甲基化水平变为较低甲基化水平，表明对治疗的响应。
本发明的另一方面提供了用于评估受试者中的结肠直肠癌(CRC)的试剂盒，并且所述试剂盒包含至少一个引物对，所述引物对允许核酸扩增以产生对于所述受试者的血液样品中可操作的CRC生物标志物概况中至少一种生物标志物的甲基化状态特异性的扩增产物。血液样品中可操作的CRC生物标志物概况包含PROM1、SARP1、MSF1及其任何组合，且甲基化的PROM1、SARP1或MSF1与受试者中CRC的存在相关。相比之下，未甲基化的PROM1、SARP1和MSF1表明所述受试者中不存在CRC。
为了检测甲基化的PROM1，所述试剂盒提供了包含至少一个对于甲基化的PROM1特异性的引物对的引物混合物；并且此类对于甲基化的PROM1特异性的引物对选自具有一个包含SEQ ID NO.1的引物和另一个包含SEQ ID NO.3的引物的引物对；具有一个包含SEQ IDNO.5的引物和另一个包含SEQ ID NO.24的引物的引物对；和具有一个包含SEQ ID NO.9的引物和另一个包含SEQ ID NO.11的引物的引物对。
为了检测甲基化的SARP1，所述试剂盒提供了包含至少一个对于甲基化的SARP1特异性的引物对的引物混合物；并且此类引物对选自具有一个包含SEQ ID NO.13的引物和另一个包含SEQ ID NO.15的引物的引物对；具有一个包含SEQ ID NO.17的引物和另一个包含SEQ ID NO.19的引物的引物对；具有一个包含SEQ ID NO.21的引物和另一个包含SEQ IDNO.23的引物的引物对；和具有一个包含SEQ ID NO.25的引物和另一个包含SEQ ID NO.27的引物的引物对。
为了检测甲基化的MSF1，所述试剂盒提供了包含至少一个对于甲基化的MSF1特异性的引物对的引物混合物；并且此类引物对选自具有一个包含SEQ ID NO.29的引物和另一个包含SEQ ID NO.31的引物的引物对；具有一个包含SEQ ID NO.33的引物和另一个包含SEQ ID NO.35的引物的引物对；具有一个包含SEQ ID NO.37的引物和另一个包含SEQ IDNO.39的引物的引物对；具有一个包含SEQ ID NO.41的引物和另一个包含SEQ ID NO.45的引物的引物对；和具有一个包含SEQ ID NO.41的引物和另一个包含SEQ ID NO.47的引物的引物对。
所述试剂盒可以进一步包含对于未甲基化的PROM1、SARP1和/或MSF1特异性的引物对，本文描述了所述引物对。
下面更详细地描述了本发明的其他方面和重复。
具体实施方式
本公开提供了对于使用血液样品的结肠直肠癌诊断、预后和治疗评价特异性的表观遗传生物标志物概况。本发明进一步提供了检测样品中结肠直肠癌的易患性或发生率的方法，所述方法包括检测选自血液样品中可操作的CRC生物标志物概况的至少一种基因的甲基化状态，所述概况包含PROM1、SARP1和MSF1。在所述方法中，所述概况中至少一个选择基因的甲基化状态变化通过测定所述基因的甲基化水平来检测。CRC生物标志物概况中的至少一种基因的甲基化表明各个阶段的CRC肿瘤细胞的存在或结肠直肠癌的易患性。本文提供的方法是方便的，患者友好的，高度灵敏且特异性的，且适合于快速鉴定与结肠直肠癌的各个阶段相关的肿瘤细胞类型。
I.CRC生物标志物概况和DNA甲基化
不涉及核苷酸序列变化的对癌细胞基因组的表观遗传修饰是普遍的。表观遗传变化受基因的初始核苷酸序列改变以外的机制介导。这些表观遗传修饰可能导致或可能不导致癌性细胞基因表达模式的改变。基因中的表观遗传改变、变化或修饰包括，但不限于，DNA甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、sumo化(sumolyation)、组蛋白甲基化和乙酰化、RNA干扰和DNA结合蛋白的异常调节。本发明的基因标志物的表观遗传变化通常涉及异常的DNA甲基化。通过检测血液样品中包含PROM1、SARP1和MSF1的CRC生物标志物概况中至少一种基因的甲基化状态，可以如本文所提供在受试者中进行CRC的诊断、预后或治疗评价。
CRC的存在或其易患性可以由一种或多种生物标志物的存在指示。在一些实施方案中，与对照相比样品中生物标志物的差异水平也可以用作诊断或预后指示。本发明提供了包含PROM1、SARP1和MSF1基因的CRC相关的生物标志物概况。具体而言，在一个实施方案中，所述概况中任一种生物标志物的甲基化表明CRC的存在或易患性。在其他实施方案中，所述概况中任两种生物标志物的甲基化表明CRC的存在或CRC的易患性。因此，在一个实施方案中，PROM1和SARP1的甲基化是CRC诊断或预后指示。在另一个实施方案中，PROM1和MSF1的甲基化是CRC诊断或预后指示。在又一个实施方案中，SARP1和MSF1的甲基化是CRC诊断或预后指示。在又一个实施方案中，PROM1、SARP1和MSF1的甲基化是CRC诊断或预后指示。选自CRC生物标志物概况的越多基因被甲基化，则CRC诊断或预后的确定性越高。包含PROM1、SARP1和MSF1的CRC生物标志物概况中一种或多种基因的甲基化状态可以通过PCR、杂交、测序或本领域中已知的任何其他方法来确定。因为基因的甲基化经常导致基因沉默，所以，在一个实施方案中，使用包含PROM1、SARP1和MSF1的生物标志物概况诊断或预后CRC的方法包括评价所述概况中一种或多种基因的表达水平。此类表达可以通过本领域中目前使用和还待开发的任何多种方法来评价。
PROM1编码跨膜糖蛋白Prominin-1(PROM1；UniProtKB/Swiss-Prot号O43490)。已经显示PROM1结合含有胆固醇的质膜微结构域中的胆固醇。还提出PROM1在上皮细胞的顶端质膜组织中发挥作用。在早期视网膜发育过程中，PROM1充当盘形态发生的关键调节剂。已知PROM1参与各种形式的视网膜营养不良。PROM1参与MAPK和Akt信号传导通路的调节。在神经母细胞瘤细胞中，PROM1以RET依赖性方式抑制细胞分化，诸如神经突增生。PROM1基因位于染色体4p15.32。
SARP1编码分泌的卷曲相关蛋白2(frizzled-related protein 2)(SARP1；UniProtKB/Swiss-Prot号Q96HF1)，其发挥通过与Wnts直接相互作用的Wnt信号传导的调节剂的功能。它们在调节特定细胞类型中的细胞生长和分化中具有作用。SFRP2可以对于眼视网膜发育和对于肌肉发生是重要的。编码SARP1的基因位于染色体4q31.3。
MSF1编码隔蛋白-9(MSF1；UniProtKB/Swiss-Prot号Q9UHD8)，其是参与胞质分裂和细胞周期控制的蛋白。编码MSF1蛋白的基因位于染色体17q25，且是卵巢肿瘤抑制基因的候选。该基因中的突变引起遗传性肌萎缩神经痛，也称为具有肱偏好的神经炎(neuritiswith brachial predilection)。涉及染色体17上的该基因和染色体11上的MLL基因的染色体易位导致急性骨髓单核细胞白血病。
通过许多筛选、检测和测定设计，本发明中发现，不仅血液样品中CRC生物标志物概况中基因的DNA保持完整，而不是降解，而且血液中这些基因的甲基化状态以高灵敏度和特异性表明CRC或其易患性。因此，本发明的一个方面提供了所述概况中选择生物标志物中至少一种的甲基化状态可用于CRC诊断和预后。具体地，选自所述概况的至少一种甲基化基因的存在表明CRC诊断和预后。此外，看起来选自所述概况的基因标志物的甲基化水平与CRC的阶段相关。一旦鉴定CRC或其易患性相关的生物标志物，则各种方法可用于筛选样品以特异性和选择性地检测所述生物标志物的甲基化状态，以进行诊断、预后或治疗评价。下面详述了一些示例性方法。
