JP6418595B2 - 複数種類の癌に関する情報を取得する方法、システムおよびプログラム - Google Patents

複数種類の癌に関する情報を取得する方法、システムおよびプログラム Download PDF

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Description

本発明は、被検者における複数種類の癌に関する情報を取得する方法、システムおよびプログラムに関する。
近年、DNAのメチル化の異常、すなわち、DNAのメチル化による遺伝子のサイレンシングが、癌などの疾患の発生や進行に関与することが明らかになってきている。それゆえ、種々の遺伝子についてDNAのメチル化状態を解析することにより、癌などの疾患を診断する試みがなされている。
例えば、特許文献１には、生体試料から抽出したDNA試料を用いて、PCDHGA10、PCDHB6、LBX2などの遺伝子領域に含まれるCpG部位のメチル化状態を解析することにより、生体試料中における乳癌などの上皮性癌由来の細胞の存否を判定することができることなどが記載されている。
また、特許文献２には、生体試料から抽出したDNA試料を用いて、COL4A2、AOX1、DUSP26、ELMO1、STOX2、EDIL3、ZNF447、EFHD1などの遺伝子領域に含まれるCpG部位のメチル化状態を解析することにより、生体試料中における大腸癌または乳癌などに由来する細胞の存否を判定することができることなどが記載されている。
更に、特許文献３には、生体試料から抽出したDNA試料を用いて、HOXA9、KCNQ1DN、RAPSN、FZD9、CDH22などの遺伝子領域に含まれるCpG部位のメチル化状態を解析することにより、生体試料中における大腸癌などに由来する細胞の存否を判定することができること、およびLBX2、PAX9、ADD3、CCDC61、ZIC4、CGB7、TOX、TNNI3などの遺伝子領域に含まれるCpG部位のメチル化状態を解析することにより、生体試料中における乳癌などに由来する細胞の存否を判定することができることなどが記載されている。
米国特許出願公開第２０１２／０１９００２４号明細書 米国特許出願公開第２０１２／０１７８６３４号明細書 米国特許出願公開第２０１３／０１３０２４２号明細書
しかしながら、上記のような、確定診断を補助するための特定の癌種に対するマーカーの探索は進んでいるが、多種類の癌種に対するマーカーの探索はあまり進んでいない。そのため、遺伝子のメチル化解析を利用した、多癌種の癌細胞の検出方法に有用な新規分子マーカーのさらなる開発が望まれている。そこで、本発明は、そのような新規マーカーを同定し、そのマーカーについてメチル化の状態を解析することにより、種々の癌に由来する癌細胞に関する情報の取得方法を提供することを目的とする。また、本発明は、その方法に好適に用いられるキットを提供することを目的とする。
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、GDF7、ZNF132、CPXM1、RPL39L、DOK1、FUZ、MGAT3およびEHD3からなる遺伝子群から選択される遺伝子領域を新規マーカーとして同定し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明によれば、被検者から採取した生体試料からDNA試料を調製する工程と、調製工程で得られたDNA試料に含まれるGDF7、ZNF132、CPXM1、RPL39L、DOK1、FUZ、MGAT3およびEHD3からなる遺伝子群から選択される少なくとも１つの遺伝子におけるCpG部位のメチル化の状態を解析する工程と、解析工程で得られた解析結果に基づいて、上記の被検者における複数種類の癌に関する情報を取得する工程とを含む、複数種類の癌に関する情報の取得方法が提供される。
本発明は、メチル化の状態を解析することにより、被検者における複数種類の癌に関する情報を取得する方法を提供することができる。
各種検体から抽出したDNAにおけるGDF7遺伝子のプロモータ領域のメチル化陽性率を示すグラフである。 各種検体から抽出したDNAにおけるZNF132遺伝子のプロモータ領域のメチル化陽性率を示すグラフである。 各種検体から抽出したDNAにおけるCPXM1遺伝子のプロモータ領域のメチル化陽性率を示すグラフである。 各種検体から抽出したDNAにおけるRPL39L遺伝子のプロモータ領域のメチル化陽性率を示すグラフである。 各種検体から抽出したDNAにおけるDOK1遺伝子のプロモータ領域のメチル化陽性率を示すグラフである。 各種検体から抽出したDNAにおけるFUZ遺伝子のプロモータ領域のメチル化陽性率を示すグラフである。 各種検体から抽出したDNAにおけるMGAT3遺伝子のプロモータ領域のメチル化陽性率を示すグラフである。 各種検体から抽出したDNAにおけるEHD3遺伝子のプロモータ領域のメチル化陽性率を示すグラフである。 各種組織から抽出したDNAにおけるGDF7遺伝子のプロモータ領域のメチル化スコアを示すグラフである。 各種組織から抽出したDNAにおけるZNF132遺伝子のプロモータ領域のメチル化スコアを示すグラフである。 各種組織から抽出したDNAにおけるCPXM1遺伝子のプロモータ領域のメチル化スコアを示すグラフである。 各種組織から抽出したDNAにおけるRPL39L遺伝子のプロモータ領域のメチル化スコアを示すグラフである。 各種組織から抽出したDNAにおけるDOK1遺伝子のプロモータ領域のメチル化スコアを示すグラフである。 各種組織から抽出したDNAにおけるFUZ遺伝子のプロモータ領域のメチル化スコアを示すグラフである。 各種組織から抽出したDNAにおけるEHD3遺伝子のプロモータ領域のメチル化スコアを示すグラフである。 各種組織から抽出したDNAを、FUZのプライマーセットを用いてメチル化特異的PCR（MSP）法により増幅した結果を示す写真である。 各種組織から抽出したDNAを、EHD3のプライマーセットを用いてメチル化特異的PCR（MSP）法により増幅した結果を示す写真である。 各種組織から抽出したDNAを、MGAT3のプライマーセットを用いてメチル化特異的PCR（MSP）法により増幅した結果を示す写真である。 被検者における複数種類の癌に関する情報を提供するための判定装置の一例を示した概略図である。 図４の判定装置の機能構成を示すブロック図である。 図４に示された判定装置のハードウェア構成を示すブロック図である。 図４に示された判定装置を用いた、被検者における複数種類の癌に関する情報を提供するための判定のフローチャートである。
本実施形態の複数種類の癌に関する情報の取得方法（以下、単に「方法」ともいう）では、まず、被検者から採取した生体試料からDNA試料を調製する。
ここで、「癌」は、脳腫瘍、肝細胞癌、大腸癌、胃癌、子宮体癌、肺癌、乳癌、前立腺癌、腎細胞癌などが例示される。本実施形態では、複数種類の癌として、これらの癌から少なくとも２種類の癌が選択される。
本実施形態において、生体試料は、被検者のDNAを含む生体由来の試料であれば特に制限されないが、好ましくはゲノムDNAを含む試料、例えば臨床検体である。臨床検体としては、例えば、体液、尿、手術または生検により採取した組織などが挙げられる。体液としては、血液、血清、血漿、リンパ液、腹水、骨髄液、乳頭分泌液などが挙げられる。また、被検者から採取した細胞または組織を培養して得られた培養物を生体試料として用いることもできる。
DNA試料の調製は、生体試料からDNAを抽出することにより行うことができる。生体試料からのDNAの抽出方法は当該技術において公知である。例えば、生体試料と、細胞または組織を可溶化する界面活性剤（例えばコール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウムなど）を含む処理液とを混合し、得られた混合液に物理的処理（撹拌、ホモジナイズ、超音波破砕など）を施して、生体試料に含まれるDNAを該混合液中に遊離させることによって、DNAを抽出することができる。この場合、混合液を遠心分離して細胞破片を沈殿させ、遊離したDNAを含む上清を後述の解析工程に用いることが好ましい。また、得られた上清を当該技術において公知の方法により精製してもよい。なお、生体試料からのDNAの抽出および精製は、市販のキットを用いて行うこともできる。
上記の調製工程は、抽出したDNAを断片化する工程をさらに含むことが好ましい。DNAを適当な長さに断片化することにより、後述するメチル化DNA免疫沈降（MeDIP）法および非メチル化シトシン変換処理を効率よく行うことができる。
DNAの断片化は、超音波処理、アルカリ処理、制限酵素処理などにより行うことができる。例えば、アルカリ処理によりDNAの断片化を行う場合は、DNA溶液に水酸化ナトリウム溶液を終濃度0.1〜1.0 Ｎとなるよう添加し、10〜40℃で５〜15分間インキュベーションすることによりDNAが断片化される。また、制限酵素処理によりDNAの断片化を行う場合、用いる制限酵素はDNAの塩基配列に基づいて適宜選択され、例えばMseIやBamHIなどが用いられる。
本実施形態の方法では、上記の調製工程で得られたDNAに含まれるGDF7、ZNF132、CPXM1、RPL39L、DOK1、FUZ、MGAT3およびEHD3からなる遺伝子群から選択される少なくとも１つの遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位のメチル化の状態を解析する。
なお、本明細書において、「CpG部位」とは、塩基配列中のシトシン（C）とグアニン（G）とが5'から3'への方向にこの順序で隣り合った配列の部位を意味する。なお、CpGの「p」の文字は、シトシンとグアニンとの間のホスホジエステル結合を表わす。
また、本明細書において、「メチル化の状態を解析する」とは、GDF7、ZNF132、CPXM1、RPL39L、DOK1、FUZ、MGAT3およびEHD3からなる遺伝子群から選択される少なくとも１つの遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位のメチル化の有無を解析すること、または該プロモータ領域のメチル化の頻度を解析することを意味する。
GDF7 (Growth Differentiating Factor 7)は、β型トランスフォーミング増殖因子(TGF-β)ファミリーのメンバーであるサイトカインの１つをコードする遺伝子として当該技術において公知である。本実施形態において、解析工程においてGDF7が選択される場合、GDF7におけるCpG部位のメチル化の状態を解析することにより得られる複数種類の癌に関する情報は、好ましくは、脳腫瘍、肝細胞癌、大腸癌、胃癌、子宮体癌、肺癌、乳癌、前立腺癌および腎細胞癌から選択される少なくとも２種類の癌に関するものである。
ZNF132 (Zinc Finger Protein 132)は、ジンクフィンガープロテインの１つをコードする遺伝子として当該技術において公知である。本実施形態において、解析工程においてZNF132が選択される場合、ZNF132におけるCpG部位のメチル化の状態を解析することにより得られる複数種類の癌に関する情報は、好ましくは、肝細胞癌、大腸癌、胃癌、子宮体癌、肺癌、腎細胞癌および乳癌から選択される少なくとも２種類の癌に関するものである。