如本发明中使用的“甲基化状态”是指目标核酸或基因内一个或多个CpG二核苷酸中甲基化胞嘧啶残基的存在或不存在。在一些实施方案中，甲基化状态通过测量甲基化水平来描述，用于测量甲基化水平的各种定量方法是本领域已知的。CpG岛可通过一系列技术鉴定，包括测序和在计算机芯片上预测方法。CpG岛可以在多个区域的核酸序列中发现，包括编码区域的上游的调节区域(包括启动子区域)中，编码区域(例如外显子)中，编码区域的下游，例如增强子区域中，和内含子中。适当时，可以评价所有这些区域，以确定它们的甲基化状态。当启动子区域中的CpG分布相当稀少时，可以评价内含子和/或外显子区域中的甲基化水平。用于评价的区域可以是包含内含子和外显子序列两者，从而重叠两个区域的区域。在一个实施方案中，所研究的CpG岛在刚刚在启动子的上游开始且向下游延伸至转录区域的启动子区域中。在另一个实施方案中，所研究的CpG岛围绕基因的编码区的5'区域以及编码区的3'区域。因此，在某些实施方案中，基因的甲基化状态通过确定基因的启动子、内含子、外显子1和/或外显子2区域中的甲基化水平来评价。“启动子”是转录起始位点(TSS)上游的区域，其从TSS延伸约10Kb、4Kb、3Kb、1Kb、500bp、300bp、150bp之间或任何其范围。更具体地，本发明的方法研究TSS周围的一个或多个相关基因的甲基化状态。
血液中的基因组DNA主要由DNase降解使开发在血液样品中可检测的有用标志物更加困难和复杂。一些基因组区域更易受到DNase降解。例如，启动子、增强子、抑制子、绝缘子和基因座控制区都已经显示与DNase高敏位点(DHS)相关。此外，基因的上游和下游2kb内和第一外显子、第一内含子、CpG岛和高度保守区域中检测到DHS的富集。因此，如果基因或其部分处于那些可降解区域之一中，则其就血液样品中生物标志物的存在或不存在而言是不可靠的指示。此外，为了在基因序列内选择甲基化状态与CRC、CRC分期、和/或CRC易患性相关的扩增子(扩增产物)用于基于PCR的甲基化测定，要求对于可靠性、重现性、灵敏度和特异性的甚至更严格的验证。
术语“样品”或“生物样品”以其最广泛的含义使用。根据本发明的实施方案，例如，样品可以包含体液，包括全血、血清、血浆、尿、粪便、唾液、脑脊髓液、精液、阴道液、肺液、泪液、汗液、粘液等；细胞提取物、从细胞分离的染色体、细胞器或膜；细胞；溶液中或结合至基底的基因组DNA、RNA或cDNA；结肠直肠组织；从活受试者整体或部分分离的结肠直肠组织印物(print)或任何其他结肠直肠材料。在一些实施方案中，生物样品还可以包括结肠直肠组织的切片，诸如活检和尸检样品，和获取用于组织学目的的冷冻切片，诸如血液、血浆、血清、痰、粪便、泪液、粘液、毛发、皮肤等。生物样品还包括外植体，和源自患者结肠直肠组织的原代和/或转化的细胞培养物。生物样品通常获得自真核生物，最优选哺乳动物，诸如灵长类动物，例如人。优选地，本发明中的生物样品是全血、血浆或血清。将如本文所提供的生物标志物概况与使用方法应用于除了血液以外的生物样品也可理解地在本发明的范围之内。
本发明中描述的方法中获得用于使用的生物样品。最经常，这将通过从受试者取出样品来进行，但也可以通过使用先前分离的样品(例如，由另一人在另一时间和/或用于其他目的来分离)，或通过在体内进行本发明的方法来进行。具有治疗或结果历史的存档结肠直肠组织、血液或血清将是特别有用的。
术语“受试者”以其最广泛的含义使用。在一个优选的实施方案中，受试者是哺乳动物。哺乳动物的非限制性实例包括人。优选地，受试者包括能够发展结肠直肠癌的任何人，包括怀疑具有结肠直肠癌的人，已经诊断具有结肠直肠癌的人，或具有结肠直肠癌家族史的人。鉴定怀疑具有癌症的受试者的方法，包括但不限于：身体检查、家族医疗史、受试者医疗史、内膜活检或多种成像技术。
样品可以通过现在已知或尚未公开的任何和所有方法收集，所述方法以保存生物材料诸如DNA或者更具体地甲基化DNA用于分析的方式收集体液。
II.用于确定选择生物标志物的甲基化状态的方法
本发明提供了用于诊断结肠直肠癌或其易患性的方法，所述方法包括检测选自包含PROM1、SARP1和MSF1的CRC生物标志物概况的至少一种基因的甲基化，其中受试者的血液样品中至少一种基因的甲基化表明CRC或其易患性。因此，在某些实施方案中，本发明的方法可以包括确定CRC生物标志物概况的基因或基因组合的甲基化状态，基本上由其组成或由其组成。可以将CRC生物标志物概况中一种或多种基因的甲基化状态与来自也不具有CRC易患性的健康个体的对照血液样品的甲基化状态进行比较。可以根据需要采用阳性对照。在具体实施方案中，甲基化状态使用多重甲基化特异性PCR来确定。在某些实施方案中，CRC生物标志物概况中基因的甲基化状态通过在基因启动子区域的甲基化来表示。在其他实施方案中，CRC生物标志物概况中基因的甲基化状态通过在选择CpG岛的甲基化来表示。在一个实施方案中，检测结肠直肠癌或结肠直肠癌的易患性的方法包括检测包含PROM1、SARP1和MSF1的CRC生物标志物概况中至少两种基因的甲基化。因此，在一个实施方案中，所述方法包括检测PROM1和SARP1的甲基化。在另一个实施方案中，所述方法包括检测PROM1和MSF1的甲基化。在又一个实施方案中，所述方法包括检测SARP1和MSF1的甲基化。在又一个实施方案中，检测结肠直肠癌或结肠直肠癌的易患性的方法包括检测PROM1、SARP1和MSF1的甲基化。
存在各种使用不同方法来评价甲基化状态的技术，诸如超甲基化或低甲基化，甲基化变化，和/或测量甲基化水平。亚硫酸氢盐测序、MSP(甲基化特异性PCR)、MS-SnuPE(甲基化敏感的单核苷酸引物延伸)、COBRA(联合亚硫酸氢盐限制性分析)、MethylLight(亚硫酸氢钠依赖性定量实时PCR)、QMSP(定量甲基化特异性PCR)、MALDI-TOF MS(基质辅助激光解吸/电离、飞行时间质谱法)和甲基化焦磷酸测序都用于定性或定量分析各种发育样品和肿瘤中的基因座和经常多基因座特异性甲基化。其他示例性技术包括，但不限于，熔解曲线甲基化特异性PCR、用或不用硫酸氢盐处理的MLPA(多重连接依赖性探针扩增)、QAMA(甲基化等位基因的定量分析)、MSRE-qPCR(基于甲基敏感的限制酶的定量PCR)、ConLight-MSP(使用定量PCR的DNA甲基化的转化特异性检测)、BS-MSP(亚硫酸氢盐转化特异性甲基化特异性PCR)、MS-SSCA(甲基化敏感的单链构象分析)、McCOBRA(熔解曲线组合亚硫酸氢盐限制性分析)、ERMA(酶促区域甲基化测定)。其他技术还包括定量PCR测序和基于寡核苷酸的微阵列系统，诸如Meth-DOP-PCR，用于从体液提取的痕量DNA的甲基化概况分析的方法和MALDI-TOF-MS阵列分析。
上述甲基化特异性PCR、测序或阵列技术中的一些包括使用内切核酸酶，所述内切核酸酶相对于甲基化位点优先切割未甲基化位点，反之亦然。切割模式的差异表明甲基化的CpG二核苷酸的存在或不存在。切割模式进而可以因为产物修饰而直接检测，或在生成对于改变的大小或电荷可区分的产物的进一步反应后进行检测，所述产物可以通过包括但不限于电泳、色谱和质谱的方法来检测。