CPXM1 (Carboxy Peptidase X Member 1)は、細胞間相互作用に関与すると考えられているタンパク質をコードする遺伝子として当該技術において公知である。本実施形態において、解析工程においてCPXM1が選択される場合、CPXM1におけるCpG部位のメチル化の状態を解析することにより得られる複数種類の癌に関する情報は、好ましくは、肝細胞癌、大腸癌、胃癌、子宮体癌、肺癌、腎細胞癌、前立腺癌および乳癌から選択される少なくとも２種類の癌に関するものである。
RPL39L (Ribosomal Protein L-39 Like)は、リボソームタンパク質L-39に類似のアミノ酸配列を有するが、機能不詳のタンパク質をコードする遺伝子として当該技術において公知である。本実施形態において、解析工程においてRPL39Lが選択される場合、RPL39LにおけるCpG部位のメチル化の状態を解析することにより得られる複数種類の癌に関する情報は、好ましくは、脳腫瘍、乳癌、肺癌、胃癌、大腸癌、腎細胞癌、子宮体癌および前立腺癌から選択される少なくとも２種類の癌に関するものである。
DOK1 (DOcKing protein 1)は、プロテインキナーゼＣ-θに結合することによりTh2サイトカインの誘導に関与するアダプター分子をコードする遺伝子として当該技術において公知である。本実施形態において、解析工程においてDOK1が選択される場合、DOK1におけるCpG部位のメチル化の状態を解析することにより得られる複数種類の癌に関する情報は、好ましくは、肝細胞癌、乳癌および前立腺癌から選択される少なくとも２種類の癌に関するものである。
FUZ (FUZzy homolog)は、ヒトにおいて機能不詳のタンパク質をコードする遺伝子として当該技術において公知である。本実施形態において、解析工程においてFUZが選択される場合、FUZにおけるCpG部位のメチル化の状態を解析することにより得られる複数種類の癌に関する情報は、好ましくは、子宮体癌、肝細胞癌、大腸癌および胃癌から選択される少なくとも２種類の癌に関するものである。
MGAT3 (Mannosyl (beta-1,4-)-Glycoprotein beta-1,4-N-AcetylglucosaminylTransferase)は、アルツハイマー病に特徴的なプラークを形成するアミロイドβの除去に関与するタンパク質をコードする遺伝子として当該技術において公知である。本実施形態において、解析工程においてMGAT3が選択される場合、MGAT3におけるCpG部位のメチル化の状態を解析することにより得られる複数種類の癌に関する情報は、好ましくは、乳癌、肺癌、大腸癌および胃癌から選択される少なくとも２種類の癌に関するものである。
EHD3 (EH-domain containing 3)は、上皮成長因子刺激による細胞骨格形成に関与するタンパク質をコードする遺伝子として当該技術において公知である。本実施形態において、解析工程においてEHD3が選択される場合、EHD3におけるCpG部位のメチル化の状態を解析することにより得られる複数種類の癌に関する情報は、好ましくは、大腸癌および胃癌に関するものである。
当該技術において、GDF7、ZNF132、CPXM1、RPL39L、DOK1、FUZ、MGAT3およびEHD3の各遺伝子のプロモータ領域の塩基配列自体は公知である。これらの塩基配列は、例えば米国国立医学図書館の国立生物情報センター（National Center for Biotechnology Information：NCBI）により提供されるデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）などの公知のデータベースから知ることができる。上記の遺伝子の各種ID番号を、表１に示す。また、各遺伝子のプロモータ領域の塩基配列を下記の表１に示す（なお、配列番号１〜３および５〜８の塩基配列はプラス鎖の配列であり、配列番号４の塩基配列はマイナス鎖の配列である）。
本発明の実施形態において、解析工程は、GDF7、ZNF132、CPXM1、RPL39L、DOK1、FUZ、MGAT3およびEHD3からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位のうち、少なくとも１つのCpG部位のメチル化の有無を解析する工程であってもよい。ここで、「メチル化の有無」とは、上記のプロモータ領域に存在するCpG部位のシトシンがメチル化されているか否かを意味する。この実施形態では、解析するCpG部位は１つであってもよいが、複数のCpG部位のメチル化の有無を解析することが好ましい。なお、複数のCpG部位は、１つの遺伝子のプロモータ領域から選択してもよいし、複数の遺伝子のプロモータ領域のそれぞれの中から選択してもよい。
本発明の別の実施形態において、解析工程は、GDF7、ZNF132、CPXM1、RPL39L、DOK1、FUZ、MGAT3およびEHD3からなる遺伝子群から選択される少なくとも１つの遺伝子のプロモータ領域におけるメチル化の頻度を解析する工程であってもよい。ここで、「メチル化の頻度」とは、上記のプロモータ領域に存在するCpG部位の数に対する、メチル化されたCpG部位の数の割合を意味する。この実施形態では、解析対象は、上記のプロモータ領域の全部であってもよいし、少なくとも１つのCpG部位を含む一部分であってもよい。なお、解析対象は、CpG部位を１つしか含んでいなくてもよいが、複数のCpG部位を含んでいることが好ましい。また、解析対象は、上記の遺伝子のうちのいずれか１つのプロモータ領域から決定してもよいし、複数の遺伝子のプロモータ領域から決定してもよい。なお、GDF7、ZNF132、CPXM1、RPL39L、DOK1、FUZ、MGAT3およびEHD3の各遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位の位置および数は既知であるので、本発明の実施形態においては、該プロモータ領域におけるメチル化されたCpG部位の数自体をメチル化の頻度として利用できる。
上記のメチル化の頻度は、DNA中のCpG部位のメチル化状態を、後述するMassARRAY（登録商標）などの質量分析法で解析することにより得られる「メチル化スコア」であってもよい。MassARRAY（登録商標）では、DNA断片を測定して、メチル化DNA断片に由来するピークと非メチル化DNA断片に由来するピークとの面積比からメチル化スコアが算出される。
本発明の実施形態では、GDF7、ZNF132、CPXM1、RPL39L、DOK1、FUZ、MGAT3およびEHD3の各遺伝子のプロモータ領域中のいずれのCpG部位、あるいは該CpG部位を含むいずれの領域を解析対象とするかについては、特に限定されない。なお、これらの遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位の位置および数は既知であるので、解析対象とするCpG部位または範囲は、後述の公知の解析方法を用いたルーチンの実験の結果に基づいて当業者が適宜決定することができる。
メチル化の状態を解析する方法は、当該技術において種々の方法が公知である。本実施形態の方法では、いずれの解析方法を用いるかは特に限定されないが、好ましくは、メチル化DNAと非メチル化DNAとを区別する工程と、DNAを増幅する工程と、メチル化DNAおよび／または非メチル化DNAを検出する工程とを含む方法である。
メチル化DNAと非メチル化DNAとを区別する工程としては、メチル化感受性制限酵素処理、MeDIP法、非メチル化シトシン変換処理などを行う工程が挙げられる。
DNAを増幅する工程としては、PCR法、定量的PCR法、IVT（in vitro transcription）増幅法、SPIA（商標）増幅法などを行う工程が挙げられる。
メチル化DNAおよび／または非メチル化DNAを検出する工程としては、電気泳動法、シークエンス解析法、マイクロアレイ解析法、質量分析法、サザンハイブリダイゼーションなどを行う工程が挙げられる。
MeDIP法とは、抗メチル化シトシン抗体もしくは抗メチル化シチジン抗体、またはメチル化DNA結合タンパク質を特異的に認識する抗体を用いる免疫沈降により、生体試料に含まれるメチル化DNAを濃縮する方法である。本発明の実施形態において、解析工程は、抽出工程で得られたDNAに含まれるメチル化DNAをMeDIP法により濃縮し、得られたメチル化DNAのメチル化状態を解析する工程であってもよい。また、MeDIP法により濃縮したメチル化DNAを、IVT増幅法などにより増幅し、得られた増幅産物について、マイクロアレイを用いてメチル化状態を解析することもできる。このような解析方法は、MeDIP on chip法と呼ばれる。
非メチル化シトシン変換処理とは、生体試料から抽出したDNAと非メチル化シトシン変換剤とを反応させることにより、該DNA中の非メチル化シトシンを他の塩基（ウラシル、チミン、アデニンまたはグアニン）に変換する処理である。ここで、非メチル化シトシン変換剤とは、DNAと反応して該DNA中の非メチル化シトシンを他の塩基（ウラシル、チミン、アデニンまたはグアニン）に変換できる物質である。このような非メチル化シトシン変換剤としては、例えば亜硫酸水素のナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの亜硫酸水素塩（バイサルファイト）が好適に用いられる。バイサルファイトを用いる処理では、DNA中の非メチル化シトシンは、脱アミノ化反応によりウラシルに変換されるが、メチル化シトシンには、このような塩基の変換が起こらない。したがって、DNA中のCpG部位のメチル化状態の違いは、バイサルファイトを用いる非メチル化シトシン変換処理によって、塩基配列の違い（CおよびU）に変換される。なお、バイサルファイトによる非メチル化シトシン変換処理は、バイサルファイト処理と呼ばれる。
バイサルファイト処理を行う場合、バイサルファイトの添加量（濃度）は、DNA中の非メチル化シトシンを十分に変換できる程度であれば特に限定されないが、例えば、DNAを含む溶液中の終濃度として１M以上、好ましくは１〜15 M、より好ましくは３〜10 Mである。また、バイサルファイトを添加した後のインキュベーションの条件（温度および時間）は、バイサルファイトの添加量に応じて適宜設定できるが、例えば、バイサルファイトを終濃度６Mで添加した場合、50〜80℃で10〜90分間インキュベーションする。
DNAに含まれるCpG部位のメチル化状態は、バイサルファイト処理したDNAをシークエンス解析して、本来の塩基配列との違いを検出することにより解析できる。この方法は、バイサルファイトシークエンス法と呼ばれている。
CpG部位のメチル化状態は、質量分析法によって解析することもできる。具体的には、バイサルファイト処理したDNAを鋳型として、解析対象とする塩基配列に特異的なプライマーセットを用いてPCR増幅した後、得られたPCR産物をさらにIVT増幅することにより、メチル化シトシンおよびウラシルはそれぞれグアニン（G）およびアデニン（A）となる。得られたIVT増幅産物をRNase Aで切断し、得られた核酸断片間におけるGとAとの質量差（16 Da）をMALDI-TOF（マトリックス支援レーザ脱離イオン化−飛行時間）型質量分析装置を用いて検出することにより、DNAのメチル化状態を解析できる。この方法はMassARRAY（登録商標）解析と呼ばれる。
IVT産物においてRNase Aによって切断される部位は、任意の塩基と該塩基に隣接するウラシル（U）またはチミン（T）との間であることが知られている。したがって、RNase Aによって切断されたIVT産物の塩基配列および質量は、鋳型として用いたDNAの塩基配列から予測することが可能である。したがって、MassARRAY（登録商標）で得られた各ピークについて、鋳型としたDNAの塩基配列のどの部分に由来するかを同定できる。例えば、DNA断片中の１か所のCpG部位がメチル化していた場合、MassARRAY（登録商標）で得られるピークは、高質量側へ16 Daシフトする。複数のCpG部位を有するDNA断片の解析では、例えば、該DNA断片中のCpG部位が２か所メチル化していた場合は32 Daシフトし、３か所メチル化していた場合は48 Daシフトする。
MassARRAY（登録商標）などの質量分析法では、測定したDNA断片のメチル化スコアを算出することができる。例えば、所定の配列のDNA断片について、分析で得られたチャートにおける非メチル化DNA断片のピークとメチル化DNA断片のピークとの面積比が１：３であった場合、このDNA断片のメチル化スコアは、３／（１+３）＝0.75より、0.75となる。なお、メチル化スコアは、理論上、DNA断片が有する全てのCpG部位がメチル化している場合は１であり、全てのCpG部位がメチル化していない場合は０である。
CpG部位のメチル化状態は、メチル化特異的PCR（MSP）法によって解析することもできる。MSP法とは、バイサルファイト処理したDNAを、後述するプライマーセットを用いてPCR増幅を行い、PCR産物の有無を確認することによって、CpG部位のメチル化状態（メチル化の有無）を解析する方法である。
MSP法では、解析対象のCpG部位がメチル化されている（すなわち、シトシンがウラシルに変換されていない）塩基配列は増幅できるが、CpG部位がメチル化されていない（すなわち、該シトシンがウラシルに変換されている）塩基配列は増幅できないプライマーセット(Mプライマー)を用いる。このようなプライマーセットを用いるMSP法では、PCR産物が存在する場合に、解析対象のCpG部位がメチル化されていることがわかる。具体的なMプライマーセットとしては、配列番号２３および２４のプライマーセット、配列番号２７および２８のプライマーセット、配列番号３１および３２のプライマーセット等が挙げられる。
MSP法は、解析対象のCpG部位のシトシンがウラシルに変換されていない塩基配列は増幅できないが、CpG部位のシトシンがウラシルに変換されている塩基配列は増幅できるプライマーセット(Uプライマー)を用いて行うこともできる。この場合、PCR産物が存在しない場合に、解析対象のCpG部位がメチル化されていることがわかる。具体的なUプライマーセットとしては、配列番号２５および２６のプライマーセット、配列番号２９および３０のプライマーセット、配列番号３３および３４のプライマーセット等が挙げられる。
MSP法で用いられるプライマーセットに含まれる各プライマーは、解析対象のCpG部位を含む塩基配列に応じて当業者が適宜設計できるが、プライマーの3'末端またはその付近に、解析対象のCpG部位のシトシンを含むように設計することが好ましい。
CpG部位のメチル化状態は、マイクロアレイを用いて解析することもできる。この場合、解析用マイクロアレイは、GDF7、ZNF132、CPXM1、RPL39L、DOK1、FUZ、MGAT3およびEHD3の各遺伝子のプロモータ領域の塩基配列に相補的な核酸プローブを、基板上に固定して作製できる。なお、このようなマイクロアレイは、当該技術において公知の方法により作製できる。
マイクロアレイによる解析では、生体試料から抽出したDNAは、当該技術において公知の標識物質により標識されていることが好ましい。よって、本実施形態の判定方法は、抽出したDNAを標識する工程をさらに含むことが好ましい。この標識工程は、生体試料中の全てのDNAを標識できるので、上記のDNA増幅工程の後に行われるのが有利である。なお、標識物質としては、蛍光物質、ビオチンなどのハプテン、放射性物質などが挙げられる。また、蛍光物質としては、Cy3、Cy5、FITC、Alexa Fluor（商標）などが挙げられる。このようにDNAを標識することにより、マイクロアレイ上のプローブからのシグナルの測定が容易になる。なお、DNAをこれらの標識物質で標識する方法は、当該技術において公知である。
上記のシグナルは、マイクロアレイの種類に応じて適切なシグナルであり得る。例えば、シグナルは、マイクロアレイの各プローブとハイブリダイズしたDNA断片が存在する場合に発生する電気的シグナルであってもよいし、上記のように解析対象のDNAが標識されている場合は、標識物質から生じる蛍光、発光などのシグナルであってもよい。シグナルの検出は、通常のマイクロアレイ測定装置に備えられたスキャナーにより行うことができる。スキャナーとしては、例えば、GeneChip（登録商標）Scanner3000 7G（Affymetrix社）、Illumina(登録商標) BeadArray Reader (Illumina社)などが挙げられる。
本実施形態の方法では、上記の解析工程で得られた解析結果に基づいて、被検者における複数種類の癌に関する情報を取得する。ここで、癌に関する情報とは、癌の診断の指標となり得る情報であれば特に限定されない。好ましくは、被検者における癌の発生もしくは状態またはその両方を示す情報である。例えば、複数種類の癌のうちいずれかの癌が存在している可能性が高い、あるいはそのような可能性が低い、との情報を提供することができる。この場合、複数種類の癌のうちいずれかは特定されない。即ち、原発巣は特定されないが、癌に罹患している可能性の高低について情報を提供することができる。このような情報は、癌のスクリーニングに有用である。血液を検体として用い、メチル化が検出された場合は、血中に原発巣由来の細胞が循環していると考えられる。また、既に癌の種類が判明している癌患者については、再発のモニタリングにも用いることができる。上記情報を取得し、医師等に提供することによって、癌の有無や程度についての医師等による判定が補助される。
本発明の実施形態では、解析工程において、メチル化されたCpG部位が有るという解析結果が得られた場合、複数種類の癌のうちいずれかの癌が発生していることを示唆する情報、または複数種類の癌のうちいずれかの癌の状態が不良である（もしくは、悪い）という情報を取得することができる。あるいは、解析工程で得られたメチル化の頻度が所定の閾値より高いか、または閾値と同じという結果が得られた場合、そのような情報を取得することができる。例えば、複数種類の癌のうちいずれかの癌が発生している可能性が高いという情報を得ることができる。
解析工程において、メチル化されたCpG部位が無いという結果が得られた場合、複数種類の癌のうちいずれの癌も発生していないことを示唆する情報または複数種類の癌のうちいずれの癌も状態が良好であるという情報を取得することができる。あるいは、解析工程で得られたメチル化の頻度が所定の閾値より低いという結果が得られた場合に、そのような情報を取得することができる。例えば、複数種類の癌のうちいずれの癌も発生している可能性が低いという情報を得ることができる。
所定の閾値は特に限定されず、種々の生体試料についてのデータの蓄積により経験的に設定することができる。次のようにして所定の閾値を設定してもよい。まず、複数種類の癌のうちいずれの癌細胞も含まないことが予め確認されている生体試料（正常組織または正常細胞）、および、複数種類の癌のうちいずれかの癌細胞を含む生体試料のそれぞれから抽出したDNAについて、メチル化の頻度を解析する。次いで、得られた解析結果に基づいて、複数種類の癌のうちいずれの癌細胞も含まない生体試料のメチル化の頻度よりも高く、且つ、複数種類の癌のうちいずれかの癌細胞を含む生体試料のメチル化の頻度よりも低い範囲から閾値を設定する。好ましくは、複数種類の癌のうちいずれの癌細胞も含まない生体試料と複数種類の癌のうちいずれかの癌細胞を含む生体試料とを高精度に区別し得る値を、閾値として設定する。
本発明の範囲には、複数種類の癌に関する情報を取得するためのキット（以下、単に「キット」ともいう）も含まれる。本発明のキットは、GDF7、ZNF132、CPXM1、RPL39L、DOK1、FUZ、MGAT3およびEHD3の各遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位から選択される少なくとも１つのメチル化の状態を解析するためのプライマーセットを含む。
本発明の実施形態において、キットに含まれるプライマーセットは、MassARRAY（登録商標）などの質量分析法、MSP法、バイサルファイトシーケンス法などのPCR増幅を伴う解析方法によりCpG部位のメチル化の状態を解析するためのプライマーセットであればよいが、好ましくはMassARRAY（登録商標）などの質量分析法またはMSP法で用いられるプライマーセットである。プライマーセットに含まれる各プライマーの塩基配列は、上記のプロモータ領域の塩基配列に応じて当業者が適宜設定できる。例えば、配列番号９および配列番号１０の塩基配列であるプライマーセット、配列番号１１および配列番号１２の塩基配列であるプライマーセット、配列番号１３および配列番号１４の塩基配列であるプライマーセット、配列番号１５および配列番号１６の塩基配列であるプライマーセット、配列番号１７および配列番号１８の塩基配列であるプライマーセット、配列番号１９および配列番号２０の塩基配列であるプライマーセット、配列番号２１および配列番号２２の塩基配列であるプライマーセット、配列番号２３および配列番号２４の塩基配列であるプライマーセット、配列番号２７および配列番号２８の塩基配列であるプライマーセット、ならびに配列番号３１および配列番号３２の塩基配列であるプライマーセットが挙げられる。
本発明の範囲には、メチル化解析により複数種類の癌に関する情報を取得するためのマーカー（以下、単に「マーカー」ともいう）も含まれる。
本発明の実施形態では、上記のマーカーは、GDF7、ZNF132、CPXM1、RPL39L、DOK1、FUZ、MGAT3およびEHD3の各遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位から選択される少なくとも１つである。
本発明の実施形態では、被検者から採取した生体試料から調製したDNA試料におけるマーカーのメチル化状態を解析し、得られた解析結果に基づいて該被検者における複数種類の癌に関する情報を取得することができる。なお、メチル化状態の解析および複数種類の癌に関する情報の取得については、これまでに述べたことと同様である。
別の実施形態では、上記のマーカーは、遺伝子のプロモータ領域の全部またはその一部の連続する塩基配列からなる。該プロモータ領域は、GDF7、ZNF132、CPXM1、RPL39L、DOK1、FUZ、MGAT3およびEHD3からなる群から選択されるいずれか１つの遺伝子のプロモータ領域である。このマーカーは、上記プロモータ領域中の少なくとも１つのCpG部位およびCpG部位を構成しない少なくとも１つのシトシンを含む単離DNAをバイサルファイト処理して得られるポリヌクレオチド(以下、単に「ポリヌクレオチド」ともいう)である。ここで、CpG部位を構成しないシトシンとは、CpG部位に含まれるシトシン以外であればよく、例えば、シトシン(C)と、アデニン(A)、チミン(T)またはシトシン(C)とが5'から3'への方向にこの順序で隣り合った塩基配列(すなわち、CA、CTまたはCC)中のシトシンが挙げられる。
この実施形態のポリヌクレオチドにおいては、上記の単離DNAのバイサルファイト処理により、該単離DNA中の非メチル化シトシンはウラシルに変換されているが、メチル化シトシンはそのままとなっている。本発明の実施形態では、このようなポリヌクレオチド中のCpG部位の配列を解析することによって、当該CpG部位のメチル化を解析することができる。この解析結果に基づき、複数種類の癌に関する情報を取得することができる。なお、上記の単離DNAは、これまでに述べたDNA試料の調製と同様にして得ることができる。また、バイサルファイト処理、メチル化状態の解析および複数種類の癌に関する情報の取得についても、これまでに述べたことと同様である。