或者，甲基化CpG二核苷酸的鉴定可以利用MeCP2MBP、MBP2、MBP4、聚-MBD蛋白或抗体的甲基结合结构域(MBD)选择性结合至甲基化DNA序列的能力。可以将MBD固定至固相基质，且用于制备型柱层析来分离高度甲基化的DNA序列。变体形式诸如表达的His标签的甲基化CpG结合结构域可以用来选择性结合至甲基化的DNA序列。最终，使限制性内切核酸酶消化的基因组DNA与表达的His标签的甲基CpG结合结构域接触。其他方法是本领域众所周知的，且包括甲基化的CpG岛回收测定(methylated-CpG island recovery assay)(MIRA)。另一种方法，MB-PCR，使用固定化在PCR容器的壁上以捕获甲基化DNA的重组的二价甲基CpG结合多肽和随后通过PCR检测结合的甲基化DNA。
用于检测甲基化CpG二核苷酸基序的进一步方法使用选择性修饰CpG二核苷酸基序的甲基化或未甲基化的形式的化学试剂。合适的化学试剂包括肼和亚硫酸氢根离子。例如，用亚硫酸氢钠处理DNA样品将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而保持甲基化的胞嘧啶，且所得尿嘧啶具有胸苷的碱基配对行为，其不同于胞嘧啶碱基配对行为。这种转化最终导致初始DNA序列的可检测变化。
一些技术使用用于评价在CpG二核苷酸的甲基化状态的引物。可以设计引物，从而使得它们不含DNA甲基化的任何潜在位点，而在差异甲基化位点的可检测序列变异位于两个引物之间。此类引物可以用于亚硫酸氢盐基因组测序、COBRA、Ms-SnuPE和几种其他技术。或者，可以设计与甲基化或未甲基化的目标序列特异性杂交的引物。杂交之后，可进行扩增反应，使用本领域已知的任何检测系统测定扩增产物。扩增产物的存在表明所述样品与引物杂交。所述引物的特异性表明DNA是否已经修饰或未经修饰，其进而表明DNA是否已被甲基化。如果与目标具有足够的互补区域，例如12、15、18或20个核苷酸，则所述引物还可含有不干扰杂交但可用于其他操作的额外核苷酸残基。此类其他残基的实例可以是限制性内切核酸酶切割位点，配体结合位点或者因子结合或接头或重复。
其他区分经甲基化和未甲基化核酸的方法是使用寡核苷酸探针。此类探针可以在扩增或不扩增的情况下直接与经修饰核酸杂交。基于探针的测定利用了寡核苷酸与特异性序列的杂交以及随后对该杂交物的检测。可以使用任何本领域已知的检测系统标记寡核苷酸探针。这些包括但不限于：荧光部分、放射性同位素标记部分、生物发光部分、发光部分、化学发光部分、酶、底物、受体或配体。例如，MSP(甲基化特异性PCR)方法使用引物对扩增DNA，所述引物对经设计通过利用由于亚硫酸氢钠处理导致的序列差异来区分甲基化DNA和未甲基化DNA。例如，亚硫酸氢根离子修饰未甲基化的胞嘧啶碱基，将它们变为尿嘧啶碱基。在杂交条件下，尿嘧啶碱基与腺嘌呤碱基杂交。因此，包含替代鸟嘌呤碱基的腺嘌呤碱基的寡核苷酸引物会与亚硫酸氢根修饰的DNA杂交，而含有鸟嘌呤碱基的寡核苷酸引物会与DNA中未修饰的(甲基化的)胞嘧啶残基杂交。使用DNA聚合酶和第二引物的扩增得到扩增产物，所述扩增产物可以容易观察到，这进而表明DNA是否已经被甲基化。尽管PCR是优选的扩增方法，但在该基本技术上的变异，诸如嵌套PCR、多重PCR、连接酶链式反应(LCR)、自我维持序列复制(3SR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、用Qβ复制酶扩增也包括在本发明的范围之内。在本发明中，用于评价相关基因的甲基化状态的优选实施方案需要扩增以产生扩增产物。
使用PCR，可能将样品中单一拷贝的特定目标序列扩增至可通过几种不同方法检测的水平。扩增产物的存在可以使用本领域中众所周知的方法直接评价。它们可以在合适的凝胶诸如琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶上可视化。检测可以涉及，例如，特定染料(诸如插入双链DNA的溴化乙锭)的结合和在UV照射器下DNA条带的可视化。用于检测扩增产物的另一种方式包括荧光或能量转移，其可以进行测量以确定甲基化DNA的存在。或者，在一些实施方案中，与标记的寡核苷酸探针的杂交促进扩增产物的检测。例如，标记的探针在延伸相过程中释放其荧光标签，从而使得可以检测或测量荧光水平。通常，探针与上游或下游引物的下游的目标序列内的序列是互补的。探针可以包括一个或多个标记。标记可以是能够帮助机器、检测器、传感器、设备或增强或未增强的人眼区分未标记的组合物和标记的组合物的任何物质。标记的实例包括但不限于：放射性同位素或其螯合物，染料(荧光或无荧光)，染剂，酶，或非放射性金属。特定实例包括，但不限于：荧光素，生物素，地高辛，碱性磷酸酶，生物素，链霉亲和素，3H，14C，32P，35S，或能够发射辐射的任何其他化合物，罗丹明，4-(4′-二甲基氨基-苯偶氮基)苯甲酸(“Dabcyl”)；4-(4'-二甲基氨基-苯偶氮基)苯磺酸(磺酰氯)(“Dabsyl”)；5-((2-氨基乙基)-氨基)-萘(naphthalene)-1-磺酸(“EDANS”)；补骨脂素衍生物，半抗原，青色素，吖啶，荧光对甲氨基酚衍生物，胆固醇衍生物；乙二胺四乙酸(“EDTA”)和其衍生物，或可以差异检测的任何其他化合物。标记还可以包括一种或多种经优化用于基因分型的荧光染料。促进目标扩增的读出的染料的实例包括，但不限于：CAL-Fluor Red610、CAL-Fluor Orange 560、dR110、5-FAM、6FAM、dR6G、JOE、HEX、VIC、TET、dTAMRA、TAMRA、NED、dROX、PET、BHQ+、Gold540和LIZ。PCR促进目标扩增的读出。
MSP技术的另一种应用被称为实时定量MSP(QMSP)，其允许实时或在端点可靠定量甲基化的DNA。实时方法一般是基于连续光学监测扩增程序，并且利用荧光标记的试剂，所述试剂在产物中的掺入可以进行定量，并且其定量表明模板中该序列的拷贝数。一种此类试剂是荧光染料，SYBR Green I，其优先结合双链DNA，且双链DNA的结合大大增强了其荧光。或者，标记的引物和/或标记的探针可用于定量。它们代表了众所周知的市售实时扩增技术的具体应用，诸如MOLECULAR 和PlexorTM等。在实时PCR系统中，可以在指数期过程中监测PCR反应，在所述指数期过程中，PCR产物的量的首先显著增加与目标模板的初始量相关。
实时PCR检测反应过程中扩增子(扩增产物)的积累。当分析来证实样品中是否存在目标DNA时，可以在已经完成扩增反应之后实施端点验证。在本发明中，此类分析优选用于检测患者中结肠直肠癌的易患性或发病率。端点PCR荧光检测技术可以使用与广泛用于实时PCR中的相同的方法。例如，仪器诸如"Gene"检测器("Gene-Machine")允许直接测量PCR管(Bioron GmbH,Ludwigshafen,German)中的荧光。使用实施PCR对甲基化的定量可以采用绝对基础，或者可以相对于组成型甲基化DNA标准品，或者可以相对于未甲基化的DNA标准品。甲基化状态可通过使用所研究标志物的信号与参照基因的信号之间的比率来测定(其中参照基因中的甲基化状态是已知的)，或者通过使用所述甲基化标志物和甲基化及非甲基化标志物的总和之间的比率来测定。或者，可测定甲基化标志物基因的绝对拷贝数。