本実施形態のポリヌクレオチドのサイズは、MSP法、シーケンス法または質量分析法によるメチル化状態の解析が可能なサイズであれば特に限定されないが、好ましくは50〜250塩基、より好ましくは70〜200塩基である。そのような本実施形態のポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号４７〜５４のいずれかの配列を有するポリヌクレオチドが挙げられる。
配列番号４７のポリヌクレオチドは、癌を有しない被検者のGDF7遺伝子のプロモータ領域の一部をバイサルファイト処理することにより得られる。この配列を有するポリヌクレオチドは、質量分析法によるメチル化状態の解析に用いられ得る。
配列番号４８のポリヌクレオチドは、癌を有しない被検者のZNF132遺伝子のプロモータ領域の一部をバイサルファイト処理することにより得られる。この配列を有するポリヌクレオチドは、質量分析法によるメチル化状態の解析に用いられ得る。
配列番号４９のポリヌクレオチドは、癌を有しない被検者のCPXM1遺伝子のプロモータ領域の一部をバイサルファイト処理することにより得られる。この配列を有するポリヌクレオチドは、質量分析法によるメチル化状態の解析に用いられ得る。
配列番号５０のポリヌクレオチドは、癌を有しない被検者のRPL39L遺伝子のプロモータ領域の一部をバイサルファイト処理することにより得られる。この配列を有するポリヌクレオチドは、質量分析法によるメチル化状態の解析に用いられ得る。
配列番号５１のポリヌクレオチドは、癌を有しない被検者のDOK1遺伝子のプロモータ領域の一部をバイサルファイト処理することにより得られる。この配列を有するポリヌクレオチドは、質量分析法によるメチル化状態の解析に用いられ得る。
配列番号５２のポリヌクレオチドは、癌を有しない被検者のFUZ遺伝子のプロモータ領域の一部をバイサルファイト処理することにより得られる。この配列を有するポリヌクレオチドは、MSP法によるメチル化状態の解析に用いられ得る。
配列番号５３のポリヌクレオチドは、癌を有しない被検者のEHD3遺伝子のプロモータ領域の一部をバイサルファイト処理することにより得られる。この配列を有するポリヌクレオチドは、MSP法によるメチル化状態の解析に用いられ得る。
配列番号５４のポリヌクレオチドは、癌を有しない被検者のMGAT3遺伝子のプロモータ領域の一部をバイサルファイト処理することにより得られる。この配列を有するポリヌクレオチドは、MSP法によるメチル化状態の解析に用いられ得る。
配列番号５５のポリヌクレオチドは、癌を有しない被検者のFUZ遺伝子のプロモータ領域の一部をバイサルファイト処理することにより得られる。この配列を有するポリヌクレオチドは、質量分析法によるメチル化状態の解析に用いられ得る。
配列番号５６のポリヌクレオチドは、癌を有しない被検者のEHD3遺伝子のプロモータ領域の一部をバイサルファイト処理することにより得られる。この配列を有するポリヌクレオチドは、質量分析法によるメチル化状態の解析に用いられ得る。
本発明には、被検者における複数種類の癌に関する情報の提供に適するシステムも含まれる。
本実施形態のシステムは、プロセッサおよび前記プロセッサの制御下にあるメモリを含むコンピュータを含む。
このシステムのメモリは、以下のステップをコンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムを記録している：
被検者由来のDNA試料に含まれるGDF7、ZNF132、CPXM1、RPL39L、DOK1、FUZ、MGAT3およびEHD3からなる遺伝子群から選択される少なくとも１つの遺伝子におけるCpG部位のメチル化の状態の解析結果を取得するステップ；
前記解析結果に基づいて、前記被検者の癌の有無を判定するステップ；および
前記判定結果を出力するステップ。
本発明には、被検者における複数種類の癌に関する情報の提供をコンピュータに実行させるためのコンピュータプログラム製品も含まれる。コンピュータプログラム製品は、インターネット等を介してダウンロード可能なプログラムや、当該プログラムを記録した媒体などが例示される。
たとえば、以下のようなステップをコンピュータに実行させるためのプログラムが例示される。
被検者由来のDNA試料に含まれるGDF7、ZNF132、CPXM1、RPL39L、DOK1、FUZ、MGAT3およびEHD3からなる遺伝子群から選択される少なくとも１つの遺伝子におけるCpG部位のメチル化の状態の解析結果を取得するステップ；
前記解析結果に基づいて、前記被検者の癌の有無を判定するステップ；および
前記判定結果を出力するステップ。
以下に、本実施形態の方法を実施するのに好適な装置の一形態を、図面を参照して説明する。しかし、本発明はこの実施形態のみに限定されるものではない。図４は、被検者における複数種類の癌に関する情報を提供するための判定装置の一例を示した概略図である。図４に示された判定装置１は、測定装置２と、該測定装置２と接続されたコンピュータシステム３とを含んでいる。
本実施形態においては、測定装置２は、MALDI-TOF型質量分析装置である。この測定装置２は、被検物質の飛行時間や質量電荷比（m/z値）などの質量分析情報を取得する。被検者由来のDNA試料から調製した測定用試料を測定装置２にセットすると、測定装置２は、該測定用試料に含まれる核酸の質量分析情報を取得し、得られた質量分析情報をコンピュータシステム３に送信する。
なお、メチル化の状態をMSP法により解析する場合、測定装置２は、蛍光イメージスキャナなどのゲルイメージング装置であってもよい。この場合、MSP法による核酸増幅を行った反応液をゲル電気泳動し、泳動後のゲルを測定装置２にセットすると、測定装置２は増幅産物を検出する。そして、測定装置２は、増幅産物のバンド強度データを取得し、得られたデータをコンピュータシステム３に送信する。
コンピュータシステム３は、コンピュータ本体３ａと、入力デバイス３ｂと、検体情報、判定結果などを表示する表示部３ｃとを含む。コンピュータシステム３は、測定装置２から質量分析情報を受信する。そして、コンピュータシステム３のプロセッサは、質量分析情報に基づいて、被検者における複数種類の癌に関する情報を提供するプログラムを実行する。
図５は、図４に示された判定装置の機能構成を示すブロック図である。図５に示されるように、コンピュータシステム３は、取得部３０１と、記憶部３０２と、算出部３０３と、判定部３０４と、出力部３０５とを備える。取得部３０１は、測定装置２と、ネットワークを介して通信可能に接続されている。なお、算出部３０３と判定部３０４とは、制御部３０６を構成している。
取得部３０１は、測定装置２から送信された情報を取得する。記憶部３０２は、判定に必要な閾値およびメチル化スコアを算出するための式を記憶する。算出部３０３は、取得部３０１で取得された情報を用い、記憶部３０２に記憶された式にしたがって、メチル化スコアを算出する。判定部３０４は、算出部３０３によって算出されたメチル化スコアが、記憶部３０２に記憶された閾値よりも低いか否かを判定する。出力部３０５は、判定部３０４による判定結果を、被検者における複数種類の癌に関する情報(例えば、該被検者から採取した生体試料中における複数種類の癌のうちいずれかの癌細胞の有無)として出力する。
図６は、図４に示された判定装置のハードウェア構成を示すブロック図である。図６に示されるように、コンピュータ本体３ａは、ＣＰＵ(Central Processing Unit)３０と、ＲＯＭ(Read Only Memory)１２１と、ＲＡＭ(Random Access Memory)３２と、ハードディスク３３と、入出力インターフェイス３４と、読出装置３５と、通信インターフェイス３６と、画像出力インターフェイス３７とを備えている。ＣＰＵ３０、ＲＯＭ３１、ＲＡＭ３２、ハードディスク３３、入出力インターフェイス３４、読出装置３５、通信インターフェイス３６および画像出力インターフェイス３７は、バス３８によってデータ通信可能に接続されている。
ＣＰＵ３０は、ＲＯＭ３１に記憶されているコンピュータプログラムおよびＲＡＭ３２にロードされたコンピュータプログラムを実行することが可能である。ＣＰＵ３０がアプリケーションプログラムを実行することにより、上述した各機能ブロックが実現される。これにより、コンピュータシステムが、被検者における複数種類の癌に関する情報を提供するための判定装置としての端末として機能する。
ＲＯＭ３１は、マスクＲＯＭ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭなどによって構成されている。ＲＯＭ３１には、ＣＰＵ３０によって実行されるコンピュータプログラムおよびこれに用いるデータが記録されている。
ＲＡＭ３２は、ＳＲＡＭ、ＤＲＡＭなどによって構成されている。ＲＡＭ３２は、ＲＯＭ３１およびハードディスク３３に記録されているコンピュータプログラムの読み出しに用いられる。ＲＡＭ３２はまた、これらのコンピュータプログラムを実行するときに、ＣＰＵ３０の作業領域として利用される。
ハードディスク３３は、ＣＰＵ３０に実行させるためのオペレーティングシステム、アプリケーションプログラム(被検者における複数種類の癌に関する情報を提供するためのコンピュータプログラム)などのコンピュータプログラムおよび当該コンピュータプログラムの実行に用いるデータがインストールされている。
読出装置３５は、フレキシブルディスクドライブ、ＣＤ−ＲＯＭドライブ、ＤＶＤ−ＲＯＭドライブなどによって構成されている。読出装置３５は、可搬型記録媒体４０に記録されたコンピュータプログラムまたはデータを読み出すことができる。
入出力インターフェイス３４は、例えば、ＵＳＢ、ＩＥＥＥ１３９４、ＲＳ−２３２Ｃなどのシリアルインターフェイスと、ＳＣＳＩ、ＩＤＥ、ＩＥＥＥ１２８４などのパラレルインターフェイスと、Ｄ／Ａ変換器、Ａ／Ｄ変換器などからなるアナログインターフェイスとから構成されている。入出力インターフェイス３４には、キーボード、マウスなどの入力デバイス３ｂが接続されている。操作者は、当該入力デバイス３ｂを使用することにより、コンピュータ本体３ａにデータを入力することが可能である。
通信インターフェイス３６は、例えば、Ethernet(登録商標)インターフェイスなどである。コンピュータシステム３は、通信インターフェイス３６により、プリンタへの印刷データの送信が可能である。
画像出力インターフェイス３７は、ＬＣＤ、ＣＲＴなどで構成される表示部３ｃに接続されている。これにより、表示部３ｃは、ＣＰＵ３０から与えられた画像データに応じた映像信号を出力することができる。表示部３ｃは、入力された映像信号にしたがって画像(画面)を表示する。
次に、判定装置１による、被検者における複数種類の癌に関する情報の提供の処理手順を説明する。図７は、図４に示された判定装置を用いた複数種類の癌に関する情報の提供のフローチャートである。ここでは、被検者由来のDNA試料から調製した測定用試料に含まれる核酸の質量分析情報からピーク面積を算出し、得られたピーク面積からメチル化スコアを算出し、得られたメチル化スコアが閾値よりも低いか否かの判定を行う場合を例として挙げて説明する。しかし、本発明は、この実施形態のみに限定されるものではない。
まず、ステップＳ１−１において、判定装置１の取得部３０１は、測定装置２から質量分析情報を取得する。次に、ステップＳ１−２において、算出部３０３は、取得部３０１が取得した質量分析情報からピーク面積を算出し、記憶部３０２に送信する。そして、ステップＳ１−３において、算出部３０３は、記憶部３０２に記憶された該ピーク面積に基づき、記憶部３０２に記憶された式にしたがって、メチル化スコアを算出する。
その後、ステップＳ１−４において、判定部３０４は、算出部３０３で算出されたメチル化スコアが、記憶部３０２に記憶された閾値よりも低いか否かの判定を行う。ここで、メチル化スコアが閾値よりも低いとき、処理は、ステップＳ１−５に進行し、判定部３０４は、被検者から採取した生体試料には癌細胞がないことを示す判定結果を出力部３０５に送信する。また、メチル化スコアが閾値よりも低くないとき(すなわち、メチル化スコアが閾値以上であるとき)、被検者から採取した生体試料には癌細胞があることを示す判定結果を出力部３０５に送信する。
そして、ステップＳ１−７において、出力部３０５は、判定結果を、被検者における複数種類の癌に関する情報として出力し、表示部３ｃに表示させたり、プリンタに印刷させたりする。これにより、被検者において癌があるのか、またはないのかについて判定することを補助する情報を医師などに提供することができる。
以下に、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
実施例１： 新規マーカーの同定
（1）生体試料
本実施例では、生体試料として、下記の表２〜４に示した検体を用いた。なお、これらの検体のうち、健常人血球は、BioChain社より購入した。それ以外の検体は、患者または健常人から採取した。これらの組織は採取された後、ただちに液体窒素で凍結され、使用されるまで−80℃で保存した。
上記の検体のうち、胃癌由来の癌組織検体、肝細胞癌由来の癌組織検体、肝細胞癌由来の非癌部組織検体、正常検体（正常子宮および健常人末梢血を除く）については、下記(2)〜(3)の記載のようにしてInfinium HumanMethylation27 BeadChip（Illumina社）を用いたInfinium Methylation Assayにより測定されたメチル化データを取得した。
肺癌、前立腺癌、健常人の末梢血については下記の文献において公開されているInfinium HumanMethylation27 BeadChip（Illumina社）のメチル化データを用いた。
・肺癌：Selamat SAら、Genome-scale analysis of DNA methylation in lung adenocarcinoma and integration with mRNA expression. Genome Res. Jul;22(7):1197-211(2012)
・前立腺癌：Kobayashi Yら、 DNA methylation profiling reveals novel biomarkers and important roles for DNA methyltransferases in prostate cancer. Genome Res. Jul 21(7):1017-27(2011)
・健常人93例の健常人末梢血のデータ：Salhia Bら、DNA methylation analysis determines the high frequency of genic hypomethylation and low frequency of hypermethylation events in plasma cell tumors. Cancer Res. Sep 1;70(17):6934-44(2010)
上記以外の検体についてはTCGA（The Cancer Genome Atlas：http://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/tcgaHome2.jsp）のデータを使用した。
なお、ここでいうメチル化データとは、下記（2）〜(3)の記載のようにしてInfinium HumanMethylation27 BeadChip（Illumina社）を用いるInfinium Methylation Assayにより得られた、GDF7、ZNF132、CPXM1、RPL39L、DOK1、FUZ、MGAT3およびEHD3のCpG部位のメチル化率（mCpG）である。
（2）DNA抽出およびバイサルファイト処理
胃癌由来の癌部組織検体、肝細胞癌由来の癌部組織検体、肝細胞癌由来の非癌部組織検体、正常検体（正常子宮および健常人末梢血を除く）について、これらの各検体からゲノムDNAを、QIAamp DNA Mini Kit（QIAGEN社）を用いて抽出した。得られたゲノムDNA（500 ng）を、EZ DNA Methylation Kit（Zymo Research社）を用いてバイサルファイト処理を行い、処理後のゲノムDNAを滅菌蒸留水（10μl）に溶出した。得られたDNA溶液（４μl）に含まれるゲノムDNAを、Bioruptor（COSMO BIO社製）によって断片化した。
（3）新規マーカーの同定
断片化したゲノムDNAについて、Infinium HumanMethylation27 BeadChip（Illumina社）を用いたInfinium Methylation Assayを行って、各検体についてのメチル化データを取得した。得られたメチル化データと、上記の各文献に公開されているメチル化データおよびTCGAのデータとを用いて、各種癌の癌部組織に特異的にメチル化が認められる新規マーカーを探索した。なお、具体的な操作は、用いたチップに添付されたマニュアルに従って行った。
ここで、Infinium HumanMethylation27 BeadChipには、ヒトのゲノム上にあるCpG部位のうち、27,578ヶ所のCpG部位ごとにメチル化用プローブと非メチル化用プローブを設けている。本実施例では、CpG部位のメチル化用プローブのシグナル強度（シグナルM）と非メチル化用プローブのシグナル強度（シグナルU）とをBeadArray Readerで検出し、以下の計算式により各遺伝子のCpG部位のメチル化率（mCpG）を算出した。
（mCpG）＝（シグナルM）／（シグナルM）＋（シグナルU）
得られた各遺伝子のメチル化率（mCpG）の値について、閾値を「0.2」に設定し、メチル化率の値がこの閾値と同じか、またはこの閾値よりも高い検体を「メチル化陽性検体」とした。そして、メチル化陽性検体の数に基づいて、各種の組織における遺伝子のメチル化陽性率（％）を下記の式により算出した。
メチル化陽性率（％）＝（メチル化陽性検体数／総検体数）×100
そして、癌部組織検体と、非癌部組織検体または正常検体との間で統計学的に有意な差を認められる場合に、その遺伝子を癌部組織でメチル化が認められるマーカーとした。
その結果、GDF7、ZNF132、CPXM1、RPL39L、DOK1、FUZ、MGAT3およびEHD3の各遺伝子のプロモータ領域が、各種癌のうち少なくとも１の癌の癌部組織に高度にメチル化が認められるマーカーとして同定された（図１Ａ〜Ｈ、下記の表５参照）。なお、図１Ａ〜Ｈにおいて、「正常検体」のメチル化陽性率は、13種類の正常検体のメチル化陽性率の平均値であり、「正常血液」のメチル化陽性率は、健常人末梢血93検体（Salhia Bら）のメチル化陽性率の平均値である。図１Ａ〜Ｈより、本発明のマーカーでは、正常検体および正常血液のメチル化陽性率の平均値が０であったことから、13種類の正常検体および正常血液のいずれもメチル化は確認されなかった。一方で、複数の所定の癌においては非癌部・正常検体よりも高いメチル化陽性率が確認された。これらより、複数種類の癌の何れかに罹患しているか否かを判別するための指標として、本実施例の遺伝子のメチル化解析が有用であることが示唆される。
表５に記載されるとおり、GDF7は、２番染色体に存在する遺伝子であり、Infinium HumanMethylation27 BeadChipにおけるprobe positionが20,729,328である。図１Ａに示されるとおり、GDF7を用いた場合は脳腫瘍、乳癌、肺癌、大腸癌、肝細胞癌(肝癌)、胃癌、腎細胞癌、子宮体癌および前立腺癌の癌部組織において、高いメチル化陽性率となった。これらの結果は、GDF7プロモータ領域のメチル化解析が、脳腫瘍、乳癌、肺癌、大腸癌、肝細胞癌、胃癌、腎細胞癌、子宮体癌および前立腺癌の何れかの癌の存在の指標となり、癌のスクリーニングに有用であることを示唆している。
表５に記載されるとおり、ZNF132は、19番染色体に存在する遺伝子であり、Infinium HumanMethylation27 BeadChipにおけるprobe positionが63,643,484である。図１Ｂに示されるとおり、ZNF132を用いた場合は乳癌、肺癌、胃癌、大腸癌、肝細胞癌、腎細胞癌および子宮体癌の癌部組織において、高いメチル化率となった。これらの結果は、ZNF132プロモータ領域のメチル化解析が、乳癌、肺癌、胃癌、大腸癌、肝細胞癌、腎細胞癌および子宮体癌の何れかの癌の存在の指標となり、癌のスクリーニングに有用であることを示唆している。
表５に記載されるとおり、CPXM1は、20番染色体に存在する遺伝子であり、Infinium HumanMethylation27 BeadChipにおけるprobe positionが2,729,489である。図１Ｃに示されるとおり、CPXM1を用いた場合は乳癌、肺癌、胃癌、大腸癌、肝細胞癌、腎細胞癌、子宮体癌および前立腺癌の癌部組織において、高いメチル化率となった。これらの結果は、CPXM1プロモータ領域のメチル化解析が、乳癌、肺癌、胃癌、大腸癌、肝細胞癌、腎細胞癌、子宮体癌および前立腺癌の何れかの癌の存在の指標となり、癌のスクリーニングに有用であることを示唆している。
表５に記載されるとおり、RPL39Lは、３番染色体に存在する遺伝子であり、Infinium HumanMethylation27 BeadChipにおけるprobe positionが188,340,169である。図１Ｄに示されるとおり、RPL39Lを用いた場合は脳腫瘍、乳癌、肺癌、胃癌、大腸癌、肝細胞癌、腎細胞癌、子宮体癌および前立腺癌の癌部組織において、高いメチル化率となった。これらの結果は、RPL39Lプロモータ領域のメチル化解析が、脳腫瘍、乳癌、肺癌、胃癌、大腸癌、肝細胞癌、腎細胞癌、子宮体癌および前立腺癌の何れかの癌の存在の指標となり、癌のスクリーニングに有用であることを示唆している。
表５に記載されるとおり、DOK1は、２番染色体に存在する遺伝子であり、Infinium HumanMethylation27 BeadChipにおけるprobe positionが74,634,604である。図１Ｅに示されるとおり、DOK1を用いた場合は乳癌、肝細胞癌および前立腺癌の癌部組織において、高いメチル化率となった。これらの結果は、DOK1プロモータ領域のメチル化解析が、乳癌、肝細胞癌および前立腺癌の何れかの癌の存在の指標となり、癌のスクリーニングに有用であることを示唆している。
表５に記載されるとおり、FUZは、19番染色体に存在する遺伝子であり、Infinium HumanMethylation27 BeadChipにおけるprobe positionが55,008,270である。図１Ｆに示されるとおり、FUZを用いた場合は胃癌、大腸癌、肝細胞癌および子宮体癌の癌部組織において、高いメチル化率となった。これらの結果は、FUZプロモータ領域のメチル化解析が、胃癌、大腸癌、肝細胞癌および子宮体癌の何れかの癌の存在の指標となり、癌のスクリーニングに有用であることを示唆している。