本发明的一个方面提供了多重PCR测定以确定所述概况中多于一种基因标志物的甲基化状态。多重PCR是用于在单一PCR实验中扩增多个目标的技术。在多重测定中，可以在反应混合物中使用多个引物对扩增多于一种目标序列。作为PCR实际使用的延伸，该技术具有在实验室内相当大节约时间和精力的潜力，而又不影响实验的效用。除了对于这些引物所需的差异甲基化检测，设计特异性引物组对于成功的多重反应是必不可少的，并且待考虑的因素包括引物长度、熔解温度、特异性和引物二聚化。
在一些形式的多重PCR测定中，相对定量经常用来确定多个样品间基因的甲基化水平的变化，并且描述相对于内部对照样品的水平的甲基化水平。对照样品可以对于多重测定在相同混合物中共同扩增，或者可以在单独混合物中扩增。可以需要并入合适的对照，以确保选择的方法正确且可靠地工作。合适的对照可以包括评价已知被甲基化的基因的甲基化状态。还可以包括阳性对照以帮助确保不会获得假阴性结果。所述基因可以是已知在所研究的样品中被甲基化的基因，或者其可以已经被人工甲基化。
在某些实施方案中，MSP(甲基化特异性PCR)引物用于本发明的方法中。在一些实施方案中，当在样品中同时分析多于一种基因的甲基化状态时，使用多重甲基化特异性实时PCR。本发明提供了可用于MSP中的示例性引物以确定CRC生物标志物概况中基因的甲基化状态，如下表1中所示。这些引物可以包含(任何)表中所示的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成。在表1中，指定为“甲基化”的引物优选被设计为结合至CRC生物标志物概况中基因的基因组序列中完全甲基化的目标区域，且产生对于甲基化生物标志物或其部分特异性的扩增产物；然而指定为“未甲基化的”的引物优选被设计为结合至CRC生物标志物概况中基因的基因组序列中相同但未甲基化的目标区域，由此产生对于未甲基化生物标志物或其部分特异性的扩增产物。因此，通过指定为“甲基化”的引物或通过指定为“未甲基化的”引物扩增的扩增子的量提供了给定样品中选择基因的目标区域的甲基化状态的测量。
这些引物的其他特征，诸如通过测定特异性评价的表现，总结在实验部分中。注意这些序列的变体可用于本发明。具体而言，可根据需要添加其他侧翼序列，例如用以改善结合特异性。变体序列优选地与本文所示引物的核苷酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或者至少99％的核苷酸序列同一性。所述引物适当时可以掺入合成核苷酸类似物，或者可以是基于DNA、RNA或PNA的，或其混合物。类似地，适当时可利用替代的荧光供体和受体部分/FRET对。除了用荧光供体和受体部分标记以外，所述引物可以包含经修饰的寡核苷酸以及其他附加基团和标记，条件是不损害作为本发明方法中引物的功能。
为了基于甲基化目标序列相对于足够参考序列的拷贝数计算甲基化的水平，建立各种数学模型。计算基于通过各种方法测定的独特循环的比较，例如，在恒定荧光水平的交叉点(Cp)和循环阈值(Ct)；或者根据建立的数学算法的Cp获取。
用于实时PCR中Ct值的算法计算每个PCR扩增达到显著阈值的循环。计算的Ct值与样品中存在的目标拷贝数成正比，且Ct值是任何样品中发现的拷贝的精确定量测量。换言之，Ct值表示引物组经设计以识别的各自目标的存在。如果目标在样品中丢失，则实时PCR反应中不应当存在扩增。
或者，可以利用Cp值。Cp值表示荧光增加最高且PCR的对数期开始的循环。480软件(Roche Applied Science,Penzberg,Germany)计算整个扩增曲线的二阶导数，并且确定该值在何处最大。二阶导数算法当荧光相对低时能够收集数据，且因此获得的数据更加可靠且可重复。
因此，所述概况的一种或多种生物标志物的甲基化状态可以通过上述方法中的一种或多种来确定。在一个实施方案中，测定中PCR或实时PCR甲基化产物的存在可以表明CRC发病或易患性的存在。在一个实施方案中，PCR或实时PCR产物可以通过与PCR反应同时或随后进行的杂交进一步鉴定或区分。在另一个实施方案中，可以测序PCR或实时PCR产物，以确认表明CRC或其易患性的具有甲基化的特定等位基因的存在。
III试剂盒
本发明的又一个方面涵盖用于经由鉴定选自包含PROM1、SARP1和MSF1的CRC生物标志物概况的基因的甲基化状态诊断CRC或其易患性的试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒包含用于检测选自所述概况的至少一种生物标志物的甲基化状态的引物组。在另一个实施方案中，试剂盒包含用于检测选自所述概况的至少两种生物标志物的甲基化状态的引物组。在又一个实施方案中，试剂盒包含用于检测选自所述概况的至少三种生物标志物的甲基化状态的引物组。如上表1中所提供，用于使用甲基化特异性PCR方法检测至少PROM1的甲基化状态的试剂盒中可以包括包含SEQ ID NOs:1、2、3、和4的引物，或包含SEQ ID NOs:5、6、7、和8的引物，或包含SEQ ID NOs:9、10、11、和12的引物。进一步，用于使用甲基化特异性PCR方法检测至少SARP1的甲基化状态的试剂盒中可以包括包含SEQ ID NOs:13、14、15、和16的引物，或包含SEQ ID NOs:17、18、19、和20的引物，或包含SEQ ID NOs:21、22、23、和24的引物，或包含SEQ ID NOs:25、26、27、和28的引物。此外，用于使用甲基化特异性PCR方法检测至少MSF1的甲基化状态的试剂盒中可以包括包含SEQ ID NOs:29、30、31、和32的引物，或包含SEQ ID NOs:33、34、35、和36的引物，或包含SEQ ID NOs:37、38、39、和40的引物，或包含SEQ ID NOs:41、42、43、和44的引物。
用于经由鉴定选自包含PROM1、SARP1和MSF1的CRC生物标志物概况的基因的甲基化状态诊断CRC或其易患性的试剂盒可以进一步包含以下中的一种或多种：核酸提取试剂、对照、一次性盒、标记试剂、酶、PCR扩增试剂或一种或多种其他促进甲基化特异性PCR的试剂。
在另一个实施方案中，试剂盒可以进一步包含可用于标记引物寡核苷酸的标记。标记可以是能够帮助机器、检测器、传感器、设备或增强或未增强的人眼区分展示高甲基化相比于低甲基化的样品与用于比较的对照样品的任何物质。标记的实例包括但不限于：放射性同位素或其螯合物，染料(荧光或无荧光)，染剂，酶，或非放射性金属。特定实例包括，但不限于：荧光素，生物素，地高辛，碱性磷酸酶，生物素，链霉亲和素，3H，14C，32P，35S，或能够发射辐射的任何其他化合物，罗丹明，4-(4′-二甲基氨基-苯偶氮基)苯甲酸(“Dabcyl”)；4-(4'-二甲基氨基-苯偶氮基)苯磺酸(磺酰氯)(“Dabsyl”)；5-((2-氨基乙基)-氨基)-萘(naphthalene)-1-磺酸(“EDANS”)；补骨脂素衍生物，半抗原，青色素，吖啶，荧光对甲氨基酚衍生物，胆固醇衍生物；乙二胺四乙酸(“EDTA”)和其衍生物，或在标记核酸存在的情况下传导信号的任何其他化合物。在本发明的一个实施方案中，标记包括一种或多种经优化用于基因分型的染料。此类染料的实例包括但不限于：dR110、5-FAM、6FAM、dR6G、JOE、HEX、VIC、TET、dTAMRA、TAMRA、NED、dROX、PET、BHQ+、Gold540、和LIZ。
在又一个实施方案中，试剂盒中的引物可以已经标记，且可以在没有标记过程的情况下用于PCR，测序反应，或结合至固体基底，诸如寡核苷酸阵列。用于经由鉴定选自包含PROM1、SARP1和MSF1的CRC生物标志物概况的基因的甲基化状态诊断CRC或其易患性的试剂盒还可以包含使用说明书。在一个实施方案中，所述试剂盒可以进一步包含将试剂盒提供的测定的输出与特定结果相联系的指示。例如，指示可以提供将选自CRC生物标志物概况的一种或多种甲基化基因的存在与CRC诊断或预后相关联的指导。例如，指示可以进一步提供将选自CRC生物标志物概况的一种或多种甲基化基因的存在与CRC诊断或预后的置信水平相关联的指导。所述指示可以含有经配置以定量基因生物标志物的甲基化状态的标准曲线。测定的输出可以是特定序列、特定基因型、实时定量PCR反应中的特定Ct水平、荧光或放射性衰变的水平、从标准曲线或从阳性或阴性对照推导的值、或这些和其他输出的任意组合的形式。所述指示可以被打印为书面材料，所述书面材料可以包括在试剂盒中，或者它可以在互联网上发布，或嵌入软件包中。所述书面材料可以包括结果的图形描绘，诸如显微照片或扩增曲线。
用于经由鉴定选自包含PROM1、SARP1和MSF1的CRC生物标志物概况的基因的甲基化状态诊断CRC或其易患性的试剂盒可以进一步包含用于收集样品的装置。此类装置可以包括但不限于：拭子、针、血液收集管、纸巾、或可用于从患者或从现在已知或尚待公开的环境收集生物样品的任何其他装置。优选地，所述试剂盒包含用于收集血液样品的装置。
此外，本发明还包括以下实施方案：
1.用于评价受试者中的结肠直肠癌(CRC)的引物混合物，所述引物混合物包含选自以下(1)至(3)项中的一者或多者：
(1)对于甲基化的PROM1特异性的引物对；
和任选地，对于未甲基化的PROM1特异性的引物对；
(2)对于甲基化的SARP1特异性的引物对；
和任选地，对于未甲基化的SARP1特异性的引物对；和
(3)对于甲基化的MSF1特异性的引物对；
和任选地，对于未甲基化的MSF1特异性的引物对。
2.实施方案1的引物混合物，其中所述对于甲基化的PROM1特异性的引物对选自具有一个包含SEQ ID NO.1的引物和另一个包含SEQ ID NO.3的引物的引物对；具有一个包含SEQ ID NO.5的引物和另一个包含SEQ ID NO.7的引物的引物对；和具有一个包含SEQ IDNO.9的引物和另一个包含SEQ ID NO.11的引物的引物对。
3.实施方案1或2的引物混合物，其中所述对于未甲基化的PROM1特异性的引物对选自具有一个包含SEQ ID NO.2的引物和另一个包含SEQ ID NO.4的引物的引物对；具有一个包含SEQ ID NO.6的引物和另一个包含SEQ ID NO.8的引物的引物对；和具有一个包含SEQ ID NO.10的引物和另一个包含SEQ ID NO.12的引物的引物对。
4.前述实施方案中任一项的引物混合物，其中所述对于甲基化的SARP1特异性的引物对选自具有一个包含SEQ ID NO.13的引物和另一个包含SEQ ID NO.15的引物的引物对；具有一个包含SEQ ID NO.17的引物和另一个包含SEQ ID NO.19的引物的引物对；具有一个包含SEQ ID NO.21的引物和另一个包含SEQ ID NO.23的引物的引物对；和具有一个包含SEQ ID NO.25的引物和另一个包含SEQ ID NO.27的引物的引物对。
5.前述实施方案中任一项的引物混合物，其中所述对于未甲基化的SARP1特异性的引物对选自具有一个包含SEQ ID NO.14的引物和另一个包含SEQ ID NO.16的引物的引物对；具有一个包含SEQ ID NO.18的引物和另一个包含SEQ ID NO.20的引物的引物对；具有一个包含SEQ ID NO.22的引物和另一个包含SEQ ID NO.24的引物的引物对；和具有一个包含SEQ ID NO.26的引物和另一个包含SEQ ID NO.28的引物的引物对。
6.前述实施方案中任一项的引物混合物，其中所述对于甲基化的MSF1特异性的引物对选自具有一个包含SEQ ID NO.29的引物和另一个包含SEQ ID NO.31的引物的引物对；具有一个包含SEQ ID NO.33的引物和另一个包含SEQ ID NO.35的引物的引物对；具有一个包含SEQ ID NO.37的引物和另一个包含SEQ ID NO.39的引物的引物对；具有一个包含SEQID NO.41的引物和另一个包含SEQ ID NO.45的引物的引物对；和具有一个包含SEQ IDNO.41的引物和另一个包含SEQ ID NO.47的引物的引物对。
7.前述实施方案中任一项的引物混合物，其中所述对于未甲基化的MSF1特异性的引物对选自具有一个包含SEQ ID NO.30的引物和另一个包含SEQ ID NO.32的引物的引物对；具有一个包含SEQ ID NO.34的引物和另一个包含SEQ ID NO.36的引物的引物对；具有一个包含SEQ ID NO.38的引物和另一个包含SEQ ID NO.40的引物的引物对；具有一个包含SEQ ID NO.42的引物和另一个包含SEQ ID NO.44的引物的引物对；和具有一个包含SEQ IDNO.46的引物和另一个包含SEQ ID NO.48的引物的引物对。
8.对于血液样品中可操作的甲基化CRC生物标志物特异性的引物在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于通过包括以下步骤的方法的评价受试者中的结肠直肠癌(CRC)：
从所述受试者获得血液样品；
使所述血液样品经受一定条件，所述条件允许核酸扩增以产生对于血液样品中可操作的CRC生物标志物概况中至少一种生物标志物的甲基化状态特异性的扩增产物；和
鉴定对于血液样品中可操作的甲基化CRC生物标志物特异性的扩增产物，其中此类扩增产物的存在表明所述受试者中存在CRC。
9.实施方案8的用途，其中所述血液样品中可操作的CRC生物标志物概况包含PROM1、SARP1、MSF1及其组合。
10.实施方案8或9的用途，其中所述扩增产物对于PROM1的甲基化状态是特异性的。
11.实施方案8-10中任一项的用途，其中所述扩增产物对于SARP1的甲基化状态是特异性的。
12.实施方案8-11中任一项的用途，其中所述扩增产物对于MSF1的甲基化状态是特异性的。
13.实施方案10的用途，其中所述PROM1的甲基化状态可通过包含至少一个对于甲基化的PROM1特异性的引物对的引物混合物来检测。
14.实施方案13的用途，其中所述引物混合物进一步包含对于未甲基化的PROM1特异性的引物对。
15.实施方案13或14的用途，其中所述对于甲基化的PROM1特异性的引物对选自具有一个包含SEQ ID NO.1的引物和另一个包含SEQ ID NO.3的引物的引物对；具有一个包含SEQ ID NO.5的引物和另一个包含SEQ ID NO.7的引物的引物对；和具有一个包含SEQ IDNO.9的引物和另一个包含SEQ ID NO.11的引物的引物对。
16.实施方案14或15的用途，其中所述对于未甲基化的PROM1特异性的引物对选自具有一个包含SEQ ID NO.2的引物和另一个包含SEQ ID NO.4的引物的引物对；具有一个包含SEQ ID NO.6的引物和另一个包含SEQ ID NO.8的引物的引物对；和具有一个包含SEQ IDNO.10的引物和另一个包含SEQ ID NO.12的引物的引物对。
17.实施方案11的用途，其中所述SARP1的甲基化状态可通过包含至少一个对于甲基化的SARP1特异性的引物对的引物混合物来检测。
18.实施方案17的用途，其中所述引物混合物进一步包含对于未甲基化的SARP1特异性的引物对。