表５に記載されるとおり、MGAT3は、22番染色体に存在する遺伝子であり、Infinium HumanMethylation27 BeadChipにおけるprobe positionが38,183,536である。図１Ｇに示されるとおり、MGAT3を用いた場合は乳癌、肺癌、胃癌および大腸癌の癌部組織において、高いメチル化率となった。これらの結果は、MGAT3プロモータ領域のメチル化解析が、乳癌、肺癌、胃癌および大腸癌の何れかの癌の存在の指標となり、癌のスクリーニングに有用であることを示唆している。
表５に記載されるとおり、EHD3は、２番染色体に存在する遺伝子であり、Infinium HumanMethylation27 BeadChipにおけるprobe positionが31,310,293である。図１Ｈに示されるとおり、EHD3を用いた場合は胃癌および大腸癌の癌部組織において、高いメチル化率となった。この結果は、EHD3プロモータ領域のメチル化解析が、胃癌および大腸癌の何れかの癌の存在の指標となり、癌のスクリーニングに有用であることを示唆している。
実施例２： GDF7遺伝子のプロモータ領域のメチル化データ（MassARRAY）の比較
（1）生体試料
本実施例では、生体試料として、上記の実施例１とは異なる患者から肝切除術により採取した肝細胞癌の癌部および非癌部組織検体ならびに上記の実施例１とは異なる患者から採取した胃癌の癌部組織検体および正常胃組織検体を含む臨床検体を用いた。該臨床検体は、正常脳組織（１検体）、脳腫瘍組織（８検体）、正常胃組織（２検体）、胃癌の癌部組織（６検体）、正常大腸組織（４検体）、大腸癌の癌部組織（５検体）、正常肝組織（２検体）、肝細胞癌の非癌部組織（５検体）、肝細胞癌の癌部組織（６検体）、正常子宮組織（４検体）、子宮体癌の癌部組織（４検体）、乳癌の非癌部組織（３検体）および乳癌の癌部組織（４検体）であった。これらの組織は採取された後、ただちに液体窒素で凍結され、使用されるまで−80℃で保存した。
（2）測定用試料および対照試料の作製
（i）ゲノムDNAの抽出
上記の各組織からゲノムDNAを、QIAamp DNA Mini Kit（QIAGEN社）を用いて抽出した。得られたDNA溶液に含まれるゲノムDNAを、Bioruptor（COSMO BIO社製）によって断片化した。また、質量分析法における検量線を作成するため、対照用ゲノムDNAとして、ヒト末梢血リンパ球のゲノムDNAを用いた。このヒト末梢血リンパ球のゲノムDNAを、GenomiPhi v2DNA amplificationキット（GEヘルスケアライフサイエンス社）を用いて増幅した。得られた増幅産物は非メチル化DNA断片（０％メチル化DNA）の溶液からなる。次いで、この非メチル化DNA断片の溶液の一部を取り、これにSssIメチラーゼ（New England Biolab社）を反応させることによりＣＧ配列にある全てのシトシンをメチル化させて、メチル化DNA断片（100％メチル化DNA）の溶液を得た。そして、０％メチル化DNAの溶液と100％メチル化DNAの溶液とを所定の割合で混合して、25％、50％および75％メチル化DNAの溶液を得た。
（ii）バイサルファイト処理
上記で得られた各DNA断片(500 ng）を、EZ DNA Methylation Kit（Zymo Research社）を用いてバイサルファイト処理を行い、処理後のゲノムDNAを滅菌蒸留水（80μl）に溶出した。
（iii）PCRおよびIVTによる増幅
バイサルファイト処理した各DNA断片に含まれるメチル化シトシンおよびウラシルを、PCR法およびIVT増幅法により、それぞれグアニンおよびアデニンに変換した。
なお、PCR法に用いたプライマーセットがメチル化DNAおよび非メチル化DNAのいずれも偏りなく増幅できることは、後述する対照試料を用いたMassARRAY（登録商標）解析によって確認されている。本発明のマーカーに対するプライマーセットの配列を、表５に示した。また、このプライマーセットで解析される領域の塩基配列（プラス鎖の配列）を、配列番号３７で示した。なお、GDF7のメチル化検出用プライマーセットで増幅される領域のバイサルファイト変換後の塩基配列を配列番号４７で示した。ここで、配列番号４７の塩基配列は、各メチル化検出用プライマーセットで増幅される領域に存在する全てのCpG部位がメチル化している場合の塩基配列を表す。
なお、上記のプライマーセットのフォワードプライマーおよびリバースプライマーの５'末端には、IVT反応のために、それぞれ以下のタグ配列およびT7プロモータ配列が付加されている。
・タグ配列：AGGAAGAGAG （配列番号３５）
・T7プロモータ配列：CAGTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCT （配列番号３６）
PCR反応液は、下記の試薬類を混合して調製した。
10x Hot Starバッファー（QIAGEN社） 0.5μL
25 mM dNTPミックス 0.04μL
Hot Star Taq（５U／μl）（QIAGEN社） 0.04μL
プライマーミックス 2.0μL
DNA溶液 1.0μL
水 1.42μL
トータル ５μL
上記の反応液について、下記の条件でPCR反応を行った。
94℃で15分を１サイクル、
94℃で20秒、52℃で30秒および72℃で１分を45サイクル、
72℃で３分。
得られた各PCR産物を、MassCLEAVE（商標）Reagentキット（SEQUENOM社）に含まれるSAP（Shrimp Alkaline Phosphatase）を用いて脱リン酸化処理した。次いで、これらに、上記のキットを用いて調製した下記の反応液を添加した。
5x T7 R&DNAポリメラーゼバッファー 0.89μL
T Cleavageミックス 0.24μL
100 mM DTT 0.22μL
T7 R&DNAポリメラーゼ 0.44μL
RNase A 0.06μL
RNaseフリーの水 3.15μL
トータル ５μL
得られた混合物を37℃で３時間インキュベーションして、IVT反応と、ウラシルまたはチミン特異的切断反応とを行った。そして、得られた各反応物をClean Resin（SEQUENOM社）により精製して、質量分析法のための試料を得た。これらの試料について、上記の臨床検体から抽出したゲノムDNAに由来する試料を測定用試料とし、対照ゲノムDNAに由来する試料を対照試料として、後述する質量分析法に用いた。
（3）MassARRAY（登録商標）を用いた質量分析法によるメチル化状態の解析
（i）検量線の作成
上記で得られた対照試料を２回ずつ独立に質量分析を行った。得られた解析結果より、各プライマーセットについての検量線を作成し、相関係数を算出した。これにより、用いたプライマーセットは、メチル化DNAおよび非メチル化DNAのいずれにも偏りなく増幅できることが確認された。
（ii）測定用試料の解析
上記で得られた測定用試料の質量分析を行い、測定用試料に含まれるDNA断片のピークを得た。次いで、得られた各ピークが、GDF7の塩基配列のどの部分に由来するかを同定した。そして、同一の塩基配列に由来する断片について、メチル化CpG部位を含む断片のピークとメチル化CpG部位を含まない断片のピークとの面積比から、メチル化スコアを算出した。結果を図２Ａに示す。
図２Ａより、GDF7遺伝子のプロモータ領域において、メチル化スコアが0.1を超えたものは、癌部組織では、脳腫瘍組織で４検体／８検体、胃癌組織で６検体／６検体、大腸癌組織で５検体／５検体、肝細胞癌組織で４検体／６検体、子宮体癌組織で４検体／４検体、乳癌組織で３検体／４検体であった。非癌部組織では、肝細胞癌の非癌部組織で５検体／５検体、乳癌の非癌部組織で０検体／３検体であった。正常組織では、脳組織で０検体／１検体、胃組織で０検体／２検体、大腸組織で０検体／４検体、肝組織で０検体／２検体、子宮組織で３検体／４検体であった。これらの結果を下記の表６にまとめる。
図２Ａおよび表６の結果から、GDF7を用いるメチル化の頻度の解析では、癌部組織検体、非癌部組織検体および正常検体のメチル化の頻度の差に基づいて、脳腫瘍、胃癌、大腸癌、肝細胞癌、子宮体癌および乳癌などの診断の補助および再発モニタリングに利用できることがわかった。
実施例３： ZNF132遺伝子のプロモータ領域のメチル化データ（MassARRAY）の比較
臨床検体として、正常胃組織（２検体）、胃癌の癌部組織（６検体）、大腸癌の非癌部組織（４検体）、大腸癌の癌部組織（５検体）、正常肝組織（２検体）、肝細胞癌の非癌部組織（５検体）、肝細胞癌の癌部組織（６検体）、正常子宮組織（４検体）、子宮体癌の癌部組織（４検体）、乳癌の非癌部組織（３検体）および乳癌の癌部組織（４検体）を用いたこと、およびMassARRAY解析用プライマーセットとして表７に示したものを用いたこと（このプライマーセットで解析される領域の塩基配列（プラス鎖の配列）を、配列番号３８で示した）以外は実施例２と同様にして、メチル化スコアを算出した。なお、ZNF132のメチル化検出用プライマーセットで増幅される領域のバイサルファイト変換後の塩基配列を配列番号４８で示した。ここで、配列番号４８の塩基配列は、各メチル化検出用プライマーセットで増幅される領域に存在する全てのCpG部位がメチル化している場合の塩基配列を表す。
なお、上記のプライマーセットのフォワードプライマーおよびリバースプライマーの５'末端には、IVT反応のために、それぞれ配列番号３５のタグ配列および配列番号３６のT7プロモータ配列が付加されている。
結果を図２Ｂに示す。図２Ｂより、ZNF132遺伝子のプロモータ領域において、メチル化スコアが0.1を超えたものは、癌部組織では、胃癌組織で６検体／６検体、大腸癌組織で５検体／５検体、肝細胞癌組織で４検体／６検体、子宮体癌組織で４検体／４検体、乳癌組織で３検体／４検体であった。非癌部組織では、大腸癌の非癌部組織で０検体／４検体、肝細胞癌の非癌部組織で０検体／５検体、乳癌の非癌部組織で０検体／３検体であった。正常組織では、胃組織で０検体／２検体、肝組織で０検体／２検体、子宮組織で０検体／４検体であった。これらの結果を下記の表８にまとめる。
図２Ｂおよび表８の結果から、ZNF132を用いるメチル化の頻度の解析では、癌部組織検体、非癌部組織検体および正常検体のメチル化の頻度の差に基づいて、胃癌、大腸癌、肝細胞癌、子宮体癌および乳癌などの診断の補助および再発モニタリングに利用できることがわかった。
実施例４： CPXM1遺伝子のプロモータ領域のメチル化データ（MassARRAY）の比較
臨床検体として、正常胃組織（２検体）、胃癌の癌部組織（６検体）、大腸癌の非癌部組織（４検体）、大腸癌の癌部組織（５検体）、正常肝組織（２検体）、肝細胞癌の非癌部組織（５検体）、肝細胞癌の癌部組織（６検体）、正常子宮組織（４検体）、子宮体癌の癌部組織（４検体）、乳癌の非癌部組織（３検体）および乳癌の癌部組織（４検体）を用いたこと、およびMassARRAY解析用プライマーセットとして表９に示したものを用いたこと（このプライマーセットで解析される領域の塩基配列（プラス鎖の配列）を、配列番号３９で示した）以外は実施例２と同様にして、メチル化スコアを算出した。なお、CPXM1のメチル化検出用プライマーセットで増幅される領域のバイサルファイト変換後の塩基配列を配列番号４９で示した。ここで、配列番号４９の塩基配列は、各メチル化検出用プライマーセットで増幅される領域に存在する全てのCpG部位がメチル化している場合の塩基配列を表す。
なお、上記のプライマーセットのフォワードプライマーおよびリバースプライマーの５'末端には、IVT反応のために、それぞれ配列番号３５のタグ配列および配列番号３６のT7プロモータ配列が付加されている。
結果を図２Ｃに示す。図１Ｃより、CPXM1遺伝子のプロモータ領域において、メチル化スコアが0.1を超えたものは、癌部組織では、胃癌組織で６検体／６検体、大腸癌組織で３検体／５検体、肝細胞癌組織で５検体／６検体、子宮体癌組織で４検体／４検体、乳癌組織で３検体／４検体であった。非癌部組織では、大腸癌の非癌部組織で０検体／４検体、肝細胞癌の非癌部組織で０検体／５検体、乳癌の非癌部組織で０検体／３検体であった。正常組織では、胃組織で０検体／２検体、肝組織で０検体／２検体、子宮組織で０検体／４検体であった。これらの結果を下記の表１０にまとめる。
図２Ｃおよび表１０の結果から、CPXM1を用いるメチル化の頻度の解析では、癌部組織検体、非癌部組織検体および正常検体のメチル化の頻度の差に基づいて、胃癌、大腸癌、肝細胞癌、子宮体癌および乳癌などの診断の補助および再発モニタリングに利用できることがわかった。
実施例５： RPL39L遺伝子のプロモータ領域のメチル化データ（MassARRAY）の比較
臨床検体として、正常脳組織（１検体）、脳腫瘍組織（８検体）、正常胃組織（２検体）、胃癌の癌部組織（６検体）、大腸癌の非癌部組織（４検体）、大腸癌の癌部組織（５検体）、正常肝組織（２検体）、肝細胞癌の非癌部組織（５検体）、肝細胞癌の癌部組織（６検体）、正常子宮組織（４検体）および子宮体癌の癌部組織（４検体）を用いたこと、およびMassARRAY解析用プライマーセットとして表１１に示したものを用いたこと（このプライマーセットで解析される領域の塩基配列（マイナス鎖の配列）を、配列番号４０で示した）以外は実施例２と同様にして、メチル化スコアを算出した。なお、RPL39Lのメチル化検出用プライマーセットで増幅される領域のバイサルファイト変換後の塩基配列を配列番号５０で示した。ここで、配列番号５０の塩基配列は、各メチル化検出用プライマーセットで増幅される領域に存在する全てのCpG部位がメチル化している場合の塩基配列を表す。
なお、上記のプライマーセットのフォワードプライマーおよびリバースプライマーの５'末端には、IVT反応のために、それぞれ配列番号３５のタグ配列および配列番号３６のT7プロモータ配列が付加されている。
結果を図２Ｄに示す。図１Ｄより、RPL39L遺伝子のプロモータ領域において、メチル化スコアが0.1を超えたものは、癌部組織では、脳腫瘍組織で７検体／８検体、胃癌組織で４検体／６検体、大腸癌組織で２検体／５検体、肝細胞癌組織で４検体／６検体、子宮体癌組織で３検体／４検体であった。非癌部組織では、大腸癌の非癌部組織で１検体／４検体、肝細胞癌の非癌部組織で０検体／５検体であった。正常組織では、脳組織で０検体／１検体、胃組織で０検体／２検体、肝組織で０検体／２検体、子宮組織で０検体／４検体であった。これらの結果を下記の表１２にまとめる。
図２Ｄおよび表１２の結果から、RPL39Lを用いるメチル化の頻度の解析では、癌部組織検体、非癌部組織検体および正常検体のメチル化の頻度の差に基づいて、脳腫瘍、胃癌、大腸癌、肝細胞癌および子宮体癌などの診断の補助および再発モニタリングに利用できることがわかった。
実施例６： DOK1遺伝子のプロモータ領域のメチル化データ（MassARRAY）の比較
臨床検体として、正常肝組織（２検体）、肝細胞癌の非癌部組織（５検体）、肝細胞癌の癌部組織（６検体）、乳癌の非癌部組織（３検体）および乳癌の癌部組織（４検体）を用いたこと、およびMassARRAY解析用プライマーセットとして表１３に示したものを用いたこと（このプライマーセットで解析される領域の塩基配列（プラス鎖の配列）を、配列番号４１で示した）以外は実施例２と同様にして、メチル化スコアを算出した。なお、DOK1のメチル化検出用プライマーセットで増幅される領域のバイサルファイト変換後の塩基配列を配列番号５１で示した。ここで、配列番号５１の塩基配列は、各メチル化検出用プライマーセットで増幅される領域に存在する全てのCpG部位がメチル化している場合の塩基配列を表す。
なお、上記のプライマーセットのフォワードプライマーおよびリバースプライマーの５'末端には、IVT反応のために、それぞれ配列番号３５のタグ配列および配列番号３６のT7プロモータ配列が付加されている。
結果を図２Ｅに示す。図２Ｅより、DOK1遺伝子のプロモータ領域において、メチル化スコアが0.1を超えたものは、癌部組織では、肝細胞癌組織で６検体／６検体、乳癌組織で３検体／４検体であった。非癌部組織では、肝細胞癌の非癌部組織で０検体／５検体、乳癌の非癌部組織で０検体／３検体であった。正常組織では、肝組織で０検体／２検体であった。これらの結果を下記の表１４にまとめる。
図２Ｅおよび表１４の結果から、DOK1を用いるメチル化の頻度の解析では、癌部組織検体、非癌部組織検体および正常検体のメチル化の頻度の差に基づいて、肝細胞癌および乳癌などの診断の補助および再発モニタリングに利用できることがわかった。
実施例７： FUZ遺伝子のプロモータ領域のメチル化データ（MassARRAY）の比較
臨床検体として、正常胃組織（２検体）、胃癌の癌部組織（６検体）、大腸癌の非癌部組織（４検体）、大腸癌の癌部組織（５検体）、正常肝組織（２検体）、肝細胞癌の非癌部組織（５検体）および肝細胞癌の癌部組織（６検体）を用いたこと、およびMassARRAY解析用プライマーセットとして表１５に示したものを用いたこと（このプライマーセットで解析される領域の塩基配列（プラス鎖の配列）を、配列番号４２で示した）以外は実施例２と同様にして、メチル化スコアを算出した。なお、FUZのメチル化検出用プライマーセットで増幅される領域のバイサルファイト変換後の塩基配列を配列番号５５で示した。ここで、配列番号５５の塩基配列は、各メチル化検出用プライマーセットで増幅される領域に存在する全てのCpG部位がメチル化している場合の塩基配列を表す。
なお、上記のプライマーセットのフォワードプライマーおよびリバースプライマーの５'末端には、IVT反応のために、それぞれ配列番号３５のタグ配列および配列番号３６のT7プロモータ配列が付加されている。
結果を図２Ｆに示す。図２Ｆより、FUZ遺伝子のプロモータ領域において、メチル化スコアが0.1を超えたものは、癌部組織では、胃癌組織で４検体／６検体、大腸癌組織で３検体／５検体、肝細胞癌組織で４検体／６検体であった。非癌部組織では、大腸癌の非癌部組織で０検体／４検体、肝細胞癌の非癌部組織で０検体／５検体であった。正常組織では、胃組織で０検体／２検体、肝組織で０検体／２検体であった。これらの結果を下記の表１６にまとめる。
図２Ｆおよび表１６の結果から、FUZを用いるメチル化の頻度の解析では、癌部組織検体、非癌部組織検体および正常検体のメチル化の頻度の差に基づいて、胃癌、大腸癌および肝細胞癌などの診断の補助および再発モニタリングに利用できることがわかった。
実施例８： EHD3遺伝子のプロモータ領域のメチル化データ（MassARRAY）の比較
臨床検体として、正常胃組織（２検体）、胃癌の癌部組織（６検体）、大腸癌の非癌部組織（４検体）および大腸癌の癌部組織（５検体）を用いたこと、およびMassARRAY解析用プライマーセットとして表１７に示したものを用いたこと（このプライマーセットで解析される領域の塩基配列（プラス鎖の配列）を、配列番号４３で示した）以外は実施例２と同様にして、メチル化スコアを算出した。なお、EHD3のメチル化検出用プライマーセットで増幅される領域のバイサルファイト変換後の塩基配列を配列番号５６で示した。ここで、配列番号５６の塩基配列は、各メチル化検出用プライマーセットで増幅される領域に存在する全てのCpG部位がメチル化している場合の塩基配列を表す。
なお、上記のプライマーセットのフォワードプライマーおよびリバースプライマーの５'末端には、IVT反応のために、それぞれ配列番号３５のタグ配列および配列番号３６のT7プロモータ配列が付加されている。
結果を図２Ｇに示す。図２Ｇより、EHD3遺伝子のプロモータ領域において、メチル化スコアが0.1を超えたものは、癌部組織では、胃癌組織で５検体／６検体、大腸癌組織で３検体／５検体であった。非癌部組織では、大腸癌の非癌部組織で０検体／４検体であった。正常組織では、胃組織で０検体／２検体であった。これらの結果を下記の表１８にまとめる。
図２Ｇおよび表１８の結果から、EHD3を用いるメチル化の頻度の解析では、癌部組織検体、非癌部組織検体および正常検体のメチル化の頻度の差に基づいて、胃癌および大腸癌などの診断の補助および再発モニタリングに利用できることがわかった。
実施例９： FUZ遺伝子のプロモータ領域のメチル化データ（MSP）の比較
（1）生体試料
本実施例では、生体試料として、胃癌の非癌部組織（２検体）、胃癌の癌部組織（４検体）、大腸癌の非癌部組織（４検体）、大腸癌の癌部組織（５検体）、正常肝組織（２検体）、肝細胞癌の非癌部組織（５検体）および肝細胞癌の癌部組織（６検体）を用いた。
（2）測定用試料および対照試料の作製
（i）ゲノムDNAの抽出
上記の各組織からゲノムDNAを、QIAamp DNA Mini Kit（QIAGEN社）を用いて抽出した。得られたDNA溶液に含まれるゲノムDNAを、Bioruptor（COSMO BIO社製）によって断片化した。
また、対照用ゲノムDNAとして、ヒト末梢血リンパ球のゲノムDNAを用いた。このヒト末梢血リンパ球のゲノムDNAを、GenomiPhi v2DNA amplificationキット（GEヘルスケアライフサイエンス社）を用いて増幅した。得られた増幅産物は非メチル化DNAからなる。次いで、該増幅産物をBioruptor（COSMO BIO社製）により断片化して、非メチル化DNA断片（０％メチル化DNA）の溶液を得た。この非メチル化DNA断片の溶液の一部を取り、これにSssIメチラーゼ（New England Biolab社）を反応させることによりＣＧ配列にある全てのシトシンをメチル化させて、メチル化DNA断片（100％メチル化DNA）の溶液を得た。
（ii）バイサルファイト処理
上記で得られた各DNA断片（500 ng）を、EZ DNA Methylation Kit（Zymo Research社）を用いてバイサルファイト処理を行い、処理後のゲノムDNAを滅菌蒸留水（80μl）に溶出した。
（3）メチル化特異的PCR（MSP）
上記（2）で得られた測定用試料および対照試料（バイサルファイト処理後のDNA）を用いて、MSPを行った。MSPで用いたPCR試薬の組成、プライマーセットおよびPCRの反応条件を以下に示す。
＜PCR試薬＞
DDW（滅菌水） 16.75μL
10×PCR buffer with MgCl2（Roche社） 2.5μL
2mM dNTP mix 2.5μL
10μMセンスプライマー 1.0μL
10μMアンチセンスプライマー 1.0μL
Faststart Taq polymerase（Roche社） 0.25μL
測定用試料または対照試料 1.0μL
トータル 25μL
＜プライマーセット＞