19.实施方案17或18的用途，其中所述对于甲基化的SARP1特异性的引物对选自具有一个包含SEQ ID NO.13的引物和另一个包含SEQ ID NO.15的引物的引物对；具有一个包含SEQ ID NO.17的引物和另一个包含SEQ ID NO.19的引物的引物对；具有一个包含SEQ IDNO.21的引物和另一个包含SEQ ID NO.23的引物的引物对；和具有一个包含SEQ ID NO.25的引物和另一个包含SEQ ID NO.27的引物的引物对。
20.实施方案18或19的用途，其中所述对于未甲基化的SARP1特异性的引物对选自具有一个包含SEQ ID NO.14的引物和另一个包含SEQ ID NO.16的引物的引物对；具有一个包含SEQ ID NO.18的引物和另一个包含SEQ ID NO.20的引物的引物对；具有一个包含SEQID NO.22的引物和另一个包含SEQ ID NO.24的引物的引物对；和具有一个包含SEQ IDNO.26的引物和另一个包含SEQ ID NO.28的引物的引物对。
21.实施方案12的用途，其中所述MSF1的甲基化状态可通过包含至少一个对于甲基化的MSF1特异性的引物对的引物混合物来检测。
22.实施方案21的用途，其中所述引物混合物进一步包含对于未甲基化的MSF1特异性的引物对。
23.实施方案21或22的用途，其中所述对于甲基化的MSF1特异性的引物对选自具有一个包含SEQ ID NO.29的引物和另一个包含SEQ ID NO.31的引物的引物对；具有一个包含SEQ ID NO.33的引物和另一个包含SEQ ID NO.35的引物的引物对；具有一个包含SEQ IDNO.37的引物和另一个包含SEQ ID NO.39的引物的引物对；具有一个包含SEQ ID NO.41的引物和另一个包含SEQ ID NO.45的引物的引物对；和具有一个包含SEQ ID NO.41的引物和另一个包含SEQ ID NO.47的引物的引物对。
24.实施方案22或23的用途，其中所述对于未甲基化的MSF1特异性的引物对选自具有一个包含SEQ ID NO.30的引物和另一个包含SEQ ID NO.32的引物的引物对；具有一个包含SEQ ID NO.34的引物和另一个包含SEQ ID NO.36的引物的引物对；具有一个包含SEQID NO.38的引物和另一个包含SEQ ID NO.40的引物的引物对；具有一个包含SEQ ID NO.42的引物和另一个包含SEQ ID NO.44的引物的引物对；和具有一个包含SEQ ID NO.46的引物和另一个包含SEQ ID NO.48的引物的引物对。
25.实施方案8-24中任一项的用途，其中当所述受试者不具有CRC的可观察的临床指示时，所述受试者中CRC的存在是发展CRC的增加风险。
26.用于评价受试者中的结肠直肠癌(CRC)的试剂盒，所述试剂盒包含：至少一个引物对，所述引物对允许核酸扩增以产生对于所述受试者的血液样品中可操作的CRC生物标志物概况中至少一种生物标志物的甲基化状态特异性的扩增产物，其中所述血液样品中可操作的CRC生物标志物概况包含PROM1、SARP1、MSF1及其组合；且其中甲基化的PROM1、SARP1或MSF1与所述受试者中CRC的存在相关。
27.实施方案26的试剂盒，其中所述甲基化的PROM1可通过包含至少一个对于甲基化的PROM1特异性的引物对的引物混合物来检测；并且其中所述对于甲基化的PROM1特异性的引物对选自具有一个包含SEQ ID NO.1的引物和另一个包含SEQ ID NO.3的引物的引物对；具有一个包含SEQ ID NO.5的引物和另一个包含SEQ ID NO.24的引物的引物对；和具有一个包含SEQ ID NO.9的引物和另一个包含SEQ ID NO.11的引物的引物对。
28.实施方案26或27的试剂盒，其中所述甲基化的SARP1可通过包含至少一个对于甲基化的SARP1特异性的引物对的引物混合物来检测；并且其中所述对于甲基化的SARP1特异性的引物对选自具有一个包含SEQ ID NO.13的引物和另一个包含SEQ ID NO.15的引物的引物对；具有一个包含SEQ ID NO.17的引物和另一个包含SEQ ID NO.19的引物的引物对；具有一个包含SEQ ID NO.21的引物和另一个包含SEQ IDNO.23的引物的引物对；和具有一个包含SEQ ID NO.25的引物和另一个包含SEQ ID NO.27的引物的引物对。
29.实施方案26-28中任一项的试剂盒，其中所述甲基化的MSF1可通过包含至少一个对于甲基化的MSF1特异性的引物对的引物混合物来检测；并且其中所述对于甲基化的MSF1特异性的引物对选自具有一个包含SEQ ID NO.29的引物和另一个包含SEQ ID NO.31的引物的引物对；具有一个包含SEQ ID NO.33的引物和另一个包含SEQ ID NO.35的引物的引物对；具有一个包含SEQ ID NO.37的引物和另一个包含SEQ ID NO.39的引物的引物对；具有一个包含SEQ ID NO.41的引物和另一个包含SEQ ID NO.45的引物的引物对；和具有一个包含SEQ ID NO.41的引物和另一个包含SEQ ID NO.47的引物的引物对。
30.试剂盒，所述试剂盒包含实施方案1-7中任一项的引物混合物。
31.评价受试者中的结肠直肠癌(CRC)的方法，所述方法包括
从所述受试者获得血液样品；
使所述血液样品经受一定条件，所述条件允许核酸扩增以产生对于血液样品中可操作的CRC生物标志物概况中至少一种生物标志物的甲基化状态特异性的扩增产物；和
鉴定对于血液样品中可操作的甲基化CRC生物标志物特异性的扩增产物，其中此类扩增产物的存在表明所述受试者中存在CRC。
32.实施方案31的方法，其中所述血液样品中可操作的CRC生物标志物概况包含PROM1、SARP1、MSF1及其组合。
33.实施方案31的方法，其中所述扩增产物对于PROM1的甲基化状态是特异性的。
34.实施方案31的方法，其中所述扩增产物对于SARP1的甲基化状态是特异性的。
35.实施方案31的方法，其中所述扩增产物对于MSF1的甲基化状态是特异性的。
36.实施方案33的方法，其中所述PROM1的甲基化状态可通过包含至少一个对于甲基化的PROM1特异性的引物对的引物混合物来检测。
37.实施方案36的方法，其中所述引物混合物进一步包含对于未甲基化的PROM1特异性的引物对。
38.实施方案36的方法，其中所述对于甲基化的PROM1特异性的引物对选自具有一个包含SEQ ID NO.1的引物和另一个包含SEQ ID NO.3的引物的引物对；具有一个包含SEQID NO.5的引物和另一个包含SEQ ID NO.7的引物的引物对；和具有一个包含SEQ ID NO.9的引物和另一个包含SEQ ID NO.11的引物的引物对。
39.实施方案37的方法，其中所述对于未甲基化的PROM1特异性的引物对选自具有一个包含SEQ ID NO.2的引物和另一个包含SEQ ID NO.4的引物的引物对；具有一个包含SEQ ID NO.6的引物和另一个包含SEQ ID NO.8的引物的引物对；和具有一个包含SEQ IDNO.10的引物和另一个包含SEQ ID NO.12的引物的引物对。
40.实施方案34的方法，其中所述SARP1的甲基化状态可通过包含至少一个对于甲基化的SARP1特异性的引物对的引物混合物来检测。
41.实施方案40的方法，其中所述引物混合物进一步包含对于未甲基化的SARP1特异性的引物对。