上記のMSPで用いたプライマーセットを表１９に示す。これらは、増幅される領域のDNAがメチル化している場合に増幅産物を得ることができるプライマーセットである。なお、FUZ遺伝子のプロモータ領域について、表１９に示されるプライマーセットで解析される領域の塩基配列を、それぞれ配列番号４４で示した。ここで、配列番号４４の塩基配列はプラス鎖の配列である。なお、FUZのメチル化検出用プライマーセット(配列番号２３および２４のMプライマー)で増幅される領域のバイサルファイト変換後の塩基配列を配列番号５２で示した。ここで、配列番号５２の塩基配列は、各メチル化検出用プライマーセットで増幅される領域に存在する全てのCpG部位がメチル化している場合の塩基配列を表す。また、FUZの非メチル化検出用プライマーセット(配列番号２５および２６のUプライマー)で増幅される領域のバイサルファイト変換後の塩基配列を配列番号５７で示した。
＜PCR反応条件＞
95℃で６分、
95℃で30秒、Ｘ℃で30秒、72℃で30秒をＹサイクル、
72℃で７分、
16℃で放置。
なお、上記の反応条件において「Ｘ」および「Ｙ」はそれぞれ、表１９に示されるアニーリング温度およびサイクル数を表す。
（4）メチル化特異的PCR（MSP）の結果解析
上述のMSPで得られた増幅産物を２％アガロースゲル電気泳動で確認した。結果を図３Ａに示す。なお、図中で「control」として示されている「０」および「100」はそれぞれ０％メチル化対照試料および１００％メチル化対照試料を表す。
FUZ遺伝子についてのPCRでは、胃癌の非癌部組織、大腸癌の非癌部組織、正常肝組織および肝細胞癌の非癌部組織ではメチル化CpGに由来するバンドを検出しなかった。他方で、胃癌の癌部組織では３検体／４検体、大腸癌の癌部組織では３検体／５検体、および肝細胞癌の癌部組織では４検体／６検体でメチル化されたDNAのバンドを検出した。また、図３Ａより、FUZを用いるメチル化の頻度の解析では、癌部組織検体と、正常検体とのメチル化の頻度の差に基づいて、胃癌、大腸癌および肝細胞癌などの診断の補助および再発モニタリングに利用できることがわかった。
実施例１０： EHD3遺伝子のプロモータ領域のメチル化データ（MSP）の比較
生体試料として、胃癌の非癌部組織（２検体）、胃癌の癌部組織（４検体）、大腸癌の非癌部組織（４検体）および大腸癌の癌部組織（５検体）を用いたこと、下記の表２０に示されるプライマーセットを用いたこと（解析される領域の塩基配列を配列番号４５で示した。なお、配列番号４５の塩基配列はプラス鎖の配列である）以外は実施例９と同様にしてMSPにより増幅産物を得た。なお、EHD3のメチル化検出用プライマーセット(配列番号２７および２８のMプライマー)で増幅される領域のバイサルファイト変換後の塩基配列を配列番号５３で示した。ここで、配列番号５３の塩基配列は、各メチル化検出用プライマーセットで増幅される領域に存在する全てのCpG部位がメチル化している場合の塩基配列を表す。また、EHD3の非メチル化検出用プライマーセット(配列番号２９および３０のUプライマー)で増幅される領域のバイサルファイト変換後の塩基配列を配列番号５８で示した。
上述のMSPで得られた増幅産物を２％アガロースゲル電気泳動で確認した。結果を図３Ｂに示す。なお、図中で「control」として示されている「０」および「100」はそれぞれ０％メチル化対照試料および１００％メチル化対照試料を表す。
EHD3遺伝子についてのPCRでは、胃癌の非癌部組織および大腸癌の非癌部組織ではメチル化CpGに由来するバンドを検出しなかった。他方で、胃癌の癌部組織では３検体／４検体、および大腸癌の癌部組織では５検体／５検体でメチル化されたDNAのバンドを検出した。また、図３Ｂより、EHD3を用いるメチル化の頻度の解析では、癌部組織検体と、非癌部組織検体とのメチル化の頻度の差に基づいて、胃癌および大腸癌などの診断の補助および再発モニタリングに利用できることがわかった。
実施例１１： MGAT3遺伝子のプロモータ領域のメチル化データ（MSP）の比較
生体試料として、胃癌の非癌部組織（２検体）、胃癌の癌部組織（６検体）、大腸癌の非癌部組織（４検体）および大腸癌の癌部組織（５検体）を用いたこと、下記の表２１に示されるプライマーセットを用いたこと（解析される領域の塩基配列を配列番号４６で示した。なお、配列番号４６の塩基配列はプラス鎖の配列である）以外は実施例９と同様にしてMSPにより増幅産物を得た。なお、MGAT3のメチル化検出用プライマーセット(配列番号３１および３２のMプライマー)で増幅される領域のバイサルファイト変換後の塩基配列を配列番号５４で示した。ここで、配列番号５４の塩基配列は、各メチル化検出用プライマーセットで増幅される領域に存在する全てのCpG部位がメチル化している場合の塩基配列を表す。また、MGAT3の非メチル化検出用プライマーセット(配列番号３３および３４のUプライマー)で増幅される領域のバイサルファイト変換後の塩基配列を配列番号５９で示した。
上述のMSPで得られた増幅産物を２％アガロースゲル電気泳動で確認した。結果を図３Ｃに示す。なお、図中で「control」として示されている「０」および「100」はそれぞれ０％メチル化対照試料および１００％メチル化対照試料を表す。
MGAT3遺伝子についてのPCRでは、胃癌の非癌部組織および大腸癌の非癌部組織ではメチル化CpGに由来するバンドを検出しなかった。他方で、胃癌の癌部組織では５検体／６検体、および大腸癌の癌部組織では４検体／５検体でメチル化されたDNAのバンドを検出した。また、図３Ｃより、MGAT3を用いるメチル化の頻度の解析では、癌部組織検体と、非癌部組織検体とのメチル化の頻度の差に基づいて、胃癌および大腸癌などの診断の補助および再発モニタリングに利用できることがわかった。
１ 判定装置
２ 測定装置
３ コンピュータシステム
３ａ コンピュータ本体
３ｂ 入力デバイス
３ｃ 表示部

Claims (3)

  1. 被検者から採取した生体試料からDNA試料を調製する工程と、
    調製工程で得られたDNA試料に含まれるGDF7、CPXM1、FUZ及びMGAT3からなる遺伝子群から選択される少なくとも１つの遺伝子のプロモータ領域におけるCpG部位のメチル化の状態を解析する工程と、
    解析工程で得られた解析結果に基づいて、前記被検者から採取した生体試料における、複数種類の癌のうちの少なくとも１種の癌に由来する癌細胞の存否に関する情報を取得する工程と
    を含む、複数種類の癌に関する情報の取得方法であって、
    前記解析工程が、少なくとも１つのCpG部位のメチル化の有無を解析する工程であり、前記情報取得工程が、メチル化されたCpG部位が有るという解析結果が得られた場合に、前記生体試料中に複数種類の癌のうちの少なくとも１種の癌に由来する癌細胞が存在するという情報を取得する工程であるか、又は
    前記解析工程が、メチル化の頻度を解析する工程であり、前記情報取得工程が、前記解析工程で得られたメチル化の頻度が所定の閾値より高い場合に、前記生体試料中に複数種類の癌のうちの少なくとも１種の癌に由来する癌細胞が存在するという情報を取得する工程であり、
    前記解析工程において、
    - GDF7のCpG部位のメチル化の状態を解析する場合、前記複数種類の癌が、脳腫瘍、肝細胞癌、大腸癌、胃癌、子宮体癌、肺癌、乳癌、前立腺癌及び腎細胞癌であり、
    - CPXM1のCpG部位のメチル化の状態を解析する場合、前記複数種類の癌は、肝細胞癌、大腸癌、胃癌、子宮体癌、肺癌、腎細胞癌、前立腺癌及び乳癌であり、
    - FUZのCpG部位のメチル化の状態を解析する場合、前記複数種類の癌は、子宮体癌、肝細胞癌、大腸癌及び胃癌であり、
    - MGAT3のCpG部位のメチル化の状態を解析する場合、前記複数種類の癌は、乳癌、肺癌、大腸癌及び胃癌である、
    前記方法。
  2. 複数種類の癌に関する情報を取得するシステムであって、
    プロセッサおよび前記プロセッサの制御下にあるメモリを含むコンピュータを含み、
    前記メモリには、
    被検者由来のDNA試料に含まれるGDF7、CPXM1、FUZおよびMGAT3からなる遺伝子群から選択される少なくとも１つの遺伝子のプロモータ領域におけるCpG部位のメチル化の状態の解析結果を取得するステップと、
    前記解析結果に基づいて、前記被検者における複数種類の癌のうちの少なくとも１種の癌の有無を判定するステップと、
    前記判定結果を出力するステップと
    を、前記コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムが記録され、
    前記解析結果が、少なくとも１つのCpG部位のメチル化の有無であり、前記取得ステップにおいて、メチル化されたCpG部位が有るという解析結果を取得した場合に、前記判定ステップにおいて、前記被検者に複数種類の癌のうちの少なくとも１種の癌が有ると判定するか、又は
    前記解析結果が、メチル化の頻度であり、前記取得ステップにおいて、メチル化の頻度が所定の閾値より高いという解析結果を取得した場合に、前記判定ステップにおいて、前記被検者に複数種類の癌のうちの少なくとも１種の癌が有ると判定し、
    前記取得ステップにおいて、
    - GDF7のCpG部位のメチル化の状態の解析結果を取得した場合、前記複数種類の癌が、脳腫瘍、肝細胞癌、大腸癌、胃癌、子宮体癌、肺癌、乳癌、前立腺癌および腎細胞癌であり、
    - CPXM1のCpG部位のメチル化の状態の解析結果を取得した場合、前記複数種類の癌は、肝細胞癌、大腸癌、胃癌、子宮体癌、肺癌、腎細胞癌、前立腺癌および乳癌であり、
    - FUZのCpG部位のメチル化の状態の解析結果を取得した場合、前記複数種類の癌は、子宮体癌、肝細胞癌、大腸癌および胃癌であり、
    - MGAT3のCpG部位のメチル化の状態の解析結果を取得した場合、前記複数種類の癌は、乳癌、肺癌、大腸癌および胃癌である、
    癌情報取得システム。
  3. 被検者由来のDNA試料に含まれるGDF7、CPXM1、FUZおよびMGAT3からなる遺伝子群から選択される少なくとも１つの遺伝子のプロモータ領域におけるCpG部位のメチル化の状態の解析結果を取得するステップと、
    前記解析結果に基づいて、前記被検者における複数種類の癌のうちの少なくとも１種の癌の有無を判定するステップと、
    前記判定結果を出力するステップと
    を、コンピュータに実行させるためのプログラムであって、
    前記解析結果が、少なくとも１つのCpG部位のメチル化の有無であり、前記取得ステップにおいて、メチル化されたCpG部位が有るという解析結果を取得した場合に、前記判定ステップにおいて、前記被検者に複数種類の癌のうちの少なくとも１種の癌が有ると判定するか、又は
    前記解析結果が、メチル化の頻度であり、前記取得ステップにおいて、メチル化の頻度が所定の閾値より高いという解析結果を取得した場合に、前記判定ステップにおいて、前記被検者に複数種類の癌のうちの少なくとも１種の癌が有ると判定し、
    前記取得ステップにおいて、
    - GDF7のCpG部位のメチル化の状態の解析結果を取得した場合、前記複数種類の癌が、脳腫瘍、肝細胞癌、大腸癌、胃癌、子宮体癌、肺癌、乳癌、前立腺癌および腎細胞癌であり、
    - CPXM1のCpG部位のメチル化の状態の解析結果を取得した場合、前記複数種類の癌は、肝細胞癌、大腸癌、胃癌、子宮体癌、肺癌、腎細胞癌、前立腺癌および乳癌であり、
    - FUZのCpG部位のメチル化の状態の解析結果を取得した場合、前記複数種類の癌は、子宮体癌、肝細胞癌、大腸癌および胃癌であり、
    - MGAT3のCpG部位のメチル化の状態の解析結果を取得した場合、前記複数種類の癌は、乳癌、肺癌、大腸癌および胃癌である、
    複数種類の癌に関する情報を取得するためのプログラム。
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