42.实施方案40的方法，其中所述对于甲基化的SARP1特异性的引物对选自具有一个包含SEQ ID NO.13的引物和另一个包含SEQ ID NO.15的引物的引物对；具有一个包含SEQ ID NO.17的引物和另一个包含SEQ ID NO.19的引物的引物对；具有一个包含SEQ IDNO.21的引物和另一个包含SEQ ID NO.23的引物的引物对；和具有一个包含SEQ ID NO.25的引物和另一个包含SEQ ID NO.27的引物的引物对。
43.实施方案41的方法，其中所述对于未甲基化的SARP1特异性的引物对选自具有一个包含SEQ ID NO.14的引物和另一个包含SEQ ID NO.16的引物的引物对；具有一个包含SEQ ID NO.18的引物和另一个包含SEQ ID NO.20的引物的引物对；具有一个包含SEQ IDNO.22的引物和另一个包含SEQ ID NO.24的引物的引物对；和具有一个包含SEQ ID NO.26的引物和另一个包含SEQ ID NO.28的引物的引物对。
44.实施方案35的方法，其中所述MSF1的甲基化状态可通过包含至少一个对于甲基化的MSF1特异性的引物对的引物混合物来检测。
45.实施方案44的方法，其中所述引物混合物进一步包含对于未甲基化的MSF1特异性的引物对。
46.实施方案44的方法，其中所述对于甲基化的MSF1特异性的引物对选自具有一个包含SEQ ID NO.29的引物和另一个包含SEQ ID NO.31的引物的引物对；具有一个包含SEQ ID NO.33的引物和另一个包含SEQ ID NO.35的引物的引物对；具有一个包含SEQ IDNO.37的引物和另一个包含SEQ ID NO.39的引物的引物对；具有一个包含SEQ ID NO.41的引物和另一个包含SEQ ID NO.45的引物的引物对；和具有一个包含SEQ ID NO.41的引物和另一个包含SEQ ID NO.47的引物的引物对。
47.实施方案45的方法，其中所述对于未甲基化的MSF1特异性的引物对选自具有一个包含SEQ ID NO.30的引物和另一个包含SEQ ID NO.32的引物的引物对；具有一个包含SEQ ID NO.34的引物和另一个包含SEQ ID NO.36的引物的引物对；具有一个包含SEQ IDNO.38的引物和另一个包含SEQ ID NO.40的引物的引物对；具有一个包含SEQ ID NO.42的引物和另一个包含SEQ ID NO.44的引物的引物对；和具有一个包含SEQ ID NO.46的引物和另一个包含SEQ ID NO.48的引物的引物对。
48.实施方案31的方法，其中当所述受试者不具有CRC的可观察的临床指示时，所述受试者中CRC的存在是发展CRC的增加风险。
尽管本文所述的发明易于进行各种改变和替代迭代，但上文已经更详细地描述了其具体实施方案。然而，应当理解，CRC生物标志物概况和其用途的详细描述不意欲将本发明限制到所公开的具体实施方案。相反，应该理解的是，本发明意欲覆盖落在如权利要求语言所定义的本发明的精神和范围内的所有改变、等价方案和替代方案。
实施例
以下实施例说明本发明的某些方面，而不限制本发明的范围。
实施例1-方法与材料
患者选择和临床样本：所有受试者均通过病理学分析诊断为具有CRC。临床和病理学数据获得自相关患者记录并总结在表2中。分析的CRC组织获得自手术切除(包括结肠镜检查)，新鲜冷冻，并储存在-80℃。在结肠镜检查之前或之后最少一周从健康个体和CRC患者抽血并获得血清样品。CRC的临床诊断通过组织学分析证实，且结肠镜检查证实健康个体不具有任何结肠相关疾病。样品为亚利桑那州(Arizona)的斯科茨代尔医疗保健中心(Scottsdale Medical Health Center)从2010年至2012年的归档样品。从斯科茨代尔医疗保健中心的伦理委员会获得研究的伦理学批准。授予伦理批准用于回顾性分析组织样本。
血液样品制备：将2ml血液收集在标准实验室tiger-顶SST(血清分离管)管中。使具有样品的管在室温下直立放置，最少30分钟，最多2小时。通过在室温或4℃下以1300xg离心15分钟而分离凝块。取出血清并转移至冷冻小瓶。通过将冷冻小瓶置于干冰中而立即快速冷冻样品，然后将小瓶储存在-80℃冰箱中，或进行实验方案的DNA提取。
血清DNA提取：使用Qiagen的QIAamp DNA血液试剂盒根据制造商的说明书(Qiagen,Valencia,CA)提取总DNA。简而言之，200μl血清用于开始提取。对于该程序，遵循制造商的说明书。提取DNA之后，继续亚硫酸氢盐转化测定，或储存在-80℃用于更长储存。
亚硫酸氢盐修饰和甲基化特异性实时PCR：使用Qiagen的EpiTect Bisulfite试剂盒(Qiagen,Gaithersburg,MD)将作为对照的来自细胞系的基因组DNA(500ng)和血液样本(50ng)亚硫酸氢盐修饰。CpGenome通用甲基化DNA和未甲基化DNAs(ChemiconInternational,Temecula,CA)用作阳性对照。通过使用Qiagen HotStar Taq PCR试剂盒和Roche 480热循环仪(Roche,Indianapolis,IN)在受试者中的甲基化特异性PCR(MSP)分析启动子甲基化。对于所有基因设计与修饰的甲基化DNA和修饰的未甲基化DNA两者互补的PCR引物组(表3)。进行四十五个循环的PCR(95℃15分钟用于热启动；45个循环的95℃30秒，59℃30秒和72℃60秒)。β-肌动蛋白用作内部对照。
统计分析：该研究以批次模式运行，使用阳性和阴性对照用于每次DNA提取。数据收集包括提取后总基因组DNA的回收和实时PCR测量。所有PCR结果通过目视检查PCR曲线进行证实。每次PCR运行包括校准样品和至少一种无模板对照样品。通过使用二阶导数法线性回归交叉点值而从校准曲线测定DNA浓度(标志物的甲基化和未甲基化DNA)。对于临床样品，处理和分析来自128个癌症病例(主要是I–IV期)和92个非癌症对照的血清样品。使用多种算法分析所得数据以计算优化的灵敏度和特异性值。
实施例2–标志物选择
总之，评估通常从GenBanks、NCBI和Sanger的癌症数据库引用的多于800种癌症标志物。如本文公开的用于CRC生物标志物概况的候选标志物选择基于包括但不限于癌性等位基因的频率的发现、全基因组生物标志物发现和关联评分系统以及在发现过程中进行的多次独立鉴定实验中开发的标准。为了解决面对CRC诊断的问题且为了使测试简单而有效，在体液诸如血液中表现良好的标志物是发现中的焦点之一。然而，血液中的基因组DNA主要被DNase降解。一些基因组区域更易受到DNase降解。例如，启动子、增强子、抑制子、绝缘子和基因座控制区都已经显示与DNase高敏位点(DHS)相关。此外，基因的上游和下游2kb内和第一外显子、第一内含子、CpG岛和高度保守区域中检测到DHS的富集。因此，如果基因或其部分处于那些可降解区域之一中，则其就血液样品中生物标志物的存在或不存在而言不是可靠的指示。此外，为了在基因标志物内选择对于与CRC、CRC分期、和/或CRC易患性相关的甲基化状态特异性的扩增子用于基于PCR的甲基化测定，要求对于可靠性、重现性、灵敏度和特异性的甚至更严格的验证。筛选后选择PROM1、SARP1和MSF1。如本申请中公开的所选标志物均在血液样品中进行验证，以确保它们的存在和准确度。开发多重PCR以测量单独或与一种或多种其他标志物组合的每种所选CRC标志物。测试每种测定法的灵敏度和特异性。
实施例3-测定开发和验证
如本申请中公开的所选标志物均在血液样品中进行验证，以确保它们的存在和准确度。开发多重PCR以使用来自如表2中显示的患者的血液样品测量每种所选CRC标志物。基于测定中样品、对照和测试组的临床数据，在表3中提供和比较所述标志物中的一种或两种或三种的阳性率和特异性率。已显示所有测定都具有满意的灵敏度和特异性，范围分别为约71％至约92％之间，和69％至95％之间。通常，所有具有两种生物标志物组合的测定的表现明显好于任何基于单一生物标志物的测定。PROM1/MSF1在所有两种标志物组合中具有最高的灵敏度和特异性，且与3种标志物组合测定相当。基于所有三种生物标志物的测定提供了基于所提供的CRC生物标志物概况的所有测定中的最好表现，具有高达92％的灵敏度和高达95％的特异性(参见表3)。
1.数据获得自128个CRC患者和92个健康对照。
2.数据获得自139个具有8种其他主要实体肿瘤的患者。
使用具有三种标志物组合的测定测试为阳性的样品在不同CRC阶段间的分布显示于表4中。
如表4中所示，使用任何三种生物标志物的测定可以鉴定所有阶段的CRC，包括早I期。此外，每个阶段的测定结果在生物标志物概况中的一种或多种基因的甲基化水平中具有可辨别的差异，其可以进一步用于CRC分期。最令人惊讶地，所述测定还鉴定了对照组中的五个阳性受试者，他们基于临床数据被认为是健康的。在基于所述测定显示阳性结果的五个健康受试者中，两个受试者分别在测试后六个和九个月被诊断为CRC。这表明，如本文公开的测定可用于早期诊断，甚至在癌细胞形成和临床可检测之前的早期诊断。医师跟进其他3个测试阳性受试者的发展CRC的潜在较高风险，其结果将可用于进一步证实所述测定用于CRC早期诊断和预后的效率。在包含生物标志物概况中的一种或多种基因的测定法下，没有CRC易患性的健康个体在他们的血液样品不具有甲基化的PROM1、SARP1或MSF1。
此外，已经在8种其他主要癌症中使用该测试，并观察到7/139阳性患者，或95％的特异性，与其他报道的方法相比最高。
本领域技术人员将容易理解，本文所述的方法、组合物和产品代表示例性实施方案，并且不意欲作为对本发明范围的限制。对于本公开技术人员将显而易见的是，可以对本文公开的本公开内容进行各种置换和改变，而不背离本发明的范围和精神。
本说明书中提到的所有专利和出版物表明本公开涉及的领域中技术人员的水平。所有专利和出版物通过引用并入本文，其程度等同于每个单独出版物被具体且单独地通过引用并入。
本文说明性描述的本公开内容可以在本文未具体公开的任何一种或多种要素、一种或多种限制不存在的情况下合适地实施。因此，例如，在本文每种情况下，术语“包含”、“基本上由...组成”和“由......组成”中任一个可以用其他两个术语中的任一个替换。已经采用的术语和表述用作描述、而非限制的术语，并且此类术语和表述的使用并不意欲排除显示和描述的特征或其部分的任何等同方案，但应当认识到，在要求保护的本公开的范围内可能存在各种改变。因此，应当理解，尽管优选实施方案和任选特征已经具体公开了本公开内容，但本领域技术人员付诸本文公开的概念的改变和变化，并且此类改变和变化被认为在所附权利要求所限定的本发明的范围内。

Claims (2)

1.用于评价受试者中的结肠直肠癌(CRC)的引物混合物，所述引物混合物包含以下(1)至(3)项：
(1)对于甲基化的PROM1特异性的引物对；
和任选地，对于未甲基化的PROM1特异性的引物对；
(2)对于甲基化的SARP1特异性的引物对；
和任选地，对于未甲基化的SARP1特异性的引物对；和
(3)对于甲基化的SARP1特异性的引物对；
和任选地，对于未甲基化的MSF1特异性的引物对；
其中，
所述对于甲基化的PROM1特异性的引物对选自如下引物对中的一对：
SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3引物对；SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.7引物对；
SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.11引物对；
所述对于未甲基化的PROM1特异性的引物对选自如下引物对中的一对：
SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4引物对；SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.8引物对；
SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.12引物对；
所述对于甲基化的SARP1特异性的引物对选自如下引物对中的一对：
SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.15引物对；SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.19引物对；
SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.23引物对；SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.27引物对；
所述对于未甲基化的SARP1特异性的引物对选自如下引物对中的一对：
SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.16引物对；SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.20引物对；
SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.24引物对；SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.28引物对；
所述对于甲基化的MSF1特异性的引物对选自如下引物对中的一对：
SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.31引物对；SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.35引物对；
SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.39引物对；SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.43引物对；
SEQ ID NO.45和SEQ ID NO.47引物对；
所述对于未甲基化的MSF1特异性的引物对选自如下引物对中的一对：
SEQ ID NO.30和SEQ ID NO.32引物对；SEQ ID NO.34和SEQ ID NO.36引物对；
SEQ ID NO.38和SEQ ID NO.40引物对；SEQ ID NO.42和SEQ ID NO.44引物对；
SEQ ID NO.46和SEQ ID NO.48引物对。
2.如权利要求1所述的引物混合物在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于评价受试者中的结肠直肠癌。
